Способ оценки активности туберкулезной инфекции у детей и подростков

Изобретение относится к медицине, преимущественно к фтизиатрии, и может быть использовано при оценке активности туберкулезной инфекции у детей и подростков. Для этого в пробы цельной крови пациента вносят специфические антигены: ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибридного белка CFP10-ESAT-6. Определяют уровень ИФН-γ в пробах через 72 часа после внесения в кровь специфических антигенов. При увеличении уровня ИФН-γ - положительной реакции на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и отрицательной - отсутствие изменения уровня ИФН-γ - на гибрид CFP10-ESAT-6 диагностируют латентную туберкулезную инфекцию. При положительной на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и гибрид CFP10-ESAT-6 - активную туберкулезную инфекцию. При положительной на ППД-Л и отрицательной одновременно на Rv2660c, ESAT-6, гибрид CFP10-ESAT-6 - поствакцинальную аллергию. Использование данного способа позволяет проводить дифференциальную диагностику латентной и активной туберкулезной инфекции у детей, что способствует ранней постановке диагноза и назначению специфического лечения. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, преимущественно к фтизиатрии и педиатрии, и может быть использовано для повышения эффективности диагностики туберкулезной инфекции у детей и подростков.

Основным методом активного выявления туберкулезной инфекции у детей в нашей стране остается проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л (Аксенова К.И. Методы контроля качества работы при массовой туберкулинодиагностике / К.И. Аксенова, Е.С. Овсянкина, Т.М. Александрова // Пробл. туб. - 2002. - №2. - С. 3-5; Туберкулезная чувствительность у детей раннего и дошкольного возраста / Е.М. Гусева [и др.] // Пробл. туб. - 2001. - №1. - С. 15-17; Флетчер И.Н. Новые подходы к диагностике и профилактике детского туберкулеза / И.Н. Флетчер, Н.В. Жебуртович // Пробл. туб. - 2002. - №4. - С. 3-5).

Известно, что на интенсивность туберкулиновых реакций могут влиять различные неспецифические факторы, которые усиливают или ослабляют феномен парааллергии (Флетчер И.Н. Новые подходы к диагностике и профилактике детского туберкулеза / И.Н. Флетчер, Н.В. Жебуртович // Пробл. туб. - 2002. - №4. - С. 3-5; Evaluation of DPPD, a single recombinant Mycobacterium tuberculosis protein as an alternative antigen for the Mantoux test / A. Campos-Neto [et al.] // Tuberculosis. - 2001. - 81, №5-6. - P. 353-358): характер питания, климатометеорологические условия, сопутствующие заболевания, детские инфекционные заболевания, различные прививки, некоторые медикаменты, общая аллергическая настроенность организма, фаза овариального цикла у девушек, индивидуальный характер чувствительности кожи (Митинская Л.А. Туберкулинодиагностика (лекция) / Л.А. Митинская // Пробл. туб. - 1998. - №3. - С. 76-77; Флетчер И.Н. Новые подходы к диагностике и профилактике детского туберкулеза / И.Н. Флетчер, Н.В. Жебуртович // Пробл. туб. - 2002. - №4. - С.3-5).

В России был разработан препарат Диаскинтест (ДСТ) (регистрационное удостоверение ЛСР-006435/08 от 11.08.08), который представляет собой комплекс рекомбинантных белков CFP10 и ESAT6, продуцируемых Escherichia coli BL21(DE3)/pCFP-ESAT (Киселев В.И. Новый кожный тест для диагностики туберкулеза на основе рекомбинантного белка ESAT-CFP / В.И. Киселев [и др.] // Молекулярная медицина. - 2008. - №4. - С. 28-34; Кожная проба с препаратом «Диаскинтест» - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции. / Под ред. Академика РАН и РАМН М.А. Пальцева. Второе издание, переработанное и дополненное. - М.: Издательство «Шико», 2011. - 256 с.: ил.). Он предназначен для внутрикожного введения - техника не отличается от пробы Манту, доза 0,2 мкг в 0,1 мл. Первые же данные (Слогацкая Л.В. Эффективность кожного теста с аллергеном туберкулезным, содержащим рекомбинантный белок CFP 10- ESAT 6, в диагностике, выявлении и определении активности туберкулезной инфекции: Автореф. дис. д-ра мед. наук. - М., 2011. - 45 с.; Выявление туберкулеза и тактика диспансерного наблюдения за лицами из групп риска по заболеванию туберкулезом с использованием препарата «Диаскинтест» / В.А. Аксенова [и др.] // Туберкулез и болезни легких. - 2010. - №2. - С. 13-19) показали безопасность применения, высокую, почти 100%, специфичность пробы с ДСТ. Появление положительной реакции на ДСТ свидетельствует не о латентном микробизме, а о развивающейся инфекции. Однако исследования показали, что метод имеет ряд недостатков: тест не чувствителен в отношении M. bovis, которая может вызывать болезнь у человека в 5-15% случаях от всех форм заболеваний, а также при атипичных МБТ, при вялотекущей инфекции, на ранних стадиях, при ограниченных формах, у больных с тяжелыми формами и иммунодефицитными состояниями ДСТ может давать ложноотрицательный результат (Menzies Т., Pai M., Comstock G. Meta-analisis: New tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research march / T. Menzies, M. Pai, G. Comstock // Annals. Intern. Med. - 2007. - Vol. 146 - P. 340-354).

Проведенные исследования показали, что специфические пробы с туберкулином и диаскинтестом для диагностики туберкулезной инфекции у детей обладают низкой информативностью. Оценивая информативность пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л, на амбулаторном этапе установлена ее низкая специфичность (27%) за счет высокого уровня поствакцинальной аллергии и невысокая чувствительность (57,7%), и, кроме того, выявлена невысокая информативность пробы с Диаскинтестом, несмотря на высокий уровень ее специфичности (96,7%). Чувствительность теста составила 23,5% (за счет большой доли ложноотрицательных результатов среди инфицированных МВТ) (Плеханова М.А. Проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л и/или проба с Диаскинтестом? // Сборник материалов XVII Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 14-16 февраля 2014 г. - М., 2014. - С. 259).

Известен иммунологический метод определения уровня интерферона-гамма (ИФН-γ) с помощью ИФА. Роль ИФН-γ в противотуберкулезном иммунитете подтверждена тяжелым течением микобактериальных инфекций у мышей - нокаутов по гену ИФН-γ (Dalton D.K., Pitts-Meek S., Keshav S. et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes // Science. 1993. - Vol. 259, №5102. - P. 1739-1742) и развитием тяжелых микобактериозов с летальным исходом у людей с генетически обусловленным полным или частичным дефицитом рецептора к ИФН-γ (Jouanguy Ε., Doffinger R., Dupuis S. et al. IL-12 and IFN-gamma in host defense against mycobacteria and salmonella in mice and men // Curr. Opin. Immunol. 1999. - Vol. 11, №3. - P. 346-351). Течение туберкулезной инфекции у людей также сопровождается продукцией ИФН-γ антигенспецифическими клетками. Основанием для клинического применения сывороточного ИФН-γ явились сведения о его сниженной продукции при туберкулезе, 380±147,8 пг/мл (490±54,9 пг/мл у здоровых). Эффективная химиотерапия способствует отчетливому повышению уровня ИФН-γ (р<0,02) по сравнению с исходными данными (Кузнецов В.П., Маркелова Е.В., Федянина Л.Н. Природные препараты альфа-интерферона и цитокинов в практике врача-фтизиатра: реферативный обзор №1. - М., 1999. - 59 с.; Хасанова P.P., Воронкова О.В., Уразова О.И. и др. Роль цитокинов в модуляции субпопуляционного состава лимфоцитов крови у больных туберкулезом легких // Пробл. туб. - 2008. - №3. - С. 31-34). В то же время по некоторым наблюдениям у больных туберкулезом, особенно при благоприятном течении процесса, может отмечаться и высокий уровень сывороточного ИФН-γ. Учитывая данные факты, трудно говорить о диагностической значимости уровня сывороточного ИФН-γ при оценке активности туберкулезной инфекции.

В отличие от сывороточного уровня ИФН-γ, количество Т-лимфоцитов, содержащих внутриклеточный ИФН-γ, у больных туберкулезом повышено по сравнению со здоровыми донорами и носителями латентной инфекции (Veenstra H., Crous I., Brahmbhatt S. et al. Changes in the kinetics of intracellular IFN-gamma production in ТВ patients during treatment // Clin. Immunol. 2007. - Vol. 124, №3. - P. 336-344). Данные о высоком содержании ИФН-γ-продуцирующих лимфоцитов у больных активным туберкулезом позволяют считать, что количество ИФН-γ-продуцирующих клеток может являться мерой микобактериальной нагрузки и использоваться для диагностики туберкулеза. В качестве специфических индукторов в диагностических целях (в первую очередь в клеточных тестах in vitro) используют антигены МБТ, в частности ESAT-6 (ранний секретируемый антиген), CFP-10 (белок культурального фильтрата), закодированные в зоне RD-1 - ТВ7.7 (р4) генома М. tuberculosis, и, что важно, они экспрессируются при размножении МБТ и отсутствуют в M. bovis BCG (Prospective comparison of the tuberculin skin test and two whole-blood interfero-gamma release assaya in person with suspected tuberculosis / G. Mazurek [et al.] // Clin. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 45. - P. 837-845). В связи с этим гибрид двух антигенов - ESAT-6 и CFP-10 был использован при разработке специфических диагностических тестов, основанных на продукции ИФН-γ в ответ на стимуляцию этими антигенами (IGRA - Interferon Gamma Release Assays) (The prognosis of latent tuberculosis: can disease be predicted? // P. Andersen [et al.] // Trends. Mol. Med. - 2007. - Vol. 13, №5. - P. 175-182). Один из методов (сертифицированная в России коммерческая тест-система QuantiFERON-TB Gold (QFT-G) производства Cellestis, Австралия) использует твердофазный иммуносорбентный анализ для измерения антигенспецифической продукции ИФН-γ циркулирующими Т-клетками в цельной крови (Lalvani Α., Millington K.А. Τ Cells and Tuberculosis: Beyond Interferon-gamma // J. Infect. Dis. 2008. - Vol. 197. - P. 941-3; Pai M., Zwerling Α., Menzies D. Systematic Review: T-Cell-Based Assays for the Diagnosis of Latent Tuberculosis Infection: An Update // Annals. Internal, medicine. 2008. - Vol. 149, №3; Ferrara G., Losi M. et al. Routine Hospital Use of a New Commercial Whole Blood Interferon-gamma Assay for the Diagnosis of Tuberculosis Infection // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005. - Vol. 172, №5. - P. 631-5; Ferrara G., Losi M. et al. Use in routine clinical practice of two commercial blood tests for diagnosis of infection with Mycobacterium tuberculosis: a prospective study // Lancet. 2006. - Vol. 367. - P. 1328-34). При постановке реакции рекомендуется короткое время экспозиции - 24 часа, поэтому тест в основном используется как скрининговый при отборе для более детального обследования на туберкулез, что не исключает получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Считается, что применение строго специфичных антигенов повышает специфичность, но значительно уменьшает чувствительность анализа (Perfomanse of purified antigens for serodiagnosis of pulmonary tuberculosis: a meta-anaiysis / K. Steingardt [et al.] // Clin. And Vaccine Immunol. - 2009. - Vol. 16. - P. 260-276). Тесты IGRA оказались чувствительными (от 58% до 96,7%) и специфичными (до 99%), (Tuberculin skin testing and in vitro T-cell responses to ESAT 6 and culture filtrate protein 10 after infecton with Mycobacterium marinum or M. Kansasii / S. Arend [et al.] // J. Infect. Dis. - 2002. - Vol. 186. - P. 1797-1807; Comparison of T-cell-based assay with tuberculin skin test for diagnostic of Mycobacterium tuberculosis infection in a school tuberculosis outbreak / K. Ewer [et al.] // Lancet. - 2003. - Vol. 361. - P. 1168-1173; Фтизиатрия. Национальное руководство: с прил. на компакт-диске / Ассоц. мед. о-в по качеству, Рос. о-во фтизиатров; ред. М.И. Перельман.- М.: Гэотар-Медиа, 2010. - 504 с.: ил.; Pinto L.M. Immunodiagnosis of tuberculosis: State of the Art / L.M. Pinto, J. Grenier, S.G. Schumacher // Med. Princ. Pract. - 2012. - №21. - P. 4-13).

Низкую чувствительность иммунодиагностических методов, например QuantiFERON GOLD in Tubes (Q-GIT), можно объяснить тем, что тест имеет один общий антиген (АГ) с вакциной БЦЖ (ТВ7.7) и два других антигена (CFP10 и ESAT-6), отсутствующих в вакцине, из-за высокой инфицированности населения туберкулезом и широкой распространенности специфической профилактики вакциной БЦЖ.

Для повышения специфичности и чувствительности ИФА продолжаются поиски более специфичных антигенов, в том числе полученных генно-инженерным путем (Al-Zamel F.A. Detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis / F.A. Al-Zamel // Expert Rev Anti Infect Ther. - 2009. - Vol. 7, №9 - P. 1099-1108). Так ESAT-6 (Rv3875) - антиген, принимающий участие в обеспечении жизнеспособности и распространении МБТ in vivo (Chapman AL, Munkanta M, Wilkinson KA et al. Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIV-positive individuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis-specific Τ cells. AIDS 2002; 16: 2285-93.), экспрессируется на ранней стадии инфекции. В экспериментах, проведенных на мышах, выявлена его протективная активность. Антитела к нему присутствуют в сыворотке крови большинства инфицированных МВТ пациентов. В ранних экспериментах установлено, что антитела к нему ассоциированы не с наличием самих поражений, а с риском развития таковых. Как следствие, их можно считать маркером латентной инфекции МВТ (Silva V.M., Kanaujia G., Gennaro M.L., Menzies D. Factors associated with humoral response to ESAT-6, 38 kDa and 14 kDa in patients with a spectrum of tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 2003, 7, 478-484.). Группа ученых под руководством профессора П. Андерсена (2011) обнаружила шесть генов, экспрессия которых не зависела от стадии инфекции, и продуктом одного из этих генов являлся белок Rv2660c, при этом сам по себе белок Rv2660c обладает низкой имунногенной активностью и считается белком латентной стадии туберкулезной инфекции (Aagaard С, Hoang Т., Dietrich J., Cardona P.J., Ιzzο Α., Dolganov G., Schoolnik G.K., Cassidy J.P., Billeskov R., Andersen P. A multistage tuberculosis vaccine that confers efficient protection before and after exposure. Nat. Med. 2011; 17 (2): 189-194).

Таким образом, перечисленное обосновывает необходимость поиска высокоэффективных, доступных методов исследования, позволяющих подтвердить или опровергнуть специфическую природу на ранней стадии инфекционного процесса.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является способ оценки активности туберкулеза у детей и подростков (Способ оценки активности туберкулеза у детей и подростков. RU 2498311 С2 / Ю.И. Пацула, М.А. Плеханова, А.В. Мордык, О.С. Глинских // Бюл. - №31. - 10.11.2013. - 9 с.), включающий оценку состояния специфического клеточного иммунитета с помощью модифицированной реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с туберкулином (ППД-Л) и иммуноферментного анализа (ИФА) с определением уровня интерферона-гамма (ИФН-γ) с ППД-Л.

К недостаткам данного метода можно отнести тот факт, что в качестве индуктора специфического клеточного ответа используют только туберкулин.

Техническим результатом изобретения является повышение информативности и сокращение времени диагностики латентной и активной туберкулезной инфекции у детей и подростков.

Заявленный технический результат достигается тем, что способ оценки активности туберкулезной инфекции у детей и подростков включает получение цельной крови пациента, внесение в пробы крови специфических антигенов: ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибридного белка CFP10-ESAT-6, определение уровня ИНФ-γ в пробах методом ИФА через 72 часа после внесения в кровь специфических антигенов, и при увеличении уровня ИФН-γ - положительной реакции на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и отрицательной - отсутствие изменения уровня ИФН-γ - на гибрид CFP10-ESAT-6 диагностируют латентную туберкулезную инфекцию, при положительной на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и гибрид CFP10-ESAT-6 - активную туберкулезную инфекцию, при положительной на ППД-Л и отрицательной одновременно на Rv2660c, ESAT-6, гибрид CFP10-ESAT-6 - поствакцинальную аллергию.

Поставленная задача решается тем, что сначала осуществляют получение цельной крови исследуемого пациента, например, путем взятия периферической крови пациента. Кровь гепаринизируют. Гепаринизированную кровь (25 ЕД гепарина на 1 мл крови) в количестве 0,02 мл инкубируют во влажной камере термостата или CO2-инкубатора в стерильных условиях, в круглодонных иммунологических планшетах, в 0,120 мл полной ростовой среды (ПРС) (среда 199, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамин (2 mM), HEPES (10 mM), гентамицина сульфат 50 мкг/мл) - контрольный образец крови. Опытные образцы крови (их четыре) по 0,02 мл крови также культивируют в 0,120 мл ПРС, содержащей внесенные туда специфические антигены: ППД-Л (первый образец), Rv2660c (второй образец), ESAT-6 (третий образец), гибридный белок CFP10-ESAT-6 (четвертый образец) в качестве индукторов ИФН-γ в разведении 50 мкг/мл в течение 72 часов. Отдельная проба соответствует отдельному антигену. Из полученных контрольного образца и образцов крови со специфическими антигенами ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибрид CFP10-ESAT-6 отбирают супернатанты (надосадок) и используют их для количественного определения ИФН-γ спектрофотометрически с помощью ИФА тест-систем, предназначенных для определения ИФН-γ. При наличии ответа (повышения уровня ИФН-γ в образце по сравнению с контрольным) после стимуляции специфическими антигенами результат расценивают как положительную реакцию, при его отсутствии - как отрицательную (отсутствие повышения уровня ИФН-γ в образце по сравнению с контрольным). При оценке ИФН-γ учитывают реакцию на определенный специфический антиген. Так, при положительной реакции на ППД-Л в сочетании с Rv2660c, ESAT-6 и отрицательной на гибридный белок CFP10-ESAT-6 диагностируют латентную туберкулезную инфекцию, при положительной на ППД-Л с гибридом CFP10-ESAT-6 - активную туберкулезную инфекцию, при положительной на ППД-Л и отрицательной одновременно на Rv2660c, ESAT-6, гибрид CFP10-ESAT-6 - поствакцинальную аллергию.

Разработанный способ позволяет повысить информативность ИФА для ИФН-γ. При выполнении теста исключены потери Т-лимфоцитов и других клеток крови, принимающих участие в реакции (макрофаги), использовано несколько антигенов (ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибрид CFP10 и ESAT-6), для установления активности туберкулезной инфекции определяют максимальное количество выделяемого клетками ИФН-γ. Отличительным признаком предлагаемого способа является: использование нескольких антигенов (ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибридный белок CFP10-ESAT-6) для индукции клеток цельной крови в течение 72 часов.

В исследовании была определена высокая специфичность и чувствительность способа оценки активности туберкулезной инфекции у детей и подростков. Для латентной туберкулезной инфекции специфичность составила 100%, чувствительность - 90,9%. Для активной туберкулезной инфекции специфичность - 90,9% и чувствительность - 95,8%.

Нами было проведено исследование по информативности предложенного способа оценки активности туберкулезной инфекции у детей и подростков.

Исследование проведено на клинической базе КУЗ ОО «Специализированная детская туберкулезная клиническая больница» и БУЗ ОО «Городская детская клиническая больница №2 имени В.П. Бисяриной», было включено 37 детей в возрасте от 1 года до 17 лет. Дети были распределены на 3 группы по результатам комплексного обследования (анамнестическим и клиническим данным, результатам туберкулинодиагностики, диаскинтеста, рентгенографии или мультиспиральной компьютерной томографии):

- первую группу сравнения (1-я группа) составили 23 пациента с установленным диагнозом туберкулеза;

- вторую группу (2-я группа) составили 11 пациентов с исключенным локальным туберкулезным процессом (латентная туберкулезная инфекция);

- третью группу (3-я группа) составили 3 пациента с поствакцинальной аллергией.

Среди детей 1-й группы регистрировали только туберкулез органов дыхания: инфильтративный туберкулез легких в 5 случаях (21,7%), первичный туберкулезный комплекс в 8 (34,8%), туберкулез внутригрудных лимфатических узлов в 10 (43,5%), в том числе в фазе инфильтрации у 16 пациентов (69,5%), в фазе распада у 1 (4,4%), в фазе обсеменения у 1 (4,4%), кальцинации у 5 (21,7%).

Дополнительно всем детям было проведено специфическое иммунологическое исследование (после получения информированного согласия родителей или их законных представителей). Исследование включало определение ИФН-γ после индукции специфическими антигенами: ППД-Л, CFP 32 В, Rv2660c, ESAT-6, 85, гибридный белок CFP10-ESAT-6. Оценку уровня специфического ИФН-γ проводили по определению индекса стимуляции (и.с.) и в пг/мл. Полученные результаты отражены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, уровень ИФН-γ, индуцированного специфическими антигенами у детей с поствакцинальной аллергией, латентной туберкулезной инфекцией и больных туберкулезом, различался.

При специфическом иммунологическом обследовании 1-й группы регистрировали положительную реакцию у большей части детей после стимуляции ППД-Л (100%) и гибридом CFP10-ESAT-6 (95,7%, во 2-й группе у 9,1%, χ2=21,674; р=0,0001) и высокий уровень показателя ИФН-γ, который был достоверно выше, чем у пациентов 2-й группы (р<0,05).

Во 2-й группе пациентов чаще регистрировали положительную реакцию после стимуляции Rv2660c и ESAT-6 (90,9%, в 1-й группе 52,2%, χ2=3,340; р=0,068) и повышенный уровень синтеза ИФН-γ по сравнению с результатами 1-й группы (р<0,05). Также во 2-й группе пациентов установили положительную реакцию после стимуляции ППД-Л (100%) и низкий уровень показателя ИФН-γ, достоверно отличающийся от результатов в 1-й группе (р<0,05). Среди основной части детей 2-й группы (90,9%) после стимуляции гибридом CFP10-ESAT-6 регистрировали отрицательную реакцию (р<0,05). При оценке уровня ИФН-γ после стимуляции CFP 32 В и 85 антигенами, статистически значимых различий между показателями в 1-й и 2-й группах не установлено (р>0,05), как и в частоте регистрации положительных или отрицательных реакций. Следовательно, данные антигены диагностического значения для определения активности туберкулезной инфекции у детей не имели.

У детей 3-й группы регистрировали положительные реакции после стимуляции туберкулином (100%), при этом по среднему уровню показатель ИФН-γ не имел значимых различий с аналогичным показателем в группах сравнения (р>0,05), что подтверждает незначительную информативность теста с туберкулином при дифференциальной диагностике поствакцинальной и инфекционной аллергии. После стимуляции другими специфическими антигенами: CFP 32В, Rv2660c, ESAT-6, гибридным белком CFP10-ESAT-6 регистрировались отрицательные реакции. Уровень показателя ИФН-γ после стимуляции антигеном не имел статистически значимых различий в группах сравнения (р>0,05). По данным H.G.Wiker и M.Harboe (1992) 85 антиген проявляет высокую перекрестную реактивность с антигенами практически всех микобактерий (Wiker H.G., Harboe M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiol Rev, 1992, 56, 648-661), с этим связан высокий процент неспецифических результатов иммунологических тестов, проводимых с его применением.

Полученные результаты исследований по определению ИФН-γ после индукции клеток цельной крови специфическими антигенами: ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибридным белком CFP10-ESAT-6 позволяют утверждать, что у детей с положительной реакцией на ППД-Л в сочетании с Rv2660c, ESAT-6 и отрицательной на гибрид CFP10 и ESAT-6 отсутствует активная туберкулезная инфекция (латентная), а при положительной на ППД-Л с гибридом CFP10-ESAT-6 имеет место активная туберкулезная инфекция. При положительной реакции на ППД-Л и отрицательной одновременно на Rv2660c, ESAT-6, гибрид CFP10-ESAT-6 - отсутствует как латентная, так и активная туберкулезная инфекция (поствакцинальная аллергия). Это позволит данные специфические антигены применять как в диагностике латентной и активной туберкулезной инфекции, так и в диагностике поствакцинальной и инфекционной аллергии.

Примерами информативности определения специфического ИФН-γ при латентной и активной туберкулезной инфекции у детей может служить следующий клинический пример.

Пример. Данил М., 13.03.08 г., направлен на консультацию в ПТД с диагнозом: Вираж туберкулиновых проб? по результатам туберкулинодиагностики в июле 2012 г. (инфильтрат 6 мм). Из анамнеза жизни известно, что ребенок неорганизованный, из социально-сохранной семьи, в течение года регистрировали до 4 эпизодов острых респираторных заболеваний, аллергический анамнез не был отягощен. Контакт с больным туберкулезом не установлен. По результатам вакцинации против туберкулеза (2008 г.) регистрировали формирование рубца 3 мм, проба Манту с 2 ТЕ ГГЛД-Л через год после вакцинации - инфильтрат 3 мм, что свидетельствовало о малой эффективности вакцинации. В динамике по результатам туберкулинодиагностики отметили сохранение сомнительной реакции на туберкулин. В 2012 г. взят на учет в ПТД по «6А» группе диспансерного учета, проведенный объем исследований свидетельствовал об отсутствии формирования локального туберкулеза. При взятии на учет регистрировали положительную реакцию на Диаскинтест от августа 2012 г. - инфильтрат 4 мм. Рекомендована и проведена противотуберкулезная терапия 2 ПТП 6 мес. По результатам контрольного обследования: проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л от 15.03.13 г. - инфильтрат 8 мм, проба с Диаскинтестом от 15.03.13 г. отрицательная. При обследовании для снятия с учета по результатам пробы с Диаскинтестом от 13.09.13 г. - инфильтрат 4 мм. Учитывая положительный результат теста, повторно проведена МСКТ ОГК - без отрицательной динамики. Ребенок был оставлен под наблюдением. В 2014 г. по результатам Диаскинтеста отметили нарастание чувствительности (инфильтрат 12 мм), проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л - инфильтрат 10 мм, МСКТ ОГК без изменений, была исключена внелегочная локализация специфического процесса. Контакт с больным туберкулезом не был установлен. С целью уточнения активности туберкулезной инфекции и решения вопроса о повторном курсе противотуберкулезной терапии провели специфическое иммунологическое исследование, определение ИНФ-γ после стимуляции специфическими антигенами (08.08.2014): зарегистрировали положительную реакцию на ППД-Л в сочетании с Rv2660c, ESAT-6 и отрицательную на гибридный белок CFP10-ESAT-6, что подтвердило отсутствие активной туберкулезной инфекции (латентная). На основании полученных результатов комплексного обследования установили отсутствие активной туберкулезной инфекции, ребенок был снят с учета с диагнозом: Тубинфицирование, что подтвердило дальнейшее профилактическое наблюдение за ребенком.

По нашему мнению, учитывая высокую специфичность и чувствительность предложенного способа, его включение в комплексное обследование позволит повысить эффективность дифференциальной диагностики латентной и активной туберкулезной инфекции у детей, что будет способствовать ранней постановке диагноза, своевременному назначению специфического лечения.

1. Способ оценки активности туберкулезной инфекции у детей и подростков, включающий получение цельной крови пациента, внесение в пробы крови специфических антигенов: ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибридного белка CFP10-ESAT-6, определение уровня ИФН-γ в пробах через 72 часа после внесения в кровь специфических антигенов, и при увеличении уровня ИФН-γ - положительной реакции на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и отрицательной - отсутствие изменения уровня ИФН-γ - на гибрид CFP10-ESAT-6 диагностируют латентную туберкулезную инфекцию, при положительной на ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6 и гибрид CFP10-ESAT-6 - активную туберкулезную инфекцию, при положительной на ППД-Л и отрицательной одновременно на Rv2660c, ESAT-6, гибрид CFP10-ESAT-6 - поствакцинальную аллергию.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение уровня ИФН-γ в пробах проводят методом ИФА.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед определением уровня ИФН-γ в пробах крови их культивируют 72 часа.

4. Способ по п. 1 или 3, отличающийся тем, что определение ИФН-γ осуществляют в супернатанте проб крови, образующемся при их культивации.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус краснухи.
Изобретение относится к медицине. Способ характеризуется тем, что в сыворотке крови пациента определяют концентрации пепсиногенов I и II, вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II.
Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения иммуноферментной тест-системы для определения эпитопов оболочечного белка вируса Пуумала протективной направленности в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования формирования окклюзионной постгеморрагической гидроцефалии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы.
Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к тест-системам для определения содержания микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду в окружающей среде, в том числе в пыли помещений, и может быть использовано для оценки пирогенности объектов окружающей среды при проведении экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью количественного определения пирогенной нагрузки пыли окружающей среды при помощи ингибиторного иммуноферментного анализа на твердой фазе.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для дооперационного прогноза осложненного течения раннего посттрансплантационного периода.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis.
Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и может быть использовано для прогнозирования тяжести течения послеоперационного периода у больных калькулезным холециститом.
Наверх