Средство, обладающее нейропротекторным действием в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения
Владельцы патента RU 2586301:
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена" (РГПУ им. А.И. Герцена) (RU)
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ВолгГМУ) (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и представляет собой средство, обладающее нейропротекторным действием в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения, характеризующееся тем, что оно включает 4-амино-3-фенилбутановую кислоту, L-аргинин гидрохлорид, при этом мольное соотношение 4-амино-3-фенилбутановой кислоты и указанного L-аргинина гидрохлорида составляет 1:2. Изобретение обеспечивает расширение арсенала малотоксичных средств, обладающих нейропротекторным действием в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения. 5 табл.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и касается средств, содержащих производные гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), обладающих нейропротекторным действием в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения.
Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) является важнейшим тормозным нейромедиатором центральной нервной системы млекопитающих, восстанавливает процессы метаболизма в головном мозге. Она повышает продуктивность мышления, улучшает память и используется, в основном, для лечения сосудистых заболеваний головного мозга [1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: «Новая волна». 2012; 2. Раевский К.С Нейрофармакологические и нейрохимические аспекты / К.С.Раевский, В.П. Георгиев // Медиаторные аминокислоты 1986. М.: «Медицина».- 165 с.; 3. Ковалев Г.В. Ноотропные средства. Волгоград. Нижне-Волжское книжное издательство. 1990. 368 с.]. Известно средство, обладающее антиишемической, гипотензивной, противоаритмической и ноотропной активностью, включающее производное ГАМК 4-амино-3-фенилбутановую кислоту и глутаминовую или никотиновую кислоты (RU №2216322). Полученное средство имеет меньшую токсичность, чем ее компоненты, оказывают более выраженное антиангинальное и противоаритмическое действие, снижают артериальное давление (RU №2216322). Нейропротекторное действие композиции в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения не описано. Известно также, что соли 4-амино-3-фенилбутановой кислоты обладают церебропротекторной активностью в условиях алкогольного и электроконвульсивного повреждения мозга (RU №2393855). Однако вышеперечисленные средства не нашли применения в терапии недостаточности мозгового кровообращения.
L-Аргинин - условно-незаменимая альфа-аминокислота, является природным L-изомером аминокислоты аргинина, необходимой для синтеза ряда белков и оксида азота (NO) - регулятора многих физиологических и патологических процессов [1. Львова О.А. и др. К вопросу о роли оксида азота в норме и при патологии нервной системы // Electronic scientific magazine "System integration in public health services". - 2011. - C. 20; 2. Andrew P.J., Mayer B. Enzymatic function of nitric oxide synthases // Cardiovascular research. - 1999. - T. 43. - №. 3. - C. 521-531]. L-Аргинин, как субстрат синтеза оксида азота, улучшает эндотелиальную функцию сосудов при сердечно-сосудистой недостаточности, сахарном диабете и гиперхолестеринемии [1. Бувалъцев В.И. Международ, мед. журнал. 2001 // Т. - Т. 3. - С. 9-14; 2. Марков X.М. Молекулярные механизмы дисфункции сосудистого эндотелия // Кардиология. - 2005. - Т. 45. - №. 12. - С. 62-72].
L-Аргинин входит в состав композиций, обладающих эндотелиопротективным, вазодилатирующим и ангиопротекторным эффектом (RU 2464019). Известно также, что L-аргинин разрешен в виде биологически активной добавки (Вазотон) при лечении сахарного диабета второго типа, физических и умственных перегрузках, атеросклерозе и др. [http://www.rlsnet.ru/baa_tn_id_31639.htm].
Нейропротекторное действие L-аргинина в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения неизвестно.
Проблема профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями мозгового кровообращения в результате травм головного и спинного мозга, с увеличением психических нагрузок, со значительным распространением психических расстройств у взрослых и детей, остается одной из актуальных задач современной медицины. В этой связи особый интерес представляют препараты, обладающие нейропротекторным действием к внешним факторам, повреждающим процессы деятельности мозга, а также способные улучшать качество его высших функций (мышление, память, внимание) [Мирзоян Р.С. Нейропротекторные и цереброваскулярные эффекты ГАМК-миметиков // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003. - Т. 66. - №. 2. - С. 53-56]. На современном этапе известно значительное число представителей лекарственных препаратов разных классов, обладающих нейропротекторным действием. Однако несмотря на широкий спектр лекарственных средств, применяющихся для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения, эффективность их остается низкой [Путилина М. В. Особенности комбинированной нейропротекторной терапии острых нарушений мозгового кровообращения // РМЖ. - 2009. - Т. 17. - №. 4. - С. 261-6].
В настоящее время в качестве нейропротекторного средства широкое распространение в практической медицине получил препарат пирацетам. Он является представителем группы ноотропных препаратов. Оказывает положительное влияние на обменные процессы и кровообращение мозга. Пирацетам применяют при разных заболеваниях центральной нервной системы, особенно связанных с сосудистыми нарушениями и патологией обменных процессов головного мозга, в том числе у людей пожилого и старческого возраста. Однако по многим общим фармакологическим тестам он имеет невысокую эффективность. Кроме того, пирацетам вызывает ряд существенных побочных эффектов: повышенную раздражительность, депрессию, нарушение сна, диспепсические расстройства, обострение коронарной недостаточности у больных пожилого возраста [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: «Новая волна». 2012].
Поэтому поиск и разработка новых высокоэффективных средств с широким спектром нейропротекторного действия, безопасных при длительном применении, позволяющих осуществлять фармакологическую коррекцию совокупности симптомов ишемического нарушения мозгового кровообращения и избежать необходимость одновременного назначения нескольких лекарств, по-прежнему остается одной из актуальных задач современной фармакологии и терапии ишемических нарушений мозгового кровообращения.
Задача изобретения - получить высокоэффективное и малотоксичное производное ГАМК, обладающее нейропротекторным действием в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения и расширить ассортимент подобных средств.
Поставленная задача реализуется предлагаемым комбинированным средством, включающим 4-амино-3-фенилбутановую кислоту и L-аргинин гидрохлорид. Причем соотношение 4-амино-3-фенилбутановая кислота: L-аргинин гидрохлорид как 1:2 (АФБАГ). При этом получают средство, обладающее комплексом нейропротекторных свойств в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения, превышающих таковые или отсутствующие у исходного вещества и ряда известных лекарственных средств целевого назначения.
Лекарственное средство содержит эффективную дозу композиции 4-амино-3-фенилбутановой кислоты с L-аргинином гидрохлоридом и фармакологически приемлемые носители и целевые добавки.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в том, что предлагаемое средство малотоксично и способно оказывать нейропротекторное действие в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример
В шаровую мельницу загружают 12.5 г (0.07 моль) 4-амино-3-фенилбутановой кислоты и 29.4 (1.4 моль) L-аргинина гидрохлорида. Смесь тщательно перемешивают в течение 0,5-1 часа, затем выгружают полученный продукт. Выход количественный.
Полученное таким образом комбинированное средство было изучено в опытах на животных.
Далее приводятся примеры, иллюстрирующие специфическую активность композиции 4-амино-3-фенилбутановой кислоты (АФК) с L-аргинином гидрохлоридом (АГХ).
Для изучения нейропротекторного действия композиции АФБАГ в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения использовали модель острого нарушения мозгового кровотока (ОНМК), вызванного одномоментной билатеральной окклюзией общих сонных артерий [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. Животным под эфирным наркозом была осуществлена одномоментная двусторонняя перевязка общих сонных артерий (ОСА) с регистрацией количества выживших животных через 6, 12, 24, 48 и 72 часа после операции.
Для выявления нейропротекторного действия композиции АФБАГ использовали тесты, позволяющие оценить неврологический статус животных в постишемический период: неврологический дефицит, спонтанное двигательное, и ориетировочно-исследовательское поведение, мнестическая функция [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с].
Обработка полученных данных проводилась с использованием статистических методов оценки результатов исследования, которые позволяют оценить степень фармакологической эффективности.
В работе были использованы белые беспородные крысы-самцы линии Вистар, рандомизированные по возрасту (четыре месяца) и массе (220-240 г), содержавшиеся в условиях лабораторного вивария, на стандартном пищевом рационе, при свободном доступе к воде и естественном световом режиме. Приводимые в таблицах значения показателей представляют собой среднестатистическую оценку результатов измерения параметров с учетом принятых уровней достоверности (р<0,05).
Острая токсичность (LD50 мг/кг) композиции 4-амино-3-фенилбутановой кислоты с L-аргинином гидрохлоридом (АФБАГ) оценивалась по выживаемости белых мышей через 24 часа после внутрибрюшного введения средства и составляет>2000 мг/кг, что позволяет классифицировать исследуемое вещество как малотоксичное. Для сравнения, острая токсичность пирацетама составляет 12000 мг/кг [Оганисян А.Ш. и др. Производные конденсированных тиенопиримидинов. Синтез и нейротропные свойства новых производных пирано [4′, 3′: 4, 5] тиено [3, 2-е] триазоло [3, 4-b] пиримидинов //Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37. - №. 1. - С. 15-16].
Экспериментальное изучение эффективности заявляемой композиции АФБАГ в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения проводили в сравнении с каждым препаратом, входящим в состав композиции [4-амино-3-фенилбутановой кислотой (АФК), L-аргинином гидрохлоридом (L-АГХ)] и с препаратом сравнения пирацетамом.
Для проведения эксперимента были сформированы следующие группы животных: контрольная группа 1 - ложнооперированные животные, которым после подведения лигатуры под сосуды, общие сонные артерии не перевязывались - позитивный контроль; контрольная группа 2 - животные с одномоментной окклюзией сонных артерий, получавшие дистиллированную воду - негативный контроль; опытная группа 3 - животные с ишемией, получавшие композицию АФБАГ; опытная группа 4 - животные с ишемией, получавшие 4-амино-3-фенилбутановую кислоту (АФК); опытная группа 5 - крысы с ишемией, получавшие L -аргинин гидрохлорид (АГХ); опытная группа 6 - крысы с ишемией, получавшие препарат сравнения пирацетам.
Исследуемую композицию - АФБАГ в дозе 50 мг/кг, 4-амино-3-фенилбутановую кислоту (14,8 мг/кг), L-аргинин гидрохлорид (35,2 мг/кг), препарат сравнения пирацетам в дозе 800 мг/кг и воду вводили per os через 2 часа после начала операции и далее один раз в сутки на протяжении трех дней.
Неврологический дефицит в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения (табл. 1, 2)
Количество выживших животных и неврологический дефицит регистрировали через 6, 12, 24, 48 и 72 часа после операции перевязки артерий. Неврологический дефицит оценивали в баллах по шкале McGrow в модификации Ганнушкиной И.В. Спонтанное двигательное и ориетировочно-исследовательское поведение определяли в тесте «Открытое поле» (ОП).
Результаты эксперимента показали, что при перевязке общих сонных артерий у животных к 72-му часу наблюдений после операции показатель летальности был достоверно ниже у крыс опытной группы 3 по сравнению с животными контрольной группы 2 (табл. 1).
Таким образом, композиция АФБАГ обладает нейропротекторным действием в условиях ишемии мозга и по активности превосходит таковое у компонентов композиции АФК и L-АГХ и препарата сравнения пирацетама (табл. 1).
После окклюзии у групп испытуемых животных наблюдался неврологический дефицит в виде тремора, вялости одно- и двухсторонних полуптозов и птозов, манежных движений, парезов и параличей конечностей. При этом на протяжении всего периода наблюдения балл неврологического дефицита был наивысшим (от 9.5±0.1 до 8.4±0.2 балла) у животных контрольной группы 2 (табл. 2). У крыс опытной группы 3, получавших композицию АФБАГ до окклюзии, степень неврологического дефицита была значительно меньше (от 7.4±0.2 до 5.8±0.7), чем у животных контрольной группы 2. Пирацетам незначительно уменьшал проявления неврологического дефицита (от 7.8±0.2 до 7.2±0.7). При этом сравнительный анализ баллов неврологического дефицита у групп испытуемых животных показал, что его проявления у крыс опытной группы 3, получавших композицию АФБАГ, были существенно ниже, чем в контрольной группе 2 (табл. 2).
Спонтанное двигательное и ориетировочно-исследовательское поведение в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения (табл. 3)
Двигательное поведение животных в условиях ишемии головного мозга изучали в тесте «Открытое поле» (ОП) [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. Методика открытого поля используется для изучения влияния вещества на показатели спонтанного индивидуального поведения животных (двигательную, ориентировочно-исследовательскую активность и эмоциональный статус).
Эксперимент проводился в стандартном круглом манеже диаметром 97 см и высотой 42 см. Крысу помещали в центр камеры хвостом к экспериментатору и наблюдали за ее поведением в течение 3 минут. В тесте регистрировали: число пересеченных секторов на периферии, число пересеченных ярко-освещенных секторов, количество вертикальных стоек, количество заглядываний в отверстия. Количество пересеченных секторов характеризует спонтанную двигательную активность животных, сумма стоек и заглядываний в отверстия - суммарную ориентировочно-исследовательскую активность.
Результаты эксперимента в тесте «ОП» показали, что у животных опытной группы 3, получающих композицию АФБАГ, через 72 часа после операции статистически значимо повышалось количество пересеченных секторов (двигательная активность), число стоек и заглядываний в отверстия (ориентировочно-исследовательская активность), что указывает на наличие у заявляемой композиции значительного нейропротекторного действия (табл. 3). У животных опытной группы 6, получавших препарат пирацетам, показатели двигательной активности несколько меньше, чем у крыс, получавших композицию АФБАГ (табл. 3).
Таким образом, результаты эксперимента показали, что введение экспериментальным животным заявляемой композиции АФБАГ в условиях недостаточности мозгового кровообращения существенно повышает выживаемость животных и снижает выраженность их неврологического дефицита. Это показывает, что композиция АФБАГ обладает выраженным нейропротекторным действием, при этом компоненты ее состава (АФК и L-АГХ) значительно уступают по активности композиции АФБАГ (табл. 3).
Антиамнестическое действие композиции в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения (табл. 4, 5)
Оценку мнестической функции животных проводили в стандартных психоневрологических тестах: «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ), «Тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ) [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая/под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.].
Тест «Условнаяреакция пассивного избегания» (табл. 4)
Методика теста УРПИ позволяет оценить влияние веществ на формирование, сохранение и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения.
Обучение животных проводилось в установке, состоящей из двух смежных отсеков, один из которых размером 60×40×40 см открыт сверху и ярко освещен (1340 Лм). Другая камера с электрифицированным полом меньшего размера (15×15×15 см), затемненная, закрытая со всех сторон, и имеет отверстие (8×8 см) для сообщения с большим отсеком. Эксперимент выполнялся в два этапа: выработка у животных условного рефлекса пассивного избегания и воспроизведение памятного следа в динамике через 24 и 72 часа.
Во время обучения тестируемое животное помещали на середину площадки освещенного отсека, хвостом к отверстию в темный отсек. В течение трех минут за животным велось визуальное наблюдение. После каждого захода в темный отсек животному наносили электроболевое раздражение (40 В, 3 импульса по 1 сек, с интервалом 0,5 сек), животных, не заходящих в темную камеру за это время, из опыта исключали. На этапе обучения животных регистрировали следующие показатели: время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек (латентный период первого захода) и количество заходов в него.
Эксперимент воспроизведения памятного следа выполнялся следующим образом: обученное животное помещали на середину площадки освещенного отсека, хвостом к отверстию в темный отсек и в течение трех минут вели визуальное наблюдение за животным. После каждого захода в темный отсек животному не наносили электроболевую стимуляцию. На этом этапе регистрировали следующие показатели: латентный период первого захода, количество заходов в него и общее время нахождения животного в темном отсеке. В эксперименте сравнивали латентный период первого захода животных в темный отсек и количество заходов в него в тесте воспроизведения памятного следа с аналогичными показателями при обучении. Увеличение латентного периода и уменьшение числа заходов указывают на обученность животного и сохранность в памяти информации об аверсивности темного отсека. [Буреш Я. и др. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - Высш. шк., 1991]. Общее время нахождения в темном отсеке, регистрируемое при воспроизведениях навыка, также отражает сохранность памятного следа у животного - чем меньше времени животное проводит в темном отсеке, тем лучше оно помнит о нанесенном ему здесь электроболевом раздражении.
Введение композиции АФБАГ у животных опытной группы 3 с экспериментальной ишемией головного мозга на этапе воспроизведения навыка избегания через 72 часа после операции наблюдалось увеличение латентного периода захода животных в темный отсек, уменьшение количества заходов в него и времени пребывания в нем по отношению к контрольной группе 2 (табл. 4). Такое положительное влияние композиции КАФАГ на обучаемость и память животных, замедление угасания памятного следа в динамике свидетельствует о наличии нейропротекторного действия у заявляемой композиции.
«Тест экстраполяционного избавления» (табл. 5)
Методика теста ТЭИ позволяет оценить индивидуальные различия когнитивного стиля решения задачи (поиска пути активного избавления из аверсивной среды).
Обучение животных проводилось в цилиндрической емкости диаметром 35 см, заполненной водой с температурой 16-18°C. Емкость содержала пластиковый цилиндрический колпак, диаметром 9 см и высотой 23 см, края которого погружались в воду на 2.5 см. Эксперимент выполнялся в два этапа: выработка у животных условного рефлекса избавления и проверка сохранности навыка экстраполяционного избавления в динамике через 24 и 72 часа.
Во время обучения тестируемое животное помещали в емкость под колпак. В течение трех минут за ним велось визуальное наблюдение. Животные подныривали под края колпака и избавлялись, таким образом, от аверсивной водной среды. Не решившие задачу животные из опыта исключались. На этапе обучения животных регистрировали следующие показатели: время от момента погружения животного в воду до начала активного плавания (латентный период двигательной активности), время иммобилизации (животное пассивно плавает в воде со слегка поднятой головой, все четыре конечности неподвижны), количество прыжков в колпаке (активные попытки выпрыгнуть из воды) и время от момента погружения животного в воду до подныривания под края колпака (латентный период подныривания)
Эксперимент воспроизведения навыка экстраполяционного избавления у животных выполняли следующим образом: обученное животное помещали в аквариум под колпак. В течение трех минут за ним велось визуальное наблюдение. При оценке когнитивных функций регистрировали наиболее значимые показатели: латентный период двигательной активности (характеристика скорости ориентировочных реакций); латентный период подныривания (показатель способности к экстраполяции, чем меньше значение показателя, тем выше скорость решения экстраполяционной задачи). В эксперименте сравнивали показатели, определяющие степень обученности животного и состояние памяти: латентный период подныривания животного при обучении и воспроизведении навыка экстраполяционного избавления (чем значительнее он уменьшается при воспроизведении навыка, тем больше обученность животного и сохраннее памятный след).
При введении композиции АФБАГ животным опытной группы 3 с экспериментальной ишемией головного мозга на этапах воспроизведения навыка через 72 часа отмечалось статистически значимое уменьшение времени решения экстраполяционной задачи (табл. 5). При этом компоненты композиции АФК и L-АГХ и препарат сравнения пирацетам значительно уступали композиции АФБАГ по активности. Такое положительное влияние композиции АФБАГ на когнитивные функции у животных свидетельствует, что она обладает выраженным нейропротекторным действием в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения.
Таким образом, результаты экспериментов показали, что композиция 4-амино-3-фенилбутановой кислоты с L-аргинином (АФБАГ) обладает нейропротекторным действием в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения. При этом нейропротекторное действие ее более выражено, чем у ее компонентов 4-амино-3-фенилбутановой кислоты, L-аргинина гидрохлорида и препарата сравнения пирацетама. Введение композиции АФБАГ существенно увеличивает выживаемость крыс и снижает выраженность неврологических нарушений и когнитивного дефицита у животных, перенесших острое нарушение мозгового кровообращения. Она в значительной степени способна уменьшать последствия тяжелой гипоксии, связанной с нарушением мозгового кровообращения.
Приведенные данные фармакологической активности композиции АФБАГ делают весьма перспективной разработку на ее основе малотоксичного и эффективного нейропротекторного средства для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения различного генеза.
Средство, обладающее нейропротекторным действием в условиях ишемического нарушения мозгового кровообращения, характеризующееся тем, что оно включает 4-амино-3-фенилбутановую кислоту, L-аргинин гидрохлорид, при этом мольное соотношение 4-амино-3-фенилбутановой кислоты и указанного L-аргинина гидрохлорида составляет 1:2.