Питательная основа для получения питательной среды для выращивания продуцентов даунорубицина

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и может быть использовано при глубинном культивировании актиномицетов рода Streptomyces, являющихся продуцентами противоопухолевого антибиотика даунорубицина. Питательная основа для получения питательной среды содержит крахмал, соевую муку, (NH₄)₂C₄H₄O₆, (NH₄)₂SO_{4 ,} CaCO₃, K₂HPO₄, глюкозу, перфтордекалин и сорбитан моностеарат при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить выход биомассы актиномицетов рода Streptomyces и повысить выход даунорубицина. 2 табл.

 

I. Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицинской и промышленной микробиологии, биотехнологии, а также к сельскому хозяйству, а именно к питательным основам микробиологических питательных сред, и может быть использовано в практике микробиологических лабораторий и биотехнологических производств, основанных на культивировании актиномицетов рода Streptomyces, являющихся продуцентами противоопухолевого антибиотика даунорубицина.

II. Уровень техники

Известна питательная основа жидкой питательной среды, предназначенной для выращивания микроорганизмов-продуцентов антибиотиков, относящихся к роду Streptomyces, содержащая питательные вещества, г/л: крахмал - 30,0; соевая мука - 30,0; (NH₄)₂C₄H₄O₆ - 5,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; CaCO₃ - 8,0; K₂HPO₄ - 0,1; глюкоза - 15,0, которая по своему составу питательных веществ сходна с предлагаемой питательной основой и является аналогом предлагаемой питательной основы (Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов/ С.М. Семенов // М. - 1990. - 240 с.; Равилов А.З. Микробиологические среды / А.З. Равилов, Р.Я. Гильмутдинов, М.Ш. Хусаинов // Казань. - 1999. - 398 с.).

К недостаткам данной питательной основы следует отнести слабый уровень транспорта к микробным клеткам питательных веществ и газов, что, в конечном итоге, приводит к замедлению роста микробных культур, снижению урожая микробных клеток и уменьшению продукции антибиотиков.

Наиболее близкими к заявляемой питательной основе прототипами, являются питательная основа для соевой среды с добавлением для активации биосинтеза в качестве одного из компонентов 0,2-25,0 об.% перфторана (ПФ, кровезаменитель, содержащий 10 об.% перфторуглеродов) или перфторорганических соединений с газотранспортной функцией (Бакулин М.К. и др. Влияние перфторорганических соединений на рост стрептомицетов и биосинтез ими антибиотика даунорубицина. - Антибиотики и химиотерапия, - 2003, Т. 48, №12. - С. 5-8). Питательная основа соевой среды, содержащая в своем составе перфторорганические соединения, обеспечивает улучшение питания микроорганизмов при культивировании актиномицетов рода Streptomyces и выход целевого метаболита - противоопухолевого антибиотика даунорубицина.

Общим с заявляемой средой является использование в составе питательной среды одинаковых питательных компонентов, обеспечивающих питание микроорганизмов, и перфтордекалина, являющимся лучшим транспортным компонентом из перфторорганических соединений, включаемых в состав перфторана или микробиологических сред.

Существенным недостатком питательной основы-прототипа, включающим перфтордекалин без эмульгатора и проведения предварительного эмульгирования соединения является то, что в ходе глубинного культивирования при перемешивании жидкой среды, в состав которой входит питательная основа, образуются относительно крупные капли (10 мкм и более) эмульсии перфтордекалина, обладающие низкой агрегативной устойчивостью, что приводит к их коалесценции, а также неполноценному использованию перфтордекалина в составе микробиологической среды из-за относительно малой площади контакта образуемых крупных капель с питательными веществами и продуктами метаболизма, что уменьшает их возможности по транспорту питательных веществ и метаболитов при глубинном культивировании актиномицетов Streptomyces purpurogeniscleroticus, приводит к относительно низким выходам биомассы и противоопухолевого антибиотика даунорубицина.

Недостатком питательной основы-прототипа с перфтораном является то, что последний является дорогостоящим кровезаменителем, оптимизированным по составу для введения в кровеносное русло человека, содержит только 14% (процентное содержание ингредиентов в перфторане указано по массе) перфтордекалина и 6% перфторметилциклогексилпиперидина, которые участвуют в стимуляции роста и продуктивности микроорганизмов, остальные 80% его ингредиентов приводят к дисбалансу микробиологической питательной среды и негативно влияют на рост микробных культур, а один из его компонентов - эмульгатор проксанол 268 (содержащийся в перфторане в количестве 4%) напрямую подавляет развитие актиномицетов рода Streptomyces.

III. Сущность изобретения заключается в следующем.

Была поставлена задача - создать питательную основу микробиологической среды, обеспечивающую увеличение выхода биомассы актиномицетов рода Streptomyces и продуцируемого ими противоопухолевого антибиотика даунорубицина.

Поставленная задача решается путем включения в состав питательной основы предварительно эмульгированного в асептических условиях перфтордекалина с использованием в качестве стабилизатора и эмульгатора сорбитан моностеарата.

Сущность технического решения питательная среда для выращивания продуцентов даунорубицина поясняется следующим.

Перфтордекалин (ПФД, химическая формула - C₁₀F₁₈), ТУ 95-1233 - бесцветная прозрачная негорючая жидкость без запаха, с вязкостью 2,74 мм²·сСт^-1 при 25°C, плотностью 1,945 г/см³ и температурой кипения 155°С. ПФД не растворим в воде и в органических растворителях, не утилизируется микроорганизмами и является лучшим из перфторорганических соединений для использования в биотехнологических процессах (Перфторорганические соединения в биологии и медицине/ Под ред. Г.Р. Иваницкого и В.В. Мороза. - Пущино, 1999. - 286 с.; Иваницкий, Г.Р. Биофизика на пороге нового тысячелетия: перфторуглеродные среды и газотранспортные кровезаменители / Иваницкий Г.Р. // Биофизика. - 2001. - №1. - С. 5-33.; Иваницкий, Г.Р. Наноконтейнеры на основе перфторуглеродов с функцией переноса оксида азота / Иваницкий Г.Р. // Биофизика. - 2008. - №2. - С. 367-377).

Сорбитан моностеарат является пищевым эмульгатором и стабилизатором, который не ингибирует рост актиномицетов рода Streptomyces и обеспечивает высокую эмульгируемость перфтордекалина.

При приготовлении питательной основы микробиологической среды предварительно готовят концентрат стерильной стабилизированной эмульсии перфтордекалина путем смешивания (из расчета на 1 дм³ конечной питательной среды) 10 г перфтордекалина; 8 г глюкозы; 0,01 г сорбитана моностеарата, трехкратной стерилизации полученной смеси в автоклаве текучим паром по 30 мин 3 суток подряд, перемешивания (перед непосредственным внесением в питательную среду) с использованием предварительно стерилизованных перемешивающих устройств: гомогенизаторов, смесителей, миксеров - при вращении в них лопастей в диапазоне 1200-1500 об/мин в течение 10 мин, что обеспечивает получение стабилизированной эмульсии перфтордекалина с средними размерами частиц 20-80 нм.

Полученную стабилизированную эмульсию перфтордекалина используют для асептического внесения в предварительно стерилизованную в автоклаве в течение 30 мин при 121°C и охлажденную до комнатной температуры питательную основу, используемую при создании питательной среды для выращивания продуцентов даунорубицина, включающую на дм³ готовой среды следующее количество компонентов питательной основы, г: крахмал - 30,0; соевая мука - 40,0; (NH₄)₂C₄H₄O₆, - 5,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; CaCO₃ - 8,0; K₂HPO₄ - 0,1; глюкоза - 8,0; перфтордекалин - 10,0; сорбитан моностеарат - 0,01.

Наличие в питательной среде 1,0% (по массе) эмульгированного перфтордекалина эффективно поддерживает диффузию питательных веществ к растущим культурам микроорганизмов при перемешивании с барботажем среды воздухом (или газами), высокий уровень обмена субстратами и метаболитами между средой и микробными клетками. При этом в среде формируется система, в которой частицы перфтордекалина обеспечивают существенное повышение уровней диффузии и оптимальные условия для направленного перемещения потоков питательных веществ и клеточных метаболитов, что, в конечном итоге, приводит к увеличению интенсивности роста, увеличению урожая растущей микробной культуры и повышению выхода противоопухолевого антибиотика даунорубицина при культивировании актиномицетов рода Streptomyces.

В качестве продуцентов даунорубицина использовали штаммы актиномицетов Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 и ВБМ 81 при посевной концентрации клеток-продуцентов в рабочей суспензии - 0,5 мг/см³ (Антибиотики и химиотерапия. - 2003, №12. - С. 5-8; Биотехнология. - 2006, №5. - С. 39-44; Ветеринарная медицина. - 2010, №3-4. - С. 12-16. Бакулин М.К. и др.).

Предлагаемая питательная основа микробиологической среды для глубинного культивирования, содержащая следующие компоненты, г/дм³: крахмал - 30,0; соевая мука - 40,0; (NH₄)₂C₄H₄O₆ - 5,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; CaCO₃ - 8,0; K₂HPO₄ - 0,1; глюкоза - 8 и эмульгированный (с использованием - 0,01 сорбитана моностеарата) перфтордекалин - 10,0 (с средним размером частиц 20-80 нм), позволяет (таблицы 1 и 2) получать выходы биомассы актиномицетов S. purpurogeniscleroticus ВБМ 81 и S. purpurogeniscleroticus ВБМ 158 за один цикл культивирования в зависимости от использованного штамма в 2,9-3,2 раза и даунорубицина 2,5-3,5 раза больше, чем при культивировании на соевой среде (контроль 1, аналог), и в 1,4-2,1 раза и 1,2-1,8 раза больше, соответственно, чем при культивировании на среде с перфтордекалином (контроль 3, среда, являющаяся лучшим и наиболее близким прототипом).

Культивирование осуществляют в биологическом реакторе, например в ферментерах марок БИОР (Йошкар-Ола) или BIOSTAT В Plus (Sartorius) в режиме постоянного перемешивания и принудительной аэрации (расход воздуха: 0,5 объема воздуха на объем среды в минуту) при прочих равных условиях.

В качестве контрольных в составе сред использованы:

контроль 1 - питательная основа соевой среды, содержащая следующие компоненты, г/л: крахмал - 30,0; соевая мука - 30,0; (NH₄)C₄H₄O₆ - 5,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; CaCO₃ - 8,0; K₂HPO₄ - 0,1; глюкоза - 15,0;

контроль 2 - питательная основа соевой среды того же состава, что и в контроле 1, с добавлением 100,0 г/дм перфторана (коммерческий кровезаменитель, содержащий в соответствии с прописью производителя в данном объеме: 14 г перфтордекалина, 6 г перфторметилциклогексилпиперидина и 4 г проксанола; солей, мМ: NaCl - 102; NaCl - 4,8; MgCl₂ - 1,8; NaHCO₃ - 7,7; NaH₂PO₄ - 1,7; D-глюкоза - 11,0);

контроль 3 - питательная основа соевой среды (состава, аналогичного контролю 1) с добавлением 10,0 г/дм³ перфтордекалина, внесенного в среду без эмульгатора и эмульгирования;

контроль 4 - питательная основа соевой среды (состава, аналогичного контролю 1) с добавлением 10,0 г/дм³ перфтор-1,3-диметилциклогексана, внесенного в среду без эмульгатора и эмульгирования;

контроль 5 - питательная основа соевой среды (состава, аналогичного контролю 1) с добавлением 10,0 г/дм³ перфторметилдекалина, внесенного в среду без эмульгатора и эмульгирования;

(примеры 1 и 2, таблицы 1 и 2).

Питательная основа для получения питательной среды для выращивания продуцентов даунорубицина, содержащая крахмал, соевую муку, (NH₄)₂C₄H₄O₆, (NH₄)₂SO₄, CaCO₃, K₂HPO₄, глюкозу, перфтордекалин и сорбитан моностеарат при следующем соотношении компонентов, г/дм³:

крахмал	30
соевая мука	40
(NH4)2C4H4O6	5
(NH4)2SO4	4
CaCO3	8
К2НРО4	0,1
глюкоза	8
перфтордекалин	10
сорбитан моностеарат	0,01