Жидкость для отбора микробиологических проб при отрицательных температурах



Жидкость для отбора микробиологических проб при отрицательных температурах
Жидкость для отбора микробиологических проб при отрицательных температурах

 


Владельцы патента RU 2588481:

Российская федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской федерации (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации (ФГБУ "48 ЦНИИ" МО РФ) (RU)

Изобретение относится к области микробиологии, ветеринарии, пищевой и фармацевтической промышленности. Предложена смывная нейтрализующая жидкость для отбора проб микроорганизмов при отрицательных температурах. Жидкость содержит 7,5 мас.% гипосульфита натрия, пропиленгликоль - 30,0 мас.% или 40,0 мас.% и, по необходимости, 10 мас.% глицерина. Изобретение обеспечивают возможность отбора проб при температурах до -30°С. Срок хранения проб без ухудшения жизнеспособности микроорганизмов в нейтрализующей жидкости без глицерина увеличивается до 3 суток, с добавкой глицерина - до 10 суток. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к составам, используемым для установления присутствия и идентификации микроорганизмов, в том числе и в условиях отрицательных (до минус 30°С) температур. Изобретение может быть использовано в микробиологии, здравоохранении, ветеринарии, пищевой и фармацевтической промышленности, в интересах Министерства обороны и Министерства РФ по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий, а также в других областях науки и производства, где возникает необходимость определять уровень микробного загрязнения объектов и контролировать качество дезинфекционных мероприятий.

Отбор микробиологических проб с поверхностей различных объектов методом смыва осуществляют с использованием тампонов (салфеток). Каждый тампон смачивают смывной жидкостью (стерильной водой, 0,85% раствором хлорида натрия или жидкой питательной средой). Если пробы отбирают после дезинфекции, то в смывную жидкость добавляют нейтрализатор для прекращения действия остатков дезинфектанта [1-3].

Смывная нейтрализующая жидкость (СНЖ) должна удовлетворять следующим требованиям: полностью нейтрализовывать в пробах остатки дезинфектанта для прекращения его микробоцидного и статического действия, обеспечивать сохраняемость микроорганизмов в пробах, быть нетоксичной, а при работах в зимних условиях - не замерзать [1-3].

Срок хранения микробиологической пробы с момента отбора до начала ее обработки в лаборатории не должен превышать 2-4 часов [1, 4]. При возникновении чрезвычайных ситуаций, связанных с распространением патогенных микроорганизмов, либо при массовых вспышках инфекционных заболеваний количество микробиологических проб может намного превышать возможности специализированных лабораторий по их обработке, в результате чего срок хранения проб значительно увеличится (от 1 до 10 суток). Кроме того, при возникновении подобных чрезвычайных ситуаций в удаленных и труднодоступных районах России срок транспортировки проб в даже в ближайшую лабораторию также может намного превысить предписанные 4 часа.

Проведение дезинфекционных мероприятий при отрицательных температурах сопряжено с большими трудностями, которые обусловлены, в частности, снижением обеззараживающей активности водных дезинфицирующих растворов и их замерзанием [5]. Перечень средств для дезинфекции при отрицательной температуре окружающей среды ограничен препаратами окислительного действия (хлорсодержащие препараты, перекись водорода и пероксокислоты) [5]. Известно, что для дезинфекции при отрицательных температурах применяют в зависимости от вида активнодействующего вещества в 2-15 раз более концентрированные растворы, чем при положительных температурах [5, 6].

Гипосульфит натрия широко применяют в качестве нейтрализатора дезинфектантов окислительного действия, количество его в СНЖ, по данным различных источников, составляет от 0,1 до 2,5% [1, 3, 4]. Указанное количество гипосульфита натрия рассчитано на нейтрализацию активнодействующих веществ в дезинфицирующих растворах, применяемых для обработки объектов при положительной температуре окружающей среды [1, 3, 4]. Чтобы добиться полной нейтрализации в микробиологической пробе остатка дезинфектанта, применяемого для «зимней» дезинфекции, необходимо увеличивать концентрацию гипосульфита натрия в СНЖ в несколько раз.

Для отбора проб при температурах до минус 30°С авторами William D. Won, Harold Ross [7] предложен состав жидкости, включающий смесь желатина и фосфата с водным раствором антифриза - этиленгликоля.

Алексеева М.И. с соавторами в ходе экспериментов по обеззараживанию различных поверхностей при отрицательных температурах добавляли 20-30% водные растворы глицерина в микробные суспензии для защиты микроорганизмов от неблагоприятных факторов окружающей среды [8]. Б.Л. Шура-Бура и М.А. Золочевский в своих экспериментах использовали смесь этиленгликоля с глицерином для предотвращения замерзания микробных суспензий [9].

Все указанные аналоги не в полной мере удовлетворяют предъявляемым к смывной нейтрализующей жидкости условиям и имеют следующие недостатки:

- низкое содержание гипосульфита натрия, недостаточное для полной нейтрализации остатков дезинфектантов, используемых для обеззараживания объектов в «зимних» условиях, либо полное его отсутствие;

- отсутствие в составе антифриза, что приводит к замерзанию СНЖ при отрицательных температурах, либо наличие токсичного компонента - этиленгликоля, который является ядовитой технической жидкостью [10].

Цель изобретения - создание смывной нейтрализующей жидкости с нетоксичными компонентами, обеспечивающей возможность отбора проб микроорганизмов в условиях отрицательных (до минус 30°С) температур, а также сохранение микроорганизмов в СНЖ в жизнеспособном состоянии и увеличение срока хранения проб более 4 часов с момента их отбора.

Данная цель достигается тем, что в составе СНЖ ядовитая техническая жидкость этиленгликоль, используемая в качестве антифриза, заменена на нетоксичный пропиленгликоль; концентрация гипосульфита натрия, нейтрализующего дезинфектанты окислительного действия, по сравнению с аналогами, увеличена в три раза. Дополнительно, при необходимости хранения проб более трех суток и защиты микроорганизмов от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, в СНЖ добавляют глицерин.

Сущность изобретения заключается в получении смывной нейтрализующей жидкости путем смешивания с водой гипосульфита натрия пятиводного, пропиленгликоля и глицерина в расчетных количествах.

Определяют необходимый для проведения работ объем смывной нейтрализующей жидкости (СНЖ) из расчета 5 см3 жидкости на одну микробиологическую пробу. Зная общий объем СНЖ, рассчитывают количество каждого компонента в отдельности с учетом состава жидкости (мас. %), планируемой температуры ее использования и сроков хранения проб:

- гипосульфит натрия пятиводный - 7,5%;

- пропиленгиколь - 30,0% для использования при температуре до минус 18°С или 40,0% для использования при температуре от минус 18°С до минус 30,0°С;

- глицерин - 10,0% (добавляют при необходимости хранения микробиологических проб более трех суток);

- вода - остальное.

Для приготовления СНЖ используют вещества с квалификацией по степени чистоты не хуже, чем чистый (ч.) или чистый для анализа (ч.д.а.).

В рассчитанном количестве водопроводной питьевой воды растворяют навеску гипосульфита натрия, затем добавляют пропиленгликоль и глицерин (если необходимо). Полученную жидкость перемешивают, разливают в стеклянную тару и стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 20 минут.

Для отбора проб микроорганизмов с поверхности методом смыва используют стерильные ватно-марлевые тампоны, укрепленные на стержнях, которые вмонтированы в пробки пробирок. Допускается использовать вместо тампонов стерильные марлевые салфетки и емкости небольшого объема с пробками (по одной на каждую пробу) [1, 3]. Перед началом работы в каждую пробирку с тампоном (емкость с пробкой) наливают по 5 см3 стерильной СНЖ.

В процессе отбора пробы соблюдают следующую последовательность операций: тампон увлажняют СНЖ, находящейся в пробирке, и дважды во взаимно перпендикулярных направлениях со сменой поверхности соприкосновения тампона протирают контрольный участок поверхности объекта. Затем тампон возвращают в ту же пробирку и полностью погружают в жидкость. В случае использования салфеток каждую берут индивидуальным стерильным пинцетом. Салфетку смачивают СНЖ, находящейся в емкости, так же, как и тампоном, протирают контрольный участок поверхности объекта, затем возвращают в емкость, погружают в жидкость и закрывают пробкой.

Пробирку (емкость) в течение 10 минут встряхивают для перевода смытых микроорганизмов с поверхности тампона (салфетки) в жидкость. Затем отобранные пробы доставляют в специализированную лабораторию, в которой проводят посев СНЖ из проб в питательный бульон или на плотную питательную среду с последующим культивированием в термостате для определения наличия и подсчета в них живых микроорганизмов.

Пример 1. Температуру кристаллизации смывных нейтрализующих жидкостей определяли при помощи аппарата АТКт-02 (производства ООО «Спецнефтехимавтоматика», г. Уфа), предназначенного для определения температуры начала кристаллизации низкозамерзающих жидкостей и тосола. Определение проводили по методике, изложенной в руководстве по эксплуатации прибора.

Температуру кристаллизации определяли для СНЖ следующего состава (мас.%):

- 7,5% гипосульфита натрия пятиводного, 30,0% пропиленгликоля;

- 7,5% гипосульфита натрия пятиводного, 30,0% пропиленгликоля, 10,0% глицерина;

- 7,5% гипосульфита натрия пятиводного, 40,0% пропиленгликоля;

- 7,5% гипосульфита натрия пятиводного, 40,0% пропиленгликоля, 10,0% глицерина.

Каждую жидкость готовили в количестве 100 см3, в качестве растворителя использовали водопроводную питьевую воду.

Перед началом работ в охлаждающей камере задавали температуру стабилизации на (12±5)°С ниже предполагаемой температуры начала кристаллизации СНЖ (минус 30°С и минус 40°С для жидкостей с содержанием пропиленгликоля 30,0% и 40,0% соответственно). За предполагаемую температуры начала кристаллизации СНЖ принимали температуру замерзания водного раствора пропиленгликоля соответствующей концентрации минус 13,0°С и минус 23°С [10]. Во внутреннюю пробирку охлаждающей камеры заливали 20 см испытываемой СНЖ, подготавливали аппарат к работе и проводили измерения. Испытания проводили в трех-пяти кратной повторности, для каждого измерения использовали новую порцию жидкости.

В результате испытаний (таблица 1), установлено, что температура кристаллизации смывной нейтрализующей жидкости, содержащей 30,0% и 40,0% пропиленгликоля, составляет, соответственно, минус (18,0±0,6)°С и минус (28,7±1,5)°С. Добавка 10,0% глицерина снижает температуру кристаллизации СНЖ на 5°С.

Пример 2. Оценку сохраняемости микроорганизмов в пробах-смывах, отобранных с поверхности после дезинфекции, в зависимости от состава СНЖ, срока и условий хранения проводили с использованием агаровых споровых культур Bacillus subtilis (штамм 3) и Bacillus anthracis (штамм СТИ-1). Содержание зрелых спор в культурах составляло не менее 90%. Испытания проводили в натурных условиях при температуре минус (15,0±3,0)°С и в климатической камере при температуре минус (28,0±2,0)°С. В испытаниях использовали смывные нейтрализующие жидкости, состав которых представлен в примере 1.

На листах из окрашенного металла размечали квадраты 10×10 см и на их поверхность наносили суспензию спор одной из культур из расчета получения плотности заражения n·10 спор·см-2.

После высыхания поверхности ее орошали дезинфицирующим раствором, содержащим 10% пероксида водорода и 40% изопропанола, используемого в качестве антифриза, с нормой расхода 300 см3·м-2. Раствор рекомендован для обработки санитарного транспорта при отрицательной температуре [6].

Чтобы получить достаточное для изучения сохраняемости количество живых спор в пробах, их отбор начинали через 5 минут после окончания орошения листов металла дезинфицирующим раствором. Отбор проб проводили методом смыва с использованием ватно-марлевых тампонов. Одновременно проводили опыт по определению контроля полноты нейтрализации дезинфицирующего раствора в пробах-смывах по методике, изложенной в Руководстве Р 4.2.2643-10 [1].

По окончании испытаний пробы транспортировали в микробиологическую лабораторию, где проводили их обработку чашечным методом в соответствии с Руководством Р 4.2.2643-10 [1]. По результатам первого высева отбирали пробы, содержащие в 1 см3 от 600 до 1500 живых спор, и только их оставляли для дальнейшего хранения. При этом 50% проб помещали в холодильник при температуре (6±1)°С, оставшиеся пробы - в термостат при температуре (20±1)°С. Испытания проводили в трехкратной повторности, результаты представлены в таблице 2.

Полнота нейтрализации дезинфицирующего раствора (таблица 2) при использовании всех испытанных смывных нейтрализующих жидкостей составляет от (82,5±5,1) до (99,1±3,7) %, что соответствует требованиям п. 5.1.2.3 Руководства Р 4.2.2643-10. Количество колоний микроорганизмов, выросших на чашках Петри после посева нейтрализованной пробы, должно быть примерно одинаковым с количеством колоний, выросших после посева контрольной пробы (но не менее 70% от количества колоний в контрольной пробе) [1, 3].

Представленные в таблице 2 данные показывают, что растворы, содержащие 7,5% тиосульфата натрия пятиводного и 30% или 40% пропиленгликоля, обеспечивают отбор проб при температурах до минус 18°С и до минус 30°С соответственно, а также сохранение спорами Bacillus subtilis, штамм 3 своей жизнеспособности до 10 суток. Выживание спор Bacillus anthracis, штамм СТИ-1 зависит от концентрации пропиленгликоля. В СНЖ, содержащей 30% пропиленгликоля, популяция сохраняет свою жизнеспособность до 7 суток при температуре хранения 6°С и до 3 суток - при 20°С. В смывной нейтрализующей жидкости, содержащей 40% пропиленгликоля, споры Bacillus anthracis, штамм СТИ-1 начинают терять свою способность к прорастанию до окончания трех суток хранения. Если дополнительно добавить в СНЖ 10% глицерина, то срок хранения в ней спор Bacillus anthracis, штамм СТИ-1 без изменения жизнеспособности увеличивается до 10 суток независимо от температуры хранения (6°С или 20°С).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Методы лабораторных исследований и испытаний медико-профилактических дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности: Руководство Р 4.2.2643-10. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2010.

2. Красильников А.П. Справочник по антисептике. - Минск: Высшая школа, 1995.

3. Временные методические указания по типовым методам микробиологических исследований эффективности и оценке средств и способов дезинфекции: Утв. начальником ЦВМУ МО СССР 11.07.7972 г. - Л.: Медицина, 1978.

4. Руководство по военной микробиологии / Под общей редакцией Мельниченко П.И. - М.: Военное издательство, 2005.

5. Костин А.П., Подкорытов Ю.А. Основы войсковой дезинфекции: Учебное пособие для слушателей и войсковых врачей. - Куйбышев: Медицина, 1977.

6 Инструкция по дезинфекции санитарного автотранспорта при различных температурных условиях: Утв. Начальником главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР 06.01.1970 №835-70.

7. W.D. Won, H. Ross Behavior of microbial aerosols in a -30°C environment // Cryobiology - 1968 - Vol. 4, №6. - P. 337-340.

8. Алексеева М.И., Жданникова E.H., Павловская Л.Г., Савельева А.Р. Обеззараживание различных поверхностей при минусовых температурах // Проблемы дезинфекции и стерилизации. Труды центрального научно-исследовательского дезинфекционного института. - М., 1969. Выпуск 20. - С. 185-189.

9. Шура-Бура Б.Л., Золочевский М.А. Эффективность обеззараживания поверхностей транспорта и техники электролизованными растворами хлористого натрия при отрицательных температурах // Военно-медицинский журнал. №1. - 1962. - С. 51-53.

10. О.Н. Дымент, К.С. Казанский, A.M. Мирошников. Гликоли и другие производные окисей этилена и пропилена. - М.: Издательство «Химия», 1976.

1. Смывная нейтрализующая жидкость для отбора проб микроорганизмов при отрицательных температурах методом смыва, включающая нейтрализующий дезинфектанты компонент - гипосульфит натрия пятиводный, антифриз и воду, отличающаяся тем, что в качестве антифриза используют пропиленгликоль, а количество компонентов в жидкости составляет, мас.%:

Na2S2O3·5H2O 7,5
пропиленгликоль 30 или 40
вода остальное.

2. Смывная нейтрализующая жидкость по п.1, отличающаяся тем, что для сохранения микроорганизмов в жизнеспособном состоянии и увеличения срока хранения проб более трех суток с момента их отбора жидкость содержит 10 мас.% глицерина.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в гастроэнтерологии. Предложен способ определения чувствительности Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам.

Изобретение относится к биохимии. Описана выделенная молекула нуклеиновой кислоты для обнаружения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), которая содержит: 5′-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3′ (SEQ ID NO: 10) или 5′-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3′ (SEQ ID NO: 11) и набор, содержащий данную молекулу и инструкцию, где p = универсальный нуклеотид, который представляет собой 3-нитропиррол, 2′-дезоксинуклеозид и 5-нитроиндол или 6Н,8Н-3,4-дигидропиримидо[4,5-с][1,2]оксазин-7-он, и n = аналог цитидина, имеющий модификацию С-5.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма риккетсий "Приморье - 25/81". Охарактеризованный штамм является представителем вида Rickettsia heilongjiangensis.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером вирус ящура штамм О №2108/Забайкальский/2010.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры человека на нормальную и патогенную микрофлору.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ связывания Mycobacteria и/или фрагментов Mycobacteria, присутствующих в водной жидкости, с твердой поверхностью.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к санитарно-гигиеническому контролю за инфицированностью Listeria monocytogenes морской воды и морепродуктов. Способ определения сапрофитных бактерий, стимулирующих рост Listeria monocytogenes в морских микробных сообществах, предусматривает засев «газоном» одной половины чашки Петри с агаризованной средой СММ испытуемыми культурами, а другой половины чашки с ГРМ-агаром - тест-культурами листерий.

Изобретение касается способа выявления серологического родства микробов, имеющих общие детерминанты в составе липополисахаридов. Способ включает получение специфических антител на липополисахариды.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения наличия в биологических жидкостях, окружающей среде и продуктах питания бактерий Escherichia coli штамма O157:Н7, включающий дезинтеграцию бактерий ферментативной обработкой и лизис неионным детергентом, адсорбцию на парамагнитных частицах при помощи специфического моноклонального антитела, детекцию антигена бактерий Е.coli O157:Н7 при помощи специфического биотинилированного моноклонального антитела, связывание полученного комплекса с нековалентным коньюгатом ДНК-матрицы с нейтравидином, диссоциацию твердофазного комплекса "антитело-антиген Е.coli O157:Н7 - биотинилированное антитело-коньюгат" добавлением раствора глицин - HCl рН 2.6, ПЦР-амплификацию ДНК-матрицы и выявление наличия бактерий Е.coli O157:Н7 по скорости нарастания флуоресцентного сигнала.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии. Изобретение представляет собой питательную среду для визуального выявления Ureaplasma urealyticum, содержащую питательную основу, стимуляторы роста, мочевину, селективные компоненты, лошадиную сыворотку, pH индикатор и дистиллированную воду.

Изобретение относится к методам определения пораженности грунтов микроорганизмами. Способ включает в себя помещение образца грунта в прибор для измерения деформации грунта со стрелочным индикатором, заливку дистиллированной водой или водой питьевого качества (контроль) или раствором специального состава (опыт). Осуществляют считывание показаний стрелочного индикатора прибора через определенные интервалы времени. Большая величина показаний стрелочного индикатора для опытного образца свидетельствует о наличии в грунте газообразующих микроорганизмов. Преимущество способа - сокращение времени исследований. 1 з.п. ф-лы, 2 ил. 1 пр.
Группа изобретений относится к микробиологии. Предложены жидкая микробиологическая питательная среда и ее применение. Жидкая микробиологическая питательная среда содержит: от 10 до 20 масс. частей дрожжевого экстракта, от 15 до 30 масс. частей пептона, от 35 до 75 масс. частей моно- и дисахаридов, до 3 масс. частей минеральных веществ, от 0,02 до 1 масс. части устойчивого желирующего вещества, а также воду. Питательная среда стерилизована в автоклаве или подвергнута ультравысокой температурной обработке (УВТ). При этом желирующее вещество является устойчивым к воздействию стерилизации в автоклаве или УВТ-обработки. Питательную среду, готовую к использованию, применяют для микробиологического скрининга в пищевой промышленности, при производстве животноводческих кормов, в косметологии, фарминдустрии, а также в области диагностики. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 пр.
Наверх