Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением



Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением

 


Владельцы патента RU 2588657:

СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн (KR)

Изобретение относится к способу продуцирования L-лизина и рибофлавина или L-треонина и рибофлавина. Способ включает культивирование модифицированного микроорганизма, который модифицирован путем усиления активности семейства ферментов биосинтеза рибофлавина в микроорганизме рода Corynebacterium, обладающего способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне; и продуцирование L-лизина и рибофлавина или L-треонина и рибофлавина посредством ферментационного процесса. Изобретение относится также к модифицированному штамму Corynebacterium glutamicum КССМ11223Р, продуцирующему L-лизин и рибофлавин, и к модифицированному микроорганизму рода Corynebacterium для продуцирования одновременно L-лизина и рибофлавина или L-треонина и рибофлавина, который модифицирован путем усиления активности семейства ферментов, экспрессируемого посредством rib-оперона, содержащего семейство генов биосинтеза рибофлавина, в микроорганизме рода Corynebacterium, обладающем способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне. Изобретение позволяет получать одновременно L-лизин и рибофлавин или L-треонин и рибофлавин с высокой степенью эффективности. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 9 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения высоких концентраций L-аминокислоты и рибофлавина и к микроорганизму для продуцирования одновременно L-аминокислоты и рибофлавина.

Предшествующий уровень техники

Зерна хлебных злаков, таких как кукуруза, просо обыкновенное, ячмень и пшеница, которые наиболее часто используют в кормах, обычно обеспечивают 30-60% потребности в аминокислотах. Таким образом, с целью удовлетворения остающихся потребностей и сохранения баланса между незаменимыми аминокислотами, требуется дополнительное обеспечение аминокислотами. Также, все корма содержат некоторые количества витаминов, и если какой-либо витамин не предлагается в достаточном количестве, может иметь место дефицит этого витамина. Таким образом, для сохранения их должных уровней витамины должны предлагаться дополнительно, подобно аминокислотам. Аминокислоты являются наиболее дорогостоящими среди компонентов кормовых продуктов, и эффективное обеспечение аминокислотами можно считать одним из факторов, которые определяют суммарную способность в производстве домашнего скота. Конкретно, L-лизин и L-треонин среди аминокислот часто становятся первыми аминокислотами, которые ограничивают рост домашнего скота. L-лизин и L-треонин можно получать ферментационным процессом, используя микроорганизмы, и L-лизин и L-треонин, полученные ферментационным процессом, добавляют в корма после очистки и концентрирования. Микроорганизмы, которые обычно применяют в ферментации L-лизина, представляют собой Corynebacterium sp.или Escherichia coli, и сообщалось о многих примерах, в которых продуцировали L-лизин посредством генноинженерных микроорганизмов (корейские патенты №10-0930203 и №10-0924065, патент US 7871801).

В настоящее время постоянно предпринимаются попытки для увеличения продуцирования L-лизина или L-треонина посредством модифицированных микроорганизмов, используя методы генной инженерии. Однако с ростом промышленности требуется обеспечение увеличивающихся количеств L-лизина или L-треонина, и таким образом предпринимаются попытки создавать способы продуцирования L-лизина или L-треонина более эффективным и экономичным путем.

Хотя витамины требуются в небольших количествах, они являются незаменимыми органическими соединениями, которые должны предлагаться для сохранения нормальных метаболических функций, роста, репродуктивных функций и здоровья домашнего скота. Среди витаминов, рибофлавин (витамин В2) представляет собой водорастворимый витамин, который биосинтезируется в различных видах микроорганизмов и во всех видах растений, но не биосинтезируется в организме позвоночных, включая человека, и, таким образом, необходимо его получение из внешних источников. Дефицит рибофлавина может вызывать отсутствие половой охоты и неспособность к размножению у свиней (Biol. Reprod. (1981) 25:659-665, J. Anim. Sci. (1984) 59:1567-1572). У домашних птиц это может вызывать проблемы в нервах, особенно седалищных нервах и плечевых нервах, и может неблагоприятно влиять на рост эмбрионов, приводя к смерти эмбрионов (Korean Feeding Standard for Poultry, 2002, the Korean Ministry of Agriculture and Forestry). Таким образом, рибофлавин применяли в качестве кормовой добавки для роста домашнего скота и, конкретно, сам концентрированный рибофлавин использовали в качестве корма.

Текущее производство рибофлавина во всем мире составляет 6000 тонн в год, из которых 75% используют в качестве кормовых добавок и оставшуюся часть используют в качестве кормовых продуктов и фармацевтических средств. В производстве рибофлавина применяют способ химического синтеза и способ микробиологической ферментации. В способе химического синтеза производят рибофлавин высокой очистки из предшественника, такого как D-рибоза, путем многостадийного процесса. Способ химического синтеза имеет недостаток в том, что исходное вещество является дорогостоящим и, таким образом, повышается стоимость производства. По этой причине разработали способ продуцирования рибофлавина путем микробиологической ферментации. Способ микробиологической ферментации представляет собой способ, в котором либо микроорганизм, который продуцирует рибофлавин, выделяют из природы, либо микроорганизм, мутированный посредством методов генной инженерии или химическим/физическим способом так, чтобы сверхпродуцировать рибофлавин, культивируют в подходящих условиях и затем выделяют рибофлавин из культуры. В последние годы в основном был изучен способ ферментации, так как он является конкурентным по стоимости и не загрязняет окружающую среду. Рибофлавин, произведенный способом ферментации, добавляют к кормовому продукту после очистки и концентрирования.

Типичный способ продуцирования рибофлавина, используя дрожжи Candida famata, раскрыт в US 5231007. В промышленном продуцировании рибофлавина наиболее часто применяют Eremothecium ashbyii и Ashbya gossypii (WO №95/26406), которые принадлежат Ascomycetes. Кроме того, сообщалось также о бактерии Bacillus subtilis в качестве штамма, который можно применять для продуцирования рибофлавина. Сообщалось о многих примерах, в которых рибофлавин продуцировали при помощи указанной выше бактерии, мутированной посредством генной инженерии (ЕР 0821063, US 5837528 и US 5334510), и авторы настоящего изобретения также производили рибофлавин, применяя указанную выше бактерию (корейский патент №10-0542573). Кроме того, также сообщалось о примере продуцирования 4,5 г/л рибофлавина, используя микроорганизм, сконструированный для сверхэкспрессии гена фермента, связанного с биосинтезом рибофлавина (J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (1999), 22:8-8).

Потребности в компонентах кормов для животных составляют примерно 1-5 г/кг L-лизина, примерно 0,6-3,3 г/кг L-треонина и 2-4 мг/кг рибофлавина, что составляет примерно 0,1% потребности в L-лизине (NRC. 1998. National Academy of Sciences-National Research Council, Washington, D.C.). Однако L-лизин и рибофлавин продуцируются отдельно путем ферментационных процессов, подвергаются очистке и концентрированию перед добавлением их к корму, и по отдельности перевозятся на завод кормовых смесей. По этой причине они могут увеличивать затраты на производство корма. Если концентрация рибофлавина в микроорганизме, который продуцирует как L-лизин, так и рибофлавин, достигает примерно 0,1% концентрации L-лизина, добавление микробной культуры может удовлетворять потребностям в кормовых добавках, но о попытках достичь этого еще не сообщалось.

В случае микроорганизмов Corynebacterium sp., рибофлавин биосинтезируют посредством двух путей из рибулозо-5-фосфата (Ru5P), который представляет собой продукт пентозофосфатного пути (РРР), и гуанозинтрифосфата (GTP), который представляет собой продукт пуринового метаболизма. В биосинтез рибофлавина вовлечено семейство генов, состоящее из гена GTP-циклогидролазы II (RibA), гена деаминазы-редуктазы пиримидинов (RibG), гена альфа-субъединицы рибофлавин-синтазы (RibC) и гена бета-субъединицы рибофлавин-синтазы (RibH) (в дальнейшем в этом документе называется "семейством генов биосинтеза рибофлавина"). Семейство генов биосинтеза рибофлавина образует оперон (rib-оперон) с рибулозо-5-фосфат-3-эпимеразой (Rpe, NCgl1536), которая вовлечена в пентозофосфатный путь, и как Rpe, так и RibA конкурируют за использование Ru5P в качестве субстрата (ФИГ. 1). Другими словами, Rpe биосинтезирует D-ксилозо-5-фосфат из Ru5P с опосредованием промежуточного способа, в котором метаболический продукт, произведенный в пентозофосфатном пути, входит в гликолитический путь и RibA биосинтезирует 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфат, который является промежуточным продуктом биосинтеза рибофлавина (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, [www.genome.jp/kegg]).

Пентозофосфатный путь в Corynebacterium является главным источником восстановительной способности (NADPH), который вовлечен в биосинтез лизина, и в литературе сообщалось о прямой корреляции между регенерацией NADPH и биосинтезом L-лизина (Wittmann and Heinzle, Microbiol 68:5843-5849, 2002; Marx et al., J Biotechnol 104:185-197, 2003; Ohnishi et al., Microbiol Lett 242:265-274, 2005).

Пентозофосфатный путь катализируется посредством глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (G6PDH), 6-фосфоглюконолактоназы, 6-фосфоглюконат дегидрогеназы (6PGD), Rpe, рибозо-5-фосфат изомеразы (RpiA), транскетолазы и трансальдолазы, и конечный метаболический продукт, произведенный посредством этого пути, входит в гликолитический процесс.

В результате исследований по осуществлению пентозофосфатного пути в ЕР 01941065 (июнь, 2001) и ЕР 02781875 (декабрь, 2002) раскрывается вариант фермента, который непосредственно продуцирует NADPH и имеет устойчивость к отрицательной обратной связи. Кроме того, раскрыты изобретения, относящиеся к штаммам Corynebacterium, продуцирующим лизин, которые сверхэкспрессируют транскетолазу и трансальдолазу (ЕР 1109915, ЕР 1179076, и ЕР 1179084). Кроме того, сообщалось об увеличении продуцирования L-лизина в штамме Corynebacterium, который сверхэкспрессирует Rpe или RpiA (DE 10037611 и DE 10037612).

Таким образом, можно видеть, что поскольку продуцирование L-лизина в штамме Corynebacterium увеличивается, то увеличивается зависимость штамма от пентозофосфатного пути. Однако путь биосинтеза рибофлавина, который является ключевым элементом настоящего изобретения, происходит из пентозофосфатного пути, и, таким образом, если поток углерода в пути биосинтеза рибофлавина усиливают, то источник углерода, который вводят в гликолитический путь через пентозофосфатный путь, будет ослабевать, что приводит к снижению производственного выхода L-лизина на единицу поставляемого источника углерода. Другими словами, можно считать, что путь биосинтеза рибофлавина в продуцирующем L-лизин штамме, который требует достаточного потока углерода в пентозофосфатном пути, является конкурирующим с пентозофосфатным путем. Также, если поток углерода, который вводят в путь биосинтеза рибофлавина, увеличивается, то это может неблагоприятно влиять на продуцирование L-лизина.

Таким образом, микроорганизмы, которые одновременно продуцируют L-лизин и рибофлавин, могут присутствовать в природе, но производственные выходы L-лизина и рибофлавина могут конкурировать друг с другом. По этой причине о попытках увеличить производство рибофлавина в промышленном микроорганизме, который продуцирует большое количество L-лизина, до уровня, полезного в промышленном масштабе, до сих пор не сообщалось.

Описание изобретения

Техническая проблема

В этих условиях авторами настоящего изобретения был выполнен большой объем работ по разработке микроорганизма, который одновременно продуцирует L-лизин и рибофлавин. В результате авторами настоящего изобретения штамму Corynebacterium, обладающему способностью к продуцированию L-лизина, путем искусственной мутации была придана адаптивность к высоким концентрациям глюконовой кислоты для увеличения потока углерода в пентозофосфатном пути, разрабатывая таким образом мутантный штамм, который имеет повышенную способность продуцировать рибофлавин по сравнению с родительским штаммом при сохранении продуцирования L-лизина на том же уровне, что и у родительского штамма. Также авторы настоящего изобретения обнаружили, что, даже если промотор семейства генов биосинтеза рибофлавина в продуцирующем L-лизин штамме Corynebacterium заменяют гетерогенным сильным промотором, штамм Corynebacterium может одновременно продуцировать L-лизин и рибофлавин в высоких концентрациях, и этот же эффект также обнаруживается в штамме Corynebacterium, обладающем способностью продуцирования L-треонина, таким образом завершая настоящее изобретение.

Техническое решение

Целью настоящего изобретения является предложение способа продуцирования L-лизина или L-треонина и рибофлавина, включающего: культивирование микроорганизма, который получают путем модификации микроорганизма Corynebacterium sp., обладающего способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне; и продуцирование L-лизина или L-треонина и рибофлавина посредством ферментационного процесса.

Другой целью настоящего изобретения является предложение модифицированного микроорганизма Corynebacterium glutamicum, который получают посредством индуцирования случайной мутации в микроорганизме Corynebacterium glutamicum, обладающем способностью продуцирования высококонцентрированного L-лизина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина на высоком уровне, где модифицированный микроорганизм Corynebacterium glutamicum депонируют под регистрационным номером КССМ11223Р.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение модифицированного микроорганизма Corynebacterium sp. для продуцирования одновременно L-лизина или L-треонина и рибофлавина, который модифицируют путем усиления активности семейства ферментов, которое экспрессируется посредством rib-оперона, содержащего семейство генов биосинтеза рибофлавина, в микроорганизме Corynebacterium sp., обладающем способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение композиции или гранулированной композиции, содержащей L-аминокислоту и рибофлавин, которую получают путем культивирования описанного выше микроорганизма и гранулирования L-аминокислоты и рибофлавина.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение кормовой добавки, включающей композицию, содержащую L-аминокислоту и рибофлавин, которую получают путем культивирования описанного выше микроорганизма, или описанную выше гранулированную композицию.

Полезные эффекты

В настоящем изобретении может предлагаться разработанный микроорганизм, который может одновременно продуцировать высокие концентрации L-аминокислоты, такой как L-лизин или L-треонин, которую производят в больших количествах в промышленном масштабе, и рибофлавина, которые используются как незаменимые в кормах для животных, и способ продуцирования L-аминокислоты и рибофлавина. Таким образом, в настоящем изобретении могут предлагаться эффекты удобного изготовления кормов и снижения затрат на производство и может предлагаться эффективный штамм для продуцирования L-аминокислоты и витаминные кормовые добавки.

Описание графических материалов

На ФИГ. 1 показано, что гликолитический путь и путь биосинтеза рибофлавина конкурируют за использование рибулозо-5-фосфата.

На ФИГ. 2 показано, что сильный промотор вставляют выше или внутри rib-оперона для усиления активности либо семейства ферментов, которое кодируется посредством rib-оперона, или семейства ферментов биосинтеза рибофлавина.

На ФИГ. 3 показан вектор pDZ-Pmrb, сконструированный для того, чтобы вставлять промотор SEQ ID NO: 5.

На ФИГ. 4 показан вектор pDZ-lysCP1-ribG, сконструированный для того, чтобы вставлять промотор SEQ ID NO: 6.

Лучший вариант

В дальнейшем в этом документе будут определены термины, используемые в данном описании изобретения.

При использовании в данном описании изобретения термин "rib-оперон" относится к оперону, включающему семейство генов биосинтеза рибофлавина, состоящее из гена ribG, кодирующего деаминазу-редуктазу пиримидина (RibG, NCgl1535), гена ribC, кодирующего альфа-субъединицу рибофлавинсинтазы (RibC, NCgl1534), гена ribA, кодирующего GTP-циклогидролазы II (RibA) и гена ribH, кодирующего бета-субъединицу рибофлавинсинтазы (RibH, NCgl1532) (в дальнейшем в этом документе называется "семейством генов биосинтеза рибофлавина"), и гена rpe, кодирующего рибулозо-5-фосфат-3-эпимеразу (Rpe, NCgl1536), которые вовлечены в пентозофосфатный путь (ФИГ. 2). Информация о генах оперона имеется в общедоступных базах данных (например NCBI GenBank).

При использовании в данном описании изобретения термин "L-аминокислота" относится к аминокислоте, выбранной из группы, состоящей из L-лизина, L-треонина, L-валина, L-изолейцина, L-триптофана и L-метионина. Конкретно, аминокислота представляет собой L-лизин или L-треонин.

Один аспект настоящего изобретения содержит способ продуцирования L-лизина или L-треонина и рибофлавина, включающий:

культивирование микроорганизма, который получают путем модификации микроорганизма Corynebacterium sp., обладающего способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне; и продуцирование L-лизина или L-треонина и рибофлавина посредством ферментационного процесса.

В конкретном примере настоящего изобретения обнаружили, что продуцирование L-лизина или L-треонина в модифицированном микроорганизме сохраняется на том же уровне, что и в родительском штамме, тогда как продуцирование рибофлавина повышено примерно в 70-80 раз и, в частности, соотношение между продуцированием лизина и продуцированием рибофлавина составляло примерно 1:0,005 или соотношение между продуцированием L-треонина и продуцированием рибофлавина составляло примерно 1:0,03 (Таблицы 1-6). Это означает, что L-аминокислота и рибофлавин, продуцируемые одновременно микроорганизмом по настоящему изобретению, являются подходящими для применения в качестве кормовых добавок.

Модифицированный микроорганизм представляет собой микроорганизм Corynebacterium sp., модифицированный для продуцирования одновременно L-аминокислоты и рибофлавина, который получают путем модификации микроорганизма Corynebacterium sp., обладающего способностью продуцирования L-аминокислоты, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-аминокислоты, как результат усиления активности семейства ферментов, которое экспрессируется посредством rib-оперона, включающего семейство генов биосинтеза рибофлавина. Конкретно, он может представлять собой мутантный микроорганизм Corynebacterium sp.для продуцирования одновременно L-лизина или L-треонина и рибофлавина, который получают путем модификации микроорганизма Corynebacterium sp., обладающего способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина, как результат усиления активности семейства ферментов, которое экспрессируется посредством rib-оперона, включающего семейство генов биосинтеза рибофлавина.

Микроорганизм Corynebacterium sp., применяемый в настоящем изобретении, может представлять собой любой штамм Corynebacterium sp., обладающий способностью продуцирования L-аминокислоты, и примеры этого включают, без ограничения, Corynebacterium glutamicum (АТСС 13032), Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539), Brevibacterium flavum (ATCC 14067) и Brevibacterium fermentum (ATCC 13869). Более конкретно, можно применять Corynebacterium glutamicum, и конкретные примеры этого включают, без ограничения, KFCC10881 (корейский патент №0159812), KFCC11074 (корейский патент №0292299), KFCC11001 (корейский патент №0253424) и КССМ11222Р. В конкретном примере настоящего изобретения мутантный микроорганизм получают путем модифицирования KFCC10881 в качестве родительского штамма для увеличения продуцирования рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне. В частности, мутантный микроорганизм получали путем модифицирования КССМ11222Р в качестве родительского штамма для увеличения продуцирования рибофлавина при сохранении продуцирования L-треонина на высоком уровне.

Микроорганизм Corynebacterium sp., обладающий способностью продуцирования L-лизина, может представлять собой микроорганизм, который продуцирует L-лизин с повышенной эффективностью. Способы повышения эффективности продуцирования L-лизина включают способ амплификации гена, который вовлечен в путь биосинтеза L-лизина, или модифицирования промотора гена для увеличения ферментной активности. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают аспартатаминотрансферазу, аспартокиназу, аспартат полуальдегиддегидрогеназу, пируваткарбоксилазу, дигидродипиколатредуктазу, дигидродипиколинатсинтазу, диаминопимелатдекарбоксилазу и тому подобные. Предыдущий патент, связанный с промоторами, произведенными коринебактерией, включает WO 09/096690, относящуюся к улучшенному промотору дигидродипиколинатредуктазы, и выданный корейский патент №0930203 раскрывают улучшенные промоторы аспартокиназы и аспартат-полуальдегид-дегидрогеназы. Также, выданный корейский патент №0924065 раскрывает способ улучшения продуцирования L-лизина путем включения одной или более копий генов, связанных с вышеупомянутым биосинтезом, и замены промоторов генов экзогенными сильными промоторами.

Микроорганизм Corynebacterium sp., обладающий способностью продуцировать L-треонин, может представлять собой микроорганизм, который продуцирует L-треонин с повышенной эффективностью. Для того чтобы улучшить способность продуцировать L-треонин, специалист в данной области техники может использовать обычные способы, такие как не только приобретение ауксотрофных мутантов, аналого-резистентных мутантов, мутантов с регулируемым метаболизмом, но также конструкцию рекомбинантных штаммов, имеющих повышенную активность фермента биосинтеза L-треонина. Например, мутантный штамм или рекомбинантный штамм можно модифицировать так, чтобы фермент биосинтеза L-треонина не подвергался ингибированию по типу обратной связи, или рекомбинантный штамм можно модифицировать для увеличения экспрессии гена фермента биосинтеза L-треонина. При модификации продуцирующего L-треонин штамма посредством этих способов, можно получать одно из свойств или комбинацию свойств, таких как ауксотрофия, аналого-резистентность и мутации, регулирующие метаболизм. Если активность фермента биосинтеза L-треонина является усиленной, можно усилить активность одного или более из этих ферментов. Примеры гена, кодирующего фермент биосинтеза L-треонина, включают ген аспартокиназы III (lysC), ген аспартат-полуальдегид-дегидрогеназы (asd), ген аспартокиназы I (thrA), ген гомосеринкиназы (thrB) и ген треонин-синтазы (thrC), которые включены в thr-оперон. Активность фермента биосинтеза L-треонина можно повышать путем включения мутации в ген, кодирующий фермент, или амплификацией гена для увеличения внутриклеточной активности фермента. Этого можно добиться, используя технологию генетической рекомбинации. Также, продуцирование L-треонина можно повышать посредством инактивации L-треониндегидрогеназы, связанной с деградацией треонина. В дополнение к ферментам системы деградации L-треонина, продуцирование L-треонина можно повышать посредством редуцирующих или разрушающих ферментов, которые вовлечены в гликолитический путь, цикл трикарбоновых кислот, или способом дыхательной цепи, которые неблагоприятно влияют на продуцирование L-треонина, ферментов, которые регулируют экспрессию генов, или ферментов системы биосинтеза побочных продуктов. Примеры способа улучшения эффективности продуцирования L-треонина включают способ модифицирования микроорганизма для усиления экспрессии ферментов, которые вовлечены в путь биосинтеза L-треонина. Ферменты, которые вовлечены в биосинтез L-треонина, включают гомосерин-дегидрогеназу, гомосерин-киназу, треонин-синтазу и экспортер треонина. Другие примеры способа придания или усиления способности продуцировать L-треонин включают способ ввода мутации для создания гомосерин-дегидрогеназы, устойчивой к обратной связи посредством треонина (US 6649379). В конкретном примере настоящего изобретения мутантный микроорганизм KFCC10881-THR (регистрационный номер: КССМ11222Р) создавали путем модифицирования KFCC10881 для получения резистентности к аналогу L-треонина AHV (2-амино-3-гидроксивалерат).

Конкретно, модифицированный микроорганизм Corynebacterium sp. может представлять собой модифицированный микроорганизм Corynebacterium sp. для продуцирования L-аминокислоты и рибофлавина с высокими концентрациями, который получают путем модифицирования микроорганизма Corynebacterium sp., обладающего способностью продуцирования L-аминокислоты на высоком уровне, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-аминокислоты на высоком уровне, как результат усиления активности ферментов, которые экспрессируются посредством rib-оперона. Кроме того, он может представлять собой микроорганизм, полученный путем усиления активности фермента, который экспрессируется семейством генов биосинтеза рибофлавина rib-оперона.

Способ усиления активности фермента может представлять собой, например, один или более способов, выбранных из группы, состоящей из способа увеличения числа внутриклеточных копий гена, кодирующего каждый фермент "оперона или семейства ферментов" (в дальнейшем в этом документе называется "семейством ферментов"), способа введения мутации в регулирующую экспрессию последовательность для хромосомного гена, кодирующего каждый фермент указанного семейства ферментов, способа замены регулирующей экспрессию последовательности для хромосомного гена, кодирующего каждый фермент указанного семейства ферментов, на последовательность, имеющую сильную активность, способа замещения хромосомного гена, кодирующего фермент, мутированным геном для увеличения активности указанного семейства ферментов, и способа введения мутации в хромосомный ген, кодирующий каждый фермент указанного семейства ферментов, для усиления активности указанного семейства генов, но не ограничиваются этим. Такой способ можно выполнять посредством разных способов, известных в данной области техники. Конкретно, способ может представлять собой способ замены регуляторной последовательности для хромосомного гена, кодирующего семейство ферментов, которое экспрессируется посредством rib-оперона, на сильный промотор, способ вставки сильного промотора выше хромосомного гена, кодирующего RibG (пиримидиндеаминазу-редуктазу), расположенного перед семейством генов биосинтеза рибофлавина, или способ увеличения числа внутриклеточных копий гена, кодирующего либо семейство ферментов, которое экспрессируется посредством rib-оперона, либо семейство ферментов, которое экспрессируется семейством генов биосинтеза рибофлавина.

Выражение "увеличение числа внутриклеточных копий" может включать случай, при котором ген, кодирующий фермент, функционально связывают с хромосомой для стабильной экспрессии фермента или случай, при котором вектор, содержащий ген, кодирующий фермент, функционально трансформируют в хромосому для стабильной экспрессии фермента. При использовании в данном описании изобретения термин "вектор" относится к ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность гена, функционально связанного с подходящей регуляторной последовательностью, чтобы экспрессировать целевой ген в подходящей клетке-хозяине.

На основе результатов, полученных путем увеличения числа копий гена, кодирующего фермент, который экспрессируется посредством rib-оперона, в хромосомной ДНК, любому специалисту в данной области техники будет очевидно, что увеличением числа копий гена, кодирующего фермент, который экспрессируется посредством rib-оперона, за пределами хромосомы посредством вектора, модификацией регуляторного участка гена, кодирующего фермент, который экспрессируется посредством rib-оперона, внутри или вне хромосомы, или модификаций самого гена для увеличения экспрессии можно достигать одного и того же результата.

При использовании вектора можно получать микроорганизм, имеющий усиленную активность фермента, который экспрессируется посредством rib-оперона, путем трансформации микроорганизма Corynebacterium sp., обладающего способностью продуцирования L-аминокислоты, при помощи рекомбинантного вектора, имеющего нуклеотидную последовательность, включенную в него. Вектор, который можно использовать в настоящем изобретении, не ограничен конкретно, и можно использовать в настоящем изобретении известный вектор. Примеры векторов, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают векторы pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322 и pMW118. В конкретном примере настоящего изобретения использовали pECCG117.

У прокариот регуляторная последовательность включает промотор, способный к инициации транскрипции, любой оператор для регуляции этой транскрипции, подходящий участок связывания рибосомы (RBS), кодирующий подходящий участок связывания рибосомы мРНК, последовательность регуляции терминации транскрипции и последовательность регуляции терминации трансляции.

Вместо свойственного организму промотора, расположенного выше гена, кодирующего фермент, можно применять улучшенный промотор, имеющий мутацию замены нуклеотида, образованный из свойственного организму промотора или гетерогенного промотора. Примеры гетерогенного промотора включают промотор pcj7, промотор lysCP1, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор асеА, промотор асеВ и тому подобные. Конкретно, можно применять промотор pcj7 или промотор lysCP1 из Corynebacterium. Наиболее конкретно, можно применять промотор lysCP1.

При использовании в данном описании изобретения термин "промотор lysCP1" обозначает промотор, улучшенный путем замены нуклеотида на участке промотора гена, кодирующего аспартаткиназу и аспартат полуальдегид дегидрогеназу, и сильный промотор, который увеличивает уровень экспрессии гена аспартаткиназы для ферментной активности приблизительно в 5 раз выше, чем у дикого типа (WO 2009/096689). Промотор lysCP1 может представлять собой нуклеотидные остатки 1-353 (SEQ ID NO: 6) последовательности SEQ ID NO: 17, которая содержит последовательность промотора lysCP1 и часть гена lysC-asd. Конкретно, вектор конструировали так, чтобы улучшенный промотор SEQ ID NO: 5, содержащий мутацию замены нуклеотида, или улучшенный промотор гена lycC, lysCP1 из SEQ ID NO: 6, имеющий сильную активность индуцирования экспрессии, можно было вводить в хромосому клетки-хозяина. Способы сверхэкспрессирования целевого гена включают способ улучшения промотора путем замещения некоторых нуклеотидов последовательности свойственного организму промотора на другие нуклеотиды для увеличения уровня экспрессии, или способ замещения промотора на промотор другого гена, имеющего высокий уровень экспрессии (WO 2009/096689).

При использовании в данном описании изобретения, термин "трансформация" означает полную операцию включения гена в клетку-хозяина, Corynebacterium sp., для его экспрессии в клетке-хозяине. В этом смысле, промотор и ген представляют собой полинуклеотиды, включая ДНК и РНК. Поскольку ген можно вводить в клетку-хозяина и экспрессировать в ней, можно использовать любой тип гена. Например, можно вводить ген в клетку-хозяина в форме кассеты экспрессии, которая представляет собой полинуклеотидную конструкцию, включающую все элементы для экспрессии гена. Кассета экспрессии включает промотор, который функционально связывают с геном, сигнал терминации транскрипции, RBS и сигнал терминации трансляции. Кассета экспрессии может иметь форму экспрессионного вектора, способного к саморепликации. Ген также можно вводить в клетку-хозяина отдельно или в полинуклеотидной конструкции, подлежащей функциональному соединению с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине.

Способы трансформации вектора по настоящему изобретению включают любой способ включения нуклеиновой кислоты в клетку, и в зависимости от клетки-хозяина может быть выбрана подходящая стандартная методика трансформации, известная в данной области техники. Примеры способа трансформации включают электропорацию, осаждение фосфата кальция (Са3(PO4)2), осаждение хлорида кальция (CaCl2), микроинъекцию, способ с полиэтиленгликолем (ПЭГ), способ с диэтиламиноэтил-декстраном (ДЭАЭ-декстран), катионно-липосомный способ, способ с ацетатом лития-ДМСО (диметилсульфоксид) и тому подобные.

Клетка-хозяин по настоящему изобретению может представлять собой хозяина, в который ДНК вводится с высокой эффективностью и экспрессируется с высокой эффективностью. Конкретно, можно использовать микроорганизм Corynebacterium sp., как описано выше. Более конкретно, можно использовать Corynebacterium glutamicum, в частности, Corynebacterium glutamicum KFCC10881. В качестве микроорганизма, обладающего способностью продуцирования L-треонина, можно использовать любой микроорганизм, способный продуцировать L-треонин, без ограничения. Конкретно, можно использовать KFCC10881-THR (регистрационный номер: КССМ11222Р).

Конкретно, микроорганизм можно получать путем замены промотора, расположенного выше хромосомного участка, кодирующего семейство ферментов, которое экспрессируется посредством rib-оперона, на промотор SEQ ID NO: 5, или путем замены вышележащего промотора гена ribG на промотор SEQ ID NO: 6. В конкретном примере настоящего изобретения промотор штамма KFCC10881 заменяли на промотор SEQ ID NO: 5 и, в результате, было показано, что средняя концентрация L-лизина не изменяется, но средняя концентрация рибофлавина повышается примерно в 61 раз (Таблица 2). Также обнаружили что, если вышележащий промотор гена ribG заменяли на промотор SEQ ID NO: 6, то средняя концентрация рибофлавина повышалась примерно в 73 раза (Таблица 3), и если повышали число копий rib-оперона, то средняя концентрация рибофлавина повышалась в 66 раз (Таблица 4). Кроме того, было показано, что, если промотор штамма KFCC10881-THR, продуцирующего L-треонин, заменяли на промотор SEQ ID NO: 5 или 6, то средняя концентрация L-треонина изменялась редко, но концентрации рибофлавина повышались в 56 раз и в 66 раз, соответственно (Таблица 6).

Конкретно, микроорганизм Corynebacterium sp., обладающий способностью продуцировать L-лизин или L-треонин, можно модифицировать для продуцирования рибофлавина в высокой концентрации вместе с L-лизином или L-треонином в высокой концентрации посредством вставки сильного промотора перед геном, кодирующим Rpe (рибулозо-5-фосфат-3-эпимеразу), расположенным выше rib-оперона, или посредством вставки сильного промотора выше гена, кодирующего RibG (деаминазу-редуктазу пиримидинов), расположенного перед семейством генов биосинтеза рибофлавина (ФИГ. 2), для усиления активности семейства ферментов, кодируемого посредством rib-оперона или семейством генов биосинтеза рибофлавина. В конкретном примере настоящего изобретения было обнаружено, что в нуклеотидной последовательности с -10го до -16го нуклеотидного остатка нуклеотидной последовательности rpe, расположенной выше rib-оперона штамма КССМ11223Р, имели место мутации. Таким образом, предполагаемый участок промотора (SEQ ID NO: 5) rib-оперона штамма КССМ11223Р клонировали и затем вводили в хромосому родительского штамма, обладающего способностью продуцировать L-лизин, и в результате было обнаружено, что продуцирование рибофлавина в штамме увеличивалось до уровня, аналогичного уровню в штамме КССМ11223Р, при сохранении продуцирования L-лизина (Таблица 2). Таким образом, предположили, что продуцирование рибофлавина может быть повышено путем усиления rib-оперона, и вводили сильный промотор выше ribG, расположенного перед семейством генов биосинтеза рибофлавина в rib-оперона, и в результате было показано, что продуцирование рибофлавина в модифицированном штамме повышалось примерно в 73 раза по сравнению с родительским штаммом (Таблица 3). Кроме того обнаружили, что даже если повышали число копий rib-оперон, продуцирование рибофлавина повышалось до уровня, аналогичного уровню при применении сильного промотора (Таблица 4). Кроме того, когда промотор выше rpe в родительском штамме, обладающем способностью продуцирования L-треонина, заменяли на промотор SEQ ID NO: 5 согласно настоящему изобретению, и когда сильный промотор вводили выше ribG, обнаружили, что продуцирование рибофлавина увеличивалось примерно в 60-70 раз при сохранении продуцирования L-треонина на уровне, аналогичном родительскому штамму (Таблица 6). Таким образом, обнаружили, что изобретательский микроорганизм Corynebacterium sp., полученный путем модификации родительского штамма для увеличения продуцирования рибофлавина при сохранении продуцирования аминокислоты на высоком уровне, может продуцировать L-аминокислоту и рибофлавин в высоких концентрациях в одно и то же время.

Конкретно, модифицированный микроорганизм Corynebacterium sp., который одновременно продуцирует L-лизин и рибофлавин, может представлять собой Corynebacterium glutamicum (регистрационный номер: КССМ11223Р), модифицированный путем индуцирования случайной мутации в Corynebacterium glutamicum, обладающем способностью продуцирования L-лизина на высоком уровне, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина на высоком уровне. Кроме того, это может быть модифицированный Corynebacterium glutamicum (регистрационный номер: КССМ11220Р, КССМ11221Р или КССМ11223Р), полученный путем модификации микроорганизма Corynebacterium sp., обладающего способностью продуцирования L-лизина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина на высоком уровне в результате усиления активности семейства ферментов, которое экспрессируется посредством rib-оперона, содержащего семейство генов биосинтеза рибофлавина.

Выполняя неспецифический мутагенез для увеличения потока углерода в пентозофосфатном пути штамма, продуцирующего L-лизин, авторы настоящего изобретения обнаружили микробную колонию темно-желтого цвета, и было обнаружено, что продуцирование рибофлавина в мутантном микроорганизме повышалось примерно в 60 раз при сохранении продуцирования L-лизина на уровне, аналогичном уровню в родительском штамме (Таблица 1). Авторами настоящего изобретения было определено, что эта характеристика мутантного штамма является полезной в производстве кормовых добавок, которые должны содержать аминокислоту и рибофлавин в постоянном соотношении. Таким образом, мутантный штамм по настоящему изобретению назвали "Corynebacterium glutamicum СА01-2183" или "KFCC10881-YC" и депонировали при помощи Корейского Центра Культур Микроорганизмов (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) 11 ноября 2011 г. под регистрационным номером КССМ11223Р. Кроме того, мутантный штамм, полученный путем включения промотора Pmrb в промотор rib-оперона родительского штамма KFCC10881, назвали "Corynebacterium glutamicum СА01-2162" или "KFCC10881::Pmrb" и депонировали при помощи Корейского Центра Культур Микроорганизмов (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) 11 ноября, 2011 г. под регистрационным номером КССМ11221Р. Кроме того, штамм, полученный путем включения lysCP1 выше инициирующего кодона гена ribG родительского штамма KFCC10881, назвали "Corynebacterium glutamicum СА01-2161" или "KFCC10881::lysCP1_ribG". Его депонировали при помощи Корейского Центра Культур Микроорганизмов (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) 11 ноября, 2011 г. под регистрационным номером КССМ11220Р.

Соотношение L-аминокислоты и рибофлавина в ферментированной среде культивирования, продуцированных одновременно посредством способа по настоящему изобретению, составляет 1:0,0001-0,1. Если L-аминокислота представляет собой L-лизин, то соотношение L-лизина и рибофлавина составляет конкретно 1:0,001-0,05 и более конкретно 1:0,003-0,01. Если L-аминокислота представляет собой L-треонин, то соотношение L-треонина и рибофлавина составляет конкретно 1:0,001-0,1 и более конкретно 1:0,005-0,05.

Культивирование микроорганизма Corynebacterium sp.можно выполнять в подходящей среде путем различных способов культивирования, известных в данной области техники (Chmiel, Bipprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991; Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweir/Wiesbaden, 1994). Примеры способа культивирования включают периодическую культуру, подпитываемую культуру и непрерывную культуру. Примеры подпитываемой культуры включают подпитываемую культуру и подпитываемую культуру многократных циклов, но не ограничены этим.

Кроме того, среда, которую можно применять в культивировании по настоящему изобретению, может представлять собой подходящую среду, известную в данной области техники, в зависимости от способа культивирования и выбранного штамма ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Среда, которую применяют в настоящем изобретении, может содержать различные источники углерода, источники азота и микроэлементы. Среда для культивирования микроорганизмов Corynebacterium может содержать в качестве источников углерода сахарозу, глюкозу, фруктозу, жир, жирную кислоту, спирт, органическую кислоту и тому подобное. Конкретные примеры источников углерода, которые можно применять в настоящем изобретении, включают углеводы, такие как меласса, глюкоза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода можно применять в подходящем количестве. Примеры источников азота, которые можно применять в настоящем изобретении, включают источники органического азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной сок, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт и гидролизаты соевого жмыха, и источники неорганического азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота можно применять самостоятельно или в комбинации. Среда может содержать в качестве источников фосфора одноосновный фосфат калия, двухосновный фосфат калия и соответствующие натрийсодержащие соли. Среда может содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа. Кроме того, среда может содержать аминокислоты, витамины и подходящие предшественники. Эти источники или предшественники можно добавлять в среду партиями или непрерывно.

Соединения, такие как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота, можно добавлять в среду подходящим способом во время культивирования для регулирования рН среды культивирования. Кроме того, во время культивирования можно применять пеногаситель, такой как полигликолевый эфир жирной кислоты, для подавления образования пены. Кроме того, с целью сохранения среды культивирования в аэробном состоянии, можно вдувать в среду культивирования кислород или кислородосодержащий газ (например, воздух). Среду культивирования обычно можно сохранять при температуре в диапазоне от 20°С до 45°С и конкретно от 25°С до 40°С. Что касается периода культивирования, то его можно продолжать до получения желаемого уровня L-аминокислоты. Конкретно, период культивирования может составлять 10-160 часов.

Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию гранулирования ферментированной среды культивирования, содержащей L-аминокислоту и рибофлавин. Ферментированная среда культивирования может содержать бактериальный осадок или может быть свободна от него. Для удаления бактериального осадка способ может дополнительно включать стадию удаления бактериального осадка из ферментированной среды культивирования, содержащей L-треонин и рибофлавин.

Если ферментированная среда культивирования содержит бактериальный осадок, можно получать гранулированную композицию, которая не требует операции фильтрации для удаления бактериального осадка и имеет свойство низкого влагопоглощения, даже если в нее не добавляют агент, препятствующий влагопоглощению. Также гранулированная композиция имеет хорошую сыпучесть и высокую насыпную плотность и содержание аминокислоты в ней можно контролировать. Способ гранулирования можно выполнять, применяя способ, описанный, например, в корейском патенте с регистрационным номером 0838200 или 0338578. Конкретно, способ гранулирования может включать стадию: концентрирования ферментативного бульона; добавление эксципиента в концентрат с образованием смешанного концентрата; включение затравки в виде частиц, имеющих размер 200-500 мкм, в гранулирующее устройство; и разбрызгивание смешанного концентрата из нижней части гранулирующего устройства при добавлении горячего воздуха для покрытия затравки в виде частиц концентратом до образования гранул, но не ограничивается этими.

Если ферментативный бульон содержит бактериальный осадок, то способ гранулирования может включать стадию: фильтрования ферментированной среды культивирования для удаления бактериального осадка; концентрирования фильтрата; высушивания концентрата с образованием гранул; и покрытие гранул покрывающим агентом, таким как эксципиент или агент, препятствующий влагопоглощению, но не ограничивается этим.

Бактериальный осадок можно удалять из ферментированной среды культивирования путем отделения L-аминокислоты и рибофлавина, используя способы, такие как центрифугирование, фильтрация, ионообменная хроматография и кристаллизация. Конкретно, L-аминокислоту и рибофлавин можно отделять путем центрифугирования ферментированной среды культивирования с низкой скоростью для удаления бактериального осадка и разделения супернатанта посредством ионообменной хроматографии, но не ограничивается этим.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается модифицированный микроорганизм Corynebacterium glutamicum, который получают путем индуцирования случайной мутации в микроорганизме Corynebacterium glutamicum, обладающем способностью продуцирования высококонцентрированного L-лизина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина на высоком уровне, где модифицированный микроорганизм Corynebacterium glutamicum депонируют под регистрационным номером КССМ11223Р.

В данном описании изобретения микроорганизм такой, как описано выше.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается модифицированный микроорганизм Corynebacterium sp. для продуцирования L-лизина или L-треонина и рибофлавина, который получают путем усиления активности семейства ферментов, которое экспрессируется посредством rib-оперона, содержащего семейство генов биосинтеза рибофлавина, в микроорганизме Corynebacterium sp., обладающем способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне.

В данном описании изобретения микроорганизм, усиление семейства ферментов и модифицированный микроорганизм Corynebacterium sp. такие, как описано выше.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается гранулированная композиция, полученная способом, включающим: а) культивирование микроорганизма, который получают путем модифицирования микроорганизма Corynebacterium sp., обладающего способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне, и продуцирование L-лизина или L-треонина и рибофлавина посредством ферментационного процесса; и б) гранулирование ферментированной среды культивирования со стадии а), которая содержит L-лизин или L-треонин и рибофлавин.

Конкретно, L-аминокислота может представлять собой L-лизин или L-треонин. Модифицированный микроорганизм такой, как описано выше.

Способ получения гранулированной композиции может дополнительно включать стадию удаления бактериального осадка из ферментированной среды культивирования со стадии а), которая содержит L-лизин или L-треонин и рибофлавин. Другими словами, как описано выше, гранулированная композиция по настоящему изобретению может содержать или не содержать бактериальный осадок.

Конкретно, соотношение L-лизин или L-треонин: рибофлавин в гранулированной композиции может составлять 1:0,0001-0,01, как описано выше.

При использовании в данном описании изобретения термин "гранулированная композиция" обозначает композицию в виде гранул, которая преодолевает недостатки обычных порошковых композиций, такие как пылеобразование и потеря продукта.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая L-лизин или L-треонин и рибофлавин, где композицию получают способом, включающим: а) культивирование микроорганизма, который получают путем модификации микроорганизма Corynebacterium sp., обладающего способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне, и продуцирование L-лизина или L-треонина и рибофлавина посредством ферментационного процесса; и

б) удаление бактериального осадка из ферментированной среды культивирования со стадии а), которая содержит L-лизин или L-треонин и рибофлавин.

Конкретно, соотношение L-лизин или L-треонин: рибофлавин в композиции может составлять 1:0,0001-0,01, как описано выше.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается корм или кормовая добавка, которые содержат описанную выше гранулированную композицию или композицию, содержащую L-лизин, L-треонин и рибофлавин.

У продуцированных в конкретном примере настоящего изобретения высококонцентрированном L-лизине или L-треонине и рибофлавине соотношение лизин:рибофлавин составляло примерно 1:0,005, или соотношение L-треонин:рибофлавин составляло примерно 1:0,03 (см. Таблицы 1-6). Требования к компонентам корма для животных составляют примерно 1-5 г/кг для L-лизина, примерно 0,6-3,3 г/кг для L-треонина и 2-4 мг/кг для рибофлавина, что составляет примерно 0,1% потребности в L-лизине (NRC. 1998. National Academy of Sciences-National Research Council, Washington, D.C.), и не сообщалось о токсичности при введении больших количеств L-лизина или L-треонина и рибофлавина. Таким образом обнаружено, что L-аминокислота и рибофлавин, продуцированные одновременно посредством способа по настоящему изобретению, являются подходящими для применения в качестве кормовых добавок.

Конкретно, L-аминокислота может представлять собой L-лизин или L-треонин.

Конкретно, соотношение L-лизин или L-треонин:рибофлавин в корме или в кормовой добавке может составлять 1:0,0001-0,01, как описано выше.

Корм по настоящему изобретению можно получать посредством получения кормовой добавки, содержащей L-аминокислоту и рибофлавин, и смешивания кормовой добавки с кормом или добавления кормовой добавки непосредственно в корм во время приготовления корма. L-аминокислота и рибофлавин в корме по настоящему изобретению могут находиться в жидком или сухом состоянии и, конкретно, в форме сухого порошка. Примеры способа сушки, который можно использовать в настоящем изобретении, включают, без ограничения, воздушную сушку, естественную сушку, сушку распылением и сублимационную сушку. Корм для домашнего скота может содержать в дополнение к L-аминокислоте и рибофлавину по настоящему изобретению обычные добавки, способные усиливать консервирующее свойство корма.

Кормовая добавка по настоящему изобретению может дополнительно содержать другие непатогенные микроорганизмы. Микроорганизмы, которые можно добавлять к кормовой добавке по настоящему изобретению, можно выбирать из группы, состоящей из Bacillus subtilis, способной продуцировать протеазу, липазу и глюкозоконвертирующий фермент, Lactobacillus sp., который имеет физиологическую активность и способность разлагать организмы в анаэробных условиях, таких как желудок крупного рогатого скота, мицелиальных грибов, таких как Aspergillus oryzae, которые проявляют эффекты увеличения массы домашнего скота, продуцирования молока и переваривание/усвоение корма (J AnimalSci 43: 910-926, 1976), и дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae (J Anim Sci 56:735-739, 1983).

Примеры корма, содержащего L-аминокислоту и рибофлавин, включают, без ограничения, растительные корма, такие как крупы, корни/плоды, побочные продукты пищевой промышленности, водоросли, клетчатку, фармацевтические побочные продукты, масла и жиры, крахмалы, плоды тыквы и побочные продукты круп, и животные корма, такие как белки, неорганические вещества, масла и жиры, минералы, белки одноклеточных, зоопланктон и пищевые остатки.

Кормовые добавки, содержащие L-аминокислоту и рибофлавин по настоящему изобретению, включают, без ограничения; связующее вещество, эмульгатор и консервант, которые добавляют для предупреждения ухудшения качества, аминокислоты, витамины, ферменты, пробиотики, вкусовые вещества, небелковые азотистые соединения, силикаты, буфер, красители, экстрагирующие агенты и олигосахариды, которые добавляют для увеличения эффектов, и другую кормовую смесь.

Методика изобретения

В дальнейшем в данном документе настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Следует понимать, однако, что эти примеры приводятся только для иллюстративных целей и не предназначены ограничивать объем настоящего изобретения.

Пример 1: Отбор штамма, толерантного к глюконовой кислоте, посредством искусственного мутагенеза

В этом Примере с целью увеличения потока углерода в пентозофосфатном пути, который является главным источником никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH), требующегося для продуцирования L-аминокислоты, выполняли эксперимент для придания штамму Corynebacterium glutamicum адаптивности к высококонцентрированной глюконовой кислоте.

Искусственную мутацию в KFCC10881 (корейский патент №0159812) в качестве родительского штамма индуцировали посредством N-метил-N-нитро-N-нитрогуанина (NTG) и потом штамм культивировали в нижеследующей среде в чашке Петри, содержащей 20 г/л глюконовой кислоты, с выделением штаммов, которые образовывали колонии быстрее контрольной группы, не обработанной при помощи NTG. В случае контрольной группы средний диаметр колоний, образованных за 60 часов, составлял примерно 0,5 мм, тогда как в случае обработанной NTG-группы диаметр колоний достигал 1 мм в течение 40 часов культивирования. Среди этих колоний обнаружили колонию, имеющую темно-желтый цвет, в отличие от контрольной группы, и таким образом предположили, что мог быть получен мутант, имеющий новый признак. Этот штамм назвали "Corynebacterium glutamicum СА01-2183", или"КРСС10881-YC", и исследовали причину развития цвета. Мутантный штамм KFCC10881-YC депонировали при помощи Корейского Центра Культур Микроорганизмов (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) 11 ноября, 2011 г. под регистрационным номером КССМ11223Р.

Состав среды в чашке Петри (рН 7,0)

20 г глюконовой кислоты, 50 г (NH4)2SO4, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 5 г KH2PO4, 10 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4·7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиаминхлорида, 2000 мкг пантотената кальция, 2000 мкг никотинамида и 20 г агара (на литр дистиллированной воды).

Пример 2: Анализ способности KFCC10881-YC продуцировать лизин и исследование причины развития цвета

С целью исследования характеристик штамма KFCC10881-YC, полученного в Примере 1 выше, для сравнения его способности продуцирования лизина, штамм культивировали как описано ниже, а также анализировали компоненты среды культивирования.

Конкретно, каждый штамм засевали в 250 мл колбу с уголковой перегородкой, содержащую 25 мл посевной среды, и потом культивировали при 30°С в течение 20 часов при встряхивании со скоростью 200 об/мин. Затем 1 мл посевной культуры засевали в 250 мл колбу с уголковой перегородкой, содержащую 24 мл продуцирующей среды, и культивировали при 30°С в течение 72 часов при встряхивании со скоростью 200 об/мин. Составы посевной среды и продуцирующей среды являются следующими.

Состав посевной среды (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH2PO4, 8 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4·7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (на литр дистиллированной воды)

Состав продуцирующей среды (рН 7,0)

100 г глюкозы, 40 г (NH4)2SO4, 2,5 г соевого экстракта, 5 г твердого кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г KH2PO4, 0,5 г MgSO4·7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида и 30 г СаСО3 (на литр дистиллированной воды).

После завершения культивирования штамм KFCC10881-YC сохранял темно-желтый цвет, и супернатант культуры также имел темно-желтый цвет, в отличие от среды культивирования контрольного KFCC10881. Таким образом, авторы настоящего изобретения предположили, что вещество, вызывающее развитие такого цвета, может содержаться в среде культивирования. Для проверки этого предположения анализировали концентрации каротиноидов и рибофлавина, которые влияют на развития цвета у микроорганизма. В результате концентрация рибофлавина в среде культивирования показала явное отличие от его концентрации в контроле и отсутствие значимого различия в концентрации каротиноидов. Концентрации L-лизина и рибофлавина, анализированные посредством ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), показаны в Таблице 1 ниже.

В результате, как видно из Таблицы 1, средняя концентрация L-лизина в KFCC10881-YC была аналогична таковой в продуцирующем L-лизин штамме KFCC10881, но средняя концентрация рибофлавина в KFCC10881-YC повышалась в 57 раз. Таким образом, можно видеть, что темно-желтый цвет колонии, который является особой характеристикой, отличающейся от родительского штамма, свойственен повышенной концентрации рибофлавина.

Пример 3: Исследование модификации в промоторе выше rib-оперона штамма, продуцирующего рибофлавин в высокой концентрации, и конструирование вектора для хромосомной интеграции модифицированного промотора (Pmrb)

С целью изучения нуклеотидной мутации, которая индуцировала изменение цвета и повышала способность продуцировать рибофлавин в штамме KFCC10881-YC, полученном в Примере 1, определяли нуклеотидную последовательность хромосомного участка, связанного с биосинтезом рибофлавина, в штамме KFCC10881-YC Corynebacterium glutamicum и подтверждали на основе базы данных NIH GenBank.

В результате обнаружили, что нуклеотидные остатки с -10го по -16й из инициирующего кодона гена rpe, расположенного выше rib-оперона, имели замену G- на -А и замену G- на -Т, соответственно. Промотор, имеющий две нуклеотидные замены в предполагаемом участке промотора rib-оперона, назвали "Pmrb" (SEQ ID NO: 5).

С целью изучения эффекта увеличения концентрации рибофлавина при увеличении активности индуцирования экспрессии и ферментной активности промотора Pmrb, имеющего нуклеотидные замены, конструировали вектор для включения промотора в хромосому.

На основе приведенной нуклеотидной последовательности синтезировали праймер, имеющий сайт рестрикционного фермента EcoRI, вставленный на 5′-конце, и праймер, имеющий сайт рестрикционного фермента Sall, вставленный на 3′-конце (SEQ ID NO: 7 и 8). Используя промоторы, выполняли ПЦР (полимеразную цепную реакцию) при помощи хромосомы KFCC10881-YC в качестве матрицы для амплификации примерно 650 пар нуклеотидных оснований фрагмента гена Pm-rpe, включая область из 350 пар нуклеотидных оснований, как предполагается, промотора rib-оперона. ПЦР выполняли при следующих условиях: первичная денатурация при 94°С в течение 5 минут и затем 30 циклов, где каждый состоит из денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 40 с с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 7 мин. Праймеры, используемые в ПЦР, являются следующими.

SEQ ID NO: 7: 5′-TTTGAATTCGTGTGCGTGCAGGTTTCTC-3′

SEQ ID NO: 8: 5′-TTTGTCGACATTCCGCTAAAACACGT-3′

Фрагмент гена, амплифицированный посредством ПЦР, обрабатывали при помощи рестрикционных ферментов EcoRI и Sall для получения фрагмента ДНК, который затем лигировали при помощи вектора pDZ (корейский патент №2009-0094433), который имеет сайты EcoRI и Sall на концах, для включения в хромосому. Затем вектор трансформировали в Е. coli DH5a, которую затем помещали на твердую среду Лурия-Бертани (LB), содержащую канамицин (25 мг/л). Колонию, трансформированную при помощи вектора, содержащего целевой ген, отбирали посредством ПЦР и затем получали плазмиду, используя обычный способ выделения плазмид, известный в данной области техники. Эту плазмиду назвали "pDZ-Pmrb" (ФИГ. 3).

Пример 4: Конструирование штамма, содержащего Pmrb, включенный в хромосому штамма выше rib-оперона, продуцирующего высококонцентрированный лизин, и сравнение продуктивностей лизина и рибофлавина

Вектор pDZ-Pmrb, полученный в Примере 3, трансформировали в продуцирующий L-лизин штамм Corynebacterium glutamicum KFCC10881 путем гомологичной рекомбинации между хромосомами. Потом штамм, содержащий мутацию промотора rib-оперона, введенную в хромосому, отделяли на основе изменения цвета колоний и культивировали таким же образом, как описано в Примере 2, и анализировали концентрации L-лизина и рибофлавина, извлеченных из культуры (Таблица 2). Штамм, в который вводили мутацию промотора rib-оперона, назвали "Corynebacterium glutamicum СА01-2162" или "KFCC10881::Pmrb". Мутантный штамм, KFCC10881::Pmrb, депонировали при помощи Корейского Центра Культур Микроорганизмов (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) 11 Ноября, 2011 г. под регистрационным номером KCCM11221P.

В результате, как видно из Таблицы 2 выше, средняя концентрация L-лизина в случае KFCC10881::Pmrb (тестируемая группа 4), введенного при помощи промотора Pmrb, имеющего две мутации замены нуклеотида, не изменялась по сравнению с таковой в контрольном KFCC10881 (тестируемая группа 3), имеющем промотор гена rpe дикого типа, но средняя концентрация рибофлавина в тестируемой группы 4 повышалась примерно в 61 раз.

Пример 5: Конструирование вектора для включения сильного промотора (LysCP1) выше ribG в rib-оперон

Для сверхэкспрессирования только группы генов биосинтеза рибофлавина за исключением гена rpe, сильный промотор, полученный из Corynebacterium, лигировали в инициирующий кодон гена ribG (SEQ ID NO: 4), расположенный в передней части семейства генов биосинтеза rib, конструируя таким образом рекомбинантный вектор для индуцирования экспрессии семейства генов биосинтеза рибофлавина.

Для получения фрагмента гена ribG, произведенного из Corynebacterium glutamicum, получали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KFCC10881 в качестве матрицы и синтезировали праймеры (SEQ ID NO: 9 и 10), сконструированные так, чтобы иметь сайт рестрикционного фермента EcoRI на 5-конце и сайт рестрикционного фермента Xbal на 3′-конце. ПЦР выполняли, используя синтезированные праймеры, с получением фрагмента ДНК, содержащего сайт с 300-ми парами нуклеотидных оснований выше инициирующего кодона гена ribG. Также синтезировали праймеры (SEQ ID NO: 11 и 12), сконструированные так, чтобы иметь сайты Xbal и Ndel рестрикционного фермента на 5′-конце и сайт Sall рестрикционного фермента на 3′-конце, и выполняли ПЦР, используя синтезированные праймеры, с получением фрагмента с 300-ми парами нуклеотидных оснований, содержащего инициирующий кодон гена ribG. ПЦР выполняли при следующих условиях: первичная денатурация при 94°С в течение 5 мин и затем 30 циклов, где каждый состоит из денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 30 с с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 7 мин. Два продукта ПЦР обрабатывали при помощи EcoRI и Xbal, и Xbal и Sall, соответственно, и затем лигировали при помощи фрагмента ДНК, полученного путем обработки вектора pDZ рестрикционными ферментами Sall и EcoRI, конструируя таким образом вектор pDZ-ribG. Последовательности праймеров, используемых в этой ПЦР, являются следующими:

SEQ ID NO: 9: 5′-TTTGAATTCGTGTGCGTGCAGGTTTCTCC-3′

SEQ ID NO: 10: 5′-TTTCTAGATTACTGCGCGAGTGCTC-3′

SEQ ID NO: 11: 5′-TTTTCTAGATAACATATGGATGTTGCGCACGCG-3′

SEQ ID NO: 12: 5′-TTTGTCGACATTGGCGTAAAACACGT-3′

Синтезировали праймеры (SEQ ID NO: 13 и 14), сконструированные для амплификации произведенного из Corynebacterium glutamicum промотора lysCP1 (SEQ ID NO: 6) и имеющие сайт рестрикционного фермента Xbal, вставленный на 5-конце, и сайт рестрикционного фермента Ndel, вставленный на 3′-конце. Используя праймеры, выполняли ПЦР с хромосомной ДНК штамма Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы для амплификации фрагмента промотора с примерно 400 парами нуклеотидных оснований. ПЦР выполняли при следующих условиях: первичная денатурация при 94°С в течение 5 мин и затем 30 циклов, где каждый состоит из денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 58°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 30 с с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 7 мин. Продукт амплификации ПЦР обрабатывали при помощи Xbal и Ndel и затем лигировали при помощи фрагмента ДНК, полученного обработкой вектора pDZ-ribG при помощи Xbal и Ndel, конструируя таким образом вектор pDZ-lysCP1_ribG (ФИГ. 4). Последовательности праймеров, используемых в ПЦР, являются следующими:

SEQ ID NO: 13: 5′-TTTTCTAGATAGGGAGCCATCTTTTGGGG-3′

SEQ ID NO: 14: 5′-TTTCATATGCTTTGTGCACCTTTCG-3′

Пример 6: Сравнение продуктивностей лизина и рибофлавина в штамме, имеющем сильный промотор (LysCP1), введенный выше ribG

Вектор pDZ-lysCP1_ribG, полученный в Примере 5, трансформировали в продуцирующий L-лизин штамм Corynebacterium glutamicum KFCC10881 посредством способа электрических импульсов. Селективно выделяли штамм, имеющий замещение lysCP1 для свойственного микроорганизму промотора хромосомного гена ribG, таким образом получая KFCC10881::lysCP1_ribG, который продуцирует и L-лизин, и рибофлавин. Этот штамм культивировали таким же образом, как описано в Примере 2, и анализировали концентрации L-лизина и рибофлавина в среде культивирования (Таблица 3). Штамм KFCC10881::lysCP1_ribG назвали "Corynebacterium glutamicum СА01-2161" или "KFCC10881::lysCP1_ribG". Этот мутантный штамм, KFCC10881::lysCP1_ribG, депонировали при помощи Корейского Центра Культур Микроорганизмов (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) 11 Ноября 2011 г. под регистрационным номером КССМ11220Р.

В результате, как показано в Таблице 3 выше, при сверхэкспрессировании RibG, используя промотор lysCP1 (тестируемая группа 6), средняя концентрация L-лизина редко изменялась по сравнению с таковой в контрольном KFCC10881 (тестируемая группа 5), имеющем промотор дикого типа, но концентрация рибофлавина повышалась примерно в 73 раза.

Таким образом, можно видеть, что когда сверхэкспрессировали оперон биосинтеза рибофлавина с использованием гетерогенного промотора, продуцирование рибофлавина можно было значительно повышать без влияния на продуцирование лизина, и так как активность промотора в индуцировании экспрессии становилась сильнее, продуцирование рибофлавина повышалось посредством сверхэкспрессии семейства генов биосинтеза рибофлавина.

Пример 7: Сравнение продуктивностей лизина и рибофлавина у штамма, имеющего повышенное число копий rib-оперона

Плазмиду, содержащую rib-оперон, вводили в штамм KFCC10881 для увеличения числа копий гена биосинтеза рибофлавина и исследовали способность штамма к продуцированию рибофлавина.

На основе приведенной нуклеотидной последовательности синтезировали праймер, имеющий сайт рестрикционного фермента Xbal, вставленный в 5′-конец, и праймер, имеющий такой же сайт рестрикционного фермента, вставленный в 3′-конец (SEQ ID NO: 15 и 16), и, используя эти праймеры, выполняли ПЦР с хромосомой KFCC10881 в качестве матрицы с амплификацией примерно 4500 пар нуклеотидных оснований rib-оперона. ПЦР выполняли при следующих условиях: первичная денатурация при 94°С в течение 5 мин и затем 30 циклов, где каждый состоит из денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 4 мин, с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 7 мин. Последовательности праймеров, используемых в ПЦР, являются следующими:

SEQ ID NO: 15: 5′-TTGGTACCGATTGAAAAGTCCGTGCGTG-3′;

SEQ ID NO: 16: 5′-TTTGGTACCCGCGATC I I I I ICAGAAACT-3′

Фрагмент гена, амплифицированного посредством ПЦР, обрабатывали при помощи рестрикционного фермента Xbal с получением фрагмента ДНК. Фрагмент ДНК лигировали при помощи вектора pECCG117, имеющего сайты рестрикции Xbal на концах, и вектор трансформировали в Е. coli DH5α, затем помещали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Потом колонию, трансформированную при помощи вектора, содержащего целевой ген, отбирали посредством ПЦР и затем получали плазмиду, используя обычный способ выделения плазмиды, известный в данной области техники. Эту плазмиду назвали "pECCG117-rib".

Вектор pECCG117-rib, полученный как описано выше, вводили в штамм KFCC10881 путем способа электрических импульсов и культивировали таким же образом, как описано в Примере 2, и анализировали концентрации L-лизина и рибофлавина в среде культивирования (Таблица 4).

В результате, как видно в Таблице 4 выше, в том случае, когда число копий rib-оперона повышали посредством включения плазмиды (тестируемая группа 8), средняя концентрация L-лизина редко изменялась по сравнению с таковой для контрольного KFCC10881::pECCG117 (тестируемая группа 7), не содержащего rib-оперон, но концентрация рибофлавина повышалась примерно в 66 раз.

Таким образом, можно видеть, что при сверхэкспрессировании гена биосинтеза рибофлавина посредством увеличения числа копий оперона биосинтеза рибофлавина, используя плазмиду, продуцирование рибофлавина в штамме может быть значительно повышено без влияния на продуцирование лизина.

Пример 8: Конструирование путем искусственного мутагенеза устойчивого к AHV штамма, продуцирующего L-треонин

В этом Примере с целью увеличения способности Corynebacterium glutamicum продуцировать L-треонин, выполняли эксперимент для придания устойчивости к аналогу L-треонина AHV (2-амино-3-гидрокси-валерату). Конкретно, искусственную мутацию в KFCC10881 в качестве родительского штамма индуцировали посредством N-метил-N-нитро-N-нитрогуанидина (NTG), и затем штамм культивировали в минимальной среде, содержащей 1-10 г/л AHV, в то время пока образовывались колонии при различных концентрациях AHV, и анализировали в сравнении с контрольной группой, не обработанной NTG. Контрольная группа, не обработанная NTG, показала устойчивость к 1-3 г/л AHV при 72 часах культивирования, но в группе, обработанной NTG, колонии образовывались вплоть до концентрации AHV, составлявшей 6 г/л за тот же самый период времени. С целью изучения того, повышалась или нет способность штаммов продуцировать L-треонин, штаммы культивировали следующим образом и анализировали продуцирование L-треонина.

Каждый из штаммов засевали в 250 мл колбу с уголковой перегородкой, содержащую 25 мл посевной среды, и культивировали при 30°С в течение 20 часов при встряхивании со скоростью 200 об/мин. После этого, 1 мл посевной культуры засевали в 250 мл колбу с уголковой перегородкой, содержащую 24 мл продуцирующей среды, и культивировали при 30°С в течение 48 часов при встряхивании со скоростью 200 об/мин. Составы посевной среды и продуцирование среды являлись следующими.

Состав минимальной среды (рН 7,2)

5 г глюкозы, 1 г KH2PO4, 5 г (NH4)2SO4, 0,4 г MgSO4·7H2O, 0,5 г NaCl, 200 мкг биотина, 100 мкг тиамин HCl, 100 мкг пантотената кальция, 0,03 г никотинамида, 0,01 г L-треонина, 2 г мочевины, 0,09 мг Na2B4O7·10H2O, 0,04 мг (NH4)6Mo7O27·4H2O, 0,01 мг ZnSO4·7H2O, 0,01 мг CuSO4·5H2O, 0,01 мг MnCl2·4H2O, 1 мг FeCl3·6H2O и 0,01 мг CaCl2 (на литр дистиллированной воды).

Состав посевной среды (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH2PO4, 8 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4·7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (на литр дистиллированной воды).

Состав продуцирующей среды (рН 7,0)

100 г глюкозы, 20 г (NH4)2SO4, 2,5 г соевого белка, 5 г твердого кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г КН2РО4, 0,5 г MgSO4·7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамин HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида и 30 г СаСО3 (на литр дистиллированной воды).

После завершения культивирования анализировали посредством ВЭЖХ концентрацию L-треонина в среде культивирования и мутантный штамм, показывающий самую высокую способность продуцирования L-треонина, назвали "Corynebacterium glutamicum СА01-2182" или "KFCC10881-THR". Мутантный штамм, KFCC10881-THR, депонировали при помощи Корейского Центра Культур Микроорганизмов (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) 11 Ноября 2011 г. под регистрационным номером КССМ11222Р. Способность KFCC10881-THR продуцировать L-треонин показана в Таблице 5 ниже.

В Таблице 5 выше тестируемая группа 9 показывает среднюю концентрацию L-треонина в контрольном KFCC10881, и тестируемая группа 10 показывает среднюю концентрацию L-треонина в KFCC10881-THR.

В результате, как видно из Таблицы 5 выше, продуцирование L-треонина в KFCC10881-THR повышалось примерно на 5,6 г/л по сравнению с таковым в KFCC10881.

Пример 9: Конструирование штаммов включением сильного промотора выше rib-оперона или выше ribG в хромосоме, и сравнение продуктивностей треонина и рибофлавина

Каждый из вектора pDZ-Pmrb, полученного в Примере 3, и вектора pDZ-lysCP1_ribG, полученного в Примере 5, трансформировали в продуцирующий L-треонин штамм KFCC10881-THR (полученный в Примере 8) посредством способа электрических импульсов. Потом штамм, имеющий замещение Pmrb для промотора дикого типа хромосомного гена rpe, или штамм, имеющий замещение lysCP1 для промотора дикого типа гена ribG, селективно выделяли и культивировали таким же образом, как описано в Примере 7. Анализировали концентрации L-треонина и рибофлавина в среде культивирования (Таблица 6).

В результате, как видно из Таблицы 6 выше, в случае KFCC10881::Pmrb (тестируемая группа 12), содержащего промотор Pmrb, имеющий две мутации замены нуклеотида, и KFCC10881-THR::lysCP1_ribG (тестируемая группа 13), имеющего RibG, сверхэкспрессированный посредством промотора lysCP1, средние концентрации L-треонина в мутантных штаммах редко изменялись по сравнению в таковыми в контрольном KFCC10881-THR (тестируемая группа 11), имеющим промоторы дикого типа генов rpe и ribG, но средние концентрации рибофлавина в мутантных штаммах повышались примерно в 56 раз и в 66 раз, соответственно.

Описанные выше результаты означают, что при сверхэкспрессировании оперона биосинтеза рибофлавина продуцирование рибофлавина можно значительно повышать без влияния на продуцирование L-треонина, продуцируя, в силу этого, L-треонин и рибофлавин в одно и то же время. Таким образом, можно видеть, что так как активность индуцирования экспрессии промотором оперона биосинтеза рибофлавина в продуцирующем L-треонин штамме становится сильнее, продуцирование рибофлавина повышается посредством сверхэкспрессии семейства генов биосинтеза рибофлавина.

1. Способ продуцирования L-лизина и рибофлавина или L-треонина и рибофлавина, включающий:
культивирование модифицированного микроорганизма, который модифицирован путем усиления активности семейства ферментов биосинтеза рибофлавина в микроорганизме рода Corynebacterium, обладающего способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне; и
продуцирование L-лизина и рибофлавина или L-треонина и рибофлавина посредством ферментационного процесса.

2. Способ по п. 1, где микроорганизм рода Corynebacterium выбран из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum и Brevibacterium lactofermentum.

3. Способ по п. 2, где микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.

4. Способ по п. 1, где соотношение L-лизин:рибофлавин или L-треонин:рибофлавин составляет 1:0,0001-0,1.

5. Способ по п. 1, дополнительно включающий гранулирование ферментированной среды культивирования, содержащей L-лизин и рибофлавин или L-треонин и рибофлавин.

6. Способ по п. 1, дополнительно включающий удаление бактериального осадка из ферментированной среды культивирования, содержащей L-лизин и рибофлавин или L-треонин и рибофлавин.

7. Модифицированный штамм Corynebacterium glutamicum КССМ11223Р, продуцирующий L-лизин и рибофлавин, который модифицирован путем индуцирования случайной мутации в микроорганизме Corynebacterium glutamicum, обладающем способностью продуцирования высококонцентрированного L-лизина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина на высоком уровне.

8. Модифицированный микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования одновременно L-лизина и рибофлавина или L-треонина и рибофлавина, который модифицирован путем усиления активности семейства ферментов, экспрессируемого посредством rib-оперона, содержащего семейство генов биосинтеза рибофлавина, в микроорганизме рода Corynebacterium, обладающем способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне.

9. Микроорганизм по п. 8, где микроорганизм рода Corynebacterium выбран из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum и Brevibacterium lactofermentum.

10. Микроорганизм по п. 8, где микроорганизм имеет усиленную активность семейства фермента, экспрессируемого семейством генов биосинтеза рибофлавина.

11. Микроорганизм по п. 10, где усиление активности семейства ферментов выполнено одним или более способами, выбранными из группы, состоящей из способа увеличения числа внутриклеточных копий гена, кодирующего каждый фермент указанного семейства ферментов, способа включения мутации в регуляторную последовательность хромосомного гена, кодирующего каждый фермент указанного семейства ферментов, способа замены регуляторной последовательности хромосомного гена, кодирующего каждый фермент указанного семейства ферментов, последовательностью, имеющей сильную активность, способа замещения хромосомного гена, кодирующего фермент, мутированным геном для увеличения активности указанного семейства ферментов и способа включения мутации в хромосомный ген, кодирующий каждый фермент указанного семейства ферментов для усиления активности указанного семейства генов.

12. Микроорганизм по п. 11, где регуляторная последовательность хромосомных генов, кодирующих указанное семейство ферментов, заменена сильным промотором.

13. Микроорганизм по п. 12, где промотор представляет собой промотор, определенный в SEQ ID NO: 5 или 6.

14. Микроорганизм по п. 8, где модифицированный микроорганизм представляет собой микроорганизм для продуцирования одновременно L-лизина и рибофлавина, который модифицирован путем усиления активности семейства ферментов, экспрессируемого посредством rib-оперона, содержащего семейство генов биосинтеза рибофлавина, в микроорганизме рода Corynebacterium, обладающем способностью продуцирования L-лизина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина на высоком уровне, и депонирован под регистрационным номером КССМ11220Р, КССМ11221Р или КССМ11223Р.

15. Микроорганизм по п. 8, где микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий способностью продуцирования L-треонина, представляет собой микроорганизм, депонированный под регистрационным номером КССМ11222Р.

16. Гранулированная композиция для использования в качестве корма для животных или кормовой добавки, полученная способом, включающим:
а) культивирование модифицированного микроорганизма, который модифицирован путем усиления активности семейства ферментов биосинтеза рибофлавина в микроорганизме рода Corynebacterium, обладающего способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L-треонина на высоком уровне; и продуцирование L-лизина и рибофлавина или L-треонина и рибофлавина посредством ферментационного процесса; и
б) гранулирование ферментированной среды культивирования со стадии а), которая содержит L-лизин и рибофлавин или L-треонин и рибофлавин.

17. Гранулированная композиция по п. 16, где соотношение L-лизин:рибофлавин или L-треонин:рибофлавин составляет 1:0,0001-0,01.

18. Гранулированная композиция по п. 16 или 17, где способ дополнительно включает удаление бактериального осадка из ферментированной среды культивирования со стадии а), которая содержит L-лизин и рибофлавин или L-треонин и рибофлавин.

19. Композиция для использования в качестве корма для животных или кормовой добавки, содержащая L-лизин и рибофлавин или L-треонин и рибофлавин, полученная способом, включающим:
а) культивирование модифицированного микроорганизма, который модифицирован путем усиления активности семейства ферментов биосинтеза рибофлавина в микроорганизме рода Corynebacterium, обладающего способностью продуцирования L-лизина или L-треонина, чтобы увеличивать продуцирование рибофлавина при сохранении продуцирования L-лизина или L треонина на высоком уровне; и продуцирование L-лизина и рибофлавина или L-треонина и рибофлавина посредством ферментационного процесса; и
б) удаление бактериального осадка из ферментированной среды культивирования со стадии а), которая содержит L-лизин и рибофлавин или L-треонин и рибофлавин.

20. Композиция по п. 19, где соотношение L-лизин:рибофлавин или L-треонин:рибофлавин составляет 1:0,0001-0,01.

21. Кормовая добавка, содержащая гранулированную композицию по п. 16 или 18 или композицию по п. 19, которая содержит L-лизин и рибофлавин или L-треонин и рибофлавин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой модифицированный Corynebacterium glutamicum, способный продуцировать L-лизин посредством утилизации ксилозы, в который введены активности ксилозоизомеразы (XylA) и ксилулокиназы (XylB), имеющие происхождение из Erwinia carotovora.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ получения бактерии Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum с повышенным уровнем синтеза L-лизина, включающий высев культуры бактерии Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, способной продуцировать L-лизин, на среду, содержащую фузидиновую кислоту, и отбор среди выросших колоний таких, которые обладают повышенным уровнем синтеза L-лизина.

Изобретение относится к области биохимии и представляет собой способ получения L-аминокислоты - L-лизина, L-треонина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-метионина или L-изолейцина - предусматривающий культивирование бактерии Escherichia coli в среде для получения и накопления L-аминокислоты и сбор L-аминокислоты.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ микробиологического синтеза L-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в которой ген fumA инактивирован.
Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биохимии. .
Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Предложены варианты способа получения тетрапиррольного соединения и бактериальная клетка для его получения. Способ предусматривает выращивание бактериальных клеток Escherichia coli в среде культивирования с получением целевого соединения из среды культивирования.

Группа изобретений относится к генетически модифицированной клетке для продуцирования фукозилированных олигосахаридов, способу ее получения и способу получения фукозилированных олигосахаридов.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой модифицированный Corynebacterium glutamicum, способный продуцировать L-лизин посредством утилизации ксилозы, в который введены активности ксилозоизомеразы (XylA) и ксилулокиназы (XylB), имеющие происхождение из Erwinia carotovora.

Изобретение относится к областям биологии и генетической инженерии. Предложен выделенный пептид для терапевтических целей, содержащий последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную SEQ ID NO:4 (GG00444), или его фрагмент или вариант, способные связываться со слизью кишечника человека, а также содержащая его ворсинчатая структура, пищевой продукт, фармацевтическая композиция, полинуклеотид, экспрессионный вектор, клетка-хозяин, кластер генов, антитело, способ лечения и способ скрининга пробиотических бактериальных штаммов.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к рекомбинантной продукции белков человека, и может быть использовано для получения белка SLURP-2 человека.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к полинуклеотиду, который кодирует полипептидный клостридиальный нейротоксин, а также к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим указанный полинуклеотид.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантной продукции белков, и может быть использовано для получения антимикробного пептида аципенсина-1 русского осетра Acipenser gueldenstaedtii.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению модифицированного vWF, и может быть использовано в медицине для лечения гемофилии.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и касается штамма-продуцента безметионинового белка CRM197. Предложенный штамм получен на основе клеток Escherichia coli BL21 (DE3) и содержит плазмидную ДНК pETDuet-1, включающую ген, с которого синтезируется белок CRM197, и дополнительно ген, с которого синтезируется метиониновая аминопептидаза E.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой модифицированный полинуклеотид, кодирующий аспартаткиназу (LysC), где инициирующий кодон полинуклеотида заменен на ATG. Изобретение относится также к вектору экспрессии, содержащему такой модифицированный полинуклеотид, а также к модифицированному микроорганизму рода Corynebacterium для продукции L-лизина, который обладает повышенной активностью аспартаткиназы по сравнению с ее эндогенной активностью, где инициирующий кодон полинуклеотида, кодирующего аспартаткиназу, заменен на ATG. Изобретение позволяет получать L-лизин с высокой продуктивностью. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 10 табл., 11 пр.
Наверх