Способ контроля эффективности облучения донорской крови с помощью реакции активации лимфоцитов фитогемагглютинином



 


Владельцы патента RU 2589281:

Коченгина Светлана Александровна (RU)
Казачкова Алена Евгеньевна (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии, и может быть использовано для контроля эффективности облучения донорской крови. Способ включает постановку реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином и учет результатов реакции путем определения индекса стимуляции лимфоцитов. Постановку реакции проводят в отношении облученной донорской крови, учет результатов выполняют с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, при этом в качестве контроля берут необлученный образец той же крови. После чего определяют эффективность облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови как Эоб=Сднтло-Сднтлк, где Эоб - эффективность облучения, Сднтло - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в опыте (в проверяемой облученной крови), Сднтлк - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в контроле (в необлученном образце той же крови). При разнице с контролем более чем в 50% делают вывод о функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента. Использование данного способа позволяет определять эффективность облучения донорской крови методом проточной цитометрии.

 

Изобретение относится к иммунологическим методам исследования крови и может использоваться для определения пригодности донорской крови для переливания пациенту.

Известно, что наиболее грозным осложнением гемотрансфузий с 90% летальностью является реакция трансплантат против хозяина (РТПХ). Решающую роль в развитии данной реакции играют цитотоксические лимфоциты донора CD3+CD8+ в присутствии Т-хелперов (CD3+CD4+). Описан случай развития РТПХ после переливания фильтрованной крови. Единственным надежным способом профилактики данного осложнения гемотрансфузий является облучение донорской крови. В результате облучения число и соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов принципиально не изменяется. Эффективность облучения контролируется биологическими детекторами доз облучения. Иммунологических способов контроля эффективности облучения, аналогичных предложенному, неизвестно.

Известен способ бластной трансформации лимфоцитов крови и лимфоидных органов свиней (см. «Методические рекомендации по изучению клеточного иммунитета у свиней при вирусных инфекциях» Сост.: А.А. Коломыцев, В.В. Макаров, В.И. Попов. - Покров, 1988. - С. 65-69).

В известном способе лимфоциты из лимфоидных органов выделяют методом измельчения их в питательной среде с последующим ресуспендированием клеток и подсчетом их концентрации. Из периферической крови лимфоциты выделяют с помощью дифференциального центрифугирования форменных элементов в градиенте плотности 17% верографина. После отмывания лимфоцитов крови и лимфоидных органов центрифугированием в питательной среде доводят концентрацию клеток до рабочей - 2×106 кл/мл питательной среды. При постановке реакции в четыре контрольные пробирки вносят по 0,5 мл рабочей суспензии лимфоцитов, 0,2 мл сыворотки свиней и по 0,3 мл питательной среды. В четыре опытные пробирки вносят по 0,5 мл суспензии лимфоцитов, 0,2 мл сыворотки свиней, 0,2 мл питательной среды и по 0,1 мл раствора митогена фитогемагглютинина в разведении 1:100. Опытные и контрольные пробирки инкубируют в термостате при 37-38°C в течение 72 часов.

Учет результатов реакции бластной трансформации лимфоцитов проводят радиометрическим способом в жидкостном сцинтиляционном β-счетчике. Включение радиоактивной метки в лимфоцитах, трансформирующихся в бласты, выражают в импульсах в минуту. Подсчитывают среднее количество импульсов радиоактивной метки с лимфоцитов в опытных и контрольных пробирках с последующим определением индекса стимуляции по формуле:

Известный метод не обладает достаточной чувствительностью для оценки иммунного статуса других животных, в частности норок.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является «Способ определения индекса стимуляции лимфоцитов для оценки иммунного статуса норок», описанный в з. №2003114790 по кл. G01N 30/48, з. 19.05.03, оп. 27.10.05 и выбранный в качестве прототипа.

Известный способ определения индекса стимуляции лимфоцитов для оценки иммунного статуса норок включает выделение лимфоцитов из периферической крови и лимфоидных органов, доведение их концентрации до рабочей, постановку реакции бласттрансформации с митогеном фитогемагглютинином, инкубацию лимфоцитов и учет результатов реакции радиометрическим способом и отличается тем, что концентрацию лимфоцитов доводят до рабочей концентрации 10-15×106 кл/мл, а инкубацию лимфоцитов осуществляют в течение 48-54 часов при температуре 37,5-40,0°C, индекс стимуляции лимфоцитов определяют по формуле:

Недостатком известного способа является его сложность, обусловленная определением учета результатов радиометрическим способом, достаточно непростым для широкого внедрения его в лабораторную практику, а также необходимостью получения весьма высокой концентрации лимфоцитов (10-15×106 кл/мл). Кроме того, его эксплуатационные возможности ограничены, т.к. он предназначен только для оценки иммунного статуса животных (норок), т.е. состояния их здоровья.

Задачей является обеспечение возможности использования способа для контроля качества донорской крови при упрощении способа.

Поставленная задача решается тем, что в способе контроля эффективности облучения донорской крови с помощью реакции активации лимфоцитов фитогеммагглютинином, включающем постановку реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином и учет результатов реакции путем определения индекса стимуляции лимфоцитов, СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ постановку реакции проводят в отношении облученной донорской крови, учет результатов выполняют с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, при этом в качестве контроля берут необлученный образец той же крови, после чего определяют эффективность облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови как:

Эоб.=Сднтло-Сднтлк, где

Эоб- эффективность облучения,

Сднтло - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8 - в опыте (в проверяемой облученной крови),

Сднтлк - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8 - в контроле (в необлученном образце той же крови),

и при разнице с контрольной более чем в 50% делают вывод о функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента.

Постановка в заявляемом способе реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином в отношении облученной донорской крови в совокупности с выполнением учета результатов реакции с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, использованием при этом в качестве контроля необлученного образца той же крови и последующей оценкой эффективности облучения крови как разности процентного содержания в ней дубль-негативных Т-лимфоцитов в сравнении с необлученной позволяет достаточно просто и надежно определять качество облученной донорской крови.

Технический результат - возможность простой и надежной оценки качества донорской крови.

Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него такими существенными признаками, как проведение постановки реакции в отношении облученной донорской крови, выполнение учета результатов с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, использование в качестве контроля необлученного образца той же крови, определение эффективности облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови по приведенной выше формуле и последующая оценка эффективности облучения крови как разности процентного содержания в ней дубль-негативных Т-лимфоцитов в сравнении с необлученной, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата.

Хотя отдельные операции предлагаемого способа, такие как использование для учета результатов проточного цитофлюориметра, проведение гейтирования лейкоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 (см. книгу Луговская М.Е. и др. «Иммунофенотипирование в диагностике гемобластов», 2005 г. ), определение дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD+CD4-CD8 (см. книгк Ярилин А.А. «Основы иммунологии», Москва, 1999 г. ) известны, однако совокупное использование указанных отличительных признаков, позволяющее достаточно просто и надежно оценить качество переливаемой крови с точки зрения безопасности ее использования для пациента, неочевидно для специалиста среднего уровня, поэтому заявитель считает, что его техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может найти широкое применение в медицине для исследования донорской крови, поэтому он соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемый способ заключается в следующем.

Проводят постановку реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином в отношении облученной донорской крови. Учет результатов выполняют с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-. При этом в качестве контроля берут необлученный образец той же крови. После этого определяют эффективность облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови как:

Эоб.=Сднтло-Сднтлк, где

Эоб - эффективность облучения,

Сднтло - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в опыте (в проверяемой облученной крови),

Сднтлк - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в контроле (в необлученном образце той же крови),

При разнице с контрольной более чем в 50% делают вывод о функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента.

На практике заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Облученную донорскую кровь для исследования в стерильных условиях вносят в вакуэт с гепарином.

Для выделения лейкоцитов крови в ламинарном шкафу готовят культуральную смесь из расчета на 1 исследование: культуральная среда RPMI-1640 - 5 мл; эмбриональная телячья сыворотка - 1 мл; глютамин - 0,1 мл; антибиотик и антимикотик - 0,1 мл, ФГА - 0,5 мл.

В стерильный культуральный флакон с подогретой до 37°C культуральной смесью вносят 0,5 мл исследуемой крови и инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 48 часов.

Надосадочную жидкость удаляют из флакона водоструйным насосом, осадок ресуспендируют и используют для исследования на проточном цитофлюориметре BD CANTO II.

В качестве негативного контроля исследуют необлученный образец той же крови, с которым проведена аналогичная пробоподготовка (культивирование с ФГА 48 часов).

Доводят концентрацию лейкоцитов в исследуемых образцах до 5-6 кл. * 109/л с помощью разводящего раствора BD.

В реакционные пробирки BD вносят по 50 мкл исследуемых образцов крови и по 5 мкл 6-цветного реагента BD, содержащего моноклональные антитела, меченные разными флюорохромами, к следующим рецепторам: CD45; CD3; CD4; CD8; CD19: CD16+56. Инкубируют в темноте при комнатной температуре 15 минут. Добавляют лизирующий раствор, инкубируют 10 минут.

Результат определяют с помощью проточного цитофлюориметра BD CANTO II, программы DIVA, регистрируя стандартные 10000 событий.

Для оценки результатов исследования проводят гейтирование активированных лейкоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определяют среди них процент дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-. Разница с контролем более чем в 50% является доказательством функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и показателем иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента.

В сравнении прототипом заявляемый способ может использоваться для контроля качества донорской крови и является более простым.

Способ контроля эффективности облучения донорской крови с помощью реакции активации лимфоцитов фитогемагглютинином, включающий постановку реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином и учет результатов реакции путем определения индекса стимуляции лимфоцитов, отличающийся тем, что постановку реакции проводят в отношении облученной донорской крови, учет результатов выполняют с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, при этом в качестве контроля берут необлученный образец той же крови, после чего определяют эффективность облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови как
Эоб=Сднтло-Сднтлк, где
Эоб - эффективность облучения,
Сднтло - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в опыте (в проверяемой облученной крови),
Сднтлк - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в контроле (в необлученном образце той же крови),
и при разнице с контрольной более чем в 50% делают вывод о функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования рецидива угрожающего выкидыша. Для этого проводят иммунологическое исследование периферической венозной крови в 7-12 недель гестации у женщин с угрозой невынашивания беременности.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения антител к аллогенным HLA-G в сыворотки крови. Для этого используют тест перекрестной совместимости (cross match) мононуклеаров донора с сывороткой реципиента.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов. Для этого используют бруцеллин для специфической активации лимфоцитов.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для прогнозирования развития безрецидивной выживаемости у больных множественной миеломой после аутологической трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики нагноившейся постнекротической псевдокисты поджелудочной железы.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Для этого окрашивают исследуемый образец крови моноклональными антителами CD235a (FITC)/ CD59(PE)/CD71 (АРС).

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для диагностики наследственной оптической нейропатии (НОН). Для этого проводят клинические и цитологические исследования и дополнительно из кожи пациента получают культуру фибробластов плотностью 5000-10000 клеток на см2, окрашивают митохондриальным потенциалзависимым флюоресцентным красителем TMRE до конечной концентрации 25 нМ.

Изобретение относится к медицине и описывает хемилюминесцентный реактив для определения присутствия и/или количества анализируемого вещества в образце с предполагаемым содержанием анализируемого вещества, при этом реактив является недисперсным и растворимым в водной среде и содержит партнера по связыванию для анализируемого вещества и хемилюминесцентную композицию, содержащую олефиновое соединение и хелат металла, где олефиновое соединение является соединением, которое способно реагировать с синглетным кислородом присоединением 2+2 с образованием диоксетана или которое способно реагировать с синглетным кислородом с циклоприсоединением 4+2 с диенами, и где металл или хелат металла представляет собой редкоземельный металл или металл Группы VIII, и где металл координирован с двумя или более атомами той же молекулы или хелирующего агента, где два или более атомов выбраны из группы, состоящей из кислорода, азота и серы.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для определения еx-vivo эффективности лечения рака. Для этого после введения одной или более доз иммуногенной композиции субъекту измеряют уровень активированных Т-лимфоцитов (CD3+ CD69+) в организме.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ММР9-1562 C>Т (rs3918242).

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и позволяет прогнозировать угрожающий поздний выкидыш у беременных женщин. Для этого в сроке 5-12 недель гестации определяют относительное количество CD178+ моноцитов гестации в периферической венозной крови. При его значении равном 37,7% или менее в моноцитарном гейте прогнозируют угрожающий поздний выкидыш у женщин с угрозой прерывания беременности ранних сроков и привычным невынашиванием в анамнезе. Использование данного способа позволяет выбрать правильную тактику ведения беременности, провести комплекс лечебно-профилактических мероприятий и снизить риск развития осложнений и неблагоприятных исходов беременности в группе женщин с высоким риском невынашивания беременности. 3 пр., 1 табл.
Наверх