Иммунологический анализ на свободный витамин d
Изобретение относится к иммунологическому анализу и касается анализа образца крови или компонентов крови на присутствие свободного витамина D, включая метаболиты витамина D, 25-гидроксивитамин D или 1,25-дигидроксивитамин D, где свободный витамин D представляет собой циркулирующую, несвязанную фракцию витамина D. Способ включает стадии: (a) добавление иммобилизованного связывающего белка или антитела к 25-(ОН)-витамину D в образец; (b) смешивание образца с разбавителем, причем указанный разбавитель содержит от 0,1% до 0,25% фторалкильного поверхностно-активного вещества; (c) инкубация образца в течение периода времени, достаточного для того, чтобы обеспечить связывание необходимого количества витамина D со связывающим белком; (d) удаление несвязанной сыворотки и компонентов сыворотки путем промывки; (e) осуществление анализа иммобилизованных связывающих белков или антител, содержащих захваченный витамин D, связанный с ними, методом конкурентного связывания с использованием меченого соединения витамина D; (f) определение концентрации меченого соединения витамина D, связанного со связывающим белком. Также способ включает количественный анализ захваченного витамина D методом масс-спектроскопии. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.
Область техники изобретения
Настоящее изобретение относится к способу иммунологического анализа для исследования образца крови или компонентов крови на присутствие свободного витамина D. Настоящее изобретение также относится к тест-системам и наборам для проведения такого иммунологического анализа, включая исследования по месту лечения.
Уровень техники
К веществам, известным как "витамин D", относят группу жирорастворимых прогормонов, а также их метаболиты и аналоги. Наиболее распространенными формами, в которых витамин D встречается в организме, являются витамин D2 (эргокальциферол) и витамин D3 (холекальциферол). Последний представляет собой эндогенную форму витамина D, которая может образовываться в коже человека под действием солнечного света. Витамин D2 является экзогенной формой витамина D, поступающей в организм с пищей. В США витамин D2 используется как фармацевтическая витаминная добавка витамина D. Если не указано иное, термин «витамин D» в данном описании относится к любой форме или формам витамина D, включая метаболиты этого витамина, такие как 25-гидроксивитамин D или 1,25-дигидроксивитамин D.
Хотя витамины D2 и D3 различаются по молекулярной структуре боковых цепей, они проявляют одинаковую биологическую активность, являясь прогормонами, превращающимися в двустадийном метаболическом процессе в итоге в 1,25-дигидроксивитамин D (1,25-(ОН)2-витамин D, известный также как кальцитриол или 1,25-дигидроксихолекальциферол). Предшествующий метаболит - 25-гидроксивитамин D (25-(ОН)-витамин D) или кальцидиол образуется в результате превращения в печени. Он считается запасаемой формой витамина D в организме.
Циркулирующий витамин D состоит в основном из 25-(ОН)-витамина D3 и 25-(ОН)-витамина D2. В биологическом смысле 25-(ОН)-витамин D2 так же эффективен, как и 25-(ОН)-витамин D3. Период полураспада 25-(ОН)-витамина D2 в кровеносном русле меньше. В клинической практике рекомендуется использовать анализ на 25-(ОН)-витамин D, который позволяет определить содержание как 25-(ОН)-витамина D2, так и 25-(ОН)-витамина D3 (1).
Витамин D уже давно признан важным веществом, активная форма которого участвует в формировании и поддержании костей, а также в других процессах в организме человека и животных. Таким образом, он служит для увеличения притока кальция в кровь, способствуя адсорбции кальция и фосфора из крови в кишечнике и обратному всасыванию кальция в почках, что обеспечивает нормальную минерализацию костей и предотвращает гипокальцемические судороги. Витамин D необходим также для роста костей и ремоделирования костной ткани остеобластами и остеокластами.
Недостаток витамина D приводит к нарушению минерализации костей и ведет к их размягчению, развитию рахита у детей и остеомаляции у взрослых, а также, возможно, способствует остеопорозу.
Витамин D выполняет и ряд других функций в организме человека, включая ингибирование высвобождения кальцитонина щитовидной железой. Кальцитонин действует непосредственно на остеокласты, что приводит к подавлению атрофии костей и разрушения хрящевой ткани. Витамин D ингибирует также секрецию паратиреоидного гормона околощитовидной железой, регулирует нервно-мышечную и иммунную функции и уменьшает воспаление. Таким образом, для здоровья человека и животных необходим достаточный уровень витамина D.
Между тем избыток витамина D (который может быть вызван превышением дозы) токсичен. Некоторые симптомы гипервитаминоза витамина D включают гиперкальциемию (повышенное содержание кальция в крови), вызванную повышенной адсорбцией кальция в кишечнике. Известно, что гипервитаминоз витамина D является причиной повышенного кровяного давления. Желудочно-кишечные симптомы токсичности витамина D могут включать снижение аппетита, тошноту и рвоту. Эти признаки часто сопровождаются полиурией (повышенным выделением мочи), полидипсией (повышенной жаждой), слабостью, нервозностью, зудом и, в конечном счете, почечной недостаточностью.
Очевидно, что очень важной является способность диагностировать возможную нехватку витамина D. Также значима, особенно для объектов, поддерживаемых витамином D, способность определить потенциальный избыток этого витамина. Общий уровень в сыворотке 25-(ОН)-витамина D считается основным показателем уровня витамина D (2). Однако эта точка зрения оспаривается.
Практически весь циркулирующий 25-(ОН)-витамин D в сыворотке связан витамин D-связывающим белком (88%) и альбумином (12%). Витамин D-связывающий белок является одним из основных компонентов сыворотки, его концентрация составляет 250-400 мг/л. Только небольшая часть, около 2%, связывающих витамин D центров этого белка занята. И совсем незначительное количество 0,04% 25-(ОН)-витамина D циркулирует в свободной, несвязанной с белком форме.
Концентрация витамин D-связывающего белка в организме человека не постоянна, и на нее могут влиять такие факторы, как беременность, использование пероральных противозачаточных средств, заболевания почек и печени. Знание концентрации этого белка весьма значимо для точной оценки истинного содержания 25-(ОН)-витамина D в организме пациента. Например, у молодой женщины, использующей пероральные противозачаточные средства, общий уровень 25-(ОН)-витамина D может лежать в нормальном диапазоне. Однако в связи с повышенным содержанием в ее организме витамин D-связывающего белка концентрация свободного 25-(ОН)-витамина D может быть заметно снижена, что приводит к повышенному риску возникновения клинической недостаточности 25-(ОН)-витамина D и всем нежелательным последствиям, связанным с ним.
Было установлено, что физиологическая активность тироидных и стероидных гормонов in vivo лучше коррелирует со свободной, несвязанной с белком фракцией, чем с общей концентрацией гормонов в плазме крови. В частности, в случае, когда уровень связывающих белков повышается или понижается, определение общего содержания циркулирующих гормонов может привести к ложному диагнозу. В таких ситуациях более точную информацию дает измерение концентрации свободных циркулирующих гормонов. Эта точка зрения известна как "гипотеза свободных гормонов". Мендель (3) предположил, что гипотеза свободных гормонов "действительна, вероятно, для всех тканей в случае тироидных гормонов, кортизола, а также гидроксилированных метаболитов витамина D".
Бикл с соавторами (4) проверили правильность гипотезы свободных гормонов в случае с 1,25-(ОН)2-витамином D. Полученные данные указывают на то, что уровни свободного 1,25-(ОН)2-витамина D, по-видимому, достаточно стабильны даже у больных с болезнями печени и пониженными уровнями витамин D-связывающего белка, несмотря на значительное снижение общего содержания 1,25-(ОН)2-витамина D.
В последующем исследовании 25-(ОН)-витамина D та же группа рекомендовала измерять уровень свободного 25-(ОН)-витамина D в случаях с измененными концентрациями связывающего белка. Автор пришел к выводу, что определение общего содержания метаболитов витамина D может привести к неверной оценке содержания витамина D у пациентов с болезнями печени, и рекомендует дополнительно измерять уровень свободного 25-(ОН)-витамина D перед тем как диагностировать недостаток витамина D. Для определения уровня свободного 25-(ОН)-витамина D Бикл с соавторами использовал ультрафильтрацию (5). Этот метод требует применения высокоочищенного витамина D с радиоизотопной меткой и часто дает завышенную оценку свободной фракции витамина D.
Лауридсен с соавторами (6) показал, что у женщин с различным фенотипами по DBP различаются концентрации 1,25-(ОН)2-витамина D и 25-(ОН)-витамина D. Ученые предполагают, что у женщин с генотипом Gc2-2 уровень витамина D остается в норме при меньших концентрациях 25-(ОН)-витамина D в плазме крови.
Существует некоторое количество более ранних работ, относящихся к определению свободных аналитов.
В патенте США 4366143 описано изобретение, относящееся к анализу доли органических веществ или лигандов, содержащихся в биологических жидкостях в связанном или несвязанном виде. Данный способ по существу представляет собой конкурентный иммунологический анализ, в котором за одну стадию к образцу одновременно присоединяют меченый лиганд и специфичный связывающий агент. Свободная часть лиганда и меченый лиганд конкурируют за реакцию со специфичным связывающим агентом и связываются с ним в соотношениях, зависящих от доли количества свободного лиганда, присутствующего в образце. Недостаток описываемого способа состоит в том, что присутствие и специфичного связывающего агента, и меченого лиганда обуславливает присутствие большого количества факторов, способных нарушить равновесие между связанными и свободными лигандом, что делает способ менее пригодным для применения в ситуациях, когда содержание свободного лиганда относительно невелико, как в случае с витамином D. Фактически не раскрыто как использовать этот способ анализа для измерения содержания свободного витамина D.
В патенте США 4292296 описан способ определения свободных аналитов в образцах, содержащих свободные аналиты и связанные с рецептором аналиты. Этот способ включает две стадии. На первой стадии образец приводят в контакт с адсорбентом для аналита, чтобы выделить анализируемое вещество из раствора. Вторая стадия включает взаимодействие связанного адсорбентом аналита с меченым аналогом аналита. После этого растворимую фазу отделяют от адсорбента и определяют количество меченых аналитов в связанной и отмытой фазах. Данный способ описан применительно к определению концентрации свободных тироидных гормонов.
Заявка на патент США 2008/0182341 относится к стабилизирующим агентам, пригодным для измерения концентраций свободного или несвязанного аналита в жидкости. Предполагается, что стабилизаторы препятствуют диссоциации лиганда от связывающего его белка. В этом документе описана процедура одновременного анализа и приведен список разнообразных стабилизирующих агентов. Указано, что стабилизирующий агент не должен содержать алкил-, амино-, фторсодержащих поверхностно-активных веществ (ПАВ).
Ни один из документов уровня техники не описывает способа определения витамина D, который отражает содержание свободного витамина D в организме.
Следует отметить, что тесты на свободный витамин D известны уже несколько десятилетий, однако, в качестве основы в них используются такие методы, как равновесный диализ или поточный диализ. Эти способы пригодны для исследователей с высококвалифицированным техническим персоналом, однако, плохо подходят для обычных лабораторий, нуждающихся в высокопроизводительных автоматизированных испытаниях для реализации своих финансовых целей. Таким образом, существует потребность в способе анализа свободного витамина D, который можно автоматизировать и который подходит для проведения исследований непосредственно на месте лечения.
Обозначенные цифрами источники представляют собой:
1. Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs.
Am J Clin Nutr. 2008 Aug; 88(2): 507S-510S.
2. Holick MF. Vitamin D: extraskeletal health.
Endocrinol Metab Clin North Am. 2010 Jun; 39(2): 381-400.
3. Mendel CM. The free hormone hypothesis: a physiologically based mathematical model.
Endocr Rev. 1989 Aug; 10(3): 232-74.
4. Bikle D, Gee E, Halloran B, Haddad J. Free 1,25-Dihydroxyvitamin D Levels in Serum from Normal Subjects, Pregnant Subjects, and Subjects with Liver Disease.
J Clin Invest. 1984; 74: 1966-1971.
5. Bikle D, Gee E, Halloran B, Kowalski MA, Ryzen E, Haddad J. Assessment of the free fraction of 25-hydroxyvitamin D in serum and its regulation by albumin and the vitamin D-binding protein.
J Clin Endocrinol Metab. 1986 Oct;63(4):954-9.
6. Lauridsen AL, Vestergaard P, Hermann AP, Brot C, Heickendorff L, Mosekilde L, Nexo E.
Plasma concentrations of 25-hydroxy-vitamin D and 1,25-dihydroxy-vitamin D are related to the phenotype of Gc (vitamin D-binding protein): a cross-sectional study on 595 early postmenopausal women.
Calcif Tissue Int. 2005 Jul; 77(1): 15-22.
7. van Hoof HJ, Swinkels LM, Ross HA, Sweep CG, Benraad TJ.
Determination of non-protein-bound plasma 1,25-dihydroxyvitamin D by symmetric (rate) dialysis. Anal Biochem 1998 May 1; 258(2): 176-83.
Сущность изобретения
Для того чтобы лучше решить одну или несколько из вышеупомянутых задач, один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способ анализа образца крови или компонентов крови на присутствие свободного витамина D (включая метаболиты витамина D, такие как 25-гидроксивитамин D и 1,25-дигидроксивитамин D), включающий
(a) добавление иммобилизованного связывающего белка или антитела к 25-(ОН)-витамину D в образце;
(b) смешивание образца с разбавителем, причем указанный разбавитель содержит фторалкилные поверхностно-активные вещества;
(c) инкубацию образца в течение промежутка времени, достаточного для того, чтобы желаемое количество 25-(ОН)-витамина D связалось со связывающим белком;
(d) удаление несвязанной сыворотки и компонентов сыворотки путем промывания;
(e) осуществление конкурентного связывания иммобилизованных связывающих белков или антител, содержащих связанный с ними 25-(ОН)-витамин D, с меченым соединением витамина D;
(f) определение концентрации меченого соединения витамина D, связанного со связывающим белком.
Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, предназначенному для осуществления вышеописанного способа.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу анализа образца крови или компонентов крови на присутствие свободного витамина D, включающему на первой стадии захват витамина D иммобилизованным связывающим агентом, таким как иммобилизованный связывающий белок или антитело к 25-(ОН)-витамину D, а на следующей стадии захваченный 25-(ОН)-витамин D подвергают анализу конкурентного связывания с меченым вариантом витамина D, причем захват свободного витамина D осуществляют путем блокирования количества связанного витамина D, достаточно малого для того, чтобы обеспечить возможность проведения повторного теста, в котором образец, из которого осуществляли захват витамина D, подвергают тем же стадиям захвата витамина, а затем аналогичному анализу конкурентного связывания. При этом измеренные концентрации свободного витамина D после двух анализов конкурентного связывания являются по существу одинаковыми.
Также изобретение относится к способу анализа образца крови или компонентов крови на присутствие свободного витамина D, включающему на первом этапе захват витамина D иммобилизованным связывающим агентом, таким как иммобилизованный связывающий белок или антитело к 25-(ОН)-витамину D, и на следующей стадии захваченный 25-(ОН)-витамин D подвергают анализу конкурентного связывания с использованием меченого варианта витамина D, в котором захватывается 0,5-5 мас.% связанного витамина D.
В еще одном аспекте способ можно применять для проведения исследований непосредственно на месте лечения. Это относится к исследованиям непосредственно в месте оказания помощи или поблизости от него, т.е. позволяющих вместо того, чтобы брать образцы крови и посылать их в диагностическую лабораторию, немедленно поместить образец в портативное, преимущественно переносное устройство, обеспечивающее возможность проводить анализ с минимальным возможным числом стадий и производимых вручную операций.
Изобретение также относится к применению фторалкилных поверхностно-активных веществ, предпочтительно перфторокарбоксилатных поверхностно-активных веществ, наиболее предпочтительно перфтороктановой кислоты, в качестве вещества для повышения растворимости витамина D в иммунологическом анализе на определение свободного витамина D.
Описание фигур
На фиг.1 показана корреляция между концентрацией свободного витамина D в первом и повторном анализе согласно настоящему изобретению. Линией обозначены результаты повторной иммуноэкстракции с использованием 0 образцов с разными уровнями свободного витамина D. Наклон линии регрессии не отличается от единицы существенно.
Подробное описание изобретения
В широком смысле изобретение относится к двухстадийному анализу для определения свободного витамина D, включающему иммуноадсорбцию несвязанного с белком 25-(ОН)-витамина D из крови или компонентов крови, в частности сыворотки или плазмы, после чего измеряют количество адсорбированного витамина D.
Образцы для анализа могут быть получены любым известным в данной области способом от субъекта, в частности человека, присутствие свободного 25-(ОН)-витамина D в крови которого необходимо исследовать.
Свободный витамин D относится к циркулирующей, несвязанной фракции витамина D. Этот термин относится к любой форме витамина D, включая витамин D2, витамин D3 и их метаболиты 25-(ОН)-витамин D2, 25-(ОН)-витамин D3, 1,25-(ОН)2-витамин D2 и 1,25-(ОН)2-витамин D3. Этот анализ можно применять для измерения количества любой из этих форм свободного витамина D, отдельно или в комбинации. В предпочтительном способе способ анализа согласно настоящему изобретению применяют для измерения свободного 25-(ОН)-витамина D, что обеспечивает определение 25-(ОН)-витамина D2 и 25-(ОН)-витамина D3. Термины "свободный" и "несвязанный" относятся к фракции, которая не связана ни с какими белками, которые включают, в первую очередь, витамин D-связывающий белок.
В предпочтительном случае образец разбавляют до, во время или после добавления связывающего белка. Разбавитель для образца может быть на водной основе и в предпочтительном случае представляет собой буферный раствор. В предпочтительном случае рН такого раствора лежит в диапазоне 6-8. Буферный раствор содержит фторалкилные ПАВ. Очевидно, что смешивание буферного раствора с образцом можно осуществить путем добавления разбавителя к образцу, добавления образца к разбавителю или одновременным добавлением буфера и образца друг к другу. По практическим соображениям предпочтительнее вливать разбавитель в образец.
Вне связи с какой-либо теорией, авторы считают, что ПАВ повышают растворимость витамина D, обеспечивая ограниченное секвестирование витамина D.
Еще один аспект изобретения относится к новому подходу к анализу свободного витамина D. Проблема, связанная с исследованием свободного витамина D, заключается в том, что исходная концентрация свободного витамина D крайне мала и не может быть измерена существующими методами иммунологического анализа. Существующие попытки решить эту проблему либо основаны на желании избежать отщепления витамина D от связывающего его белка (например, попытки "стабилизировать" равновесие между свободным и связанным витамином D), или включают признание того, что свободный витамин D-связывающий белок нельзя измерить. Подобные методы анализа включают просто отщепление витамина D от витамин D-связывающего белка.
Настоящее изобретение предусматривает ограниченное секвестирование витамина D, при котором фракция секвестированного витамина D достаточно мала, преимущественно в пределах 0,1-10% от общего витамина D, присутствующего в образце, и предпочтительно не превышает 5% от общего витамина D, что все равно отражает первоначальную концентрацию витамина D.
Это можно подтвердить, не проводя лишних экспериментов, просто добавив насыщенный тритием витамин D к буферному разбавителю. Содержание витамина D, соединенного с витамин D-связывающим белком, не должно уменьшаться более чем на 5%. Кроме того, образец может быть адсорбирован стенками покрытых антителами лунок. После удаления образца добавляется биотинилированный витамин D и определяется количество свободного витамина D, адсорбированного антителами. Образец, из которого выделено первоначальное количество витамина D, помещается в следующую лунку, также выдерживается и измеряется. Определенная концентрация свободного витамина D должна соответствовать результату, полученному после первой выдержки.
Ограниченное секвестирование витамина D достигается преимущественно добавлением 0,05-0,5 массовых % фторалкилных ПАВ (лучше всего 0,1-0,25%). В качестве фторалкилных ПАВ используются перфторалкилные ПАВ, главным образом перфторокарбоксилатные ПАВ, предпочтительнее всего перфтороктановая кислота. Лучше всего использовать от 0,1 до 0,2% перфтороктановой кислоты (предпочтительнее 0,15%). В этих условиях реакция образцов с различными уровнями витамин D-связывающего белка и одинаковой общей концентрацией витамина D была соотнесена с концентрацией свободного витамина D, измеренной методом симметричного диализа.
Возможно, в изобретении можно использовать как непосредственно перфтороктановую кислоту, так и ее производные. К таким производным обычно относятся вещества, связанные с перфтороктановой функциональной группой, включая, в частности, соли перфтороктановой кислоты, например, такие как аммонийная соль, а в случае сульфоновой кислоты соответственно сульфонаты перфтороктановой кислоты (перфтороктансульфонат, известный также как перфтороктаносульфоновая кислота).
Преимуществом описываемого метода определения содержания свободного витамина D (включая метаболиты витамина D) согласно изобретению является то, что этот метод обеспечивает формат анализа, который можно автоматизировать. Это заметно отличает разработанный метод исследования от существовавших ранее способов определения свободного витамина D.
В разработанном методе анализа добавляется связывающий белок для 25-(ОН)-витамина D. Связывающие белки, например антитела в случае витамина D, известны в литературе и широко используются в существующих иммунологических анализах на витамин D. Те же самые антитела, также как и другие связывающие белки, могут быть использованы и в данном изобретении. Например, вместо антитела для витамина D может быть использован фрагмент антитела, полученный по технологии фагового отображения. Подходящие антитела могут быть как моно-, так и поликлональными. Они могут быть получены по известной технологии, например, поликлональные антивитамины D козы, кролика или другие подходящие антитела для витамина D, известные в литературе своим применение в иммунологических анализах на витамин D. Подходящие антитела можно найти, к примеру, в следующих изданиях: Hollis, Clin. Chem 31/11, 1815-1819 (1985); Hollis, Clin. Chem 39/3, 529-533 (1993).
Связывающие белки преимущественно добавляются в виде мелких частиц, нанесенных на твердый носитель. Обычно связывающим белком покрывают твердую фазу, например, на пластину микротитратора. В качестве наиболее предпочтительного варианта связывающий белок наносят на магнитные частицы, которые облегчают разделение в магнитном поле.
После добавления связывающих белков, например антител, образец некоторое время выдерживают. Время, требующееся для выдержки, зависит от таких факторов, как концентрация реагентов, тип связывающего белка и условия вдержки, к примеру от перемешивания и температуры. Обычно время выдержки варьируется от 10 секунд до нескольких часов, преимущественно от минуты до 2 часов. Для автоматических платформ предпочтительным является короткое время выдержки (от 10 секунд до 10 минут, лучше всего от 30 секунд до 30 минут). Обычно период времени не является принципиально важным, поскольку по калибровочной системе определяется, сколько свободного витамина D свяжется в данных условиях в течение выбранного периода. Время выдержки может быть больше или меньше при условии, что будет проведена необходимая калибровка. Следовательно, предпочтительно, чтобы сравнение с калибраторами приводило в одинаковых условиях к одним и тем же промежуткам времени.
После завершения периода выдержки образец может быть известным образом подвергнут конкурентно-связывающему анализу с использованием меченого соединения витамина D. Известно большое количество меченых соединений, способных выступать в качестве конкурентно-связываемых антигенов в иммунологических анализах по определению витамина D. В качестве меток обычно используются радиоизотопные, флуоресцентные, люминесцентные, биотиновые, золотые и ферментные метки. Метод конкурентно-связывающего анализа известен специалистам и не требует пояснений, главным образом потому, что эту часть исследования можно провести с использованием любой метки, подходящей для определения витамина D. Метки, которые можно использовать, описаны, в частности, в вышеупомянутой литературе, посвященной существующим методам иммунологического анализа витамина D.
Концентрация свободного витамина D определяется в результате использования меток, позволяющих это сделать. Следует понимать, что интерпретация полученных значений обуславливается калибровочными измерениями, то есть в текущем анализе реакцией калибраторов.
Кроме того, захваченный витамин D может быть подвергнут количественному анализу по методу масс-спектроскопии.
Калибровка в методе анализа, описанном в изобретении, может быть проведена при помощи калибраторов, содержащих заранее заданную концентрацию свободного 25-(ОН)-витамина D. Доля свободного витамина D в этих калибраторах может быть определена симметричным диализом. В этом методе образец сыворотки погружается в одну сторону диализной ячейки. Другую сторону занимает тот же образец, в который добавлены следовые количества витамина D с радиоизотопной меткой. Скорость перехода витамина D с радиоизотопной меткой из одной ячейки диализа в другую прямо пропорциональна доле свободного витамина D (7).
Согласно изобретению измерение доли свободного витамина D основано на определении концентрации свободного витамина D без существенного влияния на его концентрацию, хотя и на основании ограниченного секвестирования витамина, как уже было описано ранее.
С другой стороны, изобретение представляет собой продукт в виде иммунологического анализа по определению доли 25-(ОН)-витамина D в крови и ее компонентах. В анализе используется метод, основанный на любом из ранее описанных способов его проведения. В частности, продукт подобного рода будет представлен в виде устройства для проведения иммунологического анализа. Такое устройство может содержать отдельные реагенты, необходимые для анализа, а именно связывающий белок и меченое соединение витамина D. Эти реагенты могут подаваться отдельно, и таким образом устройство будет комплектоваться только при использовании в процессе анализа, описанного в изобретении. Предпочтительнее загружать реагенты одновременно, лучше всего запакованными вместе, как комплект деталей. Устройство в качестве дополнительного элемента может содержать сосуд для образца крови или ее компонентов, однако, обычно он предоставляется отдельно. Как правило, устройство содержит связующее, зафиксированное на твердой фазе, и отдельный сопряженный витамин D. Остальные компоненты устройства, как обычно описывается в литературе, зависят от выбранной метки, так как различные метки могут предусматривать разные реагенты.
Изобретение относится также к использованию фторалкилных ПАВ, преимущественно перфторокарбоксилатных ПАВ, среди которых предпочтительнее всего перфтороктановой и/или перфторогептановой кислоты, для повышения растворимости витамина D в иммунологическом анализе по определению свободного витамина D.
Наилучшими ПАВ являются перфторалкилные ПАВ, преимущественно перфторокарбоксилаты, такие как перфторогептановая или перфтороктановая кислоты. Лучше всего использовать в качестве ПАВ перфтороктановую кислоту или ее производные. К таким производным обычно относятся вещества, связанные с перфтороктановой функциональной группой, включая, в частности, соли перфтороктановой кислоты, например, такие как аммонийная соль, а в случае сульфоновой кислоты, соответственно сульфонаты перфтороктановой кислоты (перфтороктансульфонат, известный также как перфтороктаносульфоновая кислота). Помимо этого могут быть использованы аналогичные производные и других перфторокарбоксилатных ПАВ.
Следует понимать, что изобретение не ограничивается ранее описанными вариантами выполнения и формулами. Также следует учитывать, что в формуле изобретения слово "содержащий" не исключает других компонентов или шагов. А использование единственного числа в случае некоторых существительных часто подразумевает их множественную форму, если иное не было отдельно оговорено.
Приведенные ниже примеры являются исключительно иллюстративными и не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом.
ПРИМЕР
Материалы
Микротитрационные пластины с нанесенным на них покрытием
Микротитрационные пластины максимальной степени поглощения фирмы Nunc были покрыты противомышиными антителами иммуноглобулина класса G концентрацией 200 нг/лунка. Затем слой моноклональных антител для 25-(ОН)-витамина D концентрацией 2 нг/лунка адсорбировали слоем противомышиных антител иммуноглобулина класса G. Пластины блокировали боратным буфером, содержащим бычий сывороточный альбумин и сахарозу.
Разбавитель образца
Разбавитель образца состоит из содержащего консерванты 0,1 М Трис-буфера с рН 8,0 и 0,15% перфтороктановой кислоты.
Сопряженным (то есть меченым соединением витамина D) является биотинилированный витамин D. Представленный конъюгат имеет концентрацию 25 пкг/мл в 0,1М Трис-буфере с рН 7,5, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина и консерванты.
Конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена и тетраметилбензидин были промышленного производства.
Протокол изобретения
Испытания проводятся следующим образом. В лунку микротитрационного планшета с помощью пипетки помещают 90 µл разбавителя образца. Затем добавляют к разбавителю 10 µл образца. Полученную смесь выдерживают 90 минут при 37°С. После этого лунки трижды промывают промывочным буфером. Добавляют 100 µл сопряженной пероксидазы хрена в ячейку и выдерживают в течение получаса. Лунки повторно промывают три раза промывочным буфером. Затем получают колориметрический сигнал добавлением стрептавидина, меченого пероксидазой хрена. После 20-минутной выдержки при 37°С лунки трижды промывают промывочным буфером. На следующем этапе добавляют в лунки 100 µл тетраметилбензидина. После 20 минутной выдержки в темноте при комнатной температуре добавляют 100 µл стоп-реагента и считывают поглощающую способность при 450 нм.
Сигнал, образующийся в лунке, обратно пропорционален концентрации свободного 25-(ОН)-витамина D в образце или калибраторе. Концентрация свободного 25-(ОН)-витамина D в исходном образце может быть вычислена путем сопоставления неизвестного сигнала с ответным от калибратора.
Результаты
С помощью описанного в изобретении анализа на обычных эталонных образцах была получена характерная градуировочная кривая для определения свободного 25-(ОН)-витамина D. Она приведена в нижеследующей таблице.
| Калибраторы | Калибратор А | Калибратор В | Калибратор С | Калибратор D | КалибраторЕ |
| Свободный 25(ОН)D3 [пкг/мл] | 1,1 пкг/мл | 4,2 пкг/мл | 8,6 пкг/мл | 16,2 пкг/мл | 41,6 пкг/мл |
| Поглощающая способность 450 нм | 2,304 | 1,856 | 1,177 | 0,514 | 0,132 |
| Поглощающая способность 450 нм | 2,291 | 1,808 | 1,151 | 0,517 | 0,123 |
| Средние значения | 2,298 | 1,832 | 1,164 | 0,516 | 0,128 |
| Коэффициент вариации % | 0,40% | 1,85% | 1,58% | 0,41% | 4,99% |
| Процент связывания % | 100% | 80% | 51% | 22% | 6% |
В качестве объекта для описанного в изобретении анализа может выступать образец крови либо компоненты крови человека или животных, например, пациентов. Измеренные количества витамина D могут быть соотнесены с градуировочной кривой и таким образом интерпретированы.
1. Способ анализа образца крови или компонентов крови на присутствие свободного витамина D, включая метаболиты витамина D, 25-гидроксивитамин D или 1,25-дигидроксивитамин D, где свободный витамин D представляет собой циркулирующую, несвязанную фракцию витамина D, включающий
(a) добавление иммобилизованного связывающего белка или антитела к 25-(ОН)-витамину D в образец;
(b) смешивание образца с разбавителем, причем указанный разбавитель содержит от 0,1% до 0,25% фторалкильного поверхностно-активного вещества;
(c) инкубацию образца в течение периода времени, достаточного для того, чтобы обеспечить связывание необходимого количества витамина D со связывающим белком;
(d) удаление несвязанной сыворотки и компонентов сыворотки путем промывки;
(e) осуществление анализа иммобилизованных связывающих белков или антител, содержащих захваченный витамин D, связанный с ними, методом конкурентного связывания с использованием меченого соединения витамина D;
(f) определение концентрации меченого соединения витамина D, связанного со связывающим белком.
2. Способ по п. 1, в котором фтроалкильное поверхностно-активное вещество представляет собой перфторокарбоновую кислоту, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из перфтороктановой кислоты, перфторогептановой кислоты и их смесей.
3. Способ по п. 1, в котором разбавитель представляет собой буферный раствор с буферным диапазоном рН от 6,0 до 8,0.
4. Способ по п. 2, в котором разбавитель представляет собой буферный раствор с буферным диапазоном рН от 6,0 до 8,0.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором связывающий белок представляет собой антитело.
6. Способ по любому из пп. 1-4, в котором связывающий белок представляет собой витамин D-связывающий белок.
7. Способ по любому из пп. 1-4, в котором образец крови представляет собой плазму или сыворотку крови человека.
8. Способ по любому из пп. 1-4, в котором связывающий белок используют в виде покрытия на магнитных частицах.
9. Способ по любому пп. 1-4, в котором меченое соединение витамина D содержит метку, выбранную из группы, состоящей из радиоизотопных меток, флуоресцентных меток, люминесцентных меток, биотиновых меток, золотых меток и ферментных меток.
10. Способ по любому из пп. 1-4, в котором концентрацию свободного витамина D определяют с учетом концентрации калибратора для 25-(ОН)-витамина D.
11. Способ количественного определения свободного витамина D в образце сыворотки или плазмы, включающий стадии (а), (b), (с) и (d) согласно п. 1 и количественный анализ захваченного витамина D методом масс-спектроскопии.
