Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения



Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения
Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения

 


Владельцы патента RU 2592667:

ЗОИТИС ЭлЭлСи (US)

Группа изобретений касается выделенной полинуклеотидной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), клетки-хозяина для генерирования вируса PRRS, трансфецированной такой полинуклеотидной молекулой, вакцины для защиты свиньи против инфекции вирусом PRRS, молекулы РНК, кодирующей вирус PRRS, способа генерирования вируса PRRS in vitro и плазмиды, для экспрессии вируса PRRS. Охарактеризованная выделенная молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 или 6. Предложенная группа изобретений позволяет получать эффективный иммунный ответ у свиней к северо-американскому вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней и может быть использована в ветеринарии. 8 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 10 табл., 8 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области здоровья животных и направлено на инфекционные клоны кДНК вирусов с РНК положительной полярности, на новые РНК-вирусы и их модифицированные живые формы и на конструирование вакцин, в частности свиных вакцин, с использованием таких клонов кДНК.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS) характеризуется выкидышами, мертворождениями и другими репродуктивными проблемами у свиноматок и подсвинков, а также респираторным заболеванием у молодых свиней. Возбудителем является вирус PRRS (PRRSV), представитель семейства Arteriviridae и порядка Nidovirales. Нидовирусы представляют собой оболочечные вирусы, имеющие геномы, состоящие из одной цепи РНК положительной полярности. Геномная РНК вирусов с РНК положительной полярности выполняет двойную роль: и в хранении, и в экспрессии генетической информации. У нидовирусов в репликации или транскрипции не участвует ДНК. Неструктурные белки транслируются непосредственно от геномной РНК нидовирусов в виде больших полипротеинов и впоследствии расщепляются вирусными протеазами на дискретные функциональные белки. От генома синтезируется 3′-котерминальный гнездовой набор субгеномных РНК (сгРНК), и они используются в качестве матричных РНК для трансляции структурных белков. Таким образом, репродукция нидовирусной геномной РНК представляет собой комбинированный процесс репликации генома и синтеза сгРНК.

В конце 1980-х гг. почти одновременно возникли два отличных генотипа вируса: один в Северной Америке, а другой в Европе. Вирус PRRS в настоящее время является эндемичным почти во всех свиноводческих странах, и считается одним из самых экономически важных заболеваний, влияющих на мировое свиноводство. Кроме того, высоковирулентные генотипы были выделены в Китае и окружающих странах, и такие генотипы в основном являются родственными северо-американским генотипам.

Несмотря на значительные успехи в понимании биологии PRRSV, контроль над вирусом остается сложным. Вакцинация животных в полевых условиях оказалась главным образом неэффективной. PRRS обычно вновь появляется в иммунизированных стадах, и большинство кампаний по вакцинации против PRRSV на фермах в конечном счете не позволили контролировать заболевание.

Без какого-либо ограничения теорией, инфекция свиней PRRSV дикого типа или их вакцинация живой аттенуированной формой этого патогена, к сожалению, вызывает лишь обильную продукцию ненейтрализующих антител. На протяжении данного интервала времени, например, образуются лишь ограниченные количества клеток, секретирующих интерферон (IFN)-γ. Таким образом, PRRSV, по-видимому, по своей природе стимулирует несбалансированный иммунный ответ, отличающийся стабильно высоким гуморальным (основанным на антителах) иммунитетом и изменчивым и ограниченным, но потенциально защитным Т-хелпер (Th) 1-подобным ответом IFN-γ. Одной характеристикой инфекции PRRSV, которая наиболее вероятно способствует несбалансированному развитию адаптивного иммунитета, является недостаток адекватного врожденного иммунного ответа. Обычно клетки, инфицированные вирусом, секретируют интерферон «IFN» типа I (включающий IFN-α и IFN-β), который защищает соседние клетки от инфекции. Кроме того, высвобожденный IFN типа I взаимодействует с субпопуляцией «наивных» Т-клеток для стимуляции их превращения в специфичные к вирусу клетки, секретирующие IFN типа II (IFN)-γ. Напротив, ответ IFN-α свиней на воздействие PRRSV практически отсутствует. Такая неэффективная стимуляция продукции IFN-α патогеном, как ожидается, будет иметь значительное влияние на природу адаптивного иммунного ответа хозяина, поскольку IFN-α повышает экпрессию гена IFN-γ. Соответственно, первый цитокин контролирует основной путь, который стимулирует развитие адаптивного иммунитета, а именно опосредованные Т-клетками ответы IFN-γ и пиковые противовирусные иммунные защитные механизмы.

В данном отношении стало очевидным, что предполагаемая связь между врожденным и адаптивным иммунитетом при вирусных инфекциях происходит посредством специфического типа дендритных клеток, которые обладают способностью продуцировать большие количества интеферона типа I и которые играют решающую роль в поляризации функции Т-клеток. Конкретно, редкий, но примечательный тип дендритных клеток, плазмацитоидные дендритные клетки (PDC), также известные как естественные клетки, продуцирующие IFN-α/β, играет решающую роль в противовирусном иммунитете посредством их способности вызывать дифференциацию «наивных» Т-клеток в клетки, секретирующие IFN-γ. Несмотря на их редкость, PDC являются чрезвычайно сильными продуцентами IFN-α, причем каждая клетка способна продуцировать 3-10 пг IFN-α в ответ на вирус. В отличие от этого, моноциты продуцируют в 5-10 раз меньше IFN-α в расчете на клетку. Были описаны фенотип и некоторые биологические свойства PDC свиней (Summerfield et al., 2003, Immunology 110:440). В недавних исследованиях определили, что PRRSV не стимулирует секрецию IFN-α PDC свиней (Calzada et al., 2010, Veterinary Immunology and Immunopathology 135:20).

Данный факт в сочетании с наблюдением того, что IFN-α, добавленный экзогенно во время вакцинации, улучшал интенсивность ответа IFN-γ, специфичного в отношении PRRSV (W.A. Meier et al., Vet. Immunol. Immunopath. 102, pp 299-314, 2004), подчеркивает решающую роль, которую играет IFN-α во время инфекции свиней этим вирусом. Принимая во внимание очевидную решающую роль IFN-α при развитии защитного иммунитета, важно определить способность разных штаммов вируса PRRS стимулировать и/или ингибировать продукцию IFN-α. Соответственно, существует острая необходимость в новых и улучшенных модифицированных живых вакцинах для защиты против PRRS. Как описано ниже, очевидно, что вирусы, происходящие из нового инфекционного клона кДНК, pCMV-S-P129-PK, и других, имеют другой фенотип, чем вирус Р129 дикого типа или два модифицированных живых вакцинных вируса PRRS вакцин, имеющихся в продаже. Без какого-либо ограничения теорией, согласно настоящему изобретению предложены вакцины, которые способствуют иммунному ответу на основе клеток против вируса и характеризуют новое и эффективное поколение PRRS вакцин.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом воплощении согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, включающая последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую вирус PRRS, который генетически модифицирован таким образом, что в качестве вакцины он вызывает эффективный иммунозащитный ответ против вируса PRRS у свиней. В определенных аспектах согласно изобретению предложена последовательность ДНК, как изложено в данной заявке, включающая SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, или последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную идентичность с ней, предпочтительно 80%-ную идентичность с ней и более предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность с ней.

В определенных воплощениях согласно изобретению предложена плазмида, которая включает выделенную полинуклеотидную молекулу, как изложено в данной заявке, и промотор, способный транскрибировать полинуклеотидную молекулу в подходящей клетке-хозяине. В другом воплощении приведенная в данной заявке последовательность плазмиды, кодирующая северо-американский или китайский PRRS, дополнительно кодирует один или более чем один детектируемый гетерологичный антигенный эпитоп. Согласно настоящему изобретению предложена трансфицированная клетка-хозяин, которая включает изложенную в данной заявке плазмиду.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена вакцина для защиты свиньи от инфекции вирусом PRRS. Вакцина может включать северо-американский или китайский вирус PRRS, кодируемый инфекционной молекулой РНК, инфекционную молекулу РНК или плазмиду, причем каждая(ый) из них кодируется выделенной полинуклеотидной молекулой, как она изложена в данной заявке. В еще одном аспекте вакцина включает вирусный вектор, включающий приведенный в данной заявке полинуклеотид. Изложенная в данной заявке вакцина возможно может включать приемлемый для ветеринарного применения носитель вакцины. В одном важном аспекте вакцина имеет пониженный эффект ингибирования интерферона-α по сравнению с вирусом PRRS Р129 дикого типа (см. АТСС (Американская коллекция типовых культур) 203488, 203489, патент США №6500662).

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен диагностический набор, включающий полинуклеотидные молекулы, которые различают (так называемый анализ DIVA (дифференциация инфицированных и вакцинированных животных)) свиней, инфицированных естественным путем полевым штаммом вируса PRRS, и свиней, вакцинированных изложенной в данной заявке модифицированной живой вакциной.

В других воплощениях согласно изобретению предложен способ защиты свиньи от инфекции штаммом вируса PRRS, включающий введение животному иммуногенно защитного количества вакцины согласно изложенной в данной заявке формуле изобретения.

Дополнительные и предпочтительные воплощения изобретения включают выделенный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS) или кодирующую его полинуклеотидную последовательность, где белок, кодируемый ORF1a (открытая рамка считывания 1а), выбран из группы, состоящей из тех белков, которые содержат любую из следующих аминокислотных последовательностей, где подчеркнутые остатки, как считается, являются новыми: AMANVYD (SEQ ID NO: 9); IGHNAVM (SEQ ID NO: 12); TVPDGNC (SEQ ID NO: 15); CWWYLFD (SEQ ID NO: 18); HGVHGKY (SEQ ID NO: 21); AAKVDQY (SEQ ID NO: 24); PSATDTS (SEQ ID NO: 27); LNSLLSK (SEQ ID NO: 30); APMCQDE (SEQ ID NO: 33); CAPIGMD (SEQ ID NO: 36); PKVAKVS (SEQ ID NO: 39); AGEIVGV (SEQ ID NO: 42); ADFNPEK (SEQ ID NO: 45) и QTPILGR (SEQ ID NO: 48). В другом предпочтительном воплощении изобретения согласно изобретению предложен выделенный североамериканский или китайский PRRS, который содержит любую из идентифицированных выше последовательностей в пределах белка, кодируемого ORF1a, включая любые комбинации (2, 3, 4… вплоть до 17) этих идентифицированных последовательностей.

Согласно изобретению также предложен выделенный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), где его белок, кодируемый ORF1a, выбран из группы, состоящей из тех аминокислотных последовательностей, которые содержат любую из: ANV (см. SEQ ID NO: 9); HNA (см. SEQ ID NO: 12); PDG (см. SEQ ID NO: 15); WYL (см. SEQ ID NO: 18); VHG (см. SEQ ID NO: 21); KVD (см. SEQ ID NO: 24); ATD (см. SEQ ID NO: 27); SLL (см. SEQ ID NO: 30); MCQ (см. SEQ ID NO: 33); PTG (см. SEQ ID NO: 36); VAK (см. SEQ ID NO: 39); EIV (см. SEQ ID NO: 42); FNP (см. SEQ ID NO: 45) и PIL (см. SEQ ID NO: 48), включая любые комбинации (2, 3, 4… вплоть до 17) этих идентифицированных последовательностей.

В другом предпочтительном воплощении согласно изобретению предложен выделенный северо-американский или китайский вирус PRRS, где независимо от идентичности любых других специфических положений нуклеотидной или аминокислотной последовательности в любой точке в полинуклеотиде, кодирующем вирус, или в белках, кодируемых им, вирусный белок ORF1a содержит:

(а) любую из следующих специфических аминокислот в определенных последовательностях:

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислоту D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ IDNO: 15);

аминокислоту Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислоту Н в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21);

аминокислоту V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислоту Т в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислоту L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислоту С в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33);

аминокислоту Т в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислоту А в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39);

аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности EIV (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45) и

аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 48) с включением любых комбинаций (2, 3, 4… вплоть до 17) этих идентифицированных последовательностей, или

(б) содержит указанную специфическую подчеркнутую одиночную аминокислоту в определенных последовательностях пептида ORF1a из 3 остатков любых других северо-американских или китайских вирусов PRRS, которые соответствуют последовательностям из 3 остатков, как определено выше, принимая во внимание то, что указанные другие специфические аминокислотные последовательности из 3 остатков могут демонстрировать одну или две дополнительные аминокислотные замены, но все еще распознаваться как соответствующие последовательностям, определенным выше. Для целей данного воплощения изобретения термин «соответствующий» означает то, что родственные последовательности могут быть оптимально выровнены с использованием алгоритма BLOSUM, как описано в Henikoff et al. Proc Natl. Acad. Sci., USA, 89, pp.10915-10919, 1992.

В другом предпочтительном воплощении изобретения предложен выделенный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), где его белок, кодируемый ORF1a, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит одну или более чем одну из вариаций (а), (б), (в) и (г), где каждая указанная вариация определена следующим образом:

вариация (а):

аминокислота N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислота N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислота D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ ID NO: 15);

аминокислота Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислота H в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21) или любое подмножество вариации (а);

вариация (б):

аминокислота V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислота T в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислота L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислота C в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33) или любое подмножество вариации (б);

вариация (в):

аминокислота T в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислота A в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39) или любое подмножество вариации (в); и

вариация (г),

аминокислота I в пределах аминокислотной последовательности EIV (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислота N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45);

и аминокислота I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 20) или любое подмножество ее вариации (г).

Такие вирусы PRRS могут дополнительно содержать две или более чем две из пяти аминокислотных последовательностей, идентифицированных в вариации (а), и/или две или более чем две из четырех аминокислотных последовательностей, идентифицированных в вариации (б), и/или две аминокислотные последовательности, идентифицированные в вариации (в), и/или две или более чем две из трех аминокислотных последовательностей, идентифицированных в вариации (г).

Согласно настоящему изобретению также предложена плазмида, способная непосредственно трансфицировать подходящую клетку-хозяина и экспрессировать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS) из подходящей клетки-хозяина, трансфицированной таким образом, причем плазмида содержит: (а) последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую вирус PRRS, и (б) промотор, способный транскрибировать указанную инфекционную молекулу РНК, где белок, кодируемый ORF1a указанного вируса, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит:

(1) аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислоту D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ ID NO: 15),

аминокислоту Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислоту Н в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21) или любое их подмножество; и/или

(2) аминокислоту V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислоту L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислоту C в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33) или любое их подмножество; и/или

(3) аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислоту A в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39) или любое их подмножество; и/или

(4) аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности EIV (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45)

и аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 48) или любое их подмножество.

Следует иметь в виду, что ORF1a кодирует полипротеин, имеющий протеазную функцию, a ORF1b кодирует полипротеин, имеющий репликазную (РНК-полимераза) и хеликазную функции. Дополнительную информацию относительно функций белков, кодируемых разными ORF (открытыми рамками считывания) PRRS можно найти, например, в патенте США №7132106. См. также патент США №7544362 относительно функции ORF7 и других открытых рамок считывания. Как было бы понятно в данной области, ожидается, что белки, кодируемые ORF1, имеют дополнительные функции, известные и неизвестные, и новые аминокислотные замены, полезные при использовании настоящего изобретения, не ограничиваются их эффектами на какую-либо одну специфическую функцию белков, кодируемых ORF1.

В других предпочтительных воплощениях указанная плазмида содержит промотор, который представляет собой эукариотический промотор, способный обеспечивать инициацию ДНК в эукариотических клетках-мишенях, или прокариотический или фаговый промотор, способный управлять транскрипцией плазмиды in vitro. Согласно изобретению аналогичным образом предложен способ генерирования вируса PRRS, включающий трансфицирование подходящей клетки-хозяина соответствующей плазмидой и получение вируса PRRS, генерированного трансфицированной клеткой.

Соответственно, в конкретном и предпочтительном воплощении согласно изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую северо-американский вирус PRRS, где указанная последовательность ДНК выбрана из группы, состоящей из:

(а) SEQ ID NO: 6;

(б) последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью ДНК (а), где белок, кодируемый ее ORF1a, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит:

из группы (б) (1):

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислоту D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ ID NO: 15);

аминокислоту Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислоту H в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21) или любое их подмножество; и/или

из группы (б) (2):

аминокислоту V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислоту L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислоту C в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33) или любое их подмножество; и/или

из группы (б) (3):

аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислоту A в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39) или любое их подмножество; и/или

из группы (б) (4):

аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности EIV (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45)

и аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 20) или любое их подмножество; и

(в) последовательности ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК (а) или (б) при очень жестких условиях, которые включают гибридизацию с ДНК, связанной с фильтром, в 0,5 М NaHPO4, 7% SDS (додецилсульфат натрия), 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) при 65°C и промывку в 0,1 SSC (хлорид натрия/цитрат натрия)/0,1% SDS при 68°C.

Согласно изобретению также предложены клетки-хозяева, трансфицированные полинуклеотидными молекулами, и предложены вакцины для защиты свиньи против инфекции вирусом PRRS, причем вакцина содержит:

(а) генетически модифицированный северо-американский вирус PRRS, кодируемый такими упомянутыми выше полинуклеотидными молекулами, или (б) указанную инфекционную молекулу, или (в) указанную полинуклетидную молекулу в виде плазмиды, или (г) вирусный вектор, содержащий указанную полинуклеотидную молекулу, где вирус PRRS способен вызывать эффективный иммунозащитный ответ против инфекции вирусом PRRS, в количестве, эффективном для выработки иммунной защиты против инфекции, и подходящий для ветеринарного применения носитель.

Согласно изобретению также предложены полинуклеотидные последовательности РНК, соответствующие (т.е. благодаря наличию комплементарных последовательностей кодирующих оснований):

(а) последовательности ДНК SEQ ID NO: 6;

(б) последовательности ДНК, которая имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью ДНК (а), где белок, кодируемый ее ORF1a, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит любую из следующих и любую комбинацию любых из следующих:

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислоту D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ ID NO: 15);

аминокислоту Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислоту Н в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21);

аминокислоту V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислоту L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислоту C в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33);

аминокислоту Т в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислоту А в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39);

аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности EIN (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45)

и аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 20); или

(в) последовательности ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК (а) или (б) при очень жестких условиях, которые включают гибридизацию с ДНК, связанной с фильтром, в 0,5 М NaHPO4, 7% SDS, 1 мМ EDTA при 65°C и промывку в 0,1 SSC/0,1% SDS при 68°C.

Соответственно, согласно изобретению также предложены диагностические наборы, содержащие полинуклеотидные молекулы, которые различают свиней, инфицированных естественным путем полевым штаммом вируса PRRS, и свиней, вакцинированных вакцинами по изобретению, причем вакцины (вирусы) предпочтительно демонстрируют пониженный эффект ингибирования интерферона-α по сравнению с вирусом PRRS Р129 дикого типа (SEQ ID NO: 5).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ТАБЛИЦ И ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

В Таблице 1 показаны инфекционные клоны кДНК и соответствующие вирусы, которые были получены трансфекцией в клетки PK-9.

В Таблице 2 показан эффект ингибирования интерферона-α вируса PRRS дикого типа и производными, адаптированными для роста в культуре клеток.

В Таблице 3 описан эффект ингибирования интерферона-α вируса PRRS Р129 дикого типа и его генетически сконструированными производными, адаптированными для роста в клетках PK-9, экспрессирующих CD163.

В Таблице 4 показан пониженный эффект ингибирования интерферона-α вирусов P129-PK-FL и P129-PK-d43/44 по сравнению с вирусом Р129 дикого типа и вакцинами Ingelvac PRRS.

В Таблице 5 проиллюстрирована схема исследования, проведенного для оценки безопасности и эффективности вакцинных вирусов.

В Таблице 6 показаны все отличия нуклеотидов и обусловленные ими отличия аминокислот между пассажем 0 Р129 и пассажем 17 P129-PK-FL по положению в геноме.

В Таблице 7 показано обобщение различий нуклеотидов и аминокислот между пассажем 0 Р129 и пассажем 17 P129-PK-FL по вирусному белку.

В Таблице 8 показаны все отличия нуклеотидов и обусловленные ими отличия аминокислот между геномам PRRSV, обнаруженными в инфекционных клонах кДНК pCMV-S-P129 и pCMV-S-P129-PK17-FL по положению в геноме.

В Таблицах 9 и 10 показаны аминокислотные замены, способствующие фенотипу вируса пассажа 52 (SEQ ID NO: 6).

На Фиг.1 показаны ректальные температуры после вакцинации.

На Фиг.2 показаны ректальные температуры после заражения вирулентным PRRSV NADC20.

На Фиг.3 показаны массы тела после вакцинации и после заражения.

На Фиг.4 показаны данные после заражения в отношении процентной доли легких с поражениями PRRS.

На Фиг.5 показаны баллы оценки легких (LAS) после заражения в отношении тяжести наблюдаемых поражений.

Фиг.6 представляет собой гистограмму, на которой проиллюстрированы уровни антител против PRRSV в сыворотке после вакцинации и после заражения (отношения S/P (образец/положительный контроль) ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ)).

Фиг.7 является графическим представлением вирусной нагрузки в сыворотке после заражения (log TCID50 (50%-ная инфекционная доза для тканевой культуры)/мл на клетках РАМ).

Фиг.8 представляет собой графическое представление способов, используемых для получения вакцин, включающих SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6, как описано в данной заявке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В SEQ ID NO: 1 приведен полный геном пассажа 17 P129-PK-FL.

В SEQ ID NO: 2 приведен полный геном пассажа 17 P129-PK-d43/44.

В SEQ ID NO: 3 приведен полный геном пассажа 24 P129-PK-FL.

В SEQ ID NO: 4 приведен полный геном пассажа 34 P129-PK-d43/44.

В SEQ ID NO: 5 приведен полный геном пассажа 0 Р129.

В SEQ ID NO: 6 приведен полный геном пассажа 52 Р129.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения единственные формы включают множественные ссылки, если контекст ясно не диктует иное. Таким образом, например, ссылки на «способ» включают один или более чем один способ и/или этап типа, описанного в данной заявке, которые будут очевидны специалистам в данной области при чтении данного описания и так далее.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют те же самые значения, как они обычно понимаются специалистом в области техники, к которой принадлежит это изобретение. Несмотря на то, что при использовании или испытании изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в данной заявке, далее описываются предпочтительные способы и материалы.

При использовании настоящего изобретения, если конкретно не указано противоположное, будут применяться традиционные способы вирусологии, иммунологии, микробиологии, молекулярной биологии и технологии рекомбинантных ДНК, хорошо известные специалисту в данной области техники, многие из которых описаны ниже с целью иллюстрации. Такие методики подробно описаны в литературе. См., например, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

Термин «северо-американский вирус PRRS» означает любой вирус PRRS, имеющий генетические характеристики, ассоциированные с изолятом северо-американского вируса PRRS, такого как вирус PRRS, который был впервые выделен в Соединенных Штатах приблизительно в начале 1990-х гг. (см., например, Collins, J.Е., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4: 117-126); изолят MN-1b североамериканского вируса PRRS (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6: 293-296); штамм PRRS Quebec IAF-exp91 (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140: 1405-1418) и изолят VR 2385 северо-американского вируса PRRS (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1795-1801), но не ограничиваясь ими. Генетические характеристики относятся к сходству геномных нуклеотидных последовательностей и сходству аминокислотных последовательностей, общих для штаммов северо-американского вируса PRRS. Штаммы китайского вируса PRRS обычно показывают примерно 80-93%-ное сходство нуклеотидной последовательности с северо-американскими штаммами.

Термин «европейский вирус PRRS» относится к любому штамму вируса PRRS, имеющему генетические характеристики, ассоциированные с вирусом PRRS, который был впервые выделен в Европе приблизительно в 1991 году (см., например, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13: 121-130). «Европейский вирус PRRS» в данной области иногда также называют «вирусом Lelystad».

«Эффективный иммунозащитный ответ», «иммунная защита» и подобные термины для целей настоящего изобретения означают иммунный ответ, который направлен против одного или более чем одного антигенного эпитопа патогена для защиты вакцинированного животного от инфекции патогеном. Для целей настоящего изобретения защита против инфекции патогеном включает не только абсолютное предупреждение инфекции, но также любое детектируемое снижение степени или уровня инфекции патогеном, или любое детектируемое снижение тяжести заболевания или любого симптома или состояния, возникающего в результате инфекции патогеном, у вакцинированного животного по сравнению с невакцинированным инфицированным животным. Эффективный иммунозащитный ответ может быть индуцирован у животных, которые ранее не были инфицированы патогеном и/или не являются инфицированными патогеном во время вакцинации. Эффективный иммунозащитный ответ также может быть индуцирован у животного, уже инфицированного патогеном во время вакцинации.

Генетически модифицированный вирус PRRS является «аттенуированным», если он менее вирулентен, чем его немодифицированный родительский штамм. Штамм является «менее вирулентным», если он показывает статистически значимое снижение одного или более чем одного параметра, определяющего тяжесть заболевания. Такие параметры могут включать уровень виремии, лихорадку, тяжесть респираторного дистресс-синдрома, тяжесть репродуктивных симптомов или количество или тяжесть поражений легких и так далее.

«Клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию вируса PRRS» означает клетку, способную генерировать инфекционный PRRS, будучи инфицированной вирусом по изобретению. Такие клетки включают клетки линии моноцитов/макрофагов свиней, такие как свиные альвеолярные клетки-макрофаги и производные, клетки почки обезьяны МА-104 и производные, такие как клетки MARC-145, и клетки, трансфицированные рецептором вируса PRRS. Термин «клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию вируса PRRS» также может включать клетки живой свиньи.

Термин «открытая рамка считывания» или «ORF» в том виде, как он используется в данной заявке, означает минимальную нуклеотидную последовательность, требующуюся для кодирования определенного белка вируса PRRS без промежуточного стоп-кодона.

Термины «свиной» и «свинья» используются в данной заявке взаимозаменяемо и относятся к любому животному, которое является членом семейства Suidae, такому как, например, свинья. Термин «вирус PRRS» в том виде, как он используется в данной заявке, если не указано иное, означает любой штамм либо северо-американских, либо европейских вирусов PRRS.

«PRRS» охватывает симптомы заболевания у свиньи, вызванного инфекцией вируса PRRS. Примеры таких симптомов включают, но не ограничиваются ими, лихорадку, выкидыш у беременных самок, респираторный дистресс-синдром, поражения легких, потерю аппетита и падеж молодых свиней. Вирус PRRS, который «не способен вызвать PRRS», в том виде, как он используется в данной заявке, относится к вирусу, который может инфицировать свинью, но который не вызывает каких-либо симптомов заболевания, обычно ассоциированных с инфекций PRRS у свиньи.

Термины «N-белок» или «ORF7» PRRSV в том виде, как они используются в данной заявке, определяются как полипептид, который кодируется ORF7 как европейского, так и северо-американского генотипов вируса PRRS. Примерами конкретных изотипов N-белка, которые известны в настоящее время, являются: полипептид из 123 аминокислот изолята VR2322 североамериканского PRRS прототипа, представленный в Genbank под номером доступа PRU87392, и N-белок из 128 остатков изолята Lelystad европейского PRRS прототипа, представленный в Genbank под номером доступа А26843.

Термин «область NLS-1 N-белка PRRSV» или «область NLS-1 ORF7 PRRSV» относится к сигналу ядерной локализации «pat4» или «nuc1» (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003), содержащему четыре расположенные рядом основные аминокислоты (лизин или аргинин) или три основных остатка и гистидин или пролин, расположенные в пределах приблизительно первых 15 N-концевых остатков зрелого N-белка. В качестве примера, последовательностью области NLS-1 VR2332 является KRKK, и она локализована в остатках 9-12, тогда как пследовательностью изолята Lelystad является КККК, и она локализована в остатках 10-13 N-белка.

Термин «область NLS-2 N-белка PRRSV» или «область NLS-2 ORF7 PRRSV» относится ко второму сигналу ядерной локализации в пределах N-белка, который может принимать одну из двух форм. У северо-американских вирусов PRRS NLS-2 имеет структуру, которую авторы изобретения обозначили как мотив «pat8», который начинается с пролина и в пределах трех остатков сопровождается последовательностью из пяти остатков, содержащей по меньшей мере три основных остатка (K или R) из пяти (незначительная модификация мотива «pat7» или «nuc2», описанная Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). В качестве примера, такая последовательность локализована в остатках 41-47 N-белка изолята VR2332 северо-американского PRRSV и представлена последовательностью Р…K. В европейских вирусах PRRS NLS-2 имеет мотив «pat4» или «nuc1», который представляет собой непрерывный участок из четырех основных аминокислот или трех основных остатков, ассоциированных с гистидином или пролином (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). NLS-2 изолята Lelystad европейского PRRSV локализован в остатках 47-50 и представлен последовательностью K…K.

«Область NoLS N-белка PRRSV» или «область NoLS ORF7 PRRSV» относится к сигналу ядрышковой локализации, имеющему общую длину примерно 32 аминокислоты и включающему область NLS-2 вблизи его N-конца. В качестве примера, область NoLS VR2332 локализована в остатках 41-72 и представлена последовательностью P…R (Rowland & Yoo, 2003), и соответствующая последовательность изолята Lelystad локализована в остатках42-73 и представлена последовательностью P…R.

Термин «трансфицированная клетка-хозяин» означает практически любую клетку-хозяина, как она описана в патенте США №5600662, которая при трансфицировании РНК вируса PRRS может продуцировать по меньшей мере первое поколение вирионов PRRS.

Термин «инфекционная молекула ДНК» для целей настоящего изобретения представляет собой молекулу ДНК, которая кодирует необходимые элементы для поддержки репликации, транскрипции и трансляции в функциональный вирион из подходящей клетки-хозяина.

Подобным образом, термин «выделенная полинуклеотидная молекула» относится к композиции вещества, содержащей полинуклеотидную молекулу по настоящему изобретению, очищенную до любой детектируемой степени из ее природного состояния, если такое существует.

Для целей настоящего изобретения нуклеотидная последовательность второй полинуклеотидной молекулы (либо РНК, либо ДНК) является «гомологичной» нуклеотидной последовательности первой полинуклеотидной молекулы или имеет «идентичность» с указанной первой полинуклеотидной молекулой, когда нуклеотидная последовательность второй полинуклеотидной молекулы кодирует такую же полиаминокислоту, что и нуклеотидная последовательность первой полинуклеотидной молекулы, на основе вырожденности генетического кода, или когда она кодирует полиаминокислоту, которая является достаточно сходной с полиаминокислотой, кодируемой нуклеотидной последовательностью первой полинуклеотидной молекулы так, чтобы быть полезной при использовании настоящего изобретения. Гомологичные полинуклеотидные последовательности также относятся к смысловым и антисмысловым нитям и во всех случаях к комплементарным последовательностям любых таких нитей. Для целей настоящего изобретения полинуклеотидная молекула является полезной при использовании настоящего изобретения и, следовательно, гомологичной или имеющей идентичность, когда ее можно использовать в качестве диагностического зонда для детекции присутствия вируса PRRS или вирусного полинуклеотида в образце жидкости или ткани инфицированной свиньи, например, посредством стандартных методик гибридизации или амплификации. В общем, нуклеотидная последовательность второй полинуклеотидной молекулы является гомологичной нуклеотидной последовательности первой полинуклеотидной молекулы, если она имеет по меньшей мере примерно 70%-ную идентичность нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью первой полинуклеотидной молекулы на основе алгоритма BLASTN (Национальный центр биотехнологической информации, иначе известный как NCBI (Bethesda, Maryland, США), Национального института здоровья Соединенных Штатов). В конкретном примере расчетов согласно применению настоящего изобретения дана ссылка на BLASTP 2.2.6 [Tatusova ТА and TL Madden, "BLAST 2 sequences- a new tool for comparing protein and nucleotide sequences." (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250.]. Вкратце, две аминокислотных последовательности выравнивают для оптимизации показателей выравнивания с использованием штрафа за внесение делеции (gap opening penalty) 10, штрафа за продолжение делеции (gap extension penalty) 0,1 и матрицы подсчета «blosum62» от Henikoff and Henikoff (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919. 1992). Процент идентичности затем рассчитывают как: общее число идентичных совпадений × 100/ поделенное на длину более длинной последовательности + число пробелов, введенных в более длинную последовательность для выравнивания двух последовательностей.

Предпочтительно гомологичная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере примерно 75% идентичности нуклеотидной последовательности, даже более предпочтительно по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичности нуклеотидной последовательности. Поскольку генетический код является вырожденным, гомологичная нуклеотидная последовательность может включать любое число «молчащих» замен оснований, т.е. замен нуклеотидов, которые, тем не менее, кодируют ту же самую аминокислоту.

Гомологичная нуклеотидная последовательность может дополнительно содержать немолчащие мутации, т.е. замены, делеции или добавления оснований, приводящие к различиям аминокислот в кодируемой полиаминокислоте, пока последовательность остается по меньшей мере примерно на 70% идентичной полиаминокислоте, кодируемой первой нуклеотидной последовательностью, или иным способом полезной при использовании настоящего изобретения. В этом отношении могут быть сделаны определенные консервативные аминокислотные замены, которые обычно рассматриваются как не инактивирующие общую функцию белка: такие как, в отношении положительно заряженных аминокислот (и наоборот) - лизина, аргинина и гистидина; в отношении отрицательно заряженных аминокислот (и наоборот) - аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и в отношении определенных групп нейтрально заряженных аминокислот (и во всех случаях также наоборот) - 1) аланина и серина, (2) аспарагина, глутамина и гистидина, (3) цистеина и серина, (4) глицина и пролина, (5) изолейцина, лейцина и валина, (6) метионина, лейцина и изолейцина, (7) фенилаланина, метионина, лейцина и тирозина, (8) серина и треонина, (9) триптофана и тирозина, (10) и, например, тирозина, триптофана и фенилаланина. Аминокислоты можно классифицировать согласно физическим свойствам и вкладу во вторичную и третичную структуру белка. Консервативной заменой в данной области считается замена одной аминокислоты на другую аминокислоту, которая имеет похожие свойства. Типичные консервативные замены можно найти в WO 97/09433, страница 10, опубликованной 13 марта 1997 года (PCT/GB96/02197, поданной 6 сентября 1996 года). В качестве альтернативы, консервативные аминокислоты можно группировать, как описано в Lehninger (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77). Дополнительные подходящие консервативные замены и их применение описаны ниже.

Гомологичные нуклеотидные последовательности можно определить сравнением нуклеотидных последовательностей, например, с использованием BLASTN, как описано выше. В качестве альтернативы, гомологичные нуклеотидные последовательности можно определять гибридизацией в выбранных условиях. Например, нуклеотидная последовательность второй полинуклеотидной молекулы является гомологичной SEQ ID NO: 1 (или любой другой конкретной полинуклеотидной последовательности), если она гибридизуется с комплементом SEQ ID NO: 1 при умеренно жестких условиях, например, гибридизация с ДНК, связанной с фильтром, в 0,5 М NaHPO4, 7% додецилсульфате натрия (SDS), 1 мМ EDTA при 65°C и промывка в 0,2×SSC/0,1% SDS при 42°C (см. Ausubel et al editors, Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1994, pp.6.0.3-6.4.10), или при условиях, которые в ином случае будут приводить к гибридизации последовательностей, которые кодируют вирус PRRS, как определено ниже. Модификации в условиях гибридизации можно определить эмпирически или точно рассчитать на основе длины и процентного содержания пар оснований гуанозин/цитозин (GC) зонда. Условия гибридизации можно рассчитать, как описано в Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp.9.47-9.51.

В другом воплощении вторая нуклеотидная последовательность гомологична SEQ ID NO: 1 (или любой другой последовательности по изобретению), если она гибридизуется с комплементом SEQ ID NO: 1, в очень жестких условиях, например, гибридизация с ДНК, связанной с фильтром, в 0,5 М NaHPO4, 7% SDS, 1 мМ EDTA при 65°C и промывка в 0,1×SSC/0,1% SDS при 68°C, как известно в данной области (Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1989).

Кроме того, следует понимать, что выделенные полинуклеотидные молекулы и выделенные молекулы РНК по настоящему изобретению включают как синтетические молекулы, так и молекулы, полученные посредством рекомбинантных методик, таких как клонирование и транскрипция in vitro.

Полинуклеотидные молекулы можно подвергать генетической мутации с использованием рекомбинантных методик, известных обычным специалистам в данной области, включая сайт-направленный мутагенез или случайный мутагенез, как, например, путем воздействия химических мутагенов или радиации, как известно в данной области. Мутации могут быть осуществлены стандартными способами, известными в данной области, например, сайт-направленным мутагенезом (см., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) инфекционной копии, как описано (например, Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol., 1998, 440: 199-206).

Соответственно, согласно данному изобретению дополнительно предложен способ получения генетически модифицированного североамериканского вируса PRRS, который включает мутирование последовательности ДНК, кодирующей инфекционную молекулу РНК, которая кодирует описанный выше вирус PRRS, и экспрессирование генетически модифицированного вируса PRRS с использованием подходящей экспрессионной системы. Генетически модифицированный вирус PRRS может быть экспрессирован с выделенной полинуклеотидной молекулы с использованием подходящих экспрессионных систем, общеизвестных в данной области, примеры которых описаны в данной заявке. Например, выделенная полинуклеотидная молекула может быть в виде плазмиды, способной экспрессировать кодируемый вирус в подходящей клетке-хозяине in vitro, как более подробно описано ниже.

Последовательности N-белка северо-американского PRRSV являются высококонсервативными, и приведенные последовательности имеют примерно 93-100% идентичности друг с другом. N-белки северо-американского и европейского PRRSV примерно на 57-59% идентичны и имеют общие структурные мотивы. В общем, при сравнении кодируемых PRRS последовательностей и изолятов, которые можно нумеровать по-разному в отношении конкретных нуклеотидов или кодируемых аминокислот, идентификация правильных областей легко достигается путем идентификации сохраняющихся характерных аминокислот в интересующем штамме PRRS и выравниванием их с контрольным штаммом.

Технология рекомбинантных ДНК включает крайне варьирующие и действенные методики молекулярной биологии, направленные на модификацию нуклеиновых кислот на уровне ДНК, и делает возможным анализ и модификацию геномов на молекулярном уровне. В связи с этим, вирусы, такие как вирус PRRS, ввиду малого размера их генома особенно легко поддаются такого рода манипуляциям. Однако технология рекомбинантных ДНК не является непосредственно применимой к РНК-вирусам, не относящимся к ретровирусам, поскольку репликация этих вирусов не включает промежуточную ДНК-стадию. Для таких вирусов должны быть разработаны инфекционные клоны кДНК перед тем, как к их геному можно будет применять технологию рекомбинантных ДНК для создания модицицированного вируса. Инфекционные клоны можно получать посредством конструирования полноразмерной (размер генома) кДНК (используется здесь в широком смысле ДНК-копии РНК, а не только в строгом смысле ДНК-копии мРНК) исследуемого вируса, после чего в клетках, трансфицированных полноразмерной кДНК, инфекционный транскрипт синтезируется in vivo, но инфекционные транскрипты также можно получать транскрипцией in vitro из полноразмерной кДНК в плазмиде, имеющей прокариотический промотор, в присутствии смеси для проведения транскрипции, или, вновь, in vitro с использованием лигированных фрагментов кДНК неполной длины, включающих полный вирусный геном. Во всех случаях транскрибированная РНК несет все модификации, которые были введены в кДНК, и может использоваться для дальнейшего пассажа вируса, модифицированного таким образом.

Получение инфекционного клона изолята европейского вируса PRRS или вируса Lelystad описано в патенте США №6268199, который тем самым полностью включен в данное описание посредством ссылки. Получение инфекционного клона кДНК изолята северо-американского вируса PRRS, обозначенного Р129 (Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004), описано в патенте США №6500662, который тем самым полностью включен в данное описание посредством ссылки. Последовательность кДНК Р129 раскрыта в Genbank под номером доступа AF494042 и в патенте США №6500662. Ниже в работе авторов изобретения применяется такой инфекционный клон, который в виде плазмиды экспрессируется посредством немедленного раннего промотора CMV (цитомегаловируса), и был обозначен pCMV-S-P129, и также раскрыт в патенте США №6500662. Как описано в патенте США №6500662, существуют другие плазмиды и промоторы, подходящие для применения в данном изобретении.

Принимая во внимание полноразмерную последовательность любой интересующей открытой рамки считывания и расположение интересующего аминокислотного остатка, обычному специалисту для конструирования изменений в конкретном желаемом положении требуется лишь обратиться к таблице кодонов.

Кодоны представляют собой триплетные последовательности нуклеотидов в молекулах мРНК и соответствующих им кДНК. Для кодонов характерно основание урацил (U), когда они присутствуют в молекуле мРНК, но когда они присутствуют в ДНК, для них характерно основание тимидин (Т). Простая замена в кодоне для одного и того же аминокислотного остатка в пределах полинуклеотида не будет изменять последовательность или структуру кодируемого полипептида. Очевидно, при утверждении, что конкретная последовательность из 3 нуклеотидов «кодирует(ют)» любую конкретную аминокислоту, обычный специалист понял бы, что в приведенной выше таблице дан способ идентификации конкретных рассматриваемых нуклеотидов. В качестве примера, если конкретная последовательность из трех нуклеотидов кодирует лизин, то в приведенной выше таблице показано, что двумя возможными триплетными последовательностями являются AAA и AAG. Глицин кодируют GGA, GGC, GGT (GGU, если он закодирован в РНК) и GGG. Для замены в кодируемом белке остатка лизина на глицин можно заменить триплет AAA или AAG на любой из GGA и GGC, GGT или GGG в кодирующей нуклеиновой кислоте.

Как упомянуто выше, настоящее изобретение направлено на представление вакцинных штаммов PRRS, где ответы хозяина на вирус, которые опосредованы путями интерферона, среди прочих ответов, не снижены. Как подробно описано ниже, существуют разные модификации вирусного генома, которые являются эффективными в этом отношении, особенно модификации, обнаруженные в ORF1a, как раскрыто в данной заявке, и их комбинации. Следует отметить, что сходные точки модификаций можно обнаружить в дополнительных открытых рамках считывания генома PRRS, что также раскрыто в данной заявке (см. Таблицу 9).

Стоит отметить, что некоторые другие предшествующие подходы для модификации полинуклеотида PRRS оказались успешными для того, чтобы аттенуировать вирус PRRS, возможно обеспечивая пригодность для применения в качестве вакцины, несмотря на то, что точная причина полученных в результате аттенуаций обычно не известна. Например, была раскрыта аттенуация вирулентного вируса PRRS путем мутирования или делеции области NLS-2, области NoLS или области NES в нуклеокапсиде или N-белке (кодируемом ORF7) вируса с включением делеции в открытую рамку считывания 7 (ORF7). В другом аспекте делеция ORF7 находится в пределах последовательности, кодирующей сигнал ядерной локализации (NLS) белка капсида. Делеция ORF7 в пределах последовательности, кодирующей NLS, может включать делецию одной или более чем одной аминокислоты в положениях 43-48 или делецию аминокислоты в одном из положений 43 и 44 или в обоих положениях 43 и 44. См., например, полное описание патента США №7544362, который включен в данное описание посредством ссылки. Белок нуклеокапсида (N) PRRSV, кодируемый ORF7, представляет собой маленький основной белок, который является фосфорилированным (Wootton, Rowland, and Yoo, 2002) и образует гомодимеры (Wootton and Yoo, 2003). Недавно была определена кристаллическая структура (Doan and Dokland, 2003). N-белок, по-видимому, обладает многочисленными функциями в инфицированной клетке. Помимо образования структуры сферического капсида, в который упаковывается геномная РНК, процесса, который происходит в цитоплазме, часть N-белка транспортируется в ядро и конкретно в ядрышко инфицированной клетки. Аминокислотная последовательность N-белка содержит два сигнала ядерной локализации (NLS), сигнал ядрышковой локализации (NoLS) и сигнал ядерного экспорта (NES), которые облегчают транспорт в ядро и ядрышко и экспорт из ядра, соответственно (Rowland et al., 1999; Rowland et al., 2003; Rowland and Yoo, 2003). При нахождении в ядрышке N-белок взаимодействует с маленьким ядрышковым РНК-ассоциированным белком фибрилларином и может регулировать процессинг рРНК и биогенез рибосом в инфицированной клетке для того, чтобы способствовать репликации вируса (Yoo et al., 2003). Вирусные мутации этого типа, либо сами по себе, либо в комбинации с другими ослабляющими мутациями, являются полезными для конструирования новых вакцин против PRRS. В другом примере вируса PRRS, который был аттенуирован, применяли модификацию ORF1a. Применяли делецию последовательности ДНК, кодирующей антигенный эпитоп между аминокислотами 616-752 в гипервариабельной области в кодирующей области ORF1a неструктурного белка 2, см. патент США №7618797, который включен в данное описание посредством ссылки во всей его полноте.

Исследования иммунобиологии вируса PRRS свидетельствуют о том, что взаимодействие вируса PRRS с PDC заслуживает изучения. 0,2%-0,8% одноядерных клеток периферической крови у людей, мышей, крыс, свиней и обезьян представляют собой этот тип клеток. Несмотря на ее редкость, эта клетка является важным компонентом врожденной иммунной системы и способна секретировать обильные количества IFN-α после стимуляции вирусом. Именно посредством секреции IFN-α PDC играют важную роль в регуляции противовирусного врожденного и адаптивного иммунитета, поскольку они стимулируют функцию естественных клеток-киллеров, В-клеток и Т-клеток. Кроме того, созреванию свиных дендритных клеток, происходящих из моноцитов (MoDC), способствует IFN-α, секретируемый PDC, что приводит к повышенной способности MoDC презентировать антиген и активировать T-клетки. На более поздней стадии вирусной инфекции PDC дифференцируются в уникальный тип зрелой дендритной клетки, которая непосредственно регулирует функцию Т-клеток и управляет дифференцировкой Т-клеток в клетки, способные секретировать IFN-γ, который является главным медиатором антивирусного иммунитета против вирусов, включая вирус PRRS. Не удивительно, что существуют человеческие вирусы, такие как респираторно-синцитиальный вирус и вирус кори, которые, как известно, подавляют способность PDC секретировать IFN-α. Считается, что этот ингибирующий эффект играет роль в преобладании гуморального иммунного ответа и ассоциированной иммунопатологии, наблюдаемой в результате инфекции этими вирусами, а также в повышенной чувствительности хозяина к вторичным бактериальным и вирусным инфекциям.

Напротив, изоляты PRRSV дикого типа, а также оба штамма вакцины PRRS Ingelvac (см. Примеры 5 и следующие, приведенные ниже) ингибировали способность очищенных популяций свиных PDC продуцировать IFN-α, тогда как новые штаммы вируса P129-PK-FL и P129-PK-d43/44 (см. ниже) демонстрировали близкий к нулю ингибирующий эффект на данную функцию PDC. Значение этих наблюдений состоит отчасти в важности IFN-α в регуляции развития адаптивного иммунного ответа на вирусы. Соответственно, очень вероятно, что аттенуированная вирусная вакцина, полученная из вируса, минимально подавляющего IFN-α, вызывала бы сильный противовирусный защитный иммунный ответ. Ранее был продемонстрирован адъювантный эффект IFN-α на индуцированный вакциной Ingelvac PRRS MLV вирус-специфичный ответ IFN-γ, опосредованный Т-клетками, и продемонстрировано, что интенсивность вирус-специфичного опосредованного Т-клетками ответа IFN-γ, вызванного вакциной, имела положительную корреляцию с защитным иммунитетом против вируса в полевых и лабораторных условиях. Соответственно, хотя и не ограничиваясь теорией, было бы обоснованно ожидать, что клеточно-опосредованный иммунный ответ и уровень защитного иммунитета, вызванного PRRSV, не ингибирующим IFN-α, будут значительно выше, чем при использовании изолята PRRSV, демонстрирующего фенотип дикого типа (ингибирующий IFN-α).

Обращаясь к настоящему изобретению, примечательно, что вирус Р129-PK-FL, а также все мутанты с пятью делециями, полученные из инфекционного клона кДНК pCMV-S-P129-PK, потеряли способность ингибировать продукцию IFN-α. Следовательно, этот необычный фенотип не может быть обусловлен исключительно делециями, но должен быть по меньшей мере частично обусловлен генетическими изменениями, которые стали фиксированными во время конструирования инфекционного клона. Интересно, что неклонированный вирус Р129, который последовательно пассировали 63 раза на клетках PK-9, сохранял способность ингибировать продукцию IFN (Таблица 1). Наиболее вероятным объяснением для общего фенотипа в отношении IFN, наблюдаемого у всех вирусов, происходящих от инфекционного клона, является включение одной или более чем одной мутации во время генерирования инфекционного клона. Эти мутации существовали бы, возможно с низкими уровнями, в вирусной РНК, используемой для конструирования инфекционного клона. В конечном счете, мутации возможно существовали в исходном вирусе (пассаж 0) у свиньи, или они возможно были генерированы и обогащены во время процесса адаптации вируса к росту на клетках PK-9 в течение 16 пассажей. Нельзя исключать возможности того, что мутации были результатом ошибок, индуцированных ПЦР, или артефактами клонирования. В любом случае, мутация(ции), ответственная за потерю функции ингибирования IFN-α, становилась «фиксированной» во время конструирования инфекционного клона, и ожидалось бы, что она присутствует у всех вирусов, происходящих из этого конкретного инфекционного клона.

Возможность того, что мутации, ответственные за измененный фенотип ингибирования IFN-α, пред существовал и в вирусной РНК, используемой для конструирования клона кДНК, является правдоподобной, принимая во внимание то, что у PRRSV, как известно, легко генерируется случайное генетическое разнообразие в результате ошибок вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Квазивиды вируса содержат гетерогенную смесь близкородственных генетических вариантов, которые появляются в природе во время репликации вируса in vivo. Даже более релевантным является наблюдение квазивидов вируса после многочисленных пассажей in vitro PRRSV, происходящего из инфекционного клона кДНК. Это примечательно, поскольку исходная популяция вирусных геномов в ранее проведенных исследованиях состояла из генетически гомогенной популяции, и разнообразие последовательности быстро генерировалось на протяжении пассажа в культуре клеток. В настоящем исследовании уровень геномной гетерогенности был бы выше, поскольку исходный вирус Р129 не был клонирован (биологически или молекулярно) до 16 пассажей на PK-9, приводящих к конструированию инфекционного клона. Таким образом, возможность отбора варианта РНК PRRSV, ответственного за потерю функции ингибирования IFN-α, среди квазивидов и включения в инфекционный клон кДНК pCMV-S-P129-PK17-FL кажется правдоподобной. Включение этих мутаций в инфекционный клон при определенных обстоятельствах может считаться случайным, учитывая тот факт, что все производные вирусы должны иметь этот отличный биологический фенотип, который может оказаться важным для разработки эффективных вакцин против PRRS следующего поколения.

Штамм Р129 вируса PRRS дикого типа, подобно другим штаммам этого вируса, демонстрировал сильный ингибирующий эффект на способность одноядерных клеток периферической крови (РВМС) и пазмацитоидных дендритных клеток (PDC) продуцировать интерферон (IFN)-α. С другой стороны, вирус, происходящий из инфекционного клона кДНК Р129 (pCMV-S-P129-PK17-FL), демонстрировал значительное ослабление фенотипа ингибирования IFN-α. Этот инфекционный клон конструировали из вируса, который ранее был адаптирован к росту на линии клеток почки свиньи PK-9, экспрессирующей CD163, в ходе 16 последовательных пассажей (см. патент США №7754464, который включен в данное описание посредством ссылки во всей его полноте). Фенотип ингибирования IFN-α P129-PK-FL и P129-PK-d43/44 варьировал от слабого до пренебрежимо малого и явно отличался от фенотипа, демонстрируемого каждым из двух штаммов модифицированного живого вируса PRRS вакцины Ingelvac, оба из которых были сильно ингибирующими. Данные результаты показывают, что вирусы P129-PK-FL и P129-PK-d43/44 являются биологически отличными от родительского изолята Р129 низкого пассажа, других вирусов PRRS дикого типа и обеих вакцин Ingelvac PRRS. Обсуждаются возможные последствия фенотипа ослабленного ингибирования IFN-α, а также возможные причины фенотипического изменения.

Модификации аминокислот по изобретению

При использовании настоящего изобретения, в полевых условиях могут быть идентифицированы новые изоляты PRRS северо-американского или китайского генотипов, которые содержат специфические аминокислоты в специфичных положениях в белках, кодируемых ORF1, и которые придают данным вирусам желательные фенотипы. В качестве альтернативы, как упомянуто выше, можно использовать стандартные генетические процедуры для модификации генетической последовательности (и, таким образом, аминокислотной последовательности) белка, кодируемого ORF1, вновь с получением модифицированных северо-американского и китайского вирусов PRRS, и инфекционных клонов, и полученных из них вакцин, которые все дают такие фенотипы. В предпочтительных примерах фенотипы включают, без ограничения, пониженный эффект ингибирования интерферона-α по сравнению с вирусом PRRS дикого типа и, возможно, способность репродуцироваться или сохраняться в животном-хозяине (свинье) при инициировании устойчивого иммунного ответа, но со слабой детектируемой патологией.

Таким образом, при использовании изобретения штаммы или изоляты северо-американского PRRS, которые могут служить в качестве полезного исходного материала, включают штаммы или изоляты, раскрытые, например, в патентах США №6500662, 7618797, 7691389, 7132106, 6773908, 7264957, 5695766, 5476778, 5846805, 6042830, 6982160, 6241990 и 6110468. Что касается штаммов или изолятов китайского PRRS, которые могут служить в качестве полезного исходного материала, см., например, опубликованную китайскую заявку CN200910091233.6 из китайской заявки CN201633909, относящуюся к вирусу TJM-92.

В связи с обсуждением, которое следует ниже, для большинства обычных аминокислот, кодируемых ДНК, используются общепризнанные международные одно- и трехбуквенные обозначения: аланин (Ala, А); аргинин (Arg, R); аспарагин (Asn, N); аспарагиновая кислота (Asp, D); цистеин (Cys, С); глутаминовая кислота (Glu, Е); глутамин (Gln, Q); глицин (Gly, G); гистидин (His, Н); изолейцин (Ile, I); лейцин (Leu, L); лизин (Lys, K); метионин (Met, М); фенилаланин (Phe, F); пролин (Pro, Р); серии (ser, S); треонин (Thr, Т); триптофан (Trp, W); тирозин (Tyr, Y) и валин (Val, V).

В Таблицах 9 и 10 идентифицированы наблюдаемые аминокислотные замены, ответственные за ослабление вирулентности северо-американского (и китайского) PRRS, которые коррелируют с пониженным ингибированием активности интерферона альфа, обеспечивая посредством этого безопасный и устойчивый иммунный ответ на вакцины. В Таблице 10 идентифицированы весьма предпочтительные в данном отношении аминокислотные модификации в пределах ORF1a, и показано, как возникли эти мутации в связи с пассированием из других культур Р129 (следует отметить, что проверка этой истории также облегчает разработку стратегий мутагенеза для (ре)конструирования кодирующей ДНК, имеющей любые аминокислотные замены по изобретению, по мере необходимости). В данном отношении наиболее предпочтительные улучшения аминокислот относительно ORF1a (о чем свидетельствует пассаж 52 Р129) включают: аспарагин в положении 182, аспарагин в положении 189, тирозин в положении 273, гистидин в положении 302, треонин в положении 665, цистеин в положении 943, треонин в положении 1429, аланин в положении 1505, аспарагин в положении 2410, которые также потенциально добавляют многочисленные возможности для гликозилирования и которые могут дополнительно изменять функцию белка.

Соответственно, согласно изобретению предложен выделенный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), где его белок, кодируемый ORF1a, выбран из группы, состоящей из тех аминокислотных последовательностей, которые содержат любую из:

аминокислоты N в пределах аминокислотной последовательности AMANVYD (SEQ ID NO: 9);

аминокислоты N в пределах аминокислотной последовательности IGHNAVM (SEQ ID NO: 12);

аминокислоты D в пределах аминокислотной последовательности TVPDGNC (SEQ ID NO: 15);

аминокислоты Y в пределах аминокислотной последовательности CWWYLFD (SEQ ID NO: 18);

аминокислоты Н в пределах аминокислотной последовательности HGVHGKY (SEQ ID NO: 21);

аминокислоты V в пределах аминокислотной последовательности AAKVDQY (SEQ ID NO: 24);

аминокислоты T в пределах аминокислотной последовательности PSATDTS (SEQ ID NO: 27);

аминокислоты L в пределах аминокислотной последовательности LNSLLSK (SEQ ID NO: 30);

аминокислоты C в пределах аминокислотной последовательности APMCQDE (SEQ ID NO: 33);

аминокислоты T в пределах аминокислотной последовательности CAPTGMD (SEQ ID NO: 36);

аминокислоты A в пределах аминокислотной последовательности PKVAKVS (SEQ ID NO: 39);

аминокислоты I в пределах аминокислотной последовательности AGEIVGV (SEQ ID NO: 42);

аминокислоты N в пределах аминокислотной последовательности ADFNPEK (SEQ ID NO: 45) и

аминокислоты I в пределах аминокислотной последовательности QTPILGR (SEQ ID NO: 48).

Более конкретно, согласно изобретению предложен выделенный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), где его белок, кодируемый ORF1a, выбран из группы, состоящей из тех аминокислотных последовательностей, которые содержат любую из:

аминокислоты N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислоты N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислоты D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ ID NO: 15);

аминокислоты Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислоты Н в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21);

аминокислоты V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислоты T в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислоты L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислоты C в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33);

аминокислоты T в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислоты A в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39);

аминокислоты I в пределах аминокислотной последовательности EIV (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислоты N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45) и

аминокислоты I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 48).

Как упомянуто выше, существуют многочисленные известные штаммы и изоляты северо-американского и китайского PRRS, и продолжают развивать или выделять новые штаммы. Несмотря на то, что между всеми этими штаммами существует высокий уровень гомологии аминокислотной последовательности, специалисты в данной области незамедлительно поймут, что существует некоторое варьирование, и в действительности можно использовать преимущество этих различий и сходств для дальнейшего улучшения фенотипических свойств всех вакцинных штаммов.

Во-первых, в отношении всех аминокислотных мотивов, определенных SEQ ID NO, как непосредственно определено (на страницах 31-33) выше, подчеркнутые и предпочтительные аминокислоты (как это предусмотрено от пассажа 52 Р129) обычно остаются полностью полезными, даже если расположенные рядом аминокислоты были иным образом изменены в определенных последовательностях SEQ ID NO. Таким образом, в том, что касается AMANVYD (SEQ ID NO: 9), в качестве конкретного и репрезентативного примера, обычно можно проверить соответствующую последовательность экспрессируемого ORF1 белка из любого североамериканского или китайского PRRS для обнаружения соответствующего аминокислотного мотива, даже если в других таких штаммах в результате эволюции произошли дополнительные изменения, вызывающие замены и/или делеции или присоединения. Как будет понятно специалистам в данной области, предпочтительные аминокислотные замены, демонстрируемые пассажем 52 Р129, таким образом, также должны оставаться действенными, несмотря на другие изменения в общей аминокислотной последовательности, которые происходят непосредственно 5′ или 3′ относительно определенной аминокислоты пассажа 52. Это будет особенно верным, если сопоставимые аминокислотные замены считаются консервативными. Таким образом, в отношении AMANVYD (SEQ ID NO: 9) и его подпоследовательности ANV, должна быть возможность легкой идентификации сопоставимого мотива в другом штамме PRRS, если, например, валин в нем заменен изолейцином, или лейцином, или любым другим остатком, или если остаток просто отсутствует, или добавлен дополнительный остаток. Существуют многочисленные компьютерные программы для идентификации выравниваний и, таким образом, определения того, соответствуют ли мотивы полипептидной последовательности, например, так называемые таблицы Blosum (на основе заданного уровня процента идентичности), см. S. Henikoff et al. "Amino Acid Substitution matrices from protein blocks", Proc Natl Acad Sci, USA, 89 (22), pp.10915-10919, Nov 15, 1992, а также см. A.L. Lehninger et al. Principles of Biochemistry, 2005, MacMillan and Company, 4th edition. Консервативные аминокислотные замены также распознают на основе классификации на 5 общих групп: сульфгидрильные (Cys); ароматические (Phe, Tyr и Trp); основные (Lys, Arg, His); алифатические (Val, Ileu, Leu, Met) и гидрофильные (Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser и Thr). Таким образом, в пределах использования данного изобретения находится модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей любой северо-американский или китайский PRRS, для включения в подходящем и соответствующем положении любой аминокислотной замены, определенной для пассажа 52 Р129, даже если расположенная рядом с обозначенным положением одна или более чем одна другая аминокислота была добавлена, удалена или заменена.

Дополнительно, основываясь на сходных принципах, специалистам в данной области будет понятно, что раз уж идентифицирована предпочтительная аминокислота из специфических замен пассажа 52, идентифицированных для ORF1a при использовании настоящего изобретения, тогда также можно использовать консервативные замены для любых таких аминокислот пассажа 52, либо в вариантах Р129, либо в отношении любых других северо-американского или китайского штаммов, с существенным сохранением намеченного фенотипа пассажа 52. Таким образом, в качестве репрезентативных примеров: в отношении SLL (в пределах SEQ ID NO: 30) обозначенный остаток лейцина может быть далее заменен изолейцином, валином или метионином; в отношении FNP (в пределах SEQ ID NO: 45) обозначенный аспарагин может быть заменен любым из Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Ser и Thr; и в отношении VAK (см. SEQ ID NO: 39) обозначенный аланин может быть заменен любым из Asn, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Ser и Thr; всеми и тому подобным, хотя будет совершенно понятно, что требованием настоящего изобретения не является то, что любые такие заменяющие аминокислоты действуют также, как и первоначально идентифицированные уникальные аминокислотные замены пассажа 52 в определенных положениях. Естественно, применение стандартных консервативных аминокислотных замен согласно любой другой признанной модели также применяется на практике в настоящем изобретении. Например, и во всех случаях включая обратное, Asp на Glu и наоборот, Asn на Gln, Arg на Lys, Ser на Cys или Thr, Phe на Tyr, Val на Leu или Ileu, Ala на Gly и тому подобное.

Кроме того, в пределах использования настоящего изобретения, несмотря на то, что в любой северо-американский или китайский PRRS можно успешно помещать любую из индивидуальных аминокислотных замен пассажа 52 (как идентифицировано для ORF1a выше) с желательным фенотипическим эффектом, также предпочтительно включать в конечную конструкцию так много вариантов аминокислот из Таблицы 9 или Таблицы 10, как возможно, что обычно обеспечивается подходящей модификацией кодирующей полинуклеотидной последовательности. Таким образом, использование настоящего изобретения включает предоставление китайского или североамериканского вирусов PRRS (и соответствующих кодирующих полинуклеоидов), которые обеспечивают 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и вплоть до любых из приблизительно 17 идентифицированных замен ORF1a пассажа 52 (Таблица 9), которые все находятся в конечной последовательности вируса, для включения любых специфических пар, триплетов или других комбинаций более высокого порядка всех общих идентифицированных аминокислотных замен пассажа 52. Такие аминокислотные замены, естественно, можно вводить в соответствующие кодирующие нуклеотидные последовательности вируса посредством сайт-направленного мутагенеза, ПЦР (полимеразной цепной реакции) и других методик, как хорошо известно в данной области.

Для демонстрации того, что конкретный генетически модифицированный штамм является аттенуированным, можно использовать эксперимент, описанный следующим образом.

В каждое испытание включают по меньшей мере 10 подсвинков на группу, которых получают с фермы, свободной от PRRSV. Животные дают отрицательный результат в анализе на сывороточные антитела, специфичные в отношении вируса PRRS, и не имеют PRRSV. Все животные, включенные в испытание, происходят из одного и того же источника и принадлежат к одной и той же породе. Распределение животных по группам рандомизировано.

Заражение проводят на 90-е сутки беременности посредством интраназального нанесения 1 мл PRRSV 105 TCID50 на ноздрю. Существуют по меньшей мере три группы для каждого условия испытания: одна группа для заражения Р129; одна тестируемая группа для заражения возможно аттенуированным вирусом и одна группа строгого контроля.

Исследование признается обоснованным, когда строгие контроли остаются негативными в отношении PRRSV на протяжении хода исследования, и в группе, зараженной Р129, рождается по меньшей мере на 25% меньше здоровых поросят по сравнению со строгими контролями.

Аттенуацию, или другими словами - меньшую вирулентность, определяют как статистически значимое изменение одного или более чем одного параметра, определяющего репродуктивную способность или другую симптомологию.

Значимое снижение по меньшей мере одного из следующих параметров в тестируемой группе (возможно аттенуированный вирус) по сравнению с группой, инфицированной немодифицированным родительским штаммом, было бы свидетельством аттенуации:

а) частота мертворожденных;

б) выкидыш на 112-ые сутки беременности или до них;

в) число мумифицированных поросят;

г) число менее активных и слабых поросят;

д) смертность до отъема от свиноматки.

Кроме того, предпочтительным является значимое увеличение одного из следующих параметров в тестируемой группе по сравнению с группой, инфицированной немодифицированным родительским штаммом:

е) число отъемных поросят на свиноматку;

ж) число живых здоровых поросят, рожденных на свиноматку.

В качестве альтернативы, для установления аттенуации могут быть изучены респираторные симптомы и другие симптомы инфекции PRRSV.

Аттенуированный штамм является ценным для приготовления вакцин. Настоящая вакцина является эффективной, если она защищает свинью против инфекции вирусом PRRS. Вакцина защищает свинью против инфекции вирусом PRRS, если после введения вакцины одной или более чем одной непораженной свинье последующее заражение биологически чистым изолятом вируса (например VR 2385, VR 2386, Р129 и т.д.) приводит к уменьшенной тяжести любых макроскопических или гистопатологических изменений (например поражений в легком) и/или симптомов заболевания по сравнению с изменениями или симптомами, обычно вызываемыми данным изолятом у подобных свиней, не являющихся защищенными (т.е. относительно подходящего контроля). Более конкретно, эффективность настоящей вакцины может быть показана посредством введения вакцины одной или более чем одной подходящей свинье, нуждающейся в этом, с последующим заражением большой пробой (10(3-7) TCID(50)) биологически чистого изолята PRRSV после подходящего периода времени (например 4 недели). Затем, примерно через одну неделю, у зараженной свиньи отбирают пробу крови, и затем проводят попытку выделить вирус из пробы крови. Выделение большого количества вируса является указанием того, что вакцина может не является эффективной, тогда как выделение пониженных количеств вируса (или отсутствие вируса) является указанием того, что вакцина может быть эффективной.

Таким образом, эффективность настоящей вакцины можно оценивать количественно (т.е. уменьшение процентного содержания объединенной легочной ткани по сравнению с подходящей контрольной группой) или качественно (например выделение PRRSV из крови, детекция антигена PRRSV в образце ткани легких, миндалин или лимфатических узлов посредством иммунологического анализа). Симптомы репродуктивно-респираторного заболевания свиней можно оценивать количественно (например температура/лихорадка) или полуколичественно (например наличие или отсутствие одного или более чем одного симптома или уменьшение тяжести одного или более чем одного симптома, такого как цианоз, пневмония, поражения легкого и т.д.).

Непораженная свинья представляет собой свинью, которая либо не подвергалась воздействию инфекционного агента, вызывающего репродуктивно-респираторное заболевание свиней, либо которая подвергалась воздействию инфекционного агента, вызывающего репродуктивно-респираторное заболевание свиней, но не демонстрирует симптомов данного заболевания. Пораженная свинья представляет собой свинью, которая демонстрирует симптомы PRRS, или из которой можно выделить PRRSV.

Вакцины по настоящему изобретению могут быть изготовлены следуя общепринятой договренности по включению приемлемых носителей для животных, включая людей (если это применимо), таких как стандартные буферы, стабилизаторы, разбавители, консерванты и/или солюбилизаторы, и они также могут быть приготовлены так, чтобы способствовать длительному высвобождению. Разбавители включают воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Добавки для изотоничности, среди прочих, включают хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы, среди прочих, включают альбумин. Другие подходящие наполнители и добавки вакцин, включая те, которые особенно полезны при приготовлении модифицированных живых вакцин, известны или будут очевидны специалистам в данной области. См., например, Remington′s Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing, которая включена в данное описание посредством ссылки.

Вакцины по настоящему изобретению могут дополнительно содержать один или более чем один дополнительный иммуномодулирующий компонент, такой как, например, среди прочих, адъювант или цитокин. Неограничивающие примеры адъювантов, которые можно использовать в вакцине по настоящему изобретению, включают адъювантную систему RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), квасцы, минеральные гели, такие как гель на основе гидроксида алюминия, эмульсии типа «масло в воде», эмульсии типа «вода в масле», такие как, например, полный и неполный адъюванты Фрейнда, блок-сополимеры (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil А или другие фракции сапонина, монофосфориллипид А и липид-аминный адъювант Avridine. Неограничивающие примеры эмульсий типа «масло в воде», полезных в вакцине по изобретению, включают модифицированные композиции SEAM62 и SEAM 1/2. Модифицированный SEAM62 представляет собой эмульсию типа «масло в воде», содержащую 5% (об./об.) сквалена (Sigma), 1% (об./об.) детергента SPAN® 85 (ICI Surfactants), 0,7% (об./об.) детергента TWEEN® 80 (ICI Surfactants), 2,5% (об./об.) этанола, 200 пг/мл Quil А, 100 [мгр] г/мл холестерина и 0,5% (об./об.) лецитина. Модифицированный SEAM 1/2 представляет собой эмульсию типа «масло в воде», содержащую 5% (об./об.) сквалена, 1% (об./об.) детергента SPAN® 85, 0,7% (об./об.) детергента Tween® 80, 2,5% (об./об.) этанола, 100 мкг/мл Quil А и 50 мкг/мл холестерина. Другие иммуномодулирующие агенты, которые могут быть включены в вакцину, включают, например, один или более чем один интерлейкин, интерферон или другой известный цитокин.

Вакцины по настоящему изобретению возможно могут быть приготовлены для длительного высвобождения вируса, инфекционной молекулы РНК, плазмиды или вирусного вектора по настоящему изобретению. Примеры таких композиций с длительным высвобождением включают вирус, инфекционную молекулу РНК, плазмиду или вирусный вектор в комбинации с композитами биосовместимых полимеров, таких как, например, поли(молочная кислота), поли(молочная-согликолевая кислота), метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, коллаген и тому подобное. Обзор структуры, выбора и применения деградируемых полимеров в носителях для доставки лекарственных средств был дан в нескольких публикациях, включая A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292, которая включена в данное описание посредством ссылки. Дополнительное руководство по выбору и применению полимеров в фармацевтических композициях можно найти в руководствах, известных в данной области, например, М. Chasin and R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol.45, M. Dekker, N.Y., которая также включена в данное описание посредством ссылки. Альтернативно или дополнительно, вирус, плазмида или вирусный вектор могут быть микроинкапсулированы для улучшения введения и эффективности. Способы микроинкапсулирования антигенов хорошо известны в данной области и включают методики, описанные, например, в патенте США №3137631; патенте США №3959457; патенте США №4205060; патенте США №4606940; патенте США №4744933; патенте США №5132177 и международной патентной публикации WO 95/28227, которые все включены в данное описание посредством ссылки.

Для обеспечения длительного высвобождения вируса, плазмиды или вирусного вектора также могут быть использованы липосомы. Подробности относительно того, как получать и применять липосомные композиции можно найти, наряду с другими источниками, в патенте США №4016100, патенте США №4452747, патенте США №4921706, патенте США №4927637, патенте США №4944948, патенте США №5008050 и патенте США №5009956, которые все включены в данное описание посредством ссылки.

Эффективное количество любой из вышеописанных вакцин можно определить традиционными способами, начиная с низкой дозы вируса, вирусного белка, плазмиды или вирусного вектора и затем увеличивая дозировку при мониторинге эффектов. Эффективное количество может быть достигнуто после однократного введения вакцины или после многократных введений вакцины. При определении оптимальной дозы для животного можно принимать во внимание известные факторы. Они включают вид, размер, возраст и общее состояние животного, присутствие в животном других лекарственных средств и тому подобное. Реальную дозировку предпочтительно выбирают после рассмотрения результатов из исследований других животных (см., например, Примеры 2 и 3, приведенные ниже).

Одним способом детектирования того, был ли достигнут адекватный иммунный ответ, является определение сероконверсии и титра антител у животного после вакцинации. Расписание вакцинации и число повторных иммунизации, если они используются, предпочтительно будут определяться врачом или ветеринаром на основе анализа всех релевантных факторов, некоторые из которых описаны выше.

Величину эффективной дозы вируса, белка, инфекционной молекулы ДНК, плазмиды или вирусного вектора по настоящему изобретению можно определить, используя известные методики, принимая во внимание факторы, которые могут быть определены обычным специалистом в данной области, такие как масса животного, подлежащего вакцинации. Величина дозы вируса по настоящему изобретению в вакцине по настоящему изобретению предпочтительно варьирует от примерно 101 до примерно 109 БОЕ (бляшкообразующая единица), более предпочтительно от примерно 102 до примерно 108 БОЕ и наиболее предпочтительно от примерно 103 до примерно 107 БОЕ. Величина дозы плазмиды по настоящему изобретению в вакцине по настоящему изобретению предпочтительно варьирует от примерно 0,1 мг до примерно 100 мг, более предпочтительно от примерно 1 мг до примерно 10 мг, даже более предпочтительно от примерно 10 мг до примерно 1 мг. Величина дозы инфекционной молекулы ДНК по настоящему изобретению в вакцине по настоящему изобретению предпочтительно варьирует от примерно 0,1 мг до примерно 100 мг, более предпочтительно от примерно 1 мг до примерно 10 мг, даже более предпочтительно от примерно 10 мг до примерно 1 мг. Величина дозы вирусного вектора по настоящему изобретению в вакцине по настоящему изобретению предпочтительно варьирует от примерно 101 БОЕ до примерно 109 БОЕ, более предпочтительно от примерно 102 БОЕ до примерно 108 БОЕ и даже более предпочтительно от примерно 103 до примерно 107 БОЕ. Подходящий объем дозировки варьирует от примерно 0,5 мл до примерно 10 мл, и более предпочтительно от примерно 1 мл до примерно 5 мл.

Подходящие дозы вирусного белка или пептидных вакцин при использовании настоящего изобретения обычно варьируют от 1 до 50 микрограммов на дозу, или до больших количеств, что можно определить стандартными способами, причем количество адъюванта относительно каждого такого вещества подлежит определению признанными способами. В предпочтительном примере изобретения, относящемся к вакцинации свиней, оптимальный целевой возраст для животных составляет примерно от 1 до 21 суток, что во время до отъема от свиноматки также может соответствовать другим запланированным вакцинациям, таким как вакцинация против Mycoplasma hyopneumoniae или PCV (цирковирус свиней). Дополнительно, предпочтительная схема вакцинации для племенных свиноматок включала бы аналогичные дозы со схемой ежегодной ревакцинации.

Эффективное количество любой из описанных выше вакцин можно определить традиционными способами, начиная с низкой дозы вируса, плазмиды или вирусного вектора и затем увеличивая дозировку при мониторинге эффектов. Эффективное количество может быть достигнуто после однократного введения вакцины или после многократных введений вакцины. При определении оптимальной дозы для животного можно принимать во внимание известные факторы. Они включают вид, размер, возраст и общее состояние животного, присутствие в животном других лекарственных средств и тому подобное. Реальную дозировку предпочтительно выбирают после рассмотрения результатов из исследований других животных.

Одним способом детектирования того, был ли достигнут адекватный иммунный ответ, является определение сероконверсии и титра антител у животного после вакцинации. Расписание вакцинации и число повторных иммунизации, если они используются, предпочтительно будут определяться врачом или ветеринаром на основе анализа всех релевантных факторов, некоторые из которых описаны выше.

Величину эффективной дозы вируса, инфекционной молекулы РНК, плазмиды или вирусного вектора по настоящему изобретению можно определить, используя известные методики, принимая во внимание факторы, которые могут быть определены обычным специалистом в данной области, такие как масса животного, подлежащего вакцинации. В качестве примера, вакцины могут быть доставлены перорально, парентерально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, интраназально или внутривенно. Пероральная доставка может включать, например, добавление композиций к корму или питью животных. Факторы, имеющие отношение к дозировке вакцины, включают, например, массу и возраст свиньи.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ приготовления вакцины, содержащей описанные в данной заявке вирус PRRS, инфекционную молекулу РНК, плазмиду или вирусный вектор, который включает объединение эффективного количества одного из вируса PRRS, инфекционной молекулы РНК, плазмиды или вирусного вектора по настоящему изобретению с носителем, приемлемым для фармацевтического или ветеринарного применения.

Кроме того, живая аттенуированная вакцина по настоящему изобретению может быть модифицирована, как описано в патенте США №6500662, чтобы она кодировала гетерологичный антигенный эпитоп, который вставлен в вирусный геном PRRS, с использованием известных рекомбинантный методик. См. также патент США №7132106, который включен в данное описание посредством ссылки во всей его полноте. Антигенные эпитопы, полезные в качестве гетерологичных антигенных эпитопов для настоящего изобретения, включают антигенные эпитопы из свиного патогена, отличного от вируса PRRS, которые включают, но не ограничиваются им, антигенный эпитоп из свиного патогена, выбранного из группы, состоящей из: парвовируса свиней, цирковируса свиней, ротавируса свиней, свиного гриппа, вируса псевдобешенства, вируса трансмиссивного гастроэнтерита, респираторного коронавируса свиней, вируса классической лихорадки свиней, вируса африканской лихорадки свиней, вируса энцефаломиокардита, парамиксовируса свиней, вируса torque teno, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Bacillus anthraci, Bordetella bronchiseptica, Clostridium haemolyticum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Haemophilus parasuis, Leptospira spp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynovia, Pasteurella multocida, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Streptococcus equismilis и Streptococcus suis. Нуклеотидные последовательности, кодирующие антигенные эпитопы из вышеупомянутых свиных патогенов, известны в данной области и могут быть получены из общедоступных баз данных генов во всемирной паутине, таких как Genbank Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information) (США).

Дополнительные признаки и вариации изобретения будут очевидными для специалистов в данной области из всей данной заявки, включая подробное описание, и все такие признаки подразумеваются в качестве аспектов изобретения. Подобным образом, описанные в данной заявке признаки изобретения можно повторно комбинировать в дополнительные воплощения, которые также подразумеваются в качестве аспектов изобретения, независимо от того, является ли комбинация признаков конкретно упомянутой выше в качестве аспекта или воплощения изобретения. Также, только такие ограничения, которые описаны в данной заявке как критические для изобретения, должны рассматриваться как таковые; вариации изобретения, не имеющие ограничений, которые не были описаны в данной заявке как критические, подразумеваются в качестве аспектов изобретения. Будет ясно, что изобретение можно осуществлять иначе, чем конкретно описано в вышеизложенном описании и примерах.

В свете приведенных выше идей возможны многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения, и, следовательно, они находятся в пределах объема изобретения.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не ограничивают изобретение.

ПРИМЕР 1

АДАПТАЦИЯ И ОСЛАБЛЕНИЕ ИЗОЛЯТА Р129 PRRSV НА КЛЕТКАХ РК-9

Вирулентный изолят Р129 PRRS был выделен из больной свиньи в Индиане в 1995 году в лаборатории диагностики заболеваний животных университета Purdue. Образец сыворотки из этой свиньи пассировали один раз в свинье с хорошим состоянием здоровья для увеличения количества исходных сыворотки и гомогената легких. Вирусную РНК экстрагировали из сыворотки и гомогената легких и использовали для определения полной геномной консенсусной последовательности вируса Р129 пассажа 0. РНК сначала подвергали первоначальной обработке со случайными гексамерами и использовали для синтеза «ДНК. Геном амплифицировали в трех перекрывающихся частях с использованием высокоточной (с коррекцией (proofreading)) ПЦР. ПЦР-продукты из трех отдельных ПЦР-реакций (на сегмент генома) подвергали Т/А-клонированию и использовали для секвенирования ДНК с генерацией полноразмерной геномной консенсусной последовательности (см. SEQ ID NO: 5).

Аликвоту сыворотки той же самой свиньи, которую использовали для секвенирования ДНК, содержащую Р129 пассажа 0, использовали для инфицирования клеток первичных альвеолярных макрофагов свиней (РАМ). Потомство вируса от инфекции РАМ (пассаж 1) фильтровали через 0,1 микронный шприцевой фильтр и использовали для инфицирования клеток РК-9.

Клетки РК-9 представляют собой трансгенную линию клеток, полученную стабильным трансфицированием линии клеток почки свиньи РК0809 плазмидой, кодирующей делеционную версию гена CD163 свиньи и ген устойчивости к неомицину. Подробности конструирования и определения характеристик линии клеток РК-9 были описаны ранее.

Адаптация пассажа 1 вируса из клеток РАМ для роста на клетках РК-9 была затруднительной, и требовалось несколько попыток с многочисленными параллельными линиями. Инфекцию отслеживали по иммунофлуоресценции лунок в двойной повторности с использованием моноклонального антитела SDOW17, конъюгированного с FITC (флуоресцеинизотиоцианат), специфичного в отношении вирусного белка нуклеокапсида (Rural Technologies Inc, Brookings South Dakota). Ранние пассажи приводили к небольшому числу маленьких очагов, но не генерировали достаточного количества бесклеточных вирусных частиц для инициации инфекции свежего монослоя. Эти пассажи осуществляли путем обработки инфицированного монослоя Accutase (заменитель трипсина) и повторного посева клеток в большое число лунок со свежей средой с добавлением или без добавления неинфицированных клеток PK-9. После нескольких таких пассажей некоторые линии демонстрировали явное увеличение частоты и размера флуоресцентных очагов. Некоторые из них приобретали способность к пассированию с использованием бесклеточных вирусных жидкостей. При пассаже 17 (1 на клетках РАМ, 16 на PK-9) одну линию можно было надежно поддерживать с использованием разведений бесклеточных жидкостей из предыдущих пассажей, и она приводила к инфекции всего монослоя в пределах нескольких суток. Вирус не вызывал цитопатического эффекта на клетках PK-9 на пассаже любого уровня. РНК экстрагировали из инфицированных клеток PK-9 при пассаже 17 вируса и использовали для конструирования инфекционного клона «ДНК.

ПРИМЕР 2

КОНСТРУИРОВАНИЕ ИНФЕКЦИОННОГО КЛОНА кДНК ПАССАЖА 17 Р129-PK

Конструировали инфекционный клон кДНК вируса Р129-PK пассажа 17 с использованием плазмидного остова, как описано ранее. Геном вируса амплифицировали обратной транскрипцией и ПЦР в трех перекрывающихся сегментах со встречающимися в природе уникальными сайтами эндонуклеаз рестрикции в областях перекрытия. Продукты из трех отдельных ПЦР-реакций клонировали, и секвенировали, и выравнивали с генерацией консенсусной последовательности для каждого сегмента генома. Если ни один из трех клонированных продуктов данного сегмента не соответствовал предсказанной аминокислотной последовательности консенсуса для данного сегмента, один из клонов модифицировали субклонированием и/или сайт-направленным мутагенезом до тех пор, пока он не соответствовал предсказанной аминокислотной последовательности консенсуса. Три геномных сегмента и остов плазмиды соединяли с использованием стандартных методик клонирования и сайтов эндонуклеаз рестрикции. Образующийся полноразмерный клон, обозначенный pCMV-S-P129-PK17-FL, был инфекционным при трансфекции в клетки РК-9. Последовательность этого инфекционного клона кДНК приведена в SEQ ID NO: 1. Геном является по существу идентичным вирусу пассажа 17, из которого он был сконструирован, с аутентичными концами, и в нем отсутствуют какие-либо вставки или делеции относительно консенсусных последовательностей пассажа 17. В вирусном геноме этого инфекционного клона «ДНК нет сконструированных сайтов рестрикции или других намеченных изменений.

Различия нуклеотидов и аминокислот между полными геномными консенсусными поседовательностями Р129 пассажа 0 и геномной последовательностью инфекционного клона pCMV-S-P129-PK17-FL перечислены индивидуально в Таблице 6. Таблица 6 включает все различия нуклеотидов и различия образующихся в результате аминокислот по положению в геноме. Подмножество этих мутаций отвечает за изменение фенотипа от ингибирующего IFN (пассаж 0) до неингибирующего IFN (все вирусы, полученные из инфекционного клона кДНК пассажа 17). В Таблице 7 обобщены различия нуклеотидов, аминокислот и неконсервативных аминокислот по открытой рамке считывания (ORF) PRRSV или неструктурному белку (nsp). Для целей Таблицы 7 следующие группы аминокислот находятся среди групп аминокислот, считающихся консервативными: [K, R], [D, Е], [L, I, V, А] и [S, T].

ПРИМЕР 3

ДЕЛЕЦИОННЫЕ МУТАНТЫ В ПАССАЖЕ 17 Р129-PK

В инфекционном клоне кДНК pCMV-S-P129-PK17-FL были сконструированы делеции в двух областях генома с генерацией пяти генетически модифицированных инфекционных клонов.

Одним участком генома, подлежащим модификации, была последовательность ядерной локализации (NLS), локализованная в положениях аминокислот 41-47 белка нуклеокапсида (кодируемого ORF7 PRRSV). Было сделано два типа делеций. Эти делеции были описаны ранее в контексте другого инфекционного клона PRRSV. Последовательностью дикого типа аминокислотных остатков 41-49 является PG…KN. У мутанта "d43/44", также известного как "PG--KS", подвергнуты делеции остатки лизина 43 и 44, а

остаток аспарагина 49 заменен на серии. У мутанта "d43/44/46", также известного как "PG--S-KS", подвергнуты делеции остатки лизина 43, 44 и 46, и остаток аспарагина 49 заменен на серии. Инфекционными клонами, происходящими от pCMV-S-P129-PK17-FL, которые включают эти делеции, являются pCMV-S-P129-PK17-d43/44 и pCMV-S-P129-PK17-d43/44/46, соответственно. См. патент США №7544362.

Второй участок генома, подлежащий модификации, находился в гипервариабельной области nsp2 в пределах ORF1a. Делеция 131 аминокислоты (393 нуклеотида) была описана ранее в контексте другого инфекционного клона PRRSV. Инфекционным клоном, происходящим от pCMV-S-P129-PK17-FL, который включает эту делецию, является pCMV-S-P129-PK17-nsp2.

В остове pCMV-S-P129-PK17-FL также были генерированы инфекционные клоны, которые объединяют делеции NLS и nsp2, и они были обозначены pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44 и pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44/46.

ПРИМЕР 4

ГЕНЕРИРОВАНИЕ И РОСТ ВИРУСОВ НА КЛЕТКАХ PK-9

Шесть инфекционных клонов, описанных в Примере 3, трансфицировали в клетки PK-9 с генерацией шести вирусов, как показано в Таблице 1. Вирус генерировали из этих инфекционных клонов путем прямой трансфекции кольцевой плазмиды в клетки PK-9 с использованием Lipofectamine 2000. После трансфекции выделенные вирусы вновь последовательно пассировали на клетках PK-9 для того, чтобы дополнительно повысить титры и ослабить вирулентность. Делали маточные растворы для тестирования in vitro и оценки in vivo в качестве вакцин-кандидатов. В случае вируса P129-PK17-FL, происходящего из немодифицированного инфекционного клона pCMV-S-P129-PK17-FL, вирус культивировали до достижения всего 52 пассажей из свиньи. Полный геном данного вируса секвенировали у пассажей 24 (SEQ ID NO: 3) и 52 (SEQ ID NO:6).

ПРИМЕР 5

ВИРУСЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ОТ ИНФЕКЦИОННОГО КЛОНА кДНК ПАССАЖА 17 Р129-PK, ИМЕЮТ ПОНИЖЕННУЮ СПОСОБНОСТЬ ИНГИБИРОВАТЬ ИНДУКЦИЮ IFN-АЛЬФА

Вирусы и клетки. Клетки MARC-145 и ST выращивали в модифицированной среде Игла (MEM), дополненной 5% фетальной телячей сыворотки (FBS) и антибиотиками (50 мкг/мл гентамицина, 100 UI (международные единицы) пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Клетки альвеолярных макрофагов свиней ZMAC-1 выращивали в RPMI-1640, дополненной 10% FBS. Штамм Purdue вируса TGE (трансмиссивного гастроэнтерита) получали инфицированием конфлюентных монослоев клеток ST при множественности заражения 0,01 в модифицированной среде Игла. Инокулят вируса удаляли через 1 ч, и клетки инкубировали в MEM, дополненной 2,5% FBS, при 37°C в атмосфере 5% CO2. Вирус высвобождали замораживанием и оттаиванием монослоев клеток после обнаружения 80% цитопатического эффекта. Вирусный маточный раствор TGE центрифугировали при 3500 об./мин в течение 15 мин при 4°C и хранили до применения при -80°C. Маточные растворы вируса (из клеток PK-9) были следующими: P129-PK-FL и P129-PK-dnsp2-d43/44/46 были получены при пассаже 8/25 (8 из инфекционного клона, 25 из свиньи). Четыре других вируса (P129-PK-d43/44, Р129-PK-d43/44/46, P129-PK-dnsp2 и P129-PK-dnsp2-d43/44) были получены при пассаже 21/38. Рабочие маточные растворы разных вирусов PRRS получали осуществлением одного пассажа на клетках ZMAC-1, за исключением того, что имеющиеся в продаже вакцины Ingelvac PRRS MLV и Ingelvac PRRS ATP были разведены согласно инструкциям производителя и непосредственно использованы для инфицирования.

Выделение РВМС свиньи (мононуклеарные клетки периферической крови). Свежую гепаринизированную венозную кровь разводили раствором Хэнкса, и РВМС выделяли центрифугированием в градиенте плотности через градиент Ficoll-Hypaque 1077 (Sigma). После двухкратной промывки в растворе Хэнкса, клетки суспендировали в среде RPMI с L-глутамином (Mediatech), дополненной 5% фетальной телячей сывороткой (Gibco), 100 U/мл пенициллином, 0,1 мг/мл стрептомицином, 1 мМ пируватом натрия, 1х заменимыми аминокислотами (Mediatech), 100 U/мл гетамицином и 250 мМ 2-меркаптоэтанолом (Sigma).

Очистка плазмацитоидных дендритных клеток свиньи. Очистку плазмацитоидных дендритных клеток свиньи проводили, как описано ранее (Calzada-Nova, представлена на рассмотрение), и она была основана на характерной экспрессии этими клетками CD4 и CD172 (Summerfield et al., 2003). Вкратце, свежие РВМС свиньи суспендировали в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) с 0,5% BSA (бычий сывороточный альбумин) и метили оптимальными количествами mAb (моноклональное антитело), распознающими свиной CD172 (72-22-15, VMRD). После одной промывки клетки инкубировали с вторичным козьим противомышиным антителом, конъюгированным с РЕ (фикоэритрин) (Southern Biotech), и, после промывки, с анти-CD4, меченным FITC (74-12-4, VMRD). PDC сортировали на клеточном сортере Reflection (iCyt), сортировочные ворота были настроены на популяцию CD4+/CD172low. После сортировки чистоту клеток подтверждали повторным анализом. Во всех случаях чистота была более 95%.

Анализ для измерения секреции цитокинов. РВМС или PDC стимулировали в течение 16 ч (37°C, 5% CO2) разными стимуляторами или проводили имитацию стимуляции. После инкубации среду, находящуюся над стимулированными клетками, анализировали на присутствие IFN-α с использованием сэндвич-ELISA, приготовленного с моноклональными антителами, имеющимися в продаже (mAb K9 и F17 против свиного IFN-α). Вкратце, планшеты Immulon II (Dynatech Inc.) покрывали mAb F17 против свиного IFN-α (PBL Laboratories) путем инкубации в течение ночи при 4°C с последующим блокированием средой RPMI, дополненной 5% фетальной тел ячей сывороткой. Через 1 час среду отбрасывали, и пятьдесят микролитров супернатанта, подлежащего тестированию, добавляли в лунки для анализа в двойной повторности. После 1 ч инкубации лунки для анализа промывали 4 раза и затем последовательно инкубировали с меченным биотином mAb K9 против свиного IFN-α (PBL Laboratories), конъюгированным с HRP (пероксидаза хрена) стрептавидином (Zymed Laboratories) и субстратом ТМВ (тетраметилбензидин) (KPL). Оптическую плотность определяли посредством планшет-ридера для ELISA.

Вирусы, полученные из инфекционного клона кДНК пассажа 17 Р129-PK, не имеют способности ингибировать индукцию IFN-альфа. Рабочие вирусные маточные растворы получали из группы из четырех разных изолятов вируса PRRS дикого типа (Р3412, Р129, IND5, NADC20), используя линию клеток альвеолярных макрофагов свиней ZMAC-1. Дополнительные маточные растворы также получали из производных первых двух вирусов дикого типа, которые были адаптированы к росту в культуре клеток посредством повторных пассажей в клетках PK-9, FK.D4 или MARC-145. Три из четырех изолятов дикого типа (Р129, IND5, NADC20) быстро и эффективно росли в клетках ZMAC-1 до титров примерно 107 TCID50/мл, тогда как изолят дикого типа Р3412 достигал лишь титра 105 TCID50/мл. Примечательно, что маточные растворы вирусов Р129, полученные в линии клеток ZMAC-1, достигали в 10 раз больших титров, чем маточные растворы, полученные в клетках PK-9 или MARC-145, к которым были адаптированы вирусы. Проверка способности этих вирусов стимулировать секрецию IFN-α РВМС выявила, что за одним исключением (клон C изолята Р3412) эти клетки секретировали очень маленькое количество (менее 50 пг) IFN-α в ответ на воздействие на них любого из протестированных маточных растворов вируса PRRS, которое является пренебрежимо малым по сравнению с обильной секрецией IFN-α (17540 пг), продуцируемого такими же клетками в результате воздействия на них коронавируса свиней, вируса трансмиссивного гастроэнтерита (TGEv).

PRRSV не только не способен стимулировать продукцию IFN-α свиными РВМС, но и активно ингибирует его продукцию. Ингибирующие эффекты маточных растворов PRRSV определяли измерением количества IFN-α, секретируемого РВМС в ответ на воздействие TGEv в присутствии или в отсутствие PRRSV. Как показано в Таблице 2, все 4 из протестированных изолятов вируса PRRS дикого типа, а также все производные, адаптированные к культуре клеток, проявляли сильный ингибирующий эффект (более 80%) на IFN-α ответ РВМС на TGEv. Был проведен анализ группы вирусных маточных растворов, полученных из инфекционного клона кДНК (pCMV-S-P129-PK17-FL), включая полноразмерный вирус P129-PK-FL и несколько генетически сконструированных делеционных мутантов. Как показано в Таблице 3, по сравнению с сильным ингибирующим эффектом (95%) родительского изолята Р129 дикого типа (пассаж 1) вирус P129-PK-FL и все делеционные мутанты проявляли значительно пониженную способность ингибировать индукцию IFN-α в РВМС посредством TGEv. Для дальнейшей оценки фенотипа в отношении IFN-α этих вирусов последующие эксперименты были сфокусированы на проведении прямых сравнений между вирусами P129-PK-FL и P129-PK-d43/44, родительским штаммом Р129 дикого типа и/или двумя имеющимися в продаже модифицированными живыми вакцинами PRRSV, произведенными Boehringer Ingelheim (Ingelvac PRRS MLV и Ingelvac PRRS ATP). Также тестировали дополнительный контрольный изолят низкого пассажа, NVSL-14. Как показано в Таблице 4, в четырех независимых экспериментах P129-PK-FL и Р129-PK-d43/44 проявляли значительно меньший ингибирующий эффект на IFN-α, чем родительский вирус Р129, два аттенуированных штамма Ingelvac или контрольный штамм. В одном случае коинфекция вирусами P129-PK-FL или P129-PK-d43/44 приводила к видимому усилению ответа IFN-α на TGEv.

Результаты, показанные в Таблице 2, указывают на эффект ингибирования интерферона-α вирусом PRRS дикого типа и производными, адаптированными к росту в культуре клеток. Указанные маточные растворы вирусов PRRS получали в результате выращивания в клетках ZMAC-1, и титр этих вновь генерированных маточных растворов определяли с использованием клеток ZMAC-1. Количество IFN-α, присутствующего в супернатантах культуры одноядерных клеток периферической крови свиней, подвергавшихся воздействию указанного маточного раствора вируса PRRS в течение 18 ч в присутствии или в отсутствие вируса TGE, определяли посредством ELISA. *Ответ на один TGE.

Результаты, показанные в Таблице 3, демонстрируют эффект ингибирования интерферона-α вирусом PRRS Р129 дикого типа и его генетически сконструированными производными, адаптированными к росту в клетках PK-9, экспрессирующих CD163. Количество IFN-α, присутствующего в супернатантах культуры одноядерных клеток периферической крови (РВМС) свиней, подвергавшихся воздействию указанного маточного раствора вируса PRRS в течение 18 ч в присутствии или в отсутствие вируса TGE, определяли посредством ELISA. н/п означает не применимо; *ответ на один TGE.

В Таблице 4 показан пониженный эффект ингибирования интерферона-α вирусами P129-PK-FL и P129-PK-d43/44 по сравнению с вирусом Р129 дикого типа и PRRS вакцин Ingelvac. Количество IFN-α, присутствующего в супернатантах одноядерных клеток периферической крови (РВМС) свиней, подвергавшихся воздействию указанного маточного раствора вируса PRRS в течение 18 ч в присутствии или в отсутствие вируса TGE, определяли посредством ELISA. н/п означает не применимо; *ответ на один TGEV.

Обильное количество IFN-α, секретируемого РВМС в ответ на воздействие на них TGEV, происходит в основном из субпопуляции клеток, которые составляют менее чем 0,3% популяции РВМС. Эта редкая, но важная субпопуляция клеток состоит из плазмацитоидных дендритных клеток (PDC), которые получили это название из-за характерной плазмацитоидной морфологии. Для дальнейшего изучения фенотипа в отношении IFN-α вирусов P129-PK-FL и P129-PK-d43/44 провели ряд экспериментов, подобных экспериментам, описанным выше, за исключением того, что использовали PDC, свежевыделенные из РВМС до чистоты более 95%. Как показано на Фиг.1, эта серия экспериментов подтвердила, что вирусы P129-PK-FL и P129-PK-d43/44 вызывали пренебрежимо малое ингибирование индукции IFN-α посредством TGEV. Кроме того, в одном эксперименте наблюдали видимый усиливающий эффект на TGEV-опосредованную индукцию IFN-α PDC в ответ на вирусы PRRS P129-PK-FL и P129-PK-d43/44. Напротив, вирус PRRS MLV Ingelvac проявлял сильный ингибирующий эффект на ответ IFN-α, как показано на Фиг.1.

Результаты, описанные в экспериментальном разделе, выявляют то, что вирусы PRRS P129-PK-FL и P129-PK-d43/44, а также другие производные инфекционного клона кДНК pCMV-S-P129-PK17-FL имеют значительно пониженную способность ингибировать индукцию IFN-α посредством TGEV в инфицированных клетках РВМС или PDC. Это разительно отличается от подавляющего эффекта на IFN, наблюдаемого с вирусами PRRS дикого типа (низкие пассажи) и с двумя имеющимися в продаже вакцинами на снове модифицированного живого вируса (Ingelvac PRRS MLV и Ingelvac PRRS ATP). Наблюдение того, что вирусы P129-PK-FL и P129-PK-d43/44 минимально подавляли эту важную функцию PDC, является потенциально важным, принимая во внимание значительную роль, которую играют эти клетки в опосредовании врожденного иммунитета против вирусных инфекций.

Также следует отметить, что согласно настоящему изобретению предложены вирусы клинически эффективных коммерческих вакцин, адаптированные для роста на пермиссивных клетках, которые рекомбинантно экспрессируют рецептор CD163, и что такие вирусы и вакцины не зависят от исторической технологии культивирования «клетка обезьяны» и не разрабатываются на каком-либо этапе с ее использованием. См. конкретно патент США №7754464.

ПРИМЕР 6

БЕЗОПАСНОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИН-КАНДИДАТОВ

Для того чтобы оценить их безопасность и эффективность в качестве вакцин против PRRS, три вируса, полученных из инфекционного клона кДНК pCMV-S-P129-PK17-FL, P129-PK-FL (пассаж 7/24), P129-PK-d43/44 (пассаж 17/34) и P129-PK-d43/44/46 (пассаж 17/34), оценивали в модели респираторного заболевания молодых свиней. Происхождение данных вирусов показано на Фиг.8, и схема эксперимента (группы обработки) перечислена в Таблице 5. Для гетерологичного заражения в возрасте 7 недель (четыре недели после вакцинации) использовали вирулентный изолят PRRSV NADC20 низкого пассажа. Контрольные группы обработки включали имитацию вакцины и имеющуюся в продаже PRRS вакцину Ingelvac MLV.

Необработанные (HO) группы были следующими: свиньи HO1 представляли собой индикаторы для мониторинга состояния здоровья свиней, используемых в качестве источника. Их содержали отдельно и подвергали вскрытию до заражения PRRSV. Свиньи HO2 представляли собой контактные контроли, которых содержали отдельно в загоне, находящемся между двумя загонами с вакцинированными свиньями, всего по две на группу обработки для каждой Т02-Т05. Свиньи НО3 представляли собой контактные контроли, которых содержали по одной на загон с вакцинированными свиньями, всего по две на группу обработки (Т02-Т05). Только свиней НО3 устанавливали к группе Т01.

Ректальные температуры вакцинированных животных измеряли после вакцинации и сравнивали с группой обработки Т01 (имитация вакцины). Результаты показаны на Фиг.1. Ни одна из вакцин не вызывала лихорадку. Все группы в среднем имели температуру меньше, чем 104°C на протяжении всего периода наблюдения после вакцинации.

Ректальную температуру свиней измеряли после заражения. Результаты показаны на Фиг.2. Невакцинированные свиньи Т01 демонстрировали устойчивые лихорадки с температурой больше, чем 104°C. Напротив, три вакцины значительно снижали лихорадки после заражения. P129-PK-FL был наиболее эффективен в уменьшении лихорадки.

Массу тела животных записывали до и после вакцинации. Результаты показаны на Фиг.3. Массы тела записывали на -1 (до вакцинации), 10, 24, 27 (до заражения) и 37 сутки исследования. У невакцинированных свиней заражение вирулентным вирусом NADC20 практически полностью устраняло прибавку в весе на протяжении 10-суточного периода наблюдения. Вакцины в разной степени устраняли данный эффект.

Легкие зараженных животных исследовали при вскрытии после заражения. Процентные доли каждого легкого, вовлеченные в поражения, показаны на Фиг.4. Группа Т01 с имитацией вакцины в среднем показывала 25,1% поражение легких. Вакцины в разной степени уменьшали поражение легких. P129-PK-FL был наиболее эффективным, снижая поражение легкого до 1,1%.

Тяжесть поражений легких оценивали с использованием балла оценки легкого (LAS), как показано на Фиг.5. Три вакцины уменьшали LAS. P129-PK-FL снижал средний LAS от 1,63 в группе с имитацией вакцины до 0,14.

Сывороточные антитела к PRRSV индуцировались как вакцинацией, так и заражением. S/P отношения IDEXX ELISA измеряли на 27 и 37 сутки исследования. Результаты показаны на Фиг.6. Вакцинация P129-PK-FL индуцировала наивысшие уровни антител против PRRS.

Виремию в сыворотке зараженных свиней титровали на клетках РАМ. Результаты (TCDI50/мл) приведены на Фиг.7. P129-PK-FL был наиболее эффективным в снижении виремии после заражения.

Несмотря на то, что изобретение было описано со ссылкой на приведенные выше примеры и на приложения, полное содержание каждого из которых включено посредством ссылки во всей его полноте, будет понятно, что модификации и вариации включены в пределы сущности и объема изобретения. Соответственно, изобретение ограничено лишь следующей далее формулой изобретения.

ПРИМЕР 7

ПОЛУЧЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОГО КЛОНА кДНК PCMV-S-P129-PK17-FL ИЗ КЛОНА ИНФЕКЦИОННОЙ кДНК PCMV-S-P129

Инфекционный клон кДНК PRRSV по настоящему изобретению, pCMV-S-P129-PK17-FL, может быть легко получен из описанного ранее инфекционного клона кДНК PRRSV pCMV-S-P129 обычным специалистом в данной области с использованием методики сайт-направленного мутагенеза. Инфекционный клон кДНК PRRSV pCMV-S-P129 описан в патенте США №6500662 и депонирован в АТСС (Американская коллекция типовых культур) под номером доступа 203489. Последовательность ДНК генома PRRSV в этом клоне также доступна в базе данных Genbank (NCBI) под номером доступа AF494042. Наборы для сайт-направленного мутагенеза имеются в продаже у целого ряда поставщиков и могут осуществлять многочисленные одновременные нуклеотидные замены во многих сайтах в больших плазмидах. Такие наборы включают Change-ITтм Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit (Affymetrix / USB), QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies - Stratagene Products) и AMAP Multi Site-directed Mutagenesis Kit (MBL International), но не ограничиваются ими.

Список нуклеотидных замен между инфекционным клоном кДНК PRRSV pCMV-S-P129 (доступен из АТСС) и инфекционным клоном кДНК PRRSV по настоящему изобретению pCMV-S-P129-PK17-FL представлен в Таблице 8. Все изменения находятся в областях генома, кодирующих белки. Всего имеется 74 нуклеотидных замены, которые можно ввести в инфекционный клон pCMV-S-Р129 с использованием 74 мутагенных праймеров и множественных последовательных реакций с имеющимся в продаже набором для сайт-направленного мутагенеза, получая молекулу плазмиды, которая является идентичной по последовательности описанному здесь pCMV-S-P129-PK17-FL. В действительности, такой же результат можно получить с менее чем 74 мутагенными праймерами, поскольку кластеры мутаций в пределах примерно 50-60 нуклеотидов друг от друга можно изменять с использованием одного мутагенного праймера. Например, нуклеотиды 735, 750 и 756 можно заменять с использованием одного мутагенного праймера, как и нуклеотиды 965, 992 и 1009. Таким образом, число праймеров уменьшается примерно до 60.

Из 74 нуклеотидных замен большинство (42) являются синонимичными или «молчащими», то есть они кодируют ту же самую аминокислоту. Эти нуклеотидные замены вряд ли имеют какой-либо измеримый эффект на фенотип вируса в отношении индукции или ингибирования интерферона. Остальные 32 нуклеотидные замены являются несинонимичными или «немолчащими» и приводят к аминокислотным заменам в вирусных белках. Прогнозируют, что эти 32 нуклеотидные замены непосредственно отвечают за фенотип вируса в отношении индукции/ингибирования интерферона, и должны быть заменены для того, чтобы превратить вирус, кодируемый инфекционным клоном pCMV-S-P129, в тот же самый фенотип в отношении интерферона, который демонстрируется вирусом, кодируемым инфекционным клоном pCMV-S-P129-PK17-FL. Такое изменение потребовало бы не более чем 32 мутагенных праймера, даже меньше, если принять во внимание кластеризацию некоторых релевантных нуклеотидов.

ПРИМЕР 8

СИНТЕЗ ИНФЕКЦИОННОГО КЛОНА кДНК PCMV-S-P129-PK17-FL DE NOVO

В качестве альтернативы сайт-направленному мутагенезу вирусный геном PRRS по настоящему изобретению можно химически синтезировать de novo с подходящими 5′ и 3′ адапторными последовательностями и клонировать в остов плазмиды, используемой для инфекционного клона кДНК PRRS pCMV-S-P129 (доступный в АТСС под номером доступа 203489), или в остов аналогичной плазмиды. Синтез на заказ генов, больших, чем 50 т.п.н. в длину (геном PRRSV имеет размер примерно 15,5 т.п.н.), доступен в качестве коммерческой услуги у многих производителей, включая (но не ограничиваясь): GenScript, DNA 2.0 и Bio Basic Inc. Синтетический вирусный геном направленно клонируется в вектор pCMV-S путем замены вирусного генома в инфекционном клоне pCMV-S-P129 с использованием 5′ PacI и 3′ SpeI сайтов рестрикционных ферментов, которые фланкируют геном. Для того чтобы вырезать синтетический геном, 24-нуклеотидное удлинение (5′-GCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTC-геном-3′, которое включает подчеркнутый сайт PacI) встраивается в 5′-конец синтетического генома, и 83-нуклеотидное удлинение (5′-геном-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATATTTAAATCCCAAGCCGAATTCCAGCACA CTGGCGGCCGTTACTAGTGAGCGGCCGC-3′, которое включает подчеркнутый сайт Spel) встраивается в 3′-конец синтетического генома. После разрезания плазмиды и синтетического генома PacI и SpeI подходящие фрагменты очищают, соединяют с использованием ДНК-лигазы и трансформируют в Escherichia coli для скрининга и воспроизведения с использованием стандартных методик клонирования, хорошо известных обычным специалистам в данной области.

Депонирование биологических материалов

Следующие биологические материалы (см. патент США №6500662) депонировали в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) в 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209, США 19 ноября 1998 года, и им назначали следующие номера доступа:

плазмида рТ7Р129А, номер доступа 203488;

плазмида pCMV-S-P129, номер доступа 203489.

Полный текст и раскрытие следующих патентов Соединенных Штатов включены в данное описание посредством ссылки, как если бы они были полностью изложены: US 6500662 и US 7618797.

1. Выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), где указанная последовательность ДНК выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6.

2. Клетка-хозяин для генерирования вируса PRRS, трансфицированная полинуклеотидной молекулой по п. 1.

3. Вакцина для защиты свиньи против инфекции вирусом PRRS, содержащая (а) генетически модифицированный северо-американский вирус PRRS, кодируемый полинуклеотидной молекулой по п. 1, (б) инфекционную молекулу РНК по п. 1, (в) полинуклеотидную молекулу по п. 1 в виде плазмиды или (г) вирусный вектор, содержащий полинуклеотидную молекулу по п. 1, в количестве, эффективном для выработки иммунной защиты против инфекции, и подходящий для ветеринарного применения носитель.

4. Выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует вирус PRRS, где указанная нуклеотидная последовательность представляет собой РНК-копию последовательности ДНК с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6.

5. Вакцина по п. 3, где эта вакцина имеет пониженный эффект ингибирования интерферона-α по сравнению с вирусом PRRS Р129 дикого типа.

6. Выделенная полинуклеотидная молекула по п. 1 или п. 4, которая содержит полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6.

7. Полинуклеотидная молекула РНК, кодирующая вирус PRRS, которая комплементарна по всей длине любой полинуклеотидной последовательности ДНК по п. 1 или 6.

8. Способ генерирования вируса PRRS in vitro, включающий трансфицирование подходящей клетки-хозяина плазмидой, содержащей полинуклеотидную последовательность по п. 1, и получение вируса PRRS, генерированного трансфицированной клеткой.

9. Способ генерирования вируса PRRS in vitro, включающий транскрипцию с плазмиды, имеющей промотор, способный транскрибировать полинуклеотидную молекулу, имеющую последовательность по п. 1, с последующей трансфекцией РНК транскриптов в подходящую клетку-хозяина.

10. Плазмида для экспрессии вируса PRRS, содержащая выделенную полинуклеотидную молекулу по п. 1 или 6, и промотор, способный транскрибировать эту полинуклеотидную молекулу в подходящей клетке-хозяине.



 

Похожие патенты:

Изобретения касаются вакцины и способа ее использования. Охарактеризованная вакцина включает: (i) живой аттенуированный QX-подобный вирус инфекционного бронхита (IB), полученный посредством пассирования на яйцах домашней птицы с развивающимися эмбрионами от 25 до 80 раз) и имеющий белок S1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO.
Изобретение относится к области медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. .
Изобретение относится к области медицины и касается общеукрепляющего средства при лечении новообразований. .

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может использоваться для вирусологической диагностики арбовирусных инфекций, в частности клещевого энцефалита.

Изобретение относится к области диагностики, ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для определения антител к вирусу энцефаломиелита птиц (ЭП) в иммуноферментном анализе (ИФА), и может быть использовано при диагностике ЭП в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных ветеринарных лабораториях и при изготовлении указанных наборов на предприятиях биологической промышленности.

Изобретение относится к адаптированным к человеческим клеткам вирусам эпидемического паротита, выделенным у больных эпидемическим паротитом. .

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к синтетическим олигонуклеотидным праймерам, комплементарным консервативной области S-сегмента генома вируса болезни Найроби овец, способу выявления вируса болезни Найроби овец и к тест-системе для обнаружения ДНК вируса болезни Найроби овец.

Изобретение относится к выделенному вирусу растений, названному вирус томата торрадо (ToTV), и его компонентам, а также к способам получения устойчивых к ToTV растений. .

Изобретение относится к области вирусологии и молекулярной биологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. .

Изобретение относится к области вирусологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к вакцинопрофилактике. Предложена композиция вакцины, содержащая один или более антигенов, и адъювант, содержащий олеиновую кислоту и моноолеин для применения в интраназальной вакцинации пациента.

Группа изобретений относится к ветеринарии и может быть использована для вакцинации животных против вируса лейкемии кошек (FeLV). Композиция по изобретению содержит вектор экспрессии, содержащий первый полинуклеотид, кодирующий оптимизированный полипептид оболочки ENV вируса лейкемии кошек FeLV, и второй полинуклеотид, кодирующий полипептид GAG/PRO FeLV.

Bvdv-вакцина // 2578943
Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использована для защиты восприимчивых жвачных животных против BVDV. Комбинированная вакцина содержит первый BVDV, принадлежащий к первому типу и несущий ген Е2 BVDV указанного первого типа, второй BVDV, принадлежащий к первому типу, где этот ген Е2 BVDV, принадлежащего к указанному первому типу, заменен геном Е2 BVDV, принадлежащего ко второму типу, и фармацевтически приемлемый носитель.

Изобретения относятся к области иммунологии и вирусологии и касаются иммунобиологического средства (варианты) и способа его использования (варианты). Представленное иммунобиологическое средство может быть получено на основе аденовируса человека пятого серотипа, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 1).
Наверх