Способ снижения накопления лактата при культивировании и способ получения антитела

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ снижения накопления лактата от 5% до 40% при культивировании клеток млекопитающих и способ получения антитела. Для снижения накопления лактата от 5% до 40% к культивируемым клеткам млекопитающих добавляют соль цинка в концентрации в диапазоне от 0,2 мМ до 0,4 мМ. В способе получения антитела добавляют соль цинка в концентрации от 0,2 мМ до 0,4 мМ для снижения накопления лактата от 5% до 40% к культивируемым клеткам млекопитающих, продуцирующим указанное антитело, и извлекают антитело. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 9 табл., 7 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу снижения накопления лактата в культуре клеток, указанный способ, включающий добавление соли двухвалентных переходных металлов к культуре клеток. Настоящее изобретение также относится к способу получения полипептида, указанный способ, включающий добавление соли двухвалентных переходных металлов к среде для культивирования клеток для снижения накопления лактата, ферментирование и извлечение полипептида. Более конкретно, изобретение относится к способу выращивания клеток в системе культивирования клеток, снижающему накопление лактата в культуральной среде.

Уровень техники

Технологии культивирования животных клеток широко применяют в биомедицинских исследованиях и в фармацевтической промышленности. Оценка роста и метаболической активности клеток имеет большое значение для успешного контроля и совершенствования процесса культивирования клеток. Глюкоза и лактат представляют собой два метаболита, которые чаще всего требуют контроля. В составах большинства сред глюкоза служит в качестве как основного источника углерода, так и важного источника энергии. Вхождение глюкозы в гликолитический путь приводит к образованию пирувата в качестве конечного продукта. В клетках животных пируват или может быть направлен в цикл трикарбоновых кислот, или может быть превращен в лактат. При непрерывном культивировании клеток, из-за высокой скорости превращения глюкозы в пируват и неэффективного сопряжения между гликолизом и циклом трикарбоновых кислот, существует тенденция к накоплению лактата. Накопление лактата, в свою очередь, приводит к закислению культуральной среды. Кроме того, сам лактат также может быть токсичен для клеток млекопитающих даже при контролируемом рН. Накопление лактата часто представляет собой критический фактор, ограничивающий процесс культивирования клеток, в особенности, если плотность клеток высока.

В биофармацевтическом производстве, контроль глюкозы и лактата представляет собой установившуюся практику благодаря простоте и надежности измерений, а также их химической стабильности в культуральной среде. Что еще более важно, концентрация глюкозы дает возможность оценить энергию, тогда как лактат рассматривают как важный параметр для оценки накопления побочных продуктов метаболизма и ухудшения среды культивирования. В качестве критических параметров для культивирования, измерения уровней глюкозы и лактата часто представляет собой ключевой момент в разработках по управлению процессом при выполнении операций в биореакторе, таких как подпитка или перфузия.

Ранее были предприняты значительные усилия для корреляции метаболизма глюкозы и лактата с плотностью клеток. Скорость потребления глюкозы и скорость накопления лактата отражают метаболические активности культивируемых клеток.

Как уже говорилось ранее, накопление токсичных побочных продуктов, таких как лактат, ингибирует рост клеток и продукцию антител. Чрезмерное накопление лактата может привести к увеличению осмолярности среды или, в отсутствии контроля рН, к снижению рН культуры. Основное негативное воздействие лактата обусловлено снижением рН, которое возникает как следствие выделения лактата в культуральную среду.

В патенте США №6156570 раскрывается способ культивирования клеток, предпочтительно, клеток млекопитающих, который минимизирует накопление лактата.

В патенте США №7429491 раскрывается способ усовершенствования продукции белка в культуре клеток животных с применением глюкозы в ограниченной концентрации в культуре с подпиткой.

Предпринимаемые в прошлом попытки уменьшения уровня лактата, главным образом, были сосредоточены на А] подаче и поддержании глюкозы на очень низком уровне или на В] метаболической инженерии клеток, с применением различных молекулярно-биологических методов.

Данная работа раскрывает корреляцию между добавлением солей двухвалентных переходных металлов (меди, цинка) и накоплением лактата и возможные пути снижения накопления лактата.

Раскрытие изобретения

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу снижения накопления лактата в культуре клеток, указанный способ, включающий добавление соли двухвалентных переходных металлов к культуре клеток, и к способу получения полипептида, указанный способ, включающий следующее: а) добавление соли двухвалентных переходных металлов к культуре клеток для снижения накопления лактата и b) ферментирование и извлечение полипептида.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1А показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли меди по сравнению с контролем.

На фигуре 1В показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли цинка по сравнению с контролем.

На фигуре 2А показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли меди по сравнению с контролем.

На фигуре 2В показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли цинка по сравнению с контролем.

На фигуре 3 показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли цинка по сравнению с контролем.

На фигуре 4А показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли меди по сравнению с контролем.

На фигуре 4В показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли цинка по сравнению с контролем.

На фигуре 5А показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли меди по сравнению с контролем.

На фигуре 5В показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли цинка по сравнению с контролем.

На фигуре 6 показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли магния по сравнению с контролем.

На фигуре 7 показана разница в уровне накопления лактата в присутствии соли цинка по сравнению с контролем.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение относится к способу снижения накопления лактата в культуре клеток, указанный способ, включающий добавление соли двухвалентных переходных металлов к культуре клеток.

В воплощении настоящего изобретения, соль двухвалентных переходных металлов содержит металл, который выбирают из группы, включающей медь и цинк.

В воплощении настоящего изобретения, соль меди представляет собой сульфат меди и соль цинка представляет собой сульфат цинка.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, клетку получают из линии клеток млекопитающих.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, линию клеток млекопитающих выбирают из группы, включающей без ограничения клетки яичника китайского хомячка (СНО), NS0 (клетки несекретирующие 0) и BHK (клетки почки новорожденного хомячка).

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, ион двухвалентного переходного металла добавляют в концентрации в диапазоне от примерно 0,2 мМ до примерно 0,4 мМ.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, культивирование проводят в системе, которую выбирают из группы, включающей без ограничения культивирование с подпиткой, периодическое культивирование, культивирование во встряхиваемых колбах и в биореакторе.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, снижение накопления уровня лактата равно от примерно 5% до примерно 40%.

Настоящее изобретение также относится к способу получения полипептида, где указанный способ, включает добавление соли двухвалентных переходных металлов к культуре клеток для снижения накопления лактата, ферментирование и извлечение полипептида.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, клетки получают из линии клеток млекопитающих.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, линию клеток млекопитающих выбирают из группы, включающей без ограничения клетки яичника китайского хомячка (СНО), NS0 и BHK.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, соли двухвалентных переходных металлов содержат металл, который выбирают из группы, включающей медь и цинк.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, соль меди представляет собой сульфат меди и соль цинка представляет собой сульфат цинка.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, соль добавляют в концентрации в диапазоне от примерно 0,2 мМ до примерно 0,4 мМ.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, полипептид выбирают из группы, включающей без ограничений антитела против VEGF-A, антитела против Her-2, антитела против CD6 и антитела против TNF.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, культивирование проводят в любой системе, которую выбирают из группы, включающей без ограничения культивирование с подпиткой, периодическое культивирование, культивирование во встряхиваемых колбах и в биореакторе.

В воплощении настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к способам снижения накопления лактата с применением модифицированного способа культивирования клеток, включающего фазу роста клеток и фазу продукции полипептида.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ получения полипептидов, показанный на примере получения моноклональных антител, способом со сниженным накоплением лактата.

Кроме того, в дальнейшем раскрытии показано, что снижение накопления лактата происходит в диапазоне от примерно 5% до примерно 40%.

Настоящее изобретение относится к способу получения моноклональных антител способом со сниженным накоплением лактата.

В воплощении настоящего изобретения, снижают количество накопленного лактата, которое в норме связано со стандартной процедурой получения.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, описан способ, в котором добавление солей двухвалентных переходных металлов снижает накопление лактата в системе с подпиткой.

В воплощении настоящего изобретения, соли двухвалентных переходных металлов включают соли цинка и меди.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, концентрация солей цинка и меди, примененных в культуральной среде, равно примерно на 0,4 мМ.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, соль двухвалентного переходного металла в случае меди представляет собой сульфат меди, и соль металла в случае цинка представляет собой сульфат цинка.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, концентрация солей двухвалентных переходных металлов указана как концентрация соли в культуральной среде.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, данные ионы металлов, цинка и меди, необходимы для активности ферментов, вовлеченных в реакции гликолиза и цикла трикарбоновых кислот, и, следовательно, добавление данных ионов улучшает общую метаболическую эффективность клеток, приводя к тому, что большая часть глюкозы полностью окисляется, следовательно, накопление лактата снижается.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, среда представляет собой среду определенного химического состава, которую выбирают из группы, включающей без ограничений и HyClone CDM4NS0, и HyClone CDM4Mab.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, клетки млекопитающих могут быть выбраны из группы, включающей без ограничений клетки яичника китайского хомячка (СНО), несекретирующие 0 клетки (NS0) и клетки почек новорожденного хомяка (BHK).

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, полипептид может быть выбран из группы, включающей без ограничений антитела против VEGF-A, антитела против Her-2, антитела против CD6 и антитела против TNF.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, уровень лактата в среду анализируют с помощью устройства «YSI 7100 MBS Analyzer».

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, снижение накопления лактата приводит к улучшению характеристик культуры в целом, поскольку поддержание рН, в целом, приводит к улучшению стабильности клеток. Добавление солей двухвалентных переходных металлов, например солей цинка/меди, снижает накопления лактата и, следовательно, рН среды также сохраняется.

В воплощении настоящего изобретения, соль двухвалентных переходных металлов также может быть определена как ионы двухвалентных переходных металлов.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, настоящее изобретение также относится к способу усовершенствования продукции белка, например крупномасштабной коммерческой продукции белка, например продукции антител.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, настоящее изобретение также относится к способам выращивания клеток в системе культивирования клеток, которая снижает накопление лактата в культуральной среде.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, добавление солей двухвалентных переходных металлов, т.е. солей цинка/меди дополнительно усиливает снижение накопления лактата от примерно 5% до примерно 40%.

Определение терминов:

В описании и в формуле настоящего изобретения, в соответствии с определениями, приведенными в настоящем документе, будет применена следующая терминология.

Термин «антитело» включает антитела или производные антител или их фрагменты, и характеристики антител также применяют к препаратам антитела настоящего изобретения. К фрагментам антител, функциональным эквивалентам или гомологам антител, относят любой полипептид, который включает связывающий домен иммуноглобулина или пептиды, имитирующие данный связывающий домен вместе с Fc-областью или областью, гомологичной Fc-области или, по меньшей мере, ее части. Химерные молекулы, включающие связывающий домен иммуноглобулина, или эквиваленты, слитые с другим полипептидом, также включены.

Типичные молекулы антител представляют собой интактные молекулы иммуноглобулина и те части иммуноглобулина, которые содержат паратоп, включая те части молекулы, которые известны как Fab, Fab′, F(ab′)2, Fc и F(v), а также структуру N-гликана.

Антитело описывают как функциональный компонент сыворотки, и этот термин часто относят или к набору молекул (антител или иммуноглобулинов, фрагментам и т.п.), или к одной молекуле (к молекуле антитела или молекуле иммуноглобулина). Молекула антитела способна связываться или взаимодействовать со специфической антигенной детерминантой (антигеном или эпитопом антигена), что, в свою очередь, может привести к индукции иммунологических эффекторных механизмов. Индивидуальную молекулу антитела обычно рассматривают как моноспецифическую, а композиция молекул антител может быть как моноклональной (т.е. состоящей из идентичных молекул антитела) или поликлональной (т.е. состоящей из разных молекул антител, реагирующих с одним и тем же или с различными эпитопами на одном и том же антигене или на отдельных, различных антигенах). Отдельные и различные молекулы антител, составляющие поликлональное антитело, могут быть названы «члены». Каждая молекула антитела обладает уникальной структурой, которая дает ей возможность специфически связываться с соответствующим ей антигеном, и все природные молекулы антител, в целом, имеют одинаковую основную структуру, состоящую из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.

Как применены в настоящем документе, выражения «полипептид» или «полипептидный продукт» представляют собой синонимы терминов «белок» и «белковый продукт», соответственно, и, как это обычно понимают в данной области техники, относятся, по меньшей мере, к одной цепи аминокислот, последовательно связанных посредством пептидных связей. В определенных воплощениях, «представляющий интерес белок» или «представляющий интерес полипептид» или тому подобное представляет собой белок, кодируемый экзогенной молекулой нуклеиновой кислоты, которой была трансформирована клетка-хозяин. В определенных воплощениях, в которых экзогенная ДНК, которой была трансформирована клетка-хозяин, кодирует «представляющий интерес белок», последовательность нуклеиновой кислоты экзогенной DNA определяет последовательность аминокислот. В определенных воплощениях, «представляющий интерес белок» представляет собой белок, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая эндогенна по отношению к клетке-хозяину. В определенных воплощениях, экспрессию такого эндогенного представляющего интерес белка изменяют путем трансфекции в клетку-хозяина молекулы экзогенной нуклеиновой кислоты, которая, например, может содержать одну или несколько регуляторных последовательностей и/или кодирует белок, который увеличивает экспрессию представляющего интерес белка.

В настоящем документе, термин «вариант антитела» относится к антителу, имеющему последовательность аминокислот, которая отличается от аминокислотной последовательности исходного антитела. Предпочтительно, вариант антитела включает вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, которая не встречается в природе. Такие варианты обязательно имеют менее чем 100% идентичности или сходства в последовательности с родительским антителом. В предпочтительном воплощении, вариант антитела будет иметь аминокислотную последовательность с от примерно 75% до менее чем 100% идентичности или сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельного домена или тяжелой, или легкой цепи исходного антитела, более предпочтительно, от примерно 80% до менее чем 100%, более предпочтительно, от примерно 85% до менее чем 100%, более предпочтительно, от примерно 90% до менее чем 100%, и наиболее предпочтительно, от примерно 95% до менее чем 100%. Идентичность или сходство по отношению к данной последовательности определяют в настоящем документе как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, который идентичен (т.е. тот же самый остаток) остаткам исходного антитела, после выравнивания последовательностей и введения, при необходимости, разрывов для достижения максимального процента идентичности последовательности.

Термины «среда», «среды», «среда для культивирования клеток» и «культуральная среда», как применены в настоящем документе, относятся к раствору, содержащему питательные вещества, которые питают растущие животные клетки, например клетки млекопитающих, и также могут относиться к среде вместе с клетками.

Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих представляют собой клетки яичника китайского хомячка (СНО). Способы и векторы для генетической модификации клеток и/или линий клеток для экспрессии представляющего интерес белка хорошо известны специалистам в этой области техники. Генно-инженерные методики включают, но не ограничиваются векторами для экспрессии, направленной гомологической рекомбинацией и активацией гена. Необязательно, белки экспрессируются под контролем гетерологичного элемента контроля, такого как, например, промотор, который в природе не контролирует продукцию данного полипептида. Например, промотор может представлять собой сильный вирусный промотор (например, CMV, SV40), который направляет экспрессию полипептида млекопитающего. Клетка-хозяин может или не может в норме продуцировать данный белок. Например, клетка-хозяин может представлять собой клетку СНО, которая была модифицирована генетическими способами так, чтобы продуцировать белок, это означает, что нуклеиновая кислота, кодирующая белок, была введена в клетку СНО.

Лактат, побочный продукт, генерируемый при росте клеток млекопитающих, потенциально токсичен для клеток. Накопление лактата влияет на буферную емкость среды, что приводит к снижению рН. Было показано, что лактат негативно воздействует не только на рост и продуктивность клеток, но также и на качество продукта в целом. Для снижения накопления лактата в культуральной среде было предпринято несколько подходов. Они включают рост клеток при низкой концентрации глюкозы, сверхэкспрессию пируватдекарбоксилазы и нокаут гена лактатдегидрогеназы-А (LDH-A).

Следующие примеры показывают, как способ может быть осуществлен путем добавления определенных солей двухвалентных переходных металлов для снижения накопления лактата при культивировании. Лактат снижается почти на 5-40% в течение цикла культивирования.

В воплощении настоящего изобретения, соль двухвалентных переходных металлов может также быть определена как ионы двухвалентных переходных металлов.

В воплощении настоящего изобретения, общеизвестные методики для выделения белков/антител из культуральных сред, которые могут быть применены, представляют собой ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию и аффинную хроматографию.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения, в качестве предпочтительной методики для выделения антител из среды была применена методика аффинной хроматографии.

Следующие описания конкретных воплощений настоящего изобретения представлены для целей иллюстрации и описания. Они не предназначены для того, чтобы быть исчерпывающими или ограничивать изобретение определенными раскрытыми формами. С учетом вышеизложенных идей возможны различные модификации и вариации. Кроме того, многие модификации могут быть сделаны для адаптации конкретной ситуации, материала, состава вещества, способа, стадии или стадий способа к цели, духу и объему настоящего изобретения. Все такие модификации должны находиться в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

Далее, технология настоящей заявки будет детально представлена с помощью следующих примеров. Однако примеры не должны быть истолкованы как ограничивающие объем изобретения.

ПРИМЕРЫ:

Уровень лактата анализировали для всех экспериментов, представленных в приведенных ниже примерах, с помощью устройства «YSI 7100 MBS Analyzer». pH для всех приведенных ниже экспериментов, как указано в следующих примерах, поддерживали в диапазоне pH 6,85-7,2. Уровень кислорода также поддерживали путем взбалтывания в шейкер-инкубаторе. Во всех указанных ниже примерах, концентрация добавленной соли равна концентрации соли, присутствовавшей в среде. Температуру можно соответствующим образом изменять, на основании природы примененных клеток и прочих связанных параметров.

При осуществлении настоящего изобретения применяли две соли двухвалентных переходных металлов. Данные две соли двухвалентных переходных металлов представляют собой сульфат меди пентагидрат и сульфат цинка гептагидрат.

ПРИМЕР 1:

Пример 1(А)

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток, в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NS0. Клетки СНО были генетически модифицированы так, чтобы производить антитела против VEGF-A. Соль сульфата меди пентагидрат добавляли в среду в концентрации, равной 0,4 мМ. Напротив, в контрольную среду никакой соли меди не добавляли. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в периодической фазе. На следующей стадии температуру понижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня. В приведенной ниже таблице 1 показан уровень лактата, сниженный за время цикла культивирования клеток. Полученные антитела против VEGF-A затем выделяли из среды, применяя методику аффинной хроматографии.

В контроле накопление лактата снизилось примерно на 61%, в то же время в среде с добавленной солью накопление лактата снизилось примерно на 87,5%. Настоящий пример показал дополнительное снижение накопления лактата примерно на 26,5% в присутствии указанной соли.

На фигуре 1(А) показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

Пример 1(В)

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток, в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NSO. Клетки СНО были генетически модифицированы так, чтобы производить антитела против VEGF-A. Соль сульфата цинка гептагидрат добавляли в среду в концентрации, равной 0,4 мМ. Напротив, никакой соли цинка в контрольную среду не добавляли. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. На следующей стадии, температуру понижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня. В приведенной ниже таблице 2 показано, что уровень лактата снизился за время цикла культивирования. Полученные антитела против VEGF-A затем выделяли из среды, применяя методику аффинной хроматографии.

В контроле накопление лактата снизилось примерно на 61,32%, в то же время в среде с добавленной солью накопление лактата снизилось примерно на 72,89%. Настоящий пример показал дополнительное снижение накопления лактата примерно на 11,57% в присутствии указанной соли.

На фигуре 1(В) показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

ПРИМЕР 2:

Пример 2А:

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток, в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NS0. Клетки СНО были генетически модифицированы так, чтобы производить антитела против Her-2. Соль сульфата меди пентагидрат добавляли в среду в концентрации, равной 0,4 мМ. В контрольную среду, напротив, никакой соли меди не добавляли. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. На следующей стадии температуру понижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня. В приведенной ниже таблице 3 показан уровень лактата, сниженный за время цикла культивирования. Полученные антитела против Her-2 затем выделяли из среды, применяя методику аффинной хроматографии.

В контроле накопление лактата снизилось примерно на 50,5%, в то же время в среде с добавленной солью накопление лактата снизилось примерно на 65%. Настоящий пример показал дополнительное снижение накопления лактата примерно на 14,5% в присутствии указанной соли.

На фигуре 2(А) показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

Пример 2В:

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток, в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NS0. Клетки СНО были генетически модифицированы так, чтобы производить антитела против Her-2. Соль сульфата цинка гептагидрат добавляли в среду в концентрации, равной 0,4 мМ. Напротив, в контрольную среду никакой соли цинка не добавляли. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. На следующей стадии температуру понижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня. В приведенной ниже таблице 4 показан уровень лактата, сниженный за время цикла культивирования. Полученные антитела против Her-2 затем выделяли из среды, применяя методику аффинной хроматографии.

В контроле накопление лактата снизилось примерно на 34,5%, в то же время в среде с добавленной солью накопление лактата снизилось примерно на 64,88%. Настоящий пример показал дополнительное снижение накопления лактата примерно на 30,38% в присутствии указанной соли.

На фигуре 2(В) показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

ПРИМЕР 3:

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток, в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NS0. Клетки СНО были генетически модифицированы так, чтобы производить антитела против CD6. Соль сульфата цинка гептагидрат добавляют в среду в концентрации, равной 0,4 мМ. Напротив, в контрольную среду никакой соли цинка не добавляли. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. На следующей стадии температуру понижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня. В приведенной ниже таблице 5 показан уровень лактата, сниженный за время цикла культивирования. Полученные антитела против CD6 затем выделяли из среды, применяя методику аффинной хроматографии.

Таблица 5
Возраст (в часах) Контроль-Остаточный лактат (мМ) С солью цинка-Остаточный лактат (мМ)
72 18 18
96 11,2 11,2
120 9,8 6,2
144 4,6 3
168 5,3 3,2

В контроле накопление лактата снизилось примерно на 70,55%, в то же время в среде с добавленной солью накопление лактата снизилось примерно на 82,22%. Настоящий пример показал дополнительное снижение накопления лактата примерно на 11,67% в присутствии указанной соли.

На фигуре 3 показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

ПРИМЕР 4:

Эксперимент для 4(А)

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток, в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NS0. Клетки СНО были генетически модифицированы так, чтобы производить антитела к TNF. Соль сульфат меди пентагидрат также добавляли в среду в концентрации, равной 0,4 мМ. В контрольную среду, напротив, никакой соли меди не добавляли. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. На следующей стадии температуру понижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня. В приведенной ниже таблице 6 показан уровень лактата, сниженный за время цикла культивирования. Полученные антитела к TNF затем выделяли из среды, применяя методику аффинной хроматографии.

В контроле накопление лактата снизилось примерно на 15,38%, в то же время в среде с добавленной солью накопление лактата снизилось примерно на 28,43%. Настоящий пример показал дополнительное снижение накопления лактата примерно на 13,05% в присутствии указанной соли.

На фигуре 4А показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

Эксперимент для 4(В)

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток, в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NS0. Клетки СНО были генетически модифицированы так, чтобы производить антитела к TNF. Соль сульфата цинка гептагидрат также добавляли в среду в концентрации, равной 0,4 мМ. Напротив, в контрольную среду никакой соли цинка не добавляли. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. На следующей стадии температуру понижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня. В приведенной ниже таблице 7 показан уровень лактата, сниженный за время цикла культивирования. Полученные антитела против TNF затем выделяли из среды, применяя методику аффинной хроматографии.

В контроле накопление лактата снизилось примерно на 17,37%, в то же время в среде с добавленной солью накопление лактата снизилось примерно на 23,46%. Настоящий пример показал дополнительное снижение накопления лактата примерно на 6,09% в присутствии указанной соли.

На фигуре 4В показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

ПРИМЕР 5:

Эксперимент для 5(А)

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток, в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NS0. Клетки СНО были генетически модифицированы так, чтобы производить антитела против VEGF-A. Соль сульфат меди пентагидрат также добавляли в среду в концентрации, равной 0,2 мМ. В контрольную среду, напротив, никакой соли меди не добавляли. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. На следующей стадии температуру понижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня. В приведенной ниже таблице 8 показан уровень лактата, сниженный за время цикла культивирования. Полученные антитела против VEGF-A затем выделяли из среды, применяя методику аффинной хроматографии.

В контроле накопление лактата снизилось примерно на 79,23%, в то же время в среде с добавленной солью накопление лактата снизилось примерно на 85,40%. Настоящий пример показал дополнительное снижение накопления лактата примерно на 6,17% в присутствии указанной соли.

На фигуре 5А показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

Эксперимент для 5(В)

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток, в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NS0. Клетки СНО были генетически модифицированы так, чтобы производить антитела против VEGF-A. Соль сульфата цинка гептагидрат также добавляли в среду в концентрации, равной 0,2 мМ. Напротив, в контрольную среду никакой соли цинка не добавляли. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. На следующей стадии температуру снижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня. В приведенной ниже таблице 9 показан уровень лактата, сниженный за время цикла культивирования. Полученные антитела против VEGF-A затем выделяли из среды, применяя методику аффинной хроматографии.

В контроле накопление лактата снизилось примерно на 79,23%, в то же время в среде с добавленной солью накопление лактата снизилось примерно на 88,41%. Настоящий пример показал дополнительное снижение накопления лактата примерно на 9,18% в присутствии указанной соли.

На фигуре 5В показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

ПРИМЕР 6:

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культурах клеток в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4NS0. В среду также добавляли соль сульфата магния, примененную в качестве негативного контроля в концентрации, равной 0,4 мМ. В контрольную среду, напротив, не добавляли никакой соли сульфата магния. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. На следующей стадии температуру снижали до 31±1°C и цикл культивирования клеток продолжали до 7-го дня.

На фигуре 6 показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

ПРИМЕР 7:

Культивирование клеток осуществляли в режиме культуры с подпиткой. В культуре клеток в качестве клеток-хозяев млекопитающих применяли клетки яичника китайского хомячка (СНО) и исходно поставляли культуральную среду HyClone CDM4Mab. Соль сульфата цинка гептагидрат также добавляли в среду в концентрации, равной примерно 0,3 мМ. Напротив, в контрольную среду не добавляли никакой соли сульфата цинка. Производственный цикл ферментации начинали с исходной концентрации клеток, равной 0,3-0,45×106 клеток/мл при 37±1°C, первые 3-4 дня были отведены для роста клеток в фазе периодической культуры. Следующая стадия включала понижение температуры до 31±1°C и продолжение цикла культивирования клеток до 7-го дня.

На фигуре 7 показано снижение концентрации лактата в культуральной среде.

1. Способ снижения накопления лактата от 5% до 40% при культивировании клеток млекопитающих, где указанный способ включает добавление к культуре клеток млекопитающих соли цинка в концентрации в диапазоне от 0,2 мМ до 0,4 мМ.

2. Способ по п.1, в котором соль цинка представляет собой сульфат цинка.

3. Способ по п.1, в котором линию клеток млекопитающих выбирают из группы, включающей без ограничения клетки яичника китайского хомячка (СНО), NS0 (клетки несекретирующие 0) и BHK (клетки почки новорожденного хомяка).

4. Способ по п.1, в котором культивирование проводят в системе, которую выбирают из группы, включающей без ограничения культивирование с подпиткой, периодическое культивирование, культивирование во встряхиваемых колбах и в биореакторе.

5. Способ получения антитела, где указанный способ включает следующее:
a. добавление к культивируемым клеткам млекопитающих, которые продуцируют указанное антитело, соли цинка в концентрации в диапазоне от 0,2 мМ до 0,4 мМ для снижения накопления лактата от 5% до 40%; и
b. ферментирование и извлечение указанного антитела.

6. Способ по п.5, в котором линию клеток млекопитающих выбирают из группы, включающей без ограничения клетки яичника китайского хомячка (СНО), NS0 и BHK.

7. Способ по п.5, в котором соль цинка представляет собой сульфат цинка.

8. Способ по п.5, в котором антитело выбирают из группы, включающей без ограничений антитела против VEGF-A, антитела против Her-2, антитела против CD6 и антитела к TNF.

9. Способ по п.5, в котором способ культивирования осуществляют в любой системе, которую выбирают из группы, включающей без ограничения культивирование с подпиткой, периодическое культивирование, культивирование во встряхиваемых колбах и в биореакторе.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Описано моноклональное антитело, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном кислотоустойчивых бацилл, в частности с липоарабиноманнаном туберкулезной бациллы.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описан способ ослабления посттрансляционного фукозилирования молекулы, содержащей модифицированный Fc-участок.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен способ синтеза панели мультиспецифических антител для терапии, диагностики или исследований, где проводят реакцию первого фрагмента антитела, имеющего первую моноспецифичность, полученного из первого исходного антитела, и обладающего свободной сульфгидрильной группой, с тио-реактивным кросслинкером для получения группы фрагмент антитела-кросслинкер и где проводят реакцию группы фрагмент антитела-кросслинкер попарно с каждым из трех или более дополнительных фрагментов антител, имеющих различную моноспецифичность, отличную от первого фрагмента антитела, каждый из которых имеет свободную сульфгидрильную группу, для получения панели мультиспецифических антител.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению антител, и может быть использовано для снижения гетерогенности антител во время культивирования.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения рекомбинантного моноклонального антитела против CD3*CD19 формата флексибоди.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, которое специфически связывает TSLP человека. Также раскрыты изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанное антитело, экспрессирующий вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, и клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, для экспрессии вышеуказанного антитела.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения биспецифического антигенсвязывающего белка, содержащего: две легкие цепи и две тяжелые цепи полноразмерного антитела, включающего два Fab-фрагмента и специфически связывающегося с первым антигеном; и два дополнительных Fab-фрагмента антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, где указанные дополнительные Fab-фрагменты оба слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концами тяжелых цепей, указанных в подпункте а); где пептидом-коннектором является (Gly-x-Ser)n, или (Gly-x-Ser)nGlym(х=3, n=3, 4, 5 или 6 и m=0,1, 2 или 3), или (х=4, n=2,3, или 5 и m=0, 1, 2 или 3) и где в Fab-фрагментах осуществлены следующие модификации: I) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), или в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и/или константные домены CL и СН1 замены друг на друга; II) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга или константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; III) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга или константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; IV) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; или V) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), константные домены CL и СН1 заменены друг на друга и в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга; а способ включает этапы: а) трансформацию клетки-хозяина экспрессионными векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие указанный биспецифический антигенсвязывающий белок; б) культивирования клетки-хозяина в условиях, которые позволяют синтезировать молекулу этого биспецифического антигенсвязывающего белка; и в) выделение молекулы указанного биспецифического антигенсвязывающего белка из указанной культуры.

Изобретение относится к области иммунологии. Представлены вариантные выделенные анти-CXCR4-антитела 414H5, 515H7 и их антигенсвязывающие фрагменты, способные ингибировать активацию CXCR4, где каждое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит набор из 6 CDR, последовательности, которых представлены в описании.

Настоящее изобретение относится к области биохимии. Предложены способы скрининга антитела IgG, обладающего повышенной способностью элиминировать антиген в плазме, основанные на отборе IgG, антигенсвязывающая активность которого при рН от 6,7 до 10,0 выше антигенсвязывающей активности при рН от 4,0 до 6,5.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывает эпитоп, состоящий из пептида TKSLDKGYNK нейротоксина Clostridium, и получено путем применения олигопептида с упомянутым эпитопом.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве белковой пищевой добавки. Предложен способ получения белковой биомассы путем глубинного культивирования гриба Pleurotus pulmonarius РР-3.2 на крахмал-аммонийной среде в условиях аэрации при рН 5,5-6,0 и 23-25°C.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан новый штамм вируса ветряной оспы (VZV).

Предложен способ получения рекомбинантного полипептида. Способ включает культивирование клеток CHO в среде с общим содержанием аминокислот от около 40 до примерно 100 мМ при условиях, включающих в себя, по крайней мере, один температурный сдвиг и, по крайней мере, один сдвиг pH, и экспрессирование рекомбинантного полипептида.

Изобретение касается способа получения рекомбинантного белка SAV-RGD, где SAV - мономер стрептавидина, RGD - меланома-адресующий олигопептид, имеющий аминокислотную последовательность Ser-Arg-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Phe-Pro-Gly-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Ser-Gln-Glu.

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело для использования в качестве биспецифического антитела, которое характеризуется тем, что содержит 4 полипептида.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению молекулы Фактора VIII с укороченным В-доменом и ковалентно конъюгированной с гидрофильным полимером, имеющей измененное время полужизни в кровотоке, и может быть использовано в медицине для лечения гемофилии.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу очистки полипептида, содержащего Сн2/Сн3-область. Способ включает связывание полипептида с белком А и элюирование полипептида с градиентом pH, начинающимся с 5,0 или менее, с использованием элюирующего буфера, причем элюирующий буфер включает буфер с высоким pH и буфер с низким pH, а градиент pH образуется в результате регулирования процентного содержания каждого pH-буфера в элюирующем буфере.

Изобретение относится к биохимии. Обеспечиваются способы получения белков растительного происхождения или супраструктур белков.

Изобретение относится к области получения и выделения однодоменных молекул (SDAB). Описан способ выделения или очистки SDAB молекулы, которая представляет собой трехвалентную молекулу нанотела ATN-103, направленную на TNFα и HAS, из смеси, содержащей указанную SDAB молекулу и одно или более загрязняющих веществ.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения антимикробных белков и пептидов насекомого. Способ получения комплекса антимикробных пептидов насекомого предусматривает инфицирование жирового тела насекомого на стадии личинки бактериями Micrococcus luteus А270 и Escherichia coli D31 с последующим извлечением жирового тела насекомого на стадии личинки.

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии, клеточной биологии и связано с применением экстракта лиофильно высушенной медицинской пиявки в качестве компонента питательной среды для культивирования клеток млекопитающих.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ снижения накопления лактата от 5 до 40 при культивировании клеток млекопитающих и способ получения антитела. Для снижения накопления лактата от 5 до 40 к культивируемым клеткам млекопитающих добавляют соль цинка в концентрации в диапазоне от 0,2 мМ до 0,4 мМ. В способе получения антитела добавляют соль цинка в концентрации от 0,2 мМ до 0,4 мМ для снижения накопления лактата от 5 до 40 к культивируемым клеткам млекопитающих, продуцирующим указанное антитело, и извлекают антитело. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 9 табл., 7 пр.

Наверх