Рекомбинантная плазмидная днк per-tb4gyra-acser, кодирующая сериновую ацетилтрансферазу, способную in vivo ацетилировать n-концевой серин дезацетилтимозина β4 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина β4 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-tb4gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина β4 человека

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, предназначенную для одновременного биосинтеза двух белков - гибридного полипептида, содержащего аминокислотную последовательность тимозина β4 человека и интеин, и фермента E. coli - сериновой ацетилтрансферазы. Плазмида имеет молекулярную массу 5,07 МДа и состоит из BsaBI/NdeI-фрагмента ДНК плазмиды pTWIN-1, содержащего последовательность промотора Т7 и оператора lacO; NdeI/PstI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность гибридного белка, включающего в себя адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого тимозина β4, последовательность интеина Mxe GyrA и последовательность хитин-связывающего домена; PstI/NcoI-фрагмента ДНК, кодирующего ослабленную последовательность Шайна-Дальгарно и нестандартную в качестве старт кодона аминокислоту валин; NcoI/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность сериновой N-ацетилтрансферазы; фрагмента ДНК, содержащего в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pER-TA1GyrA-AcSer клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам; ДНК фрагмента, содержащего последовательность, кодирующую точку начала репликации; ДНК фрагмента, кодирующего последовательность лактозного репрессора LacI. Изобретение относится также к штамму Escherichia coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer, продуцирующему гибридный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тимозина β4 человека и интеин, а также сериновую ацетилтрансферазу, полученному путем трансформации клеток штамма Escherichia coli C3030 рекомбинантной плазмидной ДНК pER-TB4GyrA-AcSer. Изобретение позволяет получить рекомбинантный человеческий тимозин бета 4 с высоким выходом и по упрощенной технологии. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного человеческого тимозина бета 4.

Тимозин бета 4 - это полипептид, вырабатываемый клетками тимусовой железы, который участвует в регуляции полимеризации актина, а также участвует в пролиферации, миграции и дифференциации клеток. Эти свойства тимозина бета 4 определяют его ценность в качестве медицинского препарата, особенно при лечении ишемической болезни сердца.

Тимозин бета 4 человека представляет собой 43-членный полипептид, ацетилированный по N-концевой α-аминогруппе (SEQ ID NO 2).

В мировой практике природный тимозин бета 4 получают химическим, а также микробиологическим способами. Альтернативным путем является биотехнологический способ получения тимозина бета 4 с использованием экспрессии рекомбинантного гена в бактериях.

Известны экспрессионные системы, обеспечивающие синтез тимозина β4 в составе гибридных белков с интеином Мхе GyrA (Li X., Zheng L., Peng F., Qi C., Zhang X., Zhou A., Liu Z., Wu S. Protein. Expr. Purif. 2007. V. 56. P. 229-236), а также аффинной группой из остатков гистидина (Но J.H., Chuang С.Н., Но C.Y., Shih Y.R., Lee O.K., Su Y. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. V. 48. P. 27-33).

Недостаток метода заключается в том, что полученный рекомбинантный продукт в своем составе помимо последовательности тимозина β4 содержал дополнительные аминокислотные последовательности, что может ограничивать его применение в медицинской практике. Ко всему прочему, в вышеприведенных работах была получена не ацетилированная форма тимозина β4, которая образует более стабильный комплекс с глобулярным актином и частично теряет способность природного Тβ4 ингибировать полимеризацию актина (Zoubek R.E., Hannappel Е. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2007. V. 1112. P. 435-441).

С целью избежать вышеописанных проблем была создана экспрессионная система, обеспечивающая синтез не ацетилированной формы тимозина β4 в составе гибридного белка, состоящего из тиоредоксина, остатков гистидина, сайта расщепления TEV-протеиназой и аминокислотной последовательности тимозина β4. Для отщепления не ацетилированной формы тимозина β4 из гибридного белка используют сайт-специфическую TEV-протеиназу и далее химическим путем осуществляют направленное ацетилирование по N-концевому Ser уксусным ангидридом (К.А. Бейрахова, В.Н. Степаненко, А.И. Мирошников, Р.С. Есипов Биоорганическая химия. 2011. 37 №2. С. 1-10).

Недостаток химического ацетилирования пептида заключался в образовании множества побочных продуктов реакции, что требовало дополнительной стадии очистки.

Прототип, наиболее близкий к заявленному для патентования способу получения тимозина β4, описан в работе (CAO Sai, DAI HongMei, SUN Xu, ZHUANSUN DanDan, HE JinZhou, SI XinXi, LI ShuLong, FANG HongQing, CHEN HuiPeng, XIE DaPing, ZHOU ChangLin Scientia Sinica Vitae. 2011. V. 41(10). P. 1008-1015). В данной работе ацилирование N-концевого серина тимозина бета 4 проводили in vivo ssArd1 - ацетилазой из экстремофила Sulfolobus solfataricus. Для этого в геномную ДНК штамма Е. coli BL21(DE3) интегрируют ssArd1 - интеграционную кассету в локус lpxM с помощью рекомбинации. Тимозин бета 4 синтезировался в составе гибридного белка с мини интеином Spl DnaX из Spirulina platensis.

Изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный человеческий тимозин β4 с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается за счет того, что:

1. Конструируют экспрессионную плазмиду ДНК pER-TB4GyrA путем клонирования гена тимозина β4 в векторную плазмиду pTWIN1. Участок, кодирующий измененную последовательность Шайна-Дальгарно и нестандартную в качестве старт кодона аминокислоту валин, синтезируют из двух олигонуклеотидов и клонируют в вектор pER-TB4GyrA. Далее с помощью искусственно синтезированных олигонуклеотидов амплифицируют участок генома Escherichia coli, кодирующий сериновую ацетилтрансферазу, и клонируют в векторную плазмиду pER-TB4GyrA-RBS. Таким образом, получают вектор pER-TB4GyrA-AcSer.

2. Путем трансформации плазмидной ДНК pER-TB4GyrA-AcSer клеток Escherichia coli С3030 получают штамм-продуцент.

3. При индуцированном культивировании штамма-продуцента происходит биосинтез рекомбинантной сериновой ацетилтрансферазы и накопление in vivo ацетилированного по N-концевой α-аминогруппе растворимого гибридного белка TB4GyrA, содержащего наряду с тимозином бета 4 человека и последовательность мини-интеина Мхе Gir А.

4. Клеточную биомассу разрушают в буферном растворе и выделяют осветленный клеточный лизат, содержащий гибридный белок TB4GyrA. Гибридный белок TB4GyrA наносят на хитиновый сорбент, уравновешенный в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, промывают буфером, содержащим 2 М мочевину, и уравновешивают в буфере, содержащем 100 мМ ДТТ, тем самым индуцируют автокаталитическое расщепление гибридного белка, и инкубируют 24 ч при 25°C. Отщепленный тимозин бета 4 затем элюируют в том же буфере. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного тимозина β4 человека проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. Идентификацию образующегося рекомбинантного человеческого тимозина β4 проводят с помощью масс-спектрометрии.

Техническим результатом автокаталитического расщепления гибридного белка является образование тимозина β4, выход которого достигает 3% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата не ниже 98%.

Чтобы избежать трудностей, связанных с расщеплением рекомбинантного гибридного белка с помощью различных протеаз, таких как энтерокиназа, фактор X и др., а также с целью удешевления этой стадии используют в составе гибридного белка мини-интеин GyrA из Mycobacterium xenopi (Telenti, A., Southworth, М., Alcaide, F., Daugelat, S., Jacobs, W.R. Jr. and Perler, F.B. (1997). J. Bacteriol.. V 179, P. 6378-6382) для направленного автокаталитического расщепления гибрида на целевой полипептид и интеин. Для этой цели амплифицируют ген тимозина β4 (SEQ ID NO 1) с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду с искусственным геном тимозина β4, и клонируют его в векторную плазмиду pTWIN1, содержащую ген интеина из Mycobacterium xenopi GyrA, и участок связывания с хитином (Chitin-Binding Domen) из Bacillus circulans (Telenti, A., Southworth, M,, Alcaide, F., Daugelat, S., Jacobs, W.R. Jr. and Perler, F.B. (1997). J. Bacteriol.. 179, 6378-6382; Evans, J, T.C., Bermer, J., Xu, M.-Q., (1999) J. Biol. Chem., V 274, P. 18359-18363), по сайтам эндонуклеаз рестрикции NdeI и SapI. Далее для получения полицистронной конструкции участок, кодирующий измененную последовательность Шайна-Дальгарно и нестандартную в качестве старт кодона аминокислоту валин, синтезируют из двух олигонуклеоттидов и клонируют в вектор pTWIN1 по сайтам эндонуклеаз рестриции Pst I и Bam HI. Далее с помощью искусственно синтезированных олигонуклеотидов амплифицируют участок генома Escherichia coli, кодирующий сериновую ацетилтрансферазу, и клонируют в полученную до этого векторную плазмиду pER-TB4GyrA-RBS по сайтам эндонуклеаз рестрикции NcoI и XhoI. Полученной экспрессионной плазмидой pER-TB4GyrA-AcSer, строение которой приведено на фиг. 1, трансформируют клетки E. coli С3030.

Образующийся при экспрессии рекомбинантного гена гибридный белок TB4GyrA далее in vivo процессируется с отщеплением N-формилметионина и селективно ацетилируется по N-концевому серину. Этот гибридный белок способен к автокаталитическому расщеплению на тимозин β4 человека и интеин. Выход тимозина β4 высокой степени чистоты (98%) после обращенно-фазовой хроматографии достигает 3% относительно суммарного белка клетки.

В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli С3030, содержащий плазмидную ДНК pER-TB4GyrA-AcSer для суперпродукции и продукции двух белков: гибридного белка TB4GyrA, содержащего последовательность тимозина β4 человека и интеин Мхе GirA, и фермента - сериновой ацетилтрансферазы E. coli соответственно.

Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-TB4GyrA-AcSer

- кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного человеческого тимозина β4;

- состоящую из из BsaBI/NdeI-фрагмента ДНК плазмиды pTWIN-1, содержащего последовательность промотора Т7 и оператора lacO; NdeI/PstI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность гибридного белка, включающего в себя адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого тимозина β4, последовательность интеина Мхе GyrA и последовательность хитинсвязывающего домена; PstI/NcoI-фрагмента ДНК, кодирующего ослабленную последовательность Шайна-Дальгарно и нестандартную в качестве старт кодона аминокислоту валин; NcoI/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность сериновой N-ацетилтрансферазы;

- содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pER-TB4GyrA-AcSer клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам; последовательность, кодирующую точку начала репликации; ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.

Конструкция рекомбинантной плазмидиой ДНК pER-TB4GyrA-AcSer обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка TB4GyrA, содержащего на 5′-конце ген тимозина бета 4, соединенного с геном Мхе GyrA. Для конструирования плазмиды используют химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.

Ген человеческого тимозина β4 получают амплификацией участка плазмиды pER-TEVrs-TB4 (, Stepanenko VN, Miroshnikov AI, Esipov RS (2011) Bioorg Khim. V 37 N. 2. P. 223-32).

Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты эндонуклеаз рестрикции, введены с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами А1 и B1 (SEQ ID NO 3), и затем ген клонируют в векторную плазмиду pTWIN1.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°C до 40°C при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Штамм-продуцент E. coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer отличается от штамма-реципиента E. coli C3030 только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.

Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток E. coli C3030 соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Клетки E. coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer являются одновременно суперпродуцентом и продуцентом. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка TB4GyrA, который накапливается в клетках в количестве 23% суммарного белка клетки в растворимом виде. Продукция фермента составляет 6% по отношению к общим белкам клетки.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, для чего ген рекомбинантного человеческого тимозина β4 амплифицируют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (SEQ ID NO 3), содержащими сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI (N-конец гена, праймер А1) и SapI (С-конец гена, праймер В1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой pTWIN1. Далее участок, кодирующий измененную последовательность Шайна-Дальгарно, нестандартную в качестве старт кодона аминокислоту валин и сайты эндонуклеаз рестриции PstI и BamHI, NcoI и XhoI (SEQ ID NO 6), синтезируют из двух олигонуклеотидов и клонируют в полученную плазмиду pER-TB4GyrA по сайтам эндонуклеаз рестрикции PstI и Bam H1. Ген сериновой ацетилтрансферазы получают амплификацией генома E. coli с помощью ПЦР с праймерами В3 и A3 (SEQ ID NO 5), содержащими сайты эндонуклеаз рестриции NcoI и XhoI. Полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам плазмидой pER-TB4GyrA-RBS. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E. coli C3030 и высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют с помощью секвенирования.

Штамм-продуцент E. coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.

На (SEQ ID NO 1) изображена структура гена рекомбинантного человеческого тимозина β4. На (SEQ ID NO 2) изображена аминокислотная последовательность рекомбинантного человеческого тимозина бета 4.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.

Фиг 1. Физическая карта плазмиды pER-TB4GyrA-AcSer

Фиг 2. Электрофорграмма лизата клеток штамма-продуцента E. coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК.

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3′-конца к 5′-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5′-диметокситритил-N-ацил-2′-дезоксинуклеозид-3′-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 ), к которому через 3′-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.

Для приготовления вектора ДНК плазмиду pTWTN1 (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, pH 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой SapI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера О (50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой NdeI (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°C. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°C в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Для приготовления гена тимозина бета 4 проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду с искусственным геном тимозина β4 (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 и В1 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°C, отжиг - 30 сек при 60°C, элонгация - 40 сек при 72°C, 30 циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°C в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.

Полученный синтетический фрагмент с геном рекомбинантного человеческого тимозина β4 в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ рАТФ, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°C.

ДНК, содержащую измененную последовательность Шайна-Дальгарно, а также сайты эндонуклеаз рестрикции получают из двух синтетических олигонуклеотидов А2 и В2 (SEQ ID NO 4). Олигонуклеотиды смешивают в эквимольном количестве (по 600 пмоль), денатурируют при 90°C и подвергают отжигу при медленном понижении температуры до 30°C.

Плазмиду pER-TB4GyrA (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера О (50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой PstI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, pH 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой BamHI (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°C в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Полученный синтетический фрагмент с измененной последовательностью Шайна-Дальгарно (SEQ ID NO 6) в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ рАТФ, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°C. В результате получается плазмида pER-TB4GyrA-RBS.

Плазмиду pER-TB4GyrA-RBS (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, pH 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой NcoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, pH 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой XhoI (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°C. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°C в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Для приготовления гена сериновой ацетилтрансферазы проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК E. coli (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды A3 и В3 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°C, отжиг - 30 сек при 60°C, элонгация - 40 сек при 72°C, 30 циклов ПЦР. Фрагмент длиной 564 п.о. после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°C в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем расщепляют рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора.

Полученный синтетический фрагмент с последовательностью сериновой ацетилтрансферазы в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ рАТФ, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°C.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E. coli C3030. Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pER-TB4GyrA-AcSer и анализируют с помощью эндонуклеаз NdeI, SapI, PstI, BamHI, NcoI и XhoI. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования. Физическая карта плазмиды pER-TB4GyrA-AcSer представлена на фиг. 1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Ori - участок инициации репликации пзамиды. Ap^R - ген устойчивости к ампицилину. LacI - ген репрессора лактозного оперона. TB4GyrA - ген рекомбинантного белка, кодирующий тимозин бета 4 человека и интеин GyrA. SerAc - ген сериновой ацетилтрансферазы.

Пример 2

Получение штамма-продуцента E. coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer и определение его продуктивности

Штамм-продуцент E. coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer получают трансформацией компетентных клеток E. coli C3030 плазмидой pER-TB4GyrA-AcSer, как описано в примере 1. Клетки E. coli C3030, несущие плазмиду, структура которой подтверждена данными анализа (см. пример 1), являются продуцентами двух белков.

Штамм продуцента E. coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer выращивают при 37°C в 100 мл LB-бульона (pH 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А₅₅₀ 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А₅₅₀ и количество культуры, соответствующее 1 мл с А₅₅₀ 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 сек ультразвуком, нагревают 3 мин при 100°C и пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. На фиг. 2 представлена электрофорграмма лизата клеток штамма-продуцента E. coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer, где М - стандарт молекулярных масс, L - лизат клеток, 1 - гибридный белок, содержащий тимозин бета 4, 2 - сериновая ацетилтрансфераза.

Пример 3

Получение гибридного белка TB4GyrA, его автокаталитическое расщепление и выделение рекомбинантного тимозина β4 человека

После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка TB4GyrA (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°C), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе в буфере (50 мМ Трис/HCl, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF) и выделяют центрифугированием (15000 g, 45 мин) осветленный клеточный лизат. Наносят на хитиновый сорбент уравновешенный в буфере, содержащим 50 мМ Трис/HCl, 100 мМ NaCl, промывают буфером, содержащем 50 мМ Трис/HCl, 100 мМ NaCl, 2 М мочевину, и уравновешивают в буфере, содержащем 50 мМ Трис/HCl, 100 мМ NaCl, 100 мМ ДТТ, тем самым индуцируют автокаталитическое расщепление гибридного белка, и инкубируют 24 ч при 25°C. Дальнейшую очистку рекомбинантного тимозина β4 человека проводят посредством обращенно-фазовой жидкостной хроматографии. Анализ полученного продукта проводят при помощи ОФ ВЭЖХ. Фракции с содержанием белка ТВ4 не менее 98% объединяют и лиофилизуют. Выход рекомбинантного тимозина β4 составляет 3 мг из 100 г клеток или 3% суммарного белка клеток.

Идентификацию образующегося рекомбинантного человеческого тимозина β4 проводят с помощью TOF-ESI-масс-спектрометрии на масс-спектрометре Agilent technologies 6224. Полученный сигнал рекомбинантного тимозина β4 соответствует расчетному значению массы 4962 Да.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, предназначенная для одновременного биосинтеза двух белков - гибридного полипептида, содержащего аминокислотную последовательность тимозина β4 человека и интеин, и фермента E. coli - сериновой ацетилтрансферазы, имеющая молекулярную массу 5,07 МДа; состоящая из BsaBI/NdeI-фрагмента ДНК плазмиды pTWIN-1, содержащего последовательность промотора Т7 и оператора lacO; NdeI/PstI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность гибридного белка, включающего в себя адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого тимозина β4, последовательность интеина Mxe GyrA и последовательность хитин-связывающего домена; PstI/NcoI-фрагмента ДНК, кодирующего ослабленную последовательность Шайна-Дальгарно и нестандартную в качестве старт кодона аминокислоту валин; NcoI/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность сериновой N-ацетилтрансферазы; фрагмента ДНК, содержащего в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pER-TA1GyrA-AcSer клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам; ДНК фрагмента, содержащего последовательность, кодирующую точку начала репликации; ДНК фрагмента, кодирующего последовательность лактозного репрессора LacI.

2. Штамм Escherichia coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer, продуцирующий гибридный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тимозина β4 человека и интеин, а также сериновую ацетилтрансферазу, полученный путем трансформации клеток штамма Escherichia coli C3030 рекомбинантной плазмидной ДНК pER-TB4GyrA-AcSer но п. 1.

3. Способ получения рекомбинантного тимозина β4 человека, включающий трансформацию штамма Escherichia coli C3030 полученной плазмидной ДНК pER-TB4GyrA-AcSer по п. 1, культивирование полученного штамма продуцента Escherichia coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer по п. 2, отделение гибридного белка TB4GyrA в растворимой форме после разрушения клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора в буферном растворе (50 мМ Трис/HCl, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ПМСФ), адсорбирование гибридного белка TB4GyrA на колонке с хитиновым сорбентом, индуцирование автокаталитического расщепления белка TB4GyrA буферным раствором, содержащим дитиотреитол, инкубирование на сорбенте в течение 24 ч при 25°C, элюирование целевого пептида и очистку целевого продукта обращенно-фазовой хроматографией.