Способ получения химического вещества



 


Владельцы патента RU 2595388:

ТОРЭЙ ИНДАСТРИЗ, ИНК. (JP)

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом(ами) путем непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы. Способ включает фильтрацию культуральной жидкости микроорганизма(ов) через разделительную мембрану; сохранение не прошедшей через фильтр жидкости в культуральной жидкости или возврат обратным потоком не прошедшей через фильтр жидкости в культуральную жидкость; добавление исходного сырья для ферментации в культуральную жидкость; извлечение продукта. Соотношение пентозы к гексозе в сахарном сиропе от 1:9 до 9:1, при этом пентозой является ксилоза. Коэффициент переноса кислорода(KLa) равняется от 5 до 300 час-1. Для метаболизма пентозы микроорганизм(ы) использует(ют) редуктазу ксилозы и дегидрогеназу ксилита. Изобретение обеспечивает высокий выход химического вещества. 6 з.п. ф-лы, 8 табл., 25 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения химического вещества путем непрерывной ферментации с использованием исходного сырья для ферментации, содержащего гексозу и пентозу.

Уровень техники

Поскольку актуальными являются проблема выбросов диоксида углерода в атмосферу и энергетическая проблема, то все большее внимание привлекают получаемые из биомассы химические вещества, представленные биоразлагаемыми полимерными материалами, такими как молочная кислота, и биотопливами, такими как этанол, так как эти вещества характеризуются устойчивым потреблением и обладают определенным эксплуатационным ресурсом (LCA). Указанные биоразлагаемые полимерные материалы и биотопливо обычно получают из микроорганизмов как продукты ферментации с использованием глюкозы, представляющей собой гексозу, в качестве исходного сырья для ферментации, которую выделяют из пригодной в пищу биомассы, такой как кукуруза. Однако использование пригодной в пищу биомассы вызывает рост ее стоимости из-за конкуренции с пищевыми продуктами, что приводит к нестабильному поступлению исходного сырья. В связи с этим предпринимались попытки использовать сахара, выделяемые из не пригодной в пищу биомассы, такой как рисовая солома, в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами (см. патентный документ 1).

В тех случаях, когда в качестве исходного сырья для

ферментации используют сахар, выделенный из не пригодной в пищу биомассы, целлюлоза, гемицеллюлоза и т.п., содержащиеся в не пригодной в пищу биомассе, разлагаются на сахара под действием осахаривающего фермента. В этом способе получают не только гексозы, такие как глюкоза, но и пентозы, такие как ксилоза и, таким образом, если в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами используют сахар, полученный из не пригодной в пищу биомассы, то в качестве исходного сырья для ферментации используют смешанные сахара гексоз и пентоз (см. патентный документ 1). В тех случаях, когда используют смешанные сахара пентоз и гексоз, необходимо использовать микроорганизмы, имеющие не только метаболический путь для гексоз, но и метаболический путь для пентоз. В качестве метаболического пути для пентоз известен метаболический путь с использованием редуктазы пентозы и пентолдегидрогеназы, и известно, что в данном метаболическом пути на первой стадии редуктаза пентозы действует на гексозу с образованием пентола, а затем на второй стадии пентолдегидрогеназа действует на пентол. Однако пентол, образующийся на первой стадии, не попадает на метаболический путь второй и последующих стадий, а накапливается в культуральной жидкости, что приводит к низкому выходу, вызывая проблемы.

В качестве способа ферментации, где в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами используют сахар, который получают из не пригодной в пищу биомассы и который представляет собой смешанные сахара гексоз и пентоз, может быть применена непрерывная ферментация, однако выход ферментации, который на самом деле достигается при непрерывной ферментации, не исследовался (см. патентный документ 1). С другой стороны, как известно из области техники, в том случае, когда проводят непрерывную ферментацию с использованием в качестве сырья для ферментации смеси сахаров гексоз и пентоз, ферментативный выход ниже, чем в случае периодической ферментации (см. внепатентный документ 1).

Таким образом, в соответствии с обычными технологическими принципами, ранее полагали, что для улучшения выхода ферментации при проведении непрерывной ферментации, когда смесь сахаров гексоз и пентоз используют в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами, имеющими метаболический путь пентозы, в котором используется редуктаза пентоз и пентолдегидрогеназа, то требуется улучшить метаболический путь ксилозы путем введения мутации или путем введения гена.

Документы, известные из области техники

Патентный документ

Патентный документ 1: WO 2010/067785

Непатентный документ

Непатентный документ 1: Susan T. Toon et al., Enhanced Cofermentation of Glucose and Xylose by Recombinant Saccharomyces Yeast Strains in Batch and Continuous Operating Modes, Applied Biochemistry and Biotechnology, (1997), 63-65, 243-255.

Сущность изобретения

Проблемы, которые решает настоящее изобретение

Настоящее изобретение направлено на повышение выхода ферментации при проведении ферментации с использованием смеси сахаров гексоз и пентоз в качестве сырья для ферментации микроорганизмами, имеющими метаболический путь пентоз, в котором используется редуктаза пентоз и пентолдегидрогеназа.

Средства для решения указанных проблем

В результате интенсивных исследований данной проблемы, авторы настоящего изобретения решили проблему путем проведения непрерывной ферментации, используя в качестве сырья для ферментации сырье, содержащее гексозу и пентозу и применяя разделительную мембрану, когда используют микроорганизм, имеющий редуктазу пентоз и пентолдегидрогеназу, с тем, чтобы повысить выход из смеси сахаров гексоз и пентоз, и таким образом было осуществлено настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение описывается приведенными ниже пунктами с (1) по (7).

(1) Способ получения химического вещества путем непрерывной ферментации, при этом указанный способ включает фильтрацию культуральной жидкости микроорганизма(ов) через разделительную мембрану; сохранение не прошедшей через фильтр жидкости в культуральной жидкости или возврат обратным потоком не прошедшей через фильтр жидкости в культуральную жидкость; добавление исходного сырья для ферментации в культуральную жидкость; и извлечение продукта из фильтрата; где указанное исходное сырье для ферментации содержит пентозу и гексозу и где указанный(ые) микроорганизм(ы) представляет(ют) собой микроорганизм(ы), имеющий(ие) метаболический путь, в котором для метаболизма пентозы используется редуктаза пентозы и пентолдегидрогеназа.

(2) Способ получения химического вещества в соответствии с пунктом (1), который включает осуществление непрерывной ферментации в условиях, когда коэффициент переноса кислорода (KLa) равняется от 5 до 300 час-1.

(3) Способ получения химического вещества в соответствии с пунктом (1) или (2), где отношение пентозы к гексозе, которые содержатся в указанном сырье для ферментации, составляет от 1:9 до 9:1.

(4) Способ получения химического вещества в соответствии с пунктом (1) или (2), где указанное сырье для ферментации представляет собой сахарный сироп, полученный из биомассы.

(5) Способ получения химического вещества в соответствии с любым из пунктов с (1) по (4), где указанной пентозой является ксилоза.

(6) Способ получения химического вещества в соответствии с любым из пунктов с (1) по (5), где указанной редуктазой пентозы является редуктаза ксилозы.

(7) Способ получения химического вещества в соответствии с любым из пунктов с (1) по (6), где указанной пентолдегидрогеназой является дегидрогеназа ксилита.

Полезность изобретения

Применение настоящего изобретения позволяет значительно повысить эффективность и выход при ферментативном получении различных химических веществ с использованием сырья для ферментации, содержащего гексозу и пентозу, с помощью микроорганизмов, имеющих редуктазу пентозы и дегидрогеназу пентозы.

Наилучший вариант осуществления настоящего изобретения

Способ получения химического вещества по настоящему изобретению отличается тем, что указанный способ представляет собой непрерывный способ ферментации, в котором используют исходное сырье для ферментации, содержащее смешанные сахара пентоз и гексоз, при культивировании микроорганизма(ов), имеющего(их) редуктазу пентоз и дегидрогеназу пентоз; культуральную жидкость фильтруют через разделительную мембрану; не прошедшую через фильтр жидкость сохраняют в культуральной жидкости или обратным потоком возвращают в культуральную жидкость; добавляют исходное сырье для ферментации в культуральную жидкость; и продукт извлекают из фильтрата.

Пятиуглеродный сахар, также называемый пентозой, содержит 5 атомов углерода, которые составляют сахар. Пентозу можно подразделить на альдопентозу, которая имеет альдегидную группу в 1-й позиции, и кетопентозу, которая имеет кетонную группы во 2-й позиции. Примеры альдопентозы включают ксилозу, арабинозу, рибозу и ликсозу, а примеры кетопентозы включают рибулозу и ксилулозу. Пентоза, которую используют по настоящему изобретению, может быть любой пентозой, при условии, что она может метаболизироваться микроорганизмом, а с точки зрения наличия в природе, доступности и т.п. предпочтительными являются ксилоза и арабиноза, а более предпочтительной является ксилоза.

Шестиуглеродный сахар, также называемый гексозой, содержит 6 атомов углерода, которые составляют сахар. Гексозу можно подразделить на альдозу, которая имеет альдегидную группу в 1-й позиции, и кетозу, которая имеет кетонную группы во 2-й позиции. Примеры альдозы включают глюкозу, маннозу, галактозу, аллозу, гулозу и талозу, а примеры кетозы включают фруктозу, псикозу и сорбозу. Гексоза, которую используют по настоящему изобретению, может быть любой гексозой, при условии, что она может метаболизироваться микроорганизмом, а с точки зрения наличия в природе, доступности и т.п. предпочтительными являются глюкоза, манноза и галактоза, при этом более предпочтительной является глюкоза.

Смесь сахаров, используемая в настоящем изобретении, специально не ограничивается, и смесь сахаров, предпочтительно, представляет собой сахарный сироп, полученный из содержащей целлюлозу биомассы, поскольку он содержит как гексозу, так и пентозу. Примеры содержащей целлюлозу биомассы включают растительные биомассы, такие как выжимки сахарного тростника, просо, кукурузную солому, рисовую солому и пшеничную солому; и древесные биомассы, такие как деревья и отходы строительных материалов. Содержащие целлюлозу биомассы включают целлюлозу или гемицеллюлозу, которые представляют собой полисахариды, образующиеся при дегидратационной конденсации сахаров. Путем гидролиза подобных полисахаридов можно получить сахарные сиропы, которые могут использоваться в качестве исходного сырья для ферментации. Способ получения сахарного сиропа из содержащей целлюлозу биомассы может быть любым, и примеры раскрытых способов получения подобного сахара включают способ, в котором сахарный сироп получают путем кислотного гидролиза биомассы с использованием концентрированной серной кислоты (патент Японии H11-506934 A, патент Японии 2005-229821 A), и способ, в котором биомассу подвергают гидролизу с помощью разбавленной серной кислоты, а затем подвергают ферментативной обработке целлюлазой и т.п. с получением сахарного сиропа (A. Aden et al., “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover” NREL Technical Report (2002). Кроме того, примеры раскрытых способов, где кислота не используется, включают способ, в котором биомассу гидролизуют с помощью субкритической воды при температуре от приблизительно 250 до 500°С с получением сахарного сиропа (патент Японии № 2003-212888 A), способ, в котором биомассу подвергают обработке субкритической водой, а затем подвергают ферментативной обработке и получают сахарный сироп (патент Японии № 2001-95597 A), и способ, в котором биомассу подвергают гидролизу горячей водой с температурой от 240 до 280° под давлением, а затем подвергают ферментативной обработке и получают сахарный сироп (патент Японии № 3041380 B). За указанными обработками может последовать очистка полученного сахарного сиропа. Пример указанного способа приведен в WO 2010/067785.

Массовое отношение пентозы и гексозы, содержащихся в смеси сахаров, может быть любым и, предпочтительно, представляет собой отношение в диапазоне от 1:9 до 9:1 (пентоза):(гексоза) в терминах массового соотношения пентозы к гексозе в смеси сахарного сиропа. Оно обозначает соотношение сахаров в тех случаях, когда предполагается, что смесь сахаров представляет собой сахарный сироп, полученный из биомассы, содержащей целлюлозу.

Общая концентрация сахара в смеси сахаров, преимущественно, является набольшей в диапазоне, в котором микроорганизм(ы) не испытывает(ют) ингибирование под действием субстрата. В том случае, когда концентрация сахара слишком низкая, эффективность процесса становится низкой, а потому концентрация сахара, предпочтительно, составляет не меньше чем 20 г/л. Предпочтительный интервал общей концентрации сахара составляет от 20 до 500 г/л. С учетом вышесказанного, концентрация пентозы, преимущественно, составляет не менее 5 г/л, а концентрация гексозы, преимущественно, составляет не менее 5 г/л.

Примеры источника азота, содержащегося в сырье для ферментации, включают газообразный аммиак, водный аммиак, соли аммония, мочевину и соли азотной кислоты; и другие органические источники азота, используемые в качестве вспомогательных веществ, такие как жмых, гидролизаты соевых бобов, гидролизаты казеина, другие аминокислоты, витамины, кукурузный экстракт, дрожжи или дрожжевые экстракты, мясной экстракт, пептиды, такие как пептон, и клетки различных используемых для ферментации микроорганизмов и их гидролизаты. Примеры неорганических солей, которые могут быть, соответственно, добавлены, включают соли фосфорной кислоты, соли магния, соли кальция, соли железа и соли марганца.

В тех случаях, когда микроорганизм(ы), используемый(ые) в настоящем изобретении, требует(ют) для своего роста определенное питательное вещество, то указанное питательное вещество добавляют в виде препарата или натурального продукта, содержащего питательное вещество. Если необходимо, добавляют пеногаситель. В настоящем изобретении культуральная жидкость обозначает жидкость, которую получают в результате роста микроорганизма(ов) в сырье для ферментации. Состав добавляемого сырья для ферментации может быть соответствующим образом изменен, по сравнению с составом сырья для ферментации, используемого на начальной стадии выращивания в питательной среде, таким образом, чтобы продуктивность представляющего интерес химического вещества увеличивалась.

Ниже поясняются микроорганизмы, которые могут быть использованы в способе получения химического вещества по настоящему изобретению. Микроорганизм(ы) по настоящему изобретению специально не ограничивается(ются) при условии, что микроорганизм(ы) имеет(ют) редуктазу пентозы или дегидрогеназу пентозы. Кроме того, используемый(ые) микроорганизм(ы) может(могут) быть микроорганизмом(ами), выделенным(ми) из природного окружения, или микроорганизмом(ами), свойства которого(ых) частично модифицированы путем мутации или генетической рекомбинации.

Редуктаза пентозы представляет собой восстанавливающий фермент и обозначает фермент, способный превратить альдопентозу в сахарный спирт при использовании NADH или NADPH в качестве кофермента. Например, EC 1.1.1.307 и EC 1.1.1.21 соответствуют редуктазе ксилозы, которая представляет собой фермент, превращающий ксилозу в ксилит. Например, EC 1.1.1.21 соответствует редуктазе арабинозы, которая представляет собой фермент, превращающий арабинозу в арабит. Ферменты, для которых не установлена категория вышеуказанных значений ЕС, также включены в редуктазу пентозы по настоящему изобретению при условии, что указанные ферменты обладают вышеуказанной активностью.

Пентолдегидрогеназа представляет собой дегидрогеназу и обозначает фермент, который превращает пентол в кетопентозу при использовании NAD+ в качестве кофермента. Например, EC 1.1.1.9 и EC 1.1.1.10 соответствуют дегидрогеназе ксилозы, которая является ферментом, который преобразует ксилит в ксилулозу. Например, EC 1.1.1.11 и EC 1.1.1.12 соответствуют арабитолдегидрогеназе, которая представляет собой фермент, который превращает арабит в рибозу. Ферменты, которые не категорированы как пентолдегидрогеназа, также включены в пентолдегидрогеназу по настоящему изобретению при условии, что ферменты обладают вышеуказанной активностью.

Микроорганизмы, которые могут метаболизировать пентозу, известны как микроорганизмы, имеющие редуктазу пентозы или дегидрогеназу пентозы. Примеры подобных микроорганизмов включают Pichia, Candida, Pachysolen, Kluyveromyces, Hansenula, Torulopsis, Debaryomyces, Issachenkia, Brettanomyces, Lindnera и Wickerhamomyces. Конкретные примеры подобных микроорганизмов включают Pichia stipitis, Pichia mexcana, Candida shehatae, Candida utilis, Candida tropicalis, Candida tenuis, Candida boidinii, Candida sonorensis, Candida diddensiae, Candida intermedia, Candida parapsilosis, Candida methanosorbosa, Candida wickerhamii, Pachysolen tannophilus, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Issachenkia orientalis, Debaryomyces hansenii, Hansenula polymorpha, Torulopsis bombicola, Brettanomyces naardenensis, Lindnera rhodanensis и Wickerhamomyces rabaulensis. Тот факт, что они имеют редуктазу пентозы и дегидрогеназу пентозы может быть легко установлен путем поиска в базах данных, опубликованных в Интернете, таких как KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов) и GenBank.

Кроме того, даже в случае микроорганизмов, информация для которых отсутствует в базах данных, тот факт, что микроорганизмы имеют редуктазу пентозы и дегидрогеназу пентозы, может быть установлен путем измерения ферментативной активности, как описано ниже в [1] и [2].

[1] Определение активности редуктазы пентозы

Активность редуктазы пентозы можно определить, добавляя экстракт клеток из культуры микроорганизмов к 50 мМ фосфатного буфера (900 мкл), дополненного 200 мМ ксилозы (или пентозы, такой как арабиноза) и 100 мкл 1,5 мМ раствора NAD(P)H и отслеживая при температуре 30°С уменьшение поглощения при 340 нм, специфичное для NAD(P)+, образующегося в процессе реакции.

[2] Измерение активности пентолдегидрогеназы

Активность пентолдегидрогеназы можно определить, добавляя экстракт клеток из культуры микроорганизмов к 900 мкл 50 мМ буферного раствора Tris-HCl, дополненного 50 мМ MgCl2, 300 мМ ксилита (или пентозы, такой как арабиноза) и 100 мкл 10 мМ раствора NAD(P)+ и отслеживая при температуре 35°С увеличение поглощения при 340 нм, специфичное для NAD(P)H, образующегося в процессе реакции.

Кроме того, микроорганизмы, такие как бактерии или пекарские дрожжи, которые изначально не обладают активностью редуктазы пентозы и дегидрогеназы пентозы, также включены в настоящее изобретение в тех случаях, когда их заставляют экспрессировать ферменты путем генетической рекомбинации. Известные примеры микроорганизмов, которые изначально не обладают активностью редуктазы пентозы и дегидрогеназы пентозы, включают Eschrichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Corynebacterium glutamicum, Bacillus coagulans, Bacillus subtillis, Sporolactobacillus laevolacticus, Paenibacillus polymixa, Zymomonas mobilis и Zymobacter palmae. Примеры способа получения микроорганизмов, экспрессирующих ферменты путем генетической рекомбинации, включают способ, раскрытый в патенте Японии № 2009-112289 A.

Кроме того, для микроорганизма, имеющего ферменты, ферментативную способность можно усилить путем введения мутации или генетической рекомбинации или же в микроорганизм можно ввести экзогенный ген, который заставляет микроорганизм продуцировать вещество, которое изначально не продуцируется указанным микроорганизмом. В частности, например, изомеразу ксилозы вводят в дополнение к редуктазе ксилозы и ксилитдегидрогеназе; индуцируют повышенную экспрессию киназы ксилулозы, которая действует на ксилулозу, метаболит, полученный из ксилита; или D-лактатдегидрогеназу вводят в микроорганизм, который не продуцирует D-молочную кислоту.

Далее поясняется пористая мембрана, которую используют в качестве разделительной мембраны по настоящему изобретению.

Пористая мембрана, которую используют по настоящему изобретению, специально не ограничивается, при условии, что она способна отделять от микроорганизма(ов) путем фильтрации культуральную жидкость, получаемую при культивировании микроорганизма(ов) в процессе перемешивания в сосуде для выращивания в питательной среде или в процессе перемешивания в биореакторе. Примеры пористых мембран, которые можно использовать, включают пористые керамические мембраны, пористые стеклянные мембраны, пористые органические полимерные мембраны, ткани из металлических волокон и нетканые материалы. Среди них пористые органические полимерные мембраны и керамические мембраны являются наиболее предпочтительными.

Состав пористой мембраны, которую используют в качестве разделительной мембраны по настоящему изобретению, поясняется ниже. Пористая мембрана, используемая по настоящему изобретению, обладает разделительной способностью и проницаемостью, которая подходит по свойствам и применению для жидкости, обработку которой проводят.

Пористая мембрана, предпочтительно, представляет собой пористую мембрану, имеющую пористый полимерный слой, выбранный с учетом блокирующей способности, проницаемости и разделительной способности, например, сопротивляемости засорению.

Пористая мембрана, включающая пористый полимерный слой, предпочтительно, имеет пористый полимерный слой, который выступает в качестве функционального разделительного слоя на поверхности основного пористого вещества. Основное пористое вещество несет на себе пористый полимерный слой и придает прочность разделительной мембране.

В тех случаях, когда пористая мембрана, которую используют по настоящему изобретению, имеет пористый полимерный слой на поверхности основного пористого вещества, основное пористое вещество может быть импрегнировано пористым полимерным слоем или может не быть импрегнировано пористым полимерным слоем, что можно выбрать в зависимости от применения мембраны.

Средняя толщина основного пористого вещества, предпочтительно, составляет от 50 мкм до 3000 мкм.

Основное пористое вещество состоит из органического вещества и/или неорганического вещества и т.п., и, преимущественно, используют органическое волокно. Предпочтительные примеры основного пористого вещества включают тканые материалы и нетканые материалы, состоящие из органических волокон, таких как целлюлозные волокна, волокна из триацетата целлюлозы, полиэфирные волокна, полипропиленовые волокна и полиэтиленовые волокна. Более предпочтительно, используют нетканый материал, поскольку его плотность относительно легко контролировать; его сравнительно легко получать; и он не является дорогим.

В качестве пористого полимерного слоя, предпочтительно, может быть использована органическая полимерная мембрана. Примеры веществ для органической полимерной мембраны включают полиэтиленовые смолы, полипропиленовые смолы, поливинилхлоридные смолы, поливинилиденфторидные смолы, полисульфоновые смолы, полиэфирсульфоновые смолы, полиакрилонитриловые смолы, смолы на основе целлюлозы смолы и смолы на основе триацетата целлюлозы. Органическая полимерная мембрана может представлять собой смесь смол, содержащую одну или несколько указанных смол в качестве основного компонента. Основной компонент в данном описании означает, что указанный компонент содержится в количестве не менее чем 50% масс., предпочтительно, не менее чем 60% масс. Предпочтительные примеры веществ для органической полимерной мембраны включают такие, которые легко получаются из растворов и обладают превосходной физической прочностью и химической стойкостью, такие как поливинилхлоридные смолы, поливинилиденфторидные смолы, полисульфоновые смолы, полиэфирсульфоновые смолы и полиакрилонитриловые смолы. Наиболее предпочтительно используют поливинилиденфторидную смолу или смолу, содержащую ее в качестве основного компонента.

В качестве поливинилиденфторидной смолы, предпочтительно, используют гомополимер винилиденфторида. Кроме того, в качестве поливинилиденфторидной смолы, предпочтительно, используется также сополимер с виниловыми мономерами, способными к сополимеризации с винилиденфторидом. Примеры виниловых мономеров, способных к сополимеризации с винилиденфторидом, включают тетрафторэтилен, гексафторпропилен и фтортрихлорэтилен.

Особых ограничений на пористую мембрану, которая может использоваться в качестве разделительной мембраны по настоящему изобретению, специально не накладывается, при условии, что микроорганизм(ы), используемый(ые) в процессе ферментации, не может(могут) проходить сквозь мембрану, и мембраны, преимущественно, выбирают из диапазона, в котором секреции из микроорганизма(ов), используемого(ых) в процессе ферментации, или частицы из исходного сырья для ферментации не вызывают закупоривание мембраны, а фильтрационная способность стабильно поддерживается в течение длительного периода времени. Таким образом, средний размер пор пористой разделительной мембраны, предпочтительно, составляет не меньше чем 0,01 мкм и меньше чем 5 мкм. Средний размер пор, более предпочтительно, составляет не меньше чем 0,01 мкм и меньше чем 1 мкм, поскольку в указанном диапазоне может поддерживаться высокая блокирующая способность, которая препятствует утечке микроорганизмов, и высокая проницаемость для воды, при этом проницаемость можно поддерживать с высокой точностью и воспроизводимостью в течение длительного периода времени.

В тех случаях, когда размер пор близок к размеру микроорганизма(ов), поры могут блокироваться микроорганизмом(ами). Поэтому средний размер пор пористой мембраны, предпочтительно, составляет менее 1 мкм. Чтобы предотвратить утечку микроорганизма(ов), т.е. снизить скорость удаления микроорганизма(ов), средний размер пор мембраны, преимущественно, не должен быть слишком большим, по сравнению с размером микроорганизма(ов). В тех случаях, когда используют микроорганизм с малым размером клетки, такой как бактерия, средний размер пор, предпочтительно, составляет не более 0,4 мкм, более предпочтительно, составляет меньше чем 0,2 мкм.

В некоторых случаях микроорганизм(ы) может(могут) продуцировать вещества, отличные от представляющего интерес химического вещества, например, вещества, которые имеют тенденцию к агрегированию, такие как белки и полисахариды. Кроме того, в некоторых случаях отмирание части микроорганизмов в культуральной жидкости может привести к образованию клеточного дебриса. Чтобы предотвратить закупорку пористой мембраны указанными веществами, средний размер пор, еще более предпочтительно, составляет не более 0,1 мкм.

В тех случаях, когда средний размер пор слишком мал, проницаемость пористой мембраны снижается и, таким образом, эффективную работу трудно осуществить даже с чистой мембраной. Поэтому средний размер пор пористой мембраны по настоящему изобретению, предпочтительно, составляет не меньше чем 0,01 мкм, более предпочтительно, не меньше чем 0,02 мкм, а еще более предпочтительно, не меньше чем 0,04 мкм.

Средний размер пор можно определить путем измерения диаметров всех пор, которые можно наблюдать на площади 9,2 мкм × 10,4 мкм в сканирующем электронном микроскопе при 10000-кратном увеличении, а затем усредняя измеренные значения. В качестве альтернативы, средний размер пор можно определить, сделав фотографию поверхности мембраны при 10000-кратном увеличении с помощью сканирующего электронного микроскопа и произвольно выбрав не менее 10 пор, предпочтительно, не менее 20 пор, а затем измерить диаметры указанных пор и рассчитать среднечисловые значения. Если пора не круглой формы, ее размер можно определить с помощью метода, в котором определяют круг (эквивалентный круг), площадь которого равна площади поры, с помощью устройства компьютерной обработки изображений и т.п., и диаметр эквивалентного круга принимают за диаметр поры.

Стандартное отклонение σ от среднего размера пор пористой мембраны, которую используют по настоящему изобретению, предпочтительно, составляет не больше чем 0,1 мкм. Стандартное отклонение σ от среднего размера пор, предпочтительно, должно быть как можно меньшим. Стандартное отклонение σ от среднего размера пор рассчитывают в соответствии с приведенным ниже уравнением 1, где N соответствует числу пор, которые можно наблюдать в пределах указанной выше площади 9,2 мкм × 10,4 мкм, Xk обозначает соответствующие измеренные диаметры, а X(ave) обозначает средний диаметр пор.

[Уравнение 1]

σ = k = 1 N ( X k X ( a v e ) ) 2 N (1)

Одной из наиболее важных характеристик пористой мембраны, которую используют по настоящему изобретению, является проницаемость для ферментативной культуральной жидкости. В качестве показателя проницаемости может быть использован коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды перед использованием мембраны. В настоящем изобретении коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды, предпочтительно, составляет не менее чем 5,6×10-10 м32/с/Па, если его рассчитывать путем измерения количества водного пермеата при высоте головки 1 м, используя очищенную воду с температурой 25°С, которую получают с помощью обратноосмотической мембраны. В том случае, когда коэффициент проницаемости чистой воды находится в интервале от 5,6×10-10 м32/с/Па до 6,7×10-7 м32/с/Па, может быть получено количество пермеата, которое достаточно с практической точки зрения.

Для пористой мембраны, которую используют по настоящему изобретению, шероховатость поверхности представляет собой среднее значение высоты в вертикальном направлении к поверхности. Шероховатость поверхности мембраны, является одним из факторов, которые влияют на то, насколько легко микроорганизм, прикрепившийся к поверхности разделительной мембраны, удаляется с поверхности при отмывке поверхности мембраны под действием потока жидкости, возникающего при перемешивании или с помощью циркуляционного насоса. Шероховатость поверхности пористой мембраны специально не ограничивается, при условии, что она входит в диапазоне, в котором микроорганизм(ы) и другие твердые вещества, прикрепившиеся к мембране, могут быть удалены. Шероховатость поверхности, преимущественно, составляет не более 0,1 мкм. В том случае, когда шероховатость поверхности не больше чем 0,1 мкм, микроорганизм(ы) и другие твердые вещества, присоединенные к мембране, могут быть легко удалены.

Установлено, что операцию, которая не требует избыточной мощности для очистки поверхности мембраны, можно проще осуществить путем использования, что более предпочтительно, пористой мембраны, шероховатость поверхности которой не превышает 0,1 мкм, средний размер пор составляет не меньше чем 0,01 мкм и меньше чем 1 мкм, а коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды составляет не менее 2×10-9 м32/с/Па. В тех случаях, когда шероховатость поверхности пористой мембраны не превышает 0,1 мкм, силу сдвига, создаваемую на поверхности мембраны при фильтрации микроорганизма(ов), можно снизить и тем самым уменьшить разрушение микроорганизма(ов), а также можно подавить закупоривание пористой мембраны. Таким образом, можно легче осуществить стабильную фильтрацию в течение длительного времени. Кроме того, в тех случаях, когда шероховатость поверхности пористой мембраны не превышает 0,1 мкм, непрерывную ферментацию можно осуществить при меньшей разнице трансмембранного давления. Таким образом, даже в тех случаях, когда произошло закупоривание пористой мембраны, можно добиться лучшего восстановления проницаемости с помощью промывки, по сравнению с теми случаями, когда операцию проводят при большей разнице трансмембранного давления. Поскольку подавление закупорки пористой мембраны позволяет провести устойчивую непрерывную ферментацию, то шероховатость поверхности пористой мембраны, предпочтительно, должна быть как можно меньшей.

Шероховатость пористой мембраны в настоящем изобретении измеряют с помощью атомного силового микроскопа (AFM) в следующих условиях.

- Устройство

Атомно-силовой микроскоп ("Nanoscope IIIa", производитель - Digital Instruments, Inc.)

- Условия

Зонд: консоль из SiN (производитель - Digital Instruments, Inc.)

Режим сканирования:

Контактный режим (измерение на воздухе)

Подводный полуконтактный режим (измерение под водой)

Площадь сканирования:

10 мкм × 25 мкм (измерение на воздухе)

5 мкм × 10 мкм (измерение под водой)

Разрешение сканирования: 512×512

- Приготовление образца

При проведении измерений образец мембраны на 15 мин помещают в этанол при комнатной температуре, а затем замачивают в воде RO на 24 час, чтобы промыть его, а затем сушат на воздухе. Вода RO означает воду, которую получают фильтрацией через обратноосмотическую мембрану (RO мембрану), которая представляет собой разновидность фильтрационной мембраны, с целью удаления примесей, таких как ионы и соли. Размер пор обратноосмотической мембраны составляет не более чем приблизительно 2 нм.

Шероховатость поверхности мембраны drough рассчитывают по приведенному ниже уравнению (2) из высоты в каждой точке в направлении оси Z, которую определяют с помощью атомно-силового микроскопа (AFM).

[Уравнение 2]

d r o u g h = n = 1 N | Z n Z ¯ | N (2)

d r o u g h : средняя шероховатость поверхности (мкм)

Z n : высота в направлении оси Z (мкм)

Z ¯ : средняя высота сканированной площади (мкм).

Формой пористой мембраны, используемой по настоящему изобретению, предпочтительно, является плоская мембрана. В том случае, когда формой пористой мембраны является плоская мембрана, ее среднюю толщину выбирают в зависимости от применения. Средняя толщина в том случае, когда формой пористой мембраны является плоская мембрана, предпочтительно, составляет от 20 мкм до 5000 мкм, более предпочтительно, от 50 мкм до 2000 мкм. Кроме того, формой пористой мембраны, используемой по настоящему изобретению, предпочтительно, является мембрана из полого волокна. В том случае, когда пористая мембрана представляет собой мембрану из полого волокна, внутренний диаметр полого волокна, предпочтительно, составляет от 200 мкм до 5000 мкм, а толщина мембраны, предпочтительно составляет от 20 мкм до 2000 мкм. Внутри полых волокон могут содержаться ткани или трикотаж, которым путем формования органических волокон или неорганических волокон придают цилиндрическую форму.

Описанную выше пористую мембрану можно получить, например, по способу получения, описанному в WO 2007/097260.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения разделительная мембрана по настоящему изобретению может быть мембраной, включающей, по меньшей мере, керамику. Керамика в настоящем изобретении означает вещество, которое содержит оксид металла и которое обжигают в процессе тепловой обработки при высокой температуре. Примеры оксида металла включают оксид алюминия, оксид магния, оксид титана и оксид циркония. Разделительная мембрана может быть сформирована только из оксида(ов) металла или может включать в себя оксид кремния, и/или карбид кремния, и/или муллит, и/или кордиерит, которые представляют собой соединения оксида кремния и оксида(ов) металла.

Отличные от керамики компоненты, которые образуют разделительную мембрану, не ограничиваются, при условии, что указанные компоненты могут образовать пористое тело в качестве разделительной мембраны.

Даже в тех случаях, когда разделительная мембрана содержит керамику, форма разделительной мембраны не ограничивается, и она может быть любой из монолитной мембраны, плоской мембраны и трубчатой мембраны и т.п. С точки зрения эффективности упаковки в контейнер, разделительная мембрана, преимущественно, имеет столбчатую форму, в которой в продольном направлении образуются сквозные отверстия. С точки зрения увеличения эффективности упаковки, разделительная мембрана, предпочтительно, представляет собой монолитную мембрану.

Причина, по которой разделительная мембрана, преимущественно, имеет сквозные отверстия в продольном направлении, заключается в следующем. В тех случаях, когда разделительную мембрану, имеющую столбчатую структуру, помещают в модульный контейнер для использования в качестве разделительной мембраны, модульность разделительной мембраны можно обеспечить за счет выбора предпочтительного режима из давления внешнего типа и давления внутреннего типа, а фильтрацию можно осуществлять с помощью модуля. В настоящем изобретении сторону, где разделительная мембрана контактирует с ферментативной культуральной жидкостью, далее в данном описании обозначают как первичную сторону, а сторону, в которой путем фильтрации получают фильтрат, содержащий химическое вещество, далее в данном описании обозначают как вторичную сторону.

В тех случаях, когда применяют модуль с давлением внутреннего типа, канал в первичной стороне узкий. Таким образом, можно сохранить выходную мощность циркуляционного насоса в процессе фильтрации в перекрестном потоке. Кроме того, воздействие, с целью убрать суспендированное вещество, которое накапливается на поверхности разделительной мембраны, является сильным, а потому поверхность разделительной мембраны легко содержать в чистоте. Тем не менее для того чтобы добиться указанного эффекта, разделительная мембрана с давлением внутреннего типа должна иметь входное и выходное отверстие для ферментативной культуральной жидкости. Входное и выходное отверстие находятся в таком состоянии, что они располагаются на прямой линии, образуя сквозное отверстие, поскольку в этом случае сопротивление потоку является низким. Кроме того, в тех случаях, когда разделительная мембрана имеет столбчатую форму и сквозное(ые) отверстие(ия) открывается(ются) в продольном направлении, контейнер, содержащий разделительную мембрану, можно сделать тонким. Тонкий модуль разделительной мембраны является предпочтительным с точки зрения производительности и легкости манипулирования.

Пористость разделительной мембраны не ограничивается, однако в тех случаях, когда пористость слишком низкая, эффективность фильтрации мала; а в случаях, когда пористость слишком высокая, прочность оказывается низкой. Чтобы можно было добиться и высокой эффективности фильтрации, и высокой прочности разделительной мембраны, а также обеспечить стойкость к многократной стерилизации паром, пористость, предпочтительно, должна составлять от 20% до 60%.

Пористость определяют, используя следующее уравнение:

Пористость [%]=100 × (вес влажной мембраны [г] - вес сухой мембраны [г])/удельный вес воды [г/см3]/(объем мембраны [см3])

Средний размер пор разделительной мембраны, предпочтительно, составляет от 0,01 мкм до 1 мкм, и мембрана, средний размер пор которой попадает в указанный диапазон, меньше подвержена закупориванию и обладает превосходной эффективностью фильтрации. Кроме того, для среднего диаметра пор в диапазоне от 0,02 мкм до 0,2 мкм вещества, которые легко вызывают закупоривание разделительной мембраны, такие как побочные продукты ферментации при использовании микроорганизмов или выращенных в питательной среде клеток, включая белки и полисахариды, а также клеточный дебрис, образующийся в культуральной жидкости в результате отмирания микроорганизма/выращенных в питательной среде клеток, с меньшей вероятностью вызывают закупоривание мембраны, что является особенно предпочтительным.

Для разделительной мембраны, имеющей сквозные отверстия и столбчатую структуру, наружная поверхность находится на вторичной стороне. Таким образом, более удобно применять модульный контейнер для сбора фильтрата, а разделительная мембрана должна быть упакована в контейнер, образуя модуль, который и будет использоваться. В один модуль упаковывают одну или несколько мембран.

Модульный контейнер, преимущественно, изготовлен из материала, который способен выдерживать неоднократную стерилизацию паром. Примеры веществ, устойчивых к стерилизации паром, включают нержавеющую сталь и керамику с низкой средней пористостью.

Подобный керамический мембранный модуль может быть изготовлен, как указано в способе, приведенном в WO 2012/086763, или же можно использовать коммерчески доступный мембранный модуль. Конкретные примеры коммерчески доступного модуля включают микрофильтрационную мембрану MEMBRALOX (Pall Corporation) и керамический мембранный фильтр Cefilt MF Membrane (NGK Insulators, Ltd.).

Далее поясняется процесс непрерывной ферментации.

Непрерывная ферментация по настоящему изобретению отличается тем, что она представляет собой непрерывную ферментацию, при которой культуральную жидкость микроорганизма(ов) фильтруют через разделительную мембрану; не прошедшая через фильтр жидкость сохраняется в культуральной жидкости или обратным потоком возвращается в культуральную жидкость; исходное сырье для ферментации добавляют к культуральной жидкости; и продукт извлекают из фильтрата.

При выращивании микроорганизма(ов) в питательной среде можно задать величину рН и температуру, подходящую для используемого(ых) микроорганизма(ов), и значения рН и температуры специально не ограничиваются, при условии, что микроорганизм(ы) может(могут) быть выращен(ы). Значение рН и температуры обычно находятся в диапазоне от 4 до 8 и от 20 до 75°С, соответственно. Величину рН культуральной жидкости заранее регулируют в соответствии с заданным значением, которое обычно находится в интервале от 4 до 8, используя неорганическую или органическую кислоту, щелочь, мочевину, карбонат кальция, газообразный аммиак и т.п.

С точки зрения продуктивности, концентрацию сахара в культуральной жидкости при непрерывной ферментации желательно поддерживать на уровне не более 5 г/л. Концентрацию сахара в культуральной жидкости можно контролировать скоростью подачи культуральной среды или скоростью фильтрации культуральной жидкости в процессе непрерывной ферментации или с помощью концентрации сахара в добавляемой культуральной среде. Другим способом контролирования концентрации сахара является регулирование количества подаваемого кислорода.

Метаболизм пентоз под действием микроорганизма(ов), имеющего(их) редуктазу пентозы и дегидрогеназу пентозы, который(ые) используют по настоящему изобретению, часто протекает более успешно по мере возрастания концентрации кислорода. Известно, что этанольная ферментация и т.п. с использованием глюкозы протекает более эффективно в том случае, когда подобную ферментацию проводят в анаэробных условиях, когда кислород не используют. Однако метаболизм пентоз протекает более успешно в аэробных условиях. Как полагают, указанное обстоятельство вызвано тем, что большинство редуктаз пентоз используют NADH в качестве кофермента, а в метаболическом пути пентозы реакции окисления и восстановления не сбалансированы, так что указанный дисбаланс приводит к избыточному пути с использованием кислорода. Некоторые микроорганизмы имеют редуктазу пентозы, которая представляет собой двойной фермент, способный использовать как NADH, так и NADPH. Подобный фермент может предотвратить дисбаланс в окислительно-восстановительной системе NAD/NADH в условиях, когда содержание кислорода ограничено (Metabolic Engineering: Principles and Methodologies. Gregory N. Stephanopoulos et al., Tokyo Denki University Press. p. 174 (2002)). Таким образом, количество кислорода необходимо подбирать в зависимости от используемого(ых) микроорганизма(ов). Даже в случае подобного двойного фермента, предпочтительнее использовать NADH, а не NADPH, а в таком случае метаболизм возможен и в аэробных условиях. Таким образом, что касается содержания кислорода при выращивании в питательной среде по настоящему изобретению, коэффициент переноса кислорода (KLa) (час-1) (далее в данном описании обозначают просто как KLa), предпочтительно, составляет от 5 до 300 час-1, более предпочтительно, составляет от 10 до 250 час-1 и, еще более предпочтительно, составляет от 20 до 200 час-1. В тех случаях, когда KLa не превышает 5 час-1, продуктивность может оказаться низкой, поскольку скорость потребления сахара низкая. В тех случаях, когда KLa составляет не менее 300 час-1, избыточное пенообразование может вызвать проблемы при проведении непрерывной ферментации.

KLa характеризует способность образовывать растворенный кислород за счет переноса кислорода из газовой фазы в жидкую фазу в единицу времени при аэрации и перемешивании, и его определяют в соответствии с приведенным ниже уравнением (3). (Laboratory Manual for Bioengineering. The Society for Biotechnology, Japan ed., Baifukan Co., Ltd., p. 310 (1992)).

dC/dt=KLa×(C*-C) (3)

В приведенном уравнении C обозначает концентрацию растворенного кислорода DO (в частях на миллион) в культуральной жидкости; C* обозначает концентрацию растворенного кислорода DO (в частях на миллион) в состоянии равновесия в газовой фазе в отсутствие потребления кислорода микроорганизмом(ами); а KLa обозначает коэффициент переноса кислорода (час-1). Поскольку приведенное ниже уравнение (4) получено из приведенного выше уравнения (3), то KLa можно определить, нанося на график логарифма величины C*-C в зависимости от периода аэрации.

ln(C*-C)=-KLa×t (4)

KLa в настоящем изобретении представляет собой величину, которую измеряют методом вытеснения газа (динамическим методом). Метод вытеснения газа (динамический метод) представляет собой способ, в котором воду и используемую культуральную среду помещают в перемешиваемую путем аэрации установку для выращивания в питательной среде, которая снабжена помещенным внутрь электродом для измерения растворенного кислорода, и кислород в жидкости замещают газообразным азотом, чтобы снизить концентрацию кислорода в жидкости, а затем заменяют газообразный азот сжатым воздухом и контролируют процесс увеличения количества растворенного кислорода при определенной скорости аэрации, скорости перемешивания и температуре, чтобы рассчитать величину KLa.

Соответственно, KLa можно определить, комбинируя условия аэрации и условия перемешивания, чтобы провести выращивание в питательной среде при аэрации и перемешивании. В таком случае газ, который предполагается использовать для аэрации, может быть изменен в зависимости от условий выращивания в питательной среде. Высокую концентрацию растворенного кислорода можно обеспечить, например, поддерживая концентрацию кислорода не менее 21% путем добавления кислорода к воздуху, путем повышения давления культуральной жидкости, повышения скорости перемешивания и/или увеличения скорости аэрации.

В соответствии с настоящим изобретением, KLa можно определить прямым измерением, используя вышеуказанные средства. В качестве альтернативы, в тех случаях, когда величина KLa попадает в диапазон низких значений, ее можно определить расчетным путем, поскольку, как известно, при постоянной скорости перемешивания величина KLa пропорциональна скорости аэрации, как указано в приведенном ниже уравнении (5). В частности, KLa определяют при постоянной скорости перемешивания, при этом скорость аэрации соответствующим образом изменяют, а полученные значения KLa наносят на график в зависимости от скорости аэрации, а затем определяют константы a и b, которые удовлетворяют уравнению (5), и таким путем определяют значение KLa по настоящему изобретению.

KLa=a×V+b (5)

В данном уравнении V обозначает скорость аэрации (vvm); a и b являются константами.

В тех случаях, когда значения KLa слишком велики, чтобы удовлетворять уравнению (5), для определения KLa проводят прямое измерение.

В способе получения химического соединения по настоящему изобретению разность трансмембранного давления при фильтрации не ограничивается, при условии, что можно осуществить фильтрацию ферментативной культуральной жидкости. Тем не менее в тех случаях, когда фильтрацию осуществляют через органическую полимерную мембрану с трансмембранным давлением выше, чем 150 кПа, велика вероятность разрушения структуры органической полимерной мембраны, а потому может пострадать продуктивность получения химических веществ. В тех случаях, когда разница трансмембранного значения меньше чем 0,1 кПа, можно недополучить существенную часть фильтрата ферментативной культуры, и продуктивность получения химического вещества снизится. В том случае, когда в способе получения химического вещества по настоящему изобретению применяют органическую полимерную мембрану, разница трансмембранного давления, которое равно давлению при фильтрации, предпочтительно, находится в диапазоне от 0,1 кПа до 150 кПа, поскольку в таком случае количество фильтрата ферментативной культуральной жидкости может быть большим, а снижение продуктивности получения химического вещества вследствие разрушения структуры мембраны не происходит. Таким образом, в этом случае можно поддерживать высокую продуктивность получения химического вещества. В тех случаях, когда используют органическую полимерную мембрану, разница трансмембранного давления, более предпочтительно, находится в диапазоне от 0,1 кПа до 50 кПа, еще более предпочтительно, находится в диапазоне от 0,1 кПа до 20 кПа.

И в тех случаях, когда используют керамическую мембрану, разница трансмембранного давления в процессе фильтрации не ограничивается, при условии, что можно осуществить фильтрацию ферментативной культуральной жидкости. Разница трансмембранного давления, предпочтительно, не превышает 500 кПа. В тех случаях, когда процесс проводят при давлении не менее 500 кПа, возможно закупоривание мембраны, которое может вызвать проблемы при проведении непрерывной ферментации.

В качестве движущей силы фильтрации для создания разницы трансмембранного давления в разделительной мембране может применяться сифон, в котором используют разницу в уровне жидкости (разницу гидравлической головки) между ферментативной культуральной жидкостью и жидкостью, прошедшей через пористую мембрану, или может применяться циркуляционный насос с перекрестным потоком. Кроме того, в качестве внешней силы для фильтрации можно использовать всасывающий насос на вторичной стороне разделительной мембраны. В тех случаях, когда используют циркуляционный насос с перекрестным потоком, разницу трансмембранного давления можно регулировать с помощью давления всасывания. Разницу трансмембранного давления можно также регулировать с помощью давления газа или жидкости, которые применяют для создания давления на стороне ферментативной жидкости. В тех случаях, когда осуществляют подобное регулирование давления, разницу между давлением на стороне ферментативной жидкости и давлением на стороне жидкости, прошедшей через пористую мембрану, можно принимать за разницу трансмембранного давления и использовать ее для регулирования разницы трансмембранного давления.

В способе получения химического вещества по настоящему изобретению непрерывную ферментацию (фильтрацию культуральной жидкости) для порционной клеточной культуры или клеточной культуры с подпиткой можно начать на ранней стадии выращивания в питательной среде после того, как концентрация микроорганизма повысится. В качестве альтернативы, клетки микроорганизма можно высевать с большой концентрацией, а непрерывную ферментацию осуществлять с самого начала выращивания в питательной среде. В способе получения химического вещества по настоящему изобретению подачу культуральной среды и фильтрацию культуральной жидкости можно проводить в удобные моменты времени. Временные точки начала подачи культуральной среды и фильтрации культуральной жидкости необязательно могут совпадать. Подачу культуральной среды и фильтрацию культуральной жидкости можно осуществлять как непрерывным, так и прерывистым способом.

Для обеспечения непрерывного роста клеток в культуральную среду может(могут) добавлять нутриент(ы), необходимый(ые) для роста микроорганизма. Концентрация микроорганизма в культуральной среде не ограничивается, при условии, что она является концентрацией, предпочтительной для эффективного продуцирования химического вещества. Хорошую продуктивность можно обеспечить, поддерживая концентрацию микроорганизма в культуральной среде, например, на уровне не менее 5 г/л в пересчете на сухой вес.

Если необходимо, в процессе непрерывной ферментации в способе получения химического вещества по настоящему изобретению концентрацию микроорганизма в сосуде для выращивания в питательной среде можно регулировать, удаляя из биореактора часть культуральной жидкости, содержащей микроорганизм(ы) и затем разбавляя культуральную жидкость в сосуде для выращивания в питательной среде с помощью культуральной среды. Например, когда концентрация микроорганизма в биореакторе становится слишком высокой, то велика вероятность закупорки разделительной мембраны. Закупоривание разделительной мембраны можно предотвратить, удалив часть культуральной жидкости, содержащей микроорганизм(ы), и затем разбавив культуральную жидкость в биореакторе с помощью культуральной среды. Кроме того, продуктивность получения химического вещества может меняться в зависимости от концентрации микроорганизма в биореакторе. Продуктивность можно поддерживать, удаляя часть культуральной жидкости, содержащей микроорганизм(ы), и затем разбавляя культуральную жидкость в сосуде с помощью культуральной среды, используя продуктивность в качестве показателя.

В тех случаях, когда непрерывную ферментацию осуществляют в соответствии со способом получения химического вещества по настоящему изобретению, непрерывную ферментацию можно провести с очень высоким ферментативным выходом, по сравнению с теми случаями, когда используют обычную клеточную культуру. Ферментативный выход при непрерывной ферментации в данном описании рассчитывают в соответствии с приведенным ниже уравнением (6)

Выход (г/г) = количество продукта (г)/{добавленный сахар (г) - неиспользованный сахар (г)} (6)

Установка для непрерывной ферментации, которую используют в настоящем изобретении, специально не ограничивается, при условии, что она представляет собой установку для получения химического вещества путем непрерывной ферментации, где ферментативную культуральную жидкость микроорганизма(ов) фильтруют через разделительную мембрану, а продукт извлекают из фильтрата, в то время как не прошедшая через фильтр жидкость сохраняется в ферментативной культуральной жидкости или обратным потоком возвращается в ферментативную культуральную жидкость; исходное сырье для ферментации добавляют к ферментативной культуральной жидкости; и продукт извлекают из фильтрата. Конкретные примеры установки, в которой используют органическую полимерную мембрану, включают установку, описанную в WO 2007/097260. Конкретные примеры установки, в которой используют керамическую полимерную мембрану, включают установку, описанную в WO 2012/086763.

Химическое вещество, полученное по способу получения химического вещества по настоящему изобретению, не ограничивается, при условии, что оно представляет собой вещество, продуцированное в культуральной жидкости вышеуказанным микроорганизмом. Примеры химического вещества, полученного по способу получения химического вещества по настоящему изобретению, включают спирты, органические кислоты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, представляющие собой вещества, которые являются массовой продукцией бродильного производства. Примеры веществ включают спирты, такие как этанол, изобутанол, изопропанол, н-бутанол, 1,3-пропандиол, 1,4-бутандиол, 2,3-бутандиол и глицерин; органические кислоты, такие как уксусная кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, итаконовая кислота, лимонная кислота и адипиновая кислота; нуклеиновые кислоты, такие как нуклеозиды, включая инозин и гуанозин, и нуклеотиды, включая инозиновую кислоту и гуаниловую кислоту; и диаминовые соединения, такие как кадаверин и путресцин. Настоящее изобретение можно также применять для получения таких веществ, как ферменты, антибиотики и рекомбинантные белки. Указанные химические вещества можно выделить из фильтрата хорошо известными способами (мембранным разделением, концентрированием, дистилляцией, кристаллизацией, экстракцией и т.д.).

ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение будет подробно описано на примерах. Тем не менее настоящее изобретение указанными примерами не ограничивается.

(Справочный пример 1) Метод анализа глюкозы, ксилозы и этанола

Концентрацию глюкозы, ксилозы и этанола в культуральной жидкости количественно оценивают в указанных ниже условиях проведения ВЭЖХ путем сравнения со стандартными образцами.

Колонка: Shodex SH1011 (изготовитель - Showa Denko К.К.)

Подвижная фаза: 5 мМ раствор серной кислоты (скорость потока: 0,6 мл/мин)

Реакционная жидкость: отсутствует

Метод обнаружения: RI (дифференциальный показатель преломления)

Температура: 65°С.

(Справочный пример 2) Метод анализа молочной кислоты

Молочную кислоту в культуральной жидкости количественно оценивают в указанных ниже условиях проведения ВЭЖХ путем сравнения со стандартными образцами.

Колонка: Shim-Pack SPR-H (изготовитель - Shimadzu Corporation)

Подвижная фаза: 5 мМ раствор п-толуолсульфоновой кислоты (скорость потока: 0,8 мл/мин)

Реакционная жидкость: 5 мМ раствор п-толуолсульфоновой кислоты, 20 мМ Bis-Tris, 0,1 мМ ЭДТК-Na (скорость потока: 0,8 мл/мин)

Метод обнаружения: электропроводность

Температура: 45°С.

(Справочный пример 3) Определение активности редуктазы пентозы

Каждый из штамма Candida tropicalis NBRC0199, штамма Pichia stipitis NBRC1687 и штамма Candida utilis CuLpLDH, описанных в WO 2010/140602, инокулируют в 5 мл среды YPX (1% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона, 2% ксилозы) с помощью платиновой петли и клеточную культуру оставляют на ночь перемешиваться на качалке при температуре 30°С (прекультура). На следующий день прекультуру инокулируют в 50 мл среды YPX, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл и клеточную культуру оставляют на 24 час на качалке при температуре 30°С. Собранную культуральную жидкость дважды промывают 50 мМ фосфатным буфером. Клетки микроорганизма вновь суспендируют в 50 мМ фосфатного буфера и гомогенизуют в гомогенизаторе шарового типа (0,6 г шариков φ0,5, 4000 об/мин, 1 мин × 5 раз) с последующим центрифугированием и извлечением полученной надосадочной жидкости, и надосадочную жидкость используют в качестве экстракта клеток микроорганизма. Экстракт клеток микроорганизма добавляют к 50 мМ фосфатного буфера (900 мкл), дополненного 200 мМ ксилозы и 100 мкл 1,5 мМ раствора NAD(P)H, и дают реакции протекать при 30°С, непрерывно контролируя поглощение при 340 нм. Образец без добавления ксилита используют в качестве холостой пробы. В тех случаях, когда степень снижения поглощения превышает степень снижения поглощения холостого образца, считают, что штамм обладает активностью редуктазы пентозы. В итоге можно подтвердить, что все 3 штамма обладают активностью редуктазы пентозы.

(Справочный пример 4) Определение активности пентолдегидрогеназы

Каждый из штамма Candida tropicalis NBRC0199, штамма Pichia stipitis NBRC1687 и штамма Candida utilis CuLpLDH, описанных в WO 2010/140602, инокулируют в 5 мл среды YPX (1% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона, 2% ксилозы) с помощью платиновой петли и клеточную культуру оставляют на ночь перемешиваться на качалке при температуре 30°С (прекультура). На следующий день прекультуру инокулируют в 50 мл среды YPX, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл и клеточную культуру оставляют на 24 час на качалке при температуре 30°С. Собранную культуральную жидкость дважды промывают 50 мМ буферным раствором Tris-HCl. Клетки микроорганизма вновь суспендируют в 50 мМ буферного раствора Tris-HCl и гомогенизуют в гомогенизаторе шарового типа (0,6 г шариков φ0,5, 4000 об/мин, 1 мин × 5 раз) с последующим центрифугированием и извлечением полученной надосадочной жидкости, и надосадочную жидкость используют в качестве экстракта клеток микроорганизма. Экстракт клеток микроорганизма добавляют к 900 мкл 50 мМ буферного раствора Tris-HCl, дополненного 50 мМ раствора MgCl2, 300 мМ раствора ксилита и 100 мкл 10 мМ раствора NAD(P)+, и дают реакции протекать при 35°С, непрерывно контролируя поглощение при 340 нм. Образец без добавления ксилита используют в качестве холостой пробы. В тех случаях, когда степень снижения поглощения превышает степень снижения поглощения холостого образца, считают, что штамм обладает активностью пентолдегидрогеназы. В итоге можно подтвердить, что все 3 штамма обладают активностью пентолдегидрогеназы.

(Справочный пример 5) Определение KLa

Электрод для определения растворенного кислорода (изготовитель - Mettler-Toledo) помещают в сосуд для выращивания в питательной среде, чтобы измерить концентрацию растворенного кислорода для каждого условия аэрации/перемешивания, и определяют величину KLa динамическим способом с использованием газообразного азота. В сосуд для выращивания в питательной среде емкостью 1,5 л помещают воду, а затем через воду продувают достаточное количество газообразного азота, при этом температуру воды поддерживают на уровне 30°С и перемешивают воду с постоянной скоростью. Когда электродная величина становится минимальной, проводят калибровку нуля электрода для определения растворенного кислорода. Затем используемый для аэрации газ меняют с газообразного азота на воздух при заданной скорости аэрации и для определения KLa измеряют изменения концентрации растворенного кислорода. В таблице 1 приведены значения KLa для различных условий аэрации/перемешивания при скорости перемешивания 800 об/мин и температуре 30°С с использованием сжатого воздуха.

[Таблица 1]
Газ для аэрации Скорость аэрации (vvm) Скорость перемешивания (об/мин) 30°С
KLa (час-1)
Воздух 0,01 800 4
0,05 800 14
0,1 800 27
0,2 800 57
0,3 800 89
0,5 800 144
0,6 800 168
1,5 800 327

Зависимость между скоростью аэрации и KLa помещают на графике в интервале указанных в таблице значений от 0,01 до 0,6 vvm, чтобы рассчитать константы (a, b) в уравнении (5). В итоге константы (a, b) равны (284, 0,49). Поскольку значение 1,5 vvm не удовлетворяет линейному соотношению на графике, то указанное значение не используют при расчете констант.

(Сравнительный пример 1) Получение этанола при порционном культивировании Candida tropicalis с использованием гексозы в качестве исходного сырья для ферментации

В качестве микроорганизма используют штамм Candida tropicalis NBRC0199, а в качестве культуральной среды используют среду YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона, 7% глюкозы). Штамм Candida tropicalis NBRC0199 культивируют в течение ночи в 2 мл среды YPD в пробирке при температуре 30°С при перемешивании на качалке (прекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мл среды YPD, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл и выращивание в питательной среде проводят при перемешивании в течение ночи на качалке (прекультура). Жидкость с прекультурой инокулируют в 1,5 л среды YPD, и порционное выращивание в питательной среде осуществляют в течение 16 час в указанных ниже условиях при перемешивании со скоростью 800 об/мин с помощью мешалки, которой снабжен сосуд для выращивания в питательной среде, при этом контролируют скорость аэрации и температуру в сосуде для выращивания в питательной среде, и получают этанол (таблица 3).

Сосуд для выращивания в питательной среде: 2 л

Эффективная емкость сосуда для выращивания в питательной среде: 1,5 л

Регулирование температуры: 30°С

Скорость аэрации в сосуде для выращивания в питательной среде: 0,1 vvm, сжатый воздух

Скорость перемешивания в сосуде для выращивания в питательной среде: 800 об/мин

Регулирование рН: отсутствует

Стерилизация: сосуд для выращивания в питательной среде и используемую среду в течение 20 мин подвергают стерилизации паром под высоким давлением в автоклаве при температуре 121°С.

(Сравнительный пример 2) Получение этанола при порционном культивировании Candida tropicalis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Используя среду YPDX, состав которой приведен в таблице 2, в качестве культуральной среды, осуществляют порционное выращивание в питательной среде в течение 23 час в тех же условиях, что и в сравнительном примере 1, и получают этанол (таблица 3).

[Таблица 2]
Компоненты Содержание
Глюкоза 3%
Ксилоза 4%
Бактопептон 2%
Дрожжевой экстракт 1%

(Сравнительный пример 3) Продуцирование этанола микроорганизмом Candida tropicalis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Используя среду YPDX, состав которой приведен в таблице 2, в качестве культуральной среды, осуществляют непрерывную ферментацию без использования разделительной мембраны. Штамм Candida tropicalis NBRC0199 выращивают в питательной среде в течение ночи в 2 мл среды YPD в пробирке при температуре 30°С при встряхивании на качалке (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мл среды YPD, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл и выращивание в питательной среде проводят при встряхивании в течение ночи на качалке (препрекультура). Жидкость с препрекультурой инокулируют в 1,5 л среды YPDX, помещенной в биореактор непрерывного действия (то же устройство, которое показано на фигуре 2 документа WO 2007/097260, за исключением того, что элемент разделительной мембраны удаляют), и выращивание в питательной среде проводят в течение 16 час в тех же самых условиях для скорости перемешивания, скорости аэрации и температуры в сосуде для выращивания в питательной среде, что и в сравнительном примере 1 (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования непрерывную ферментацию проводят в течение 360 час для получения этанола. Для подачи культуральной среды и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, используют насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO) для подачи культуральной среды и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, непосредственно из сосуда для выращивания в питательной среде. Установив скорость сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, равной 0,05 л/час, осуществляют процесс, контролируя скорость подачи культуральной среды таким образом, чтобы количество культуральной жидкости в сосуде для выращивания в питательной среде составляло 1,5 л (таблица 3).

(Пример 1) Продуцирование этанола микроорганизмом Candida tropicalis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 1

Используя среду YPDX, состав которой приведен в таблице 2, в качестве культуральной среды, осуществляют непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Штамм Candida tropicalis NBRC0199 выращивают в питательной среде в течение ночи в 2 мл среды YPD в пробирке при температуре 30°С при встряхивании на качалке (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мл среды YPD, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят при встряхивании в течение ночи на качалке (препрекультура). Жидкость с препрекультурой инокулируют в 1,5 л среды YPDX, которую помещают в сосуд для выращивания в питательной среде непрерывного действия, снабженный интегрированной мембраной, свойства которой указаны ниже (устройство, показанное на фигуре 2 документа WO 2007/097260), и выращивание в питательной среде проводят в течение 36 час при скорости вращения 800 об/мин с помощью мешалки, которой снабжен сосуд, контролируя скорость аэрации и температуру в сосуде для выращивания в питательной среде (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования начинают непрерывную ферментацию для получения этанола. Для подачи культуральной среды и фильтрации культуральной жидкости используют насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO). Культуральную среду непосредственно подают в сосуд для выращивания в питательной среде, а фильтрацию культуральной жидкости осуществляют, собирая фильтрат через элемент, который имеет присоединенную к нему разделительную мембрану. Скорость подачи культуральной среды регулируют таким образом, чтобы количество культуральной жидкости в сосуде для выращивания в питательной среде составляло 1,5 л при постоянной скорости фильтрации культуральной жидкости, а разнице трансмембранного давления в процессе фильтрации дают изменяться в диапазоне от 0,1 до 20,0 кПа, и непрерывную ферментацию для получения этанола проводят в течение 370 час (таблица 3).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 л

Эффективный объем сосуда для выращивания в питательной среде: 1,5 л

Используемая разделительная мембрана: фильтрационная мембрана из поливинилиденфторида

Эффективная площадь фильтрации разделительного элемента мембраны: 120 см2

Коэффициент проницаемости разделительной мембраны для чистой воды: 50×10-9 м32/с/Па

Средний размер пор разделительной мембраны: 0,1 мкм

Стандартное отклонение среднего размера пор: 0,035 мкм

Шероховатость поверхности разделительной мембраны: 0,06 мкм

Регулирование температуры: 30°С

Скорость аэрации в сосуде для выращивания в питательной среде: 0,01 vvm, сжатый воздух

Скорость перемешивания в сосуде для выращивания в питательной среде: 800 об/мин

Регулирование рН: отсутствует

Скорость фильтрации культуральной жидкости: 0,05 л/час.

Стерилизация: сосуд для выращивания в питательной среде, снабженный элементом разделительной мембраны, и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Пример 2) Продуцирование этанола микроорганизмом Candida tropicalis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 2

Используя штамм Candida tropicalis NBRC0199, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 369 час в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что скорость аэрации сжатым воздухом в сосуде для выращивания в питательной среде равна 0,1 vvm, и получают этанол (таблица 3).

(Пример 3) Продуцирование этанола микроорганизмом Candida tropicalis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 3

Используя штамм Candida tropicalis NBRC0199, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 370 час в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что скорость аэрации сжатым воздухом в сосуде для выращивания в питательной среде равна 1,5 vvm, и получают этанол (таблица 3).

[Таблица 3]
Сравнительный пример 1: порционная ферментация Сравнительный пример 2: порционная ферментация Сравнительный пример 3: непрерывная ферментация Пример 1: непрерывная ферментация с использованием мембраны Пример 2: непрерывная ферментация с использованием мембраны Пример 3: непрерывная ферментация с использованием мембраны
Ферментативный период (час) 16 23 360 370 369 370
Общее количество добавленной глюкозы (г) 106 48,0 568 594 613 620
Общее количество добавленной ксилозы (г) 0 64,1 738 742 827 783
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 0 72 37 18 6
Общее количество полученного этанола (г) 48,6 26,9 333 429 483 433
Выход этанола (г/г) 0,46 0,24 0,27 0,33 0,34 0,31

(Сравнительный пример 4) Продуцирование этанола при порционном культивировании Pichia stipitis с использованием гексозы в качестве исходного сырья для ферментации

Используя штамм Pichia stipitis NBRC1687 в качестве микроорганизма, порционное выращивание в питательной среде проводят в течение 40 час в тех же условиях, что и в сравнительном примере 1, и получают этанол (таблица 4).

(Сравнительный пример 5) Продуцирование этанола при порционном культивировании Pichia stipitis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Используя штамм Pichia stipitis NBRC1687 в качестве микроорганизма, порционное выращивание в питательной среде проводят в течение 40 час в тех же условиях, что и в сравнительном примере 2, и получают этанол (таблица 4).

(Сравнительный пример 6) Продуцирование этанола микроорганизмом Pichia stipitis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Используя штамм Pichia stipitis NBRC1687 в качестве микроорганизма, проводят непрерывную ферментацию исходной смеси сахаров без использования разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию проводят в течение 368 час в тех же условиях, что и в сравнительном примере 3, за исключением того, что время прекультивирования составляет 40 час, и получают этанол (таблица 4).

(Пример 4) Продуцирование этанола микроорганизмом Pichia stipitis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 1

Используя штамм Pichia stipitis NBRC1687 в качестве микроорганизма, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию проводят в течение 370 час в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что время прекультивирования составляет 48 час, а разница трансмембранного давления составляет от 0,1 до 19,8 кПа, и получают этанол (таблица 4).

(Пример 5) Продуцирование этанола микроорганизмом Pichia stipitis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 2

Используя штамм Pichia stipitis NBRC1687 в качестве микроорганизма, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию проводят в течение 369 час в тех же условиях, что и в примере 2, за исключением того, что время прекультивирования составляет 40 час, а разница трансмембранного давления составляет от 0,1 до 19,8 кПа, и получают этанол (таблица 4).

(Пример 6) Продуцирование этанола микроорганизмом Pichia stipitis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 3

Используя штамм Pichia stipitis NBRC1687 в качестве микроорганизма, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию проводят в течение 370 час в тех же условиях, что и в примере 3, за исключением того, что время прекультивирования составляет 36 час, а разница трансмембранного давления составляет от 0,1 до 19,8 кПа, и получают этанол (таблица 4).

[Таблица 4]
Сравнительный пример 4: порционная ферментация Сравнительный пример 5: порционная ферментация Сравнительный пример 6: непрерывная ферментация Пример 4: непрерывная ферментация с использованием мембраны Пример 5: непрерывная ферментация с использованием мембраны Пример 6: непрерывная ферментация с использованием мембраны
Ферментативный период (час) 24 40 368 370 369 370
Общее количество добавленной глюкозы (г) 105 48,0 581 557 613 583
Общее количество добавленной ксилозы (г) 0 64,1 754 747 827 744
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 0 129 56 42 9
Общее количество полученного этанола (г) 49,4 33,6 397 487 559 487
Выход этанола (г/г) 0,47 0,30 0,33 0,39 0,40 0,37

(Сравнительный пример 7) Получение D-молочной кислоты при порционном культивировании Candida utilis с использованием гексозы в качестве исходного сырья для ферментации

В качестве микроорганизма используют штамм Candida utilis CuLpLDH, который получают, как раскрыто в WO 2010/140602. Порционное выращивание в питательной среде проводят в течение 40 час в тех же условиях, что и в сравнительном примере 1, за исключением того, что рН среды доводят до значения 6,0 с помощью 1N раствора гидроксида кальция, и получают D-молочную кислоту (таблица 5).

(Сравнительный пример 8) Получение D-молочной кислоты при порционном культивировании Candida utilis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Порционное выращивание в питательной среде проводят в течение 40 час в тех же условиях, что и в сравнительном примере 2, за исключением того, что в качестве микроорганизма используют штамм Candida utilis CuLpLDH, а рН среды доводят до значения 6,0 с помощью 1N раствора гидроксида кальция, и получают D-молочную кислоту (таблица 5).

(Сравнительный пример 9) Продуцирование D-молочной кислоты микроорганизмом Candida utilis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Используя штамм Candida utilis CuLpLDH в качестве микроорганизма, проводят непрерывную ферментацию исходной смеси сахаров без использования разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 368 час в тех же условиях, что и в сравнительном примере 3, за исключением того, что время прекультивирования составляет 40 час, а рН среды доводят до значения 6,0 с помощью 1N раствора гидроксида кальция, и получают D-молочную кислоту (таблица 5).

(Пример 7) Продуцирование D-молочной кислоты микроорганизмом Candida utilis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 1

Используя штамм Candida utilis CuLpLDH в качестве микроорганизма, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 370 час в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что время прекультивирования составляет 50 час, а рН среды доводят до значения 6,0 с помощью 1N раствора гидроксида кальция, и получают D-молочную кислоту (таблица 5).

(Пример 8) Продуцирование D-молочной кислоты микроорганизмом Candida utilis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 2

Используя штамм Candida utilis CuLpLDH в качестве микроорганизма, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 369 час в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что время прекультивирования составляет 40 час, а рН среды доводят до значения 6,0 с помощью 1N раствора гидроксида кальция, и получают D-молочную кислоту (таблица 5).

(Пример 9) Продуцирование D-молочной кислоты микроорганизмом Candida utilis при непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 3

Используя штамм Candida utilis CuLpLDH в качестве микроорганизма, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 370 час в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что время прекультивирования составляет 30 час, а рН среды доводят до значения 6,0 с помощью 1N раствора гидроксида кальция, и получают D-молочную кислоту (таблица 5).

[Таблица 5]
Сравнительный пример 7: порционная ферментация Сравнительный пример 8: порционная ферментация Сравнительный пример 9: непрерывная ферментация Пример 7: непрерывная ферментация с использованием мембраны Пример 8: непрерывная ферментация с использованием мембраны Пример 9: непрерывная ферментация с использованием мембраны
Ферментативный период (час) 40 40 368 370 369 370
Общее количество добавленной глюкозы (г) 107 46,5 559 575 614 583
Общее количество добавленной ксилозы (г) 0 62,1 773 781 795 753
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 0 83 93 61 15
Общее количество полученной D-молочной кислоты (г) 30,9 22,8 287 353 391 344
Выход D-молочной кислоты (г/г) 0,29 0,21 0,23 0,28 0,29 0,26

(Сравнительный пример 10) Получение этанола порционной ферментацией с помощью Candida tropicalis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья 2 для ферментации

Проводят порционную ферментацию, используя штамм Candida tropicalis NBRC0199. В качестве среды для ферментации используют среду YPDX с тем же составом, который приведен в таблице 2, за исключением того, что применяемая концентрация сахаров составляет 1% глюкозы и 9% ксилозы. Этанол получают в процессе порционной ферментации в течение 42 час, при этом другие условия проведения операции и т.п. такие же, как в сравнительном примере 2 (таблица 6).

(Сравнительный пример 11) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Candida tropicalis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья 2 для ферментации

Используя штамм Candida tropicalis NBRC0199, проводят непрерывную ферментацию без использования разделительной мембраны. В качестве среды для ферментации используют среду YPDX с тем же составом, который приведен в таблице 2, за исключением того, что применяемая концентрация сахаров составляет 1% глюкозы и 9% ксилозы. Этанол получают в процессе непрерывной ферментации в течение 400 час, при этом другие условия проведения операции и т.п. такие же, как в сравнительном примере 3 (таблица 6).

(Пример 10) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Candida tropicalis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 4

Используя штамм Candida tropicalis NBRC0199, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. В качестве среды для ферментации используют среду YPDX с тем же составом, который приведен в таблице 2, за исключением того, что применяемая концентрация сахаров составляет 1% глюкозы и 9% ксилозы. Этанол получают в процессе непрерывной ферментации в течение 420 час, при этом другие условия проведения операции и т.п. такие же, как в примере 1 (таблица 6).

(Пример 11) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Candida tropicalis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием керамической разделительной мембраны 5

Используя штамм Candida tropicalis NBRC0199, проводят непрерывную ферментацию с использованием керамической разделительной мембраны. В качестве среды для ферментации используют среду YPDX, имеющую тот же состав, что и приведенный в таблице 2, за исключением того, что применяемая концентрация сахаров составляет 1% глюкозы и 9% ксилозы. Штамм Candida tropicalis NBRC0199 выращивают в питательной среде в течение ночи в 2 мл среды YPD в пробирке при температуре 30С при встряхивании на качалке (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мл среды YPD, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят при встряхивании в течение ночи на качалке (препрекультура). Жидкость с препрекультурой инокулируют в 1,5 л среды YPDX, помещенной в биореактор непрерывного действия, снабженный разделительной мембраной (устройство, приведенное на фигуре 12 документа WO 2012/086763), и выращивание в питательной среде проводят в течение 36 час, вращая мешалку, которой снабжен сосуд, со скоростью 800 об/мин и контролируя скорость аэрации и температуру в сосуде для выращивания в питательной среде (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования начинают непрерывную ферментацию. Поддерживая разницу трансмембранного давления в процессе фильтрации на уровне не более 500 кПа, получают этанол непрерывной ферментацией в течение 400 час (таблица 6).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 л

Эффективный объем сосуда для выращивания в питательной среде: 1,5 л

Используемая разделительная мембрана: Celfit микрофильтрационная мембрана Monolith φ4-19 (NGK Insulators, Ltd.)

Длина элемента разделительной мембраны: 500 мм

Средний размер пор разделительной мембраны: 0,1 мкм

Регулирование температуры: 30°С

Скорость аэрации в сосуде для выращивания в питательной среде: 0,01 vvm, сжатый воздух

Скорость перемешивания в сосуде для выращивания в питательной среде: 800 об/мин

Регулирование рН: отсутствует

[Таблица 6]
Сравнительный пример 10: порционная ферментация Сравнительный пример 11: непрерывная ферментация Пример 10: непрерывная ферментация с использованием мембраны Пример 11: непрерывная ферментация с использованием керамической мембраны
Ферментативный период (час) 42 400 420 400
Общее количество добавленной глюкозы (г) 16,5 210 227 41,2
Общее количество добавленной ксилозы (г) 137 1802 1901 362
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 119 45,2 17,1
Общее количество полученного этанола (г) 7,4 116 260 145
Выход этанола (г/г) 0,05 0,06 0,13 0,12

(Сравнительный пример 12) Получение этанола порционной ферментацией с помощью Candida tropicalis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья 3 для ферментации

Порционную ферментацию проводят, используя штамм Candida tropicalis NBRC0199. В качестве исходного сырья для ферментации используют сироп, полученный осахариванием целлюлозы, который готовят по способу, раскрытому в примере 2 документа WO 2010/067785, применяя нанофильтрационную мембрану. Состав среды для ферментации подбирают в соответствии с таблицей 7, используя соответствующие реагенты. Этанол получают в процессе порционной ферментации в течение 72 час, при этом другие условия проведения операции и т.п. такие же, как и в сравнительном примере 3 (таблица 8).

[Таблица 7]
Компоненты Содержание
Глюкоза 6%
Ксилоза 3%
Бактопептон 2%
Дрожжевой экстракт 1%

(Сравнительный пример 13) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Candida tropicalis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья 3 для ферментации

Непрерывную ферментацию проводят, используя штамм Candida tropicalis NBRC0199 без применения разделительной мембраны. Аналогично сравнительному примеру 12, в качестве среды для ферментации используют культуральную среду, описанную в таблице 7. Этанол получают в процессе непрерывной ферментации в течение 400 час, при этом другие условия проведения операции и т.п. такие же, как и в сравнительном примере 3 (таблица 8).

(Пример 12) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Candida tropicalis с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 6

Используя штамм Candida tropicalis NBRC0199, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Аналогично сравнительному примеру 12, в качестве среды для ферментации используют культуральную среду, описанную в таблице 7. Этанол получают в процессе непрерывной ферментации в течение 456 час, при этом другие условия проведения операции и т.п. такие же, как и в примере 1 (таблица 8).

[Таблица 8]
Сравнительный пример 12: порционная ферментация Сравнительный пример 13: непрерывная ферментация Пример 12: непрерывная ферментация с использованием мембраны
Ферментативный период (час) 72 400 456
Общее количество добавленной глюкозы (г) 91,5 1220 1391
Общее количество добавленной ксилозы (г) 43,5 580 661
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 58,0 29,0
Общее количество полученного этанола (г) 37,6 525 699
Выход этанола (г/г) 0,28 0,30 0,35

Как показывают представленные результаты, химические вещества могут быть с высоким выходом получены из смешанных сахаров пентоз и гексоз.

Применимость в промышленности

Применение настоящего изобретения позволяет значительно повысить эффективность ферментативного получения различных химических веществ с использованием исходного сырья для ферментации, содержащего гексозы и пентозы.

1. Способ получения химического вещества путем непрерывной ферментации, при этом указанный способ включает фильтрацию культуральной жидкости микроорганизма(ов) через разделительную мембрану; сохранение не прошедшей через фильтр жидкости в культуральной жидкости или возврат обратным потоком не прошедшей через фильтр жидкости в культуральную жидкость; добавление исходного сырья для ферментации в культуральную жидкость и извлечение продукта, который представляет собой химическое вещество, продуцированное микроорганизмом (микроорганизмами) из фильтрата; где указанное исходное сырье для ферментации содержит пентозу и гексозу и где указанный(ые) микроорганизм(ы) представляет(ют) собой микроорганизм(ы), имеющий(ие) метаболический путь, в котором для метаболизма пентозы используется редуктаза пентозы и пентолдегидрогеназа.

2. Способ получения химического вещества по п. 1, который включает осуществление непрерывной ферментации в условиях, когда коэффициент переноса кислорода (KLa) равняется от 5 до 300 час-1.

3. Способ получения химического вещества по любому одному из пп. 1 или 2, где отношение пентозы к гексозе, которые содержатся в указанном сырье для ферментации, составляет от 1:9 до 9:1.

4. Способ получения химического вещества по любому одному из пп. 1 или 2, где указанное сырье для ферментации включает сахарный сироп, полученный из содержащей целлюлозу биомассы.

5. Способ получения химического вещества по любому одному из пп. 1 или 2, где указанной пентозой является ксилоза.

6. Способ получения химического вещества по любому одному из пп. 1 или 2, где указанной редуктазой пентозы является редуктаза ксилозы.

7. Способ получения химического вещества по любому одному из пп. 1 или 2, где указанной пентолдегидрогеназой является дегидрогеназа ксилита.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом(ами) посредством непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом (микроорганизмами) путем непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ превращения лигноцеллюлозы в органическую кислоту.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы получения молочной кислоты, получения лактида и получения полимолочной кислоты.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен полипептид D-лактатдегидрогеназы, который содержит полипептид с аминокислотной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне не менее 80% с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, раскрытые в описании, где указанный полипептид обладает D-лактатдегидрогеназной активностью.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041, являющийся продуцентом молочной кислоты.

Изобретение относится к биотехнологии пищевых продуктов и может быть использовано при переработке растворов брожения с получением молочной кислоты. Способ извлечения молочной кислоты из растворов брожения включает экстракцию молочной кислоты солью четвертичного аммониевого основания в разбавителе и реэкстракцию кислоты, причем экстракцию ведут солью четвертичного аммониевого основания в сульфатной форме [(R4N)2SO4], где R представляет собой алкильный или арильный радикал, в присутствии п-третичных алкилфенолов при молярном соотношении (R4N)2SO4 : п-третичные алкилфенолы, равном соответственно 1:2, при значении рН раствора 5,0-7,0, реэкстракцию кислоты проводят растворами гидроксида натрия, а регенерацию экстрагента осуществляют его обработкой стехиометрическим количеством серной кислоты.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения высококонцентрированных очищенных лактатсодержащих растворов, в частности высококонцентрированных очищенных растворов молочной кислоты и ее солей, на основе культуральной жидкости, полученной в результате культивирования клеток микроорганизмов.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности для получения L(+)-лактата посредством микробиологического синтеза. .

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом(ами) посредством непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом (микроорганизмами) путем непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способ получения С2-С6спиртов из метансодержащего сырья, оборудование для получения С2-С6спиртов и способ получения топлива для моторизованного транспорта.

Настоящее изобретение относится к способу получения бутанола, который имеет важное промышленное значение как исходное сырье для получения химических и фармацевтических продуктов, а также в качестве растворителя и топлива.
Изобретение относится к гидролизной промышленности, в частности к способам очистки гидролизатов лигноцеллюлозного сырья от ингибиторов ацетонобутилового брожения, и может быть использовано при подготовке питательных сред для получения биоэтанола, биобутанола, ацетона.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения спиртов и/или ацетона из целлюлозного или лигноцеллюлозного субстрата.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения комплекса органических растворителей, включающего ацетон, бутанол и этанол, из возобновляемого растительного целлюлозосодержащего сырья включает измельчение до размера частиц 20-80 мкм.
Способ предусматривает получение н-бутилового спирта путем анаэробного сбраживания ацетонобутиловыми бактериями сусла, полученного из измельченных клубней топинамбура.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа биологического получения н-бутанола и микроорганизма Clostridia acetobutylicum, используемого в таком способе.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма - продуцента н-бутанола, используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленно ценных органических соединений.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом(ами) посредством непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.
Наверх