Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp4 риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме "реального времени"



Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp4 риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp4 риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp4 риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp4 риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

 


Владельцы патента RU 2595427:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, ветеринарной медицины, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции видоспецифичного фрагмента ДНК Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени». Набор состоит из двух олигодезоксирибонуклеотидных праймеров: F: 5-CATGAGTCACGAAGTGGCT-3′, R: 5′-GGCACACTCACATCAATC-3′ и одного флуоресцентно-меченого ДНК-зонда: 5′-Cy5-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-BHQ2. Изобретение позволяет повысить надежность детекции A. marginale, упростить анализ и сократить время его проведения до 1.5 часов (не включая подготовку пробы). 3 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, ветеринарной медицины, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции видоспецифичного фрагмента ДНК Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени», содержащему два олигодезоксирибонуклеотидных праймера (прямой и обратный) и один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.

Anaplasma marginale (Род Anaplasma, отряд Rickettsiales, семейство Anaplasmatacea) является возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота (далее - КРС). A. marginale - облигатный внутриклеточный паразит, поражающий эритроциты. Анаплазмоз, вызванный A. marginale, протекает с признаками лихорадки, анемии, атонии желудочно-кишечного тракта и истощения. Смертность больных животных по разным оценкам составляет от 30 до 100%. Источником возбудителя являются инфицированные животные, переносчиками - около 20 видов клещей, а также кровососущие насекомые (Kocan, К.М., delaFuente, J., Blouin, E.F., Garcia-Garcia, J.C., 2004. Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae): recent advances indefining host-pathogen adaptation sofa tick-borne rickettsia. Parasitology 129, S285-S300. СайтИнтернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15938516, 2015 г.; Scoles, G.A., Broce, A.B., Lysyk, T.J., Palmer, G.H., 2005. Relative efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) compared with mechanical transmission by Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae). J. Med. Entomol. 42, 668-675. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16119558, 2015 г.). Возможна также механическая передача возбудителя от зараженных животных к здоровым через нестерильные инструменты при проведении зоотехнических мероприятий.

Анаплазмоз крупного рогатого скота широко распространен во всем мире и приводит к значительным экономическим потерям вследствие уменьшения мясомолочной продуктивности скота, ущерба от недополучения молодняка и гибели животных. Анаплазмоз КРС, вызванный A. marginale, зарегистрирован во многих тропических и субстропических странах. Анаплазмоз КРС является эндемичным для Мексики, Центральной и Южной Америки, Карибских островов, Африки и Азии. Энзоотическими очагами анаплазмоза являются все страны Латинской Америки (Guglielmone, А.А., 1995. Epidemiology of babesiosis and anaplasmosis in South and Central America. Vet. Parasitol. 57, 109-119. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7597777, 2015 г.). Анаплазмоз КРС распространен фактически по всей территории США и Канады, также в некоторых странах Европы, главным образом средиземноморских (DelaFuente, J., Lew, A., Lutz, Н., Meli, M.L., Hofmann-Lehmann, R., Shkap, V., etal., 2005. Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development. Anim. Health Res. Rev. 6, 75-89. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16164010, 2015 г.). Это заболевание регистрируют в Украине, Белоруссии, Молдавии, Казахстане, государствах Средней Азии и Закавказья. Согласно ветеринарной отчетности в Российской Федерации неблагополучными по анаплазмозу являются субъекты Центрального, Северо-Западного и Приволжского федеральных округов (Гулюкин М.И. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) / М.И. Гулюкин, В.Т. Заблоцкий, В.В. Белименко // РВЖ.СХЖ. - 2013. - №2. - С. 36-40. Сайт Интернет: http://cyberleninka.ru/article/n/monitoring-epizooticheskoy-situatsii-po-protozoynym-kroveparazitarnym-boleznyam-domashnih-zhivotnyh-v-rossiyskoy-federatsii-2007-2012, 2015 г.).

Своевременная диагностика играет решающую роль в предотвращении распространения инфекционных заболеваний. Многообразие клинических проявлений анаплазмоза затрудняет его диагностику, поэтому проблема создания надежных тест-систем для выявления патогенных видов анаплазм остается актуальной. На сегодняшний день для диагностики анаплазмоза применяют в основном микроскопические и серологические методы исследования, однако эти методы имеют ряд существенных недостатков, а именно недостаточно высокую чувствительность и специфичность. Так, результаты микроскопических исследований мазков крови ненадежны на ранних стадиях инфицирования и в случаях заболеваний, сопровождающихся тяжелой формой анемии, а серологические методы, основанные на использовании антител к антигенам A. marginale, имеют недостаточно высокую чувствительность и не позволяют дифференцировать А. marginale от других видов анаплазм (Dreher, U. М., J. Fuente, R. Hofmann-Lehmann, М. L. Meli, N. Pusterla, К. М. Kocan, Z. Woldehiwet, U. Braun, G. Regula, К. D. Staerk, and H. Lutz, 2005: Serologic crossreactivity between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12, 1177-1183. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16210480, 2015 г.).

Наиболее оперативную и точную диагностическую информацию позволяет получить выявление ДНК возбудителей анаплазмоза в крови КРС с помощью полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР). Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) специфического фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров до количеств, достаточных для его детекции любым из известных методов - электрофоретическим, гибридизационно-ферментным или гибридизационно-флуоресцентным. Преимуществом ПЦР-диагностики является высокая чувствительность и специфичность - она позволяет обнаружить возбудителя на самых ранних стадиях заболевания, в том числе и во время латентной фазы, и надежно дифференцировать анаплазмоз от ряда сходных по клиническим проявлениям заболеваний. Другими достоинствами метода являются небольшие затраты времени на проведение анализа и возможность автоматизации процесса.

ПЦР является единственным средством для диагностики анаплазмоза при носительстве в отсутствии клинических симптомов (Kocan KM, de la Fuente J, Blouin EF, Coetzee JF, Ewing SA. The natural history of Anaplasma marginale. Vet Parasitol. 2010 Feb 10; 167(2-4): 95-107. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19811876, 2015 г.).

Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения животных (OIE, the World Organisation for Animal Health), изложенным в «Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных 2015 г.» (Сайт Интернет: http://www.oie.int/en/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/, 2015 г.), ПЦР-диагностику A. marginale следует применять перед каждым перемещением животного на новое место и для подтверждения диагноза.

На сегодняшний день описаны разные методы ПЦР для детекции A. marginale, однако ни один из них не лишен недостатков, которые связаны с выбором мишени для ПЦР и способа получения и анализа результатов. Сложность выбора олигодезоксирибонуклеотидов для ПЦР состоит в том, что они должны обладать строгой видовой специфичностью. В случае использования в полимеразной цепной реакции праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, не имеющих видовой специфичности, возможны ложноотрицательные результаты исследования. В случае же, если выбранные олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд имеют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты исследования. Правильный выбор сочетания пары праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет осуществить амплификацию и детекцию методом ПЦР в режиме «реального времени» строго целевого фрагмента ДНК.

Известен набор праймеров для амплификации фрагмента гена msp4 A. marginale: MSP45: 5′-GGGAGCTCCTATGAATTACAGAGAATTGTTTAC-3′ и MSP43: 5′-CCGGATCCTTAGCTGAACAGGAATCTTGC-3′ (De la Fuente J, Van Den Bussche RA, Kocan KM. Molecular phylogeny and biogeography of North American isolates of Anaplasma marginale (Rickettsiaceae: Ehrlichieae). Vet Parasitol. 2001 97, 65-76. Сайт Интернет:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11337128, 2015 г.). Недостатком этого метода является отсутствие видоспецифичности у праймеров - они имеют 100%-ную идентичность с соответствующими участками гена msp4 другого вида анаплазмы - A. ovis, и поэтому не могут быть использованы для дифференцирования этих двух патогенов.

Известен набор из праймеров на ген msp4: AmarMSP4.520f 5′-TGACGTGCTGCACACAGATTT-3′ и AmarMSP4.586r 5′-AACAAAGCTTGCGCCTATCC-3′ и ДНК-зонда 5′-6FAM-CCTGTGTCCCCGTATGTATGTGCCG-3′ (Fyumagwa RD, Simmler P, Meli ML, Hoare R, Hofmann-Lehmann R, Lutz H. Prevalence of Anaplasma marginale in different tick species from Ngorongoro Crater, Tanzania. Vet Parasitol. 2009 Apr 6; 161(l-2): 154-7. doi: 10.1016/j.vetpar.2008.12.018. Epub 2009 Jan 14. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19201099, 2015 г.). Недостатком данного метода является высокая степень идентичности (90-95%) последовательностей праймеров и зонда с соответствующими участками гена msp4 двух других близкородственных видов анаплазм - A. ovis и A. centrale, что уменьшает надежность правильной идентификации патогена.

Ближайшим аналогом является набор из двух праймеров на ген msp4 AmargMSP4Fw: 5-CTGAAGGGGGAGTAATGGG-3 и AmargMSP4Rev: 5-GGTAATAGCTGCCAGAGATTCC-3 (прототип - Torina A, Agnone A, Blanda V, Alongi A, D′Agostino R, Caracappa S, Marino AM, Di Marco V, de la Fuente J. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale. Ticks Tick Borne Dis. 2012 Dec; 3(5-6): 283-7. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23182548, 2015 г.), который позволяет дифференциально выявлять A. marginale. Недостатком метода является необходимость анализировать результаты ПЦР методом электрофореза, что увеличивает время проведения анализа.

Задачей изобретения является создание набора синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции фрагмента гена msp4 A. marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени», который может быть использован для дифференциального выявления риккетсий A. marginale в крови крупного рогатого скота и других жвачных животных, а также в кровососущих членистоногих.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в повышении надежности детекции A. marginale, упрощении анализа и сокращении времени его проведения до 1.5 часов (не включая подготовку пробы), а также уменьшении стоимости анализа.

Технический результат достигается тем, что набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp4 риккетсии Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» содержит два олигодезоксирибонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, которые имеют следующую структуру:

Прямой праймер: F: 5-CATGAGTCACGAAGTGGCT-3′

Обратный праймер: R: 5′-GGCACACTCACATCAATC-3′

Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд:

Probe: 5′-Cy5-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-BHQ2.

Преимуществом использования в ПЦР флуоресцентно-меченого ДНК-зонда Probe: 5′-Cy5-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-BHQ2 является отсутствие необходимости проведения дополнительной стадии анализа - электрофоретической детекции результатов ПЦР, поскольку регистрация накопления ДНК происходит непосредственно в ходе самой реакции, что приводит к значительному сокращению времени исследования (до 1.5 часов, не включая подготовку пробы), а использование флуоресцентно-меченого зонда повышает надежность исследования.

В рамках патентуемого технического решения разработанные олигодезоксирибонуклеотиды к гену msp4 являются видоспецифичными для A. marginale и позволяют достоверно выявлять методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» наличие гена msp4 и, следовательно, риккетсии A. marginale в крови крупного рогатого скота и других жвачных животных, а также у кровососущих членистоногих.

Характеристика набора олигодезоксирибонуклеотидов и участка амплифицируемой ДНК

Предлагаемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры фланкируют участок гена msp4 A. marginale длиной 177 пар нуклеотидов. Использование в наборе с патентуемыми олигодезоксирибонуклеотидными праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продукта амплификации в режиме «реального времени».

Перечень графических материалов

На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность фрагмента гена msp4 A. marginale и отмечены участки гена, к которым подобраны патентуемые олигодезоксирибонуклеотиды.

На фиг. 2 представлен результат электрофоретического разделения фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР с использованием патентуемых олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и ДНК, выделенной из крови неинфицированной (К-) и инфицированных (1-6) коров; маркер длин ДНК 100-1000 п. н.

На фиг. 3 представлены графики накопления продукта ПЦР в режиме «реального времени» с использованием патентуемых олигодезоксирибонуклеотидов и ДНК, выделенной из крови неинфицированной (К-) и инфицированных коров (1-6). По оси абсцисс отображено количество циклов ПЦР, по оси ординат - интенсивность флуоресценции (F).

Методика конструирования набора олигодезоксирибонуклеотидов

Выбор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции фрагмента гена msp4 A. marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» осуществляли на основе последовательностей полноразмерного гена msp4 разных изолятов A. marginale. Ген msp4 кодирует иммунодоминантный белок наружной мембраны A. marginale. Для подбора праймеров были использованы имеющиеся в базе данных Генбанк (Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, 2015 г.) последовательности гена msp4 разных изолятов A. marginale, а также близкородственных видов анаплазм - A. centrale, A. ovis и A. phagocytophilum. Выявление характерных для A. marginale консервативных участков гена msp4 для подбора праймеров проводили с помощью сервера ClustalW2 (Сайт Интернет: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/, 2015 г.). Видоспецифичность праймеров была проверена с использованием алгоритма BLASTN (Сайт Интернет: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, 2015 г.). Выбор олигодезоксирибонуклеотидов основывался на следующих критериях: длина 18-25 пар нуклеотидов; температура отжига олигодезоксирибонуклеотидных праймеров сходная и находится в диапазоне 55-65°C; температура отжига ДНК-зонда выше температур отжига олигодезоксирибонуклеотидных праймеров; отсутствие в последовательности олигодезоксирибонуклеотида вторичных структур с температурой плавления выше его температуры отжига; отсутствие само- и взаимокомплементарности между 3′-концами выбранных олигонуклеотидов; отсутствие идентичности с участками геномов других видов анаплазм. В результате сравнительного анализа структуры гена msp4 разных изолятов A. marginale и близкородственных видов были разработаны и синтезированы олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд для проведения полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» (табл. 1, фиг. 1), которые позволяют проводить дифференциальное выявление A. marginale.

Экстракция ДНК

Экстракцию ДНК из цельной крови коров проводили с использованием набора реагентов с помощью набора Sorb-M (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя.

Проведение полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени». Реакцию амплификации проводили в 10 мкл смеси для ПЦР, содержащей 1×буфер для амплификации, 3 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов, 1 активную единицу HS Taq ДНК-полимеразы (все реактивы производства ЗАО «Евроген», Россия) ,2 мкл ДНК, 0.2 мкМ прямого и 0.2 мкМ обратного олигодезоксирибонуклеотидного праймера, 0.1 мкМ флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.

Отработка условий амплификации проводилась при использовании ДНК коров, инфицированных A. marginale. Амплификация проводилась по следующей схеме: денатурация при 95°C - 3 мин (1 цикл); затем 45 циклов: денатурация при 95°C -15 с, отжиг при 58°C - 15 с, синтез при 72°C - 15 с; синтез при 72°C - 2 мин (1 цикл). Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналу красителя Су5 на приборе «LightCycler 98» (Roche, Швейцария). Результаты ПЦР оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле по наличию продукта реакции длиной 177 пар нуклеотидов (фиг. 2) и по экспоненциальному росту флюоресценции (фиг. 3).

Апробация патентуемых олигодезоксирибонуклеотидов

Апробацию патентуемых олигодезоксирибонуклеотидов проводили на образцах ДНК, выделенной из цельной крови коров, неинфицированных и инфицированных A. marginale. Экспериментально было показано, что выбранные олигодезоксирибонуклеотиды обеспечивают синтез и детекцию целевого фрагмента гена msp4 A. marginale длиной 177 пар нуклеотидов (фиг. 2, 3). Для подтверждения амплификации фрагмента целевого гена полученный фрагмент ДНК был лигирован в вектор pGEM-T Easy (Promega, США) и клонирован в клетках Escherichia coli DH5α. Выделенные плазмиды были секвенированы по методу Сэнгера. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей с помощью программы BLAST (Сайт Интернет: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, 2015 г.) показал, что они имеют 99-100% идентичности с фрагментом гена msp4 разных изолятов A. marginale.

Для испытания аналитической специфичности праймеров и зонда использовались образцы ДНК овец, зараженных близкородственным видом риккетсий - A. ovis, а также образцы ДНК коров, содержащие ДНК бактерий, не относящихся к роду Anaplasma - Sanguibacter keddieii, Propionibacterium acnes, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia. Анализ результатов ПЦР в режиме «реального времени» показал отсутствие роста флуоресценции, характерного для A. marginale, и отсутствие каких-либо продуктов ПЦР при анализе результатов методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Это свидетельствует об аналитической специфичности ПЦР с патентуемыми олиго дезоксирибонуклеотидами.

Таким образом, заявляемый набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов обеспечивает амплификацию и детекцию фрагмента гена msp4 риккетсии A. marginale методом ПЦР в режиме «реального времени».

Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp4 риккетсии Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени», содержащий два олигодезоксирибонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, которые имеют следующую структуру:
Прямой праймер: F: 5-CATGAGTCACGAAGTGGCT-3′
Обратный праймер: R: 5′-GGCACACTCACATCAATC-3′
Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд:
Probe: 5′-Cy5-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-BHQ2.



 

Похожие патенты:

Изобретение направлено на композиции и способы выделения, обнаружения, амплификации и количественной оценки патоген-специфичных нуклеиновых кислот в биологическом образце.

Группа изобретений относится к биохимии. Описан набор реагентов для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae в образце, включающий по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции и, при необходимости, олигонуклеотидный зонд, термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты, отличающийся тем, что первый олигонуклеотидный праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, второй олигонуклеотидный праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

Изобретение относится к биохимии. Описан набор для выявления ДНК провируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV (bovine immunodeficiency virus)), содержащий пару специфичных праймеров и ДНК-зонд, методом ПЦР в режиме реального времени.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности аллеля мутанта bm3 и аллеля СОМТ дикого типа с использованием ткани растения кукурузы.

Настоящее изобретение относится к способам выявления лиц с промежуточной возрастной макулодистрофией (ВМД), характеризующихся повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии, с помощью полигенного показателя, рассчитываемого на основании результатов полногеномного исследования генных ассоциаций, использующего тысячи однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП).
Изобретение относится к биохимии, в частности к способу диагностики существования или наличия высокого риска гипертиреоза у животного семейства кошачьих и набору для его осуществления.

Группа изобретений относится к области геномики. Предложены способ выявления вариации числа копий в образце генома и система, используемая для осуществления способа.

Изобретение относится к области медицинской и молекулярной генетики, а именно к генетическим конструкциям. Способ определения уровня экспрессии генов Trim5a-ch и Trim5a-hum в образцах клеточной суспензии, предварительно обработанных генотерапевтическим лекарственным средством, в состав которого входит химерный ген Trim5a, предусматривает: выделение нуклеиновых кислот из образцов клеточной суспензии; обработку выделенных нуклеиновых кислот с помощью ДНКазы с получением тотальной клеточной РНК без примеси ДНК; проведение полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией, с использованием полученной тотальной клеточной РНК с детекцией продуктов в режиме реального времени с получением кривых накопления флуоресцентного сигнала; расчет нормализованных концентраций мРНК TRIM5a-ch и мРНК TRIM5a-hum в исследуемых образцах, характеризующих уровень экспрессии, на основании значений копий кДНК TRIM5a-ch и кДНК TRIM5a-hum и кДНК гена бета-глюкоронидазы в пробе ПЦР, полученных из кривых накопления флуоресцентного сигнала, причем расчет проводят по формуле: нормализованная концентрация мРНК TRIM5a = Число копий кДНК TRIM5a/число копий кДНК gus, где gus, - это "house-keeping" ген бета-глюкоронидазы человека.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. В частности, изобретение связано с фосфодиэстеразой-9А (PDE9A) для применения ее в качестве маркера злокачественной опухоли предстательной железы, а также для применения PDE9A в качестве маркера для диагностики, детекции, мониторинга или прогнозирования злокачественной опухоли предстательной железы или прогрессии злокачественной опухоли предстательной железы, и иммуноанализом.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для оценки индивидуального генетического риска атеросклероза. Осуществляют взятие крови, выделение ДНК и генотипирование митохондриальной ДНК.

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано при проведении медико-биологических исследований. Предложен способ подготовки суспензии лимфоцитов человека в этанол-уксусном фиксаторе для выделения ДНК, включающий центрифугирование указанной суспензии и удаление надосадочной жидкости. Затем полученный препарат высушивают в течение 5 мин при температуре 55°С, после чего добавляют физиологический раствор. Способ обеспечивает сохранение качественных и количественных характеристик образца, приемлемых для дальнейшего проведения полимеразной цепной реакции. 3 ил., 1 пр.

Изобретение касается способа диагностики волчанки у человека. Представленное изобретение включает определение наличия вариации по меньшей мере в одном локусе риска SLE, причем указанная вариация по меньшей мере в одном локусе представляет собой аллель риска однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Указанная вариация по меньшей мере в одном локусе содержит Т-аллель rs849142 JAZF1. Определение присутствия указанной вариации по меньшей мере в одном локусе указывает, что субъект страдает волчанкой. Изобретение может быть использовано для точной диагностики такого аутоиммунного заболевания, как волчанка. 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 10 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан диагностический способ in vitro диагностики рака эндометрия. Способ предусматривает определение уровня биомаркера P4HB в образце от пациента. Было обнаружено, что дифференциальная экспрессия этого биомаркера в опухолевой ткани первичного рака эндометрия коррелирует с его уровнем экспрессии в образцах маточной жидкости по сравнению с контрольными значениями. Таким образом, этот биомаркер является эффективным, поскольку было обнаружено, что он дифференциально экспрессируется в нескольких различных типах образцов от пораженных особей. Изобретение может быть использовано в медицине. 9 н. и 45 з.п. ф-лы, 20 ил., 12 табл., 25 пр.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 серогруппы по ингибирующей активности. Способ включает стадии: а) смешивают в одной емкости объемом 100 мл стерильную водопроводную воду и клетки двух штаммов холерных вибрионов токсигенных (ctx+tcA+) и атоксигенных (ctx-tcA-) в соотношении 1:1 до конечной концентрации 104 м.к. на мл, пробу инкубируют при 25°С 24, 72 часа или более; б) вносят 0,5 мл жидкости после инкубации в микропробирки объемом 1,5 мл и выделяют ДНК; в) проводят амплификацию ДНК со специфическими праймерами к INDEL-гену cheA, имеющими следующие последовательности , г) проводят анализ продуктов амплификации с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле; д) дифференцируют полученный результат по наличию специфических аллелей для каждого из штаммов - атоксигенных, имеющих размер 193 п.о., и токсигенных -169 п.о., наглядность присутствия которых дает возможность делать вывод о наличии ингибирующей активности или ее отсутствии у исследуемых штаммов. Изобретение позволяет быстро определять способность выживать в водных объектах штаммов холерных вибрионов и может быть использовано для мониторинга вод водоемов на наличие токсигенных штаммов холерных вибрионов и предотвращения холеры. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 3 пр.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии и может быть использована в молекулярно-генетической диагностике онкологических заболеваний. Способ предусматривает проведение биоинформационного анализа предшествующих публикаций о генах-онкомаркерах колоректального рака и отбор генов, метилирование сайтов PuCGPy регуляторных областей которых происходит с высокой частотой в ДНК клеток колоректального рака, с учетом возможности выявления метилирования гена на ранних стадиях заболевания и формирование панели из следующих генов-онкомаркеров колоректального рака: CNRIP1, ELMO1, ESR1, FBN1, RXRg, RYR2, SEPT9b, SOCS3 и UCHL1. Затем проводят гидролиз высокоочищенной геномной ДНК из исследуемого биоматериала метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI, лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера с последующей амплификацией в реальном времени с использованием геномных праймеров и зондов, комплементарных последовательностям регуляторных областей генов CNRIP1, ELMO1, ESR1, FBN1, RXRg, RYR2, SEPT9b, SOCS3 и UCHL1 в исследуемой ДНК, и гибридных праймеров, 3'-концы которых комплементарны 5'-концам ДНК в заданных местах гидролиза GlaI, а оставшаяся часть комплементарна адаптерной последовательности. Заключение о наличии последовательности Pu(5mC)GPy (где 5mC - 5-метилцитозин, Pu - A или G, Py - T или C) в регуляторных областях генов CNRIP1, ELMO1, ESR1, FBN1, RXRg, RYR2, SEPT9b, SOCS3 и UCHL1 делают по появлению флуоресцентного сигнала. В качестве адаптерной последовательности используют универсальный олигонуклеотидный адаптер 5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5'. Использование изобретений позволяет упростить и повысить точность определения метилирования сайтов PuCGPy. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины и касается способа, тест-системы диагностики диабетической нефропатии. Сущность способа заключается в том, что в образце от субъекта определяют биомаркер, который представляет собой подобный антигену CD5. Использование способа позволяет диагностировать диабетическую нефропатию. 5 н. и 28 з.п. ф-лы, 13 табл., 5 ил., 1 пр.

Настоящее изобретение относится к количественному способу определения, обладает ли обследуемый человек нарушенной функцией репарации ошибочно спаренных оснований ДНК. Способ предусматривает получение ядерных экстрактов с нормальной функцией MMR и утраченной функцией MMR в качестве положительного и отрицательного контроля из диагностического образца. Далее осуществляют смешивание каждого ядерного экстракта с субстратом-молекулой ДНК, включающим по меньшей мере одну ошибку спаривания оснований, выполняют анализ репарации ошибочно спаренных оснований. В заключении определяют, способен ли указанный ядерный экстракт образца к репарации указанного субстрата-молекулы ДНК; причем указанный образец включает нормальные незлокачественные конститутивные клетки, например, фибробласты. Изобретение дополнительно относится к набору, включающему необходимые реагенты для применения в указанном способе. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 9 пр.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). У индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России, из периферической венозной крови выделяют ДНК, после чего проводят анализ полиморфизмов генов TNFα, Ltα, TNFR1 и TNFR2. Среди индивидуумов без сопутствующей патологии глаз в случае выявления комбинации -308G TNFα и +1663G TNFR2 либо комбинации +36G TNFR1 и +1663G TNFR2 или при наличии сопутствующей патологии глаз как миопия, катаракта или возрастная макулярная дегенерация сетчатки в случае выявления +36A TNFR1 либо комбинации +36AA TNFR1 и +1663A TNFR2 либо +250G Ltα и +36AA TNFR1 прогнозируют повышенный риск развития ПОУГ. У индивидуумов с сопутствующей патологией глаз при выявлении +250A Ltα и +36G TNFR1 либо -308G TNFα и +36G TNFR1 прогнозируют низкий риск развития ПОУГ. Изобретение обеспечивает раннее выявление больных с ПОУГ, что позволит предупредить прогрессирование заболевания. 6 ил., 2 табл., 7 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ и система для определения нуклеотидной последовательности в заданной области генома плода. Способ включает следующие этапы: конструирование библиотеки для секвенирования из образца геномной ДНК из периферической крови беременной женщины; секвенирование библиотеки для секвенирования с целью получения результата секвенирования. Результат секвенирования плода включает множество полученных при секвенировании данных. Нуклеотидную последовательность в заданной области генома определяют посредством использования скрытой марковской модели на основании результата секвенирования последовательностей плода в сочетании с генетической информацией о родственнике с помощью алгоритма Витерби. Система состоит из аппарата конструирования библиотеки, секвенатора и анализатора. Использование изобретений позволяет произвести генотипирование с высокой точностью. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает приготовление реакционной смеси, содержащей буферный раствор и исследуемый образец ДНК. Добавляют к смеси ДНК-метилтрансферазу с активностью 2 е.а./мкл, модифицирующую цитозин в положении С5, выбранную из группы: Fsp4HI, НаеIII, HspAI, AluI, в зависимости от того, какой сайт необходимо расщепить, смесь инкубируют в течение часа, полученную С5-метилированную ДНК обрабатывают MD-эндонуклеазой ElmI с активностью 2 е.а./мкл или PkrI с активностью 2 е.а./мкл в зависимости от того, в какой позиции необходимо гидролизовать ДНК. С помощью данного способа можно осуществить исчерпывающий сайт-специфический гидролиз ДНК по шести- и восьминуклеотидным последовательностям, не расщепляемым традиционно используемыми эндонуклеазами рестрикции. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр.
Наверх