Способ экспрессной оценки биосовместимости металлов и их сплавов по пилипенко п.н.



Способ экспрессной оценки биосовместимости металлов и их сплавов по пилипенко п.н.
Способ экспрессной оценки биосовместимости металлов и их сплавов по пилипенко п.н.

 


Владельцы патента RU 2595812:

федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (государственный университет)" (RU)

Изобретение относится к медицинской технике, точнее к технике лабораторных исследований, в частности к способам проведения анализа биосовместимости металлических материалов, изделий и имплантатов. А также изделий, полученных при отработке производственных технологий, включая различные способы пассивации металлических поверхностей готовых изделий медицинского назначения. Способ экспрессной оценки биосовместимости металлов и их сплавов по Пилипенко П.Н. состоит из подготовки образца испытуемого материала и тестирующей среды, помещения образца в тестирующую среду, инкубирования при заданной температуре и определения изменения концентрации перекиси водорода в тестирующей среде, что характеризует степень биосовместимости образца. Степень биосовместимости рассчитывают по формуле В=-lg(VΔC/Sτ)-8, где V - объем буферного раствора (л); ΔC - изменение концентрации перекиси водорода в буферном растворе (моль/л); S - площадь поверхности образца (см2); τ - время инкубирования (мин). Предложенный способ позволяет повысить скорость определения биосовместимости исследуемых имплантируемых металлических материалов при одновременном обеспечении доступности его использования в учреждениях практического здравоохранения любого уровня для контроля качества металлических имплантатов, используемых в ортопедической, хирургической, стоматологической и другой медицинской практике. 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к медицинской технике, точнее к технике лабораторных исследований, в частности к способам проведения анализа биосовместимости имплантируемых материалов.

Одним из важнейших критериев отбора имплантируемых материалов является биосовместимость - отсутствие негативного влияния на организм. Например, ортопедические имплантаты в настоящее время изготавливаются чаще всего из металлов, металлических сплавов и керамики. Известно, что после введения в организм имплантата, он и/или его компоненты вступают в контакт как с клетками окружающих тканей, так и со всей внутренней средой организма [1]. Наиболее перспективными способами доклинической оценки биосовместимости имплантируемых материалов считаются исследования их токсичности в опытах in vivo, а также тесты in vitro для оценки неспецифической токсичности материалов медицинского назначения.

Известен способ оценки биосовместимости титановых сплавов медицинского назначения [2], состоящий из изучения их влияния на параметры развития популяций различных штаммов бифидобактерий (Bifidobacterium adolescentis МС-42, В. adolescentis ГО-13, В. bifidum №1, В. longum В379М), такие как: количество жизнеспособных клеток (определяли методом предельных разведений), уровень накопления биомассы (нефелометрически), активности кислотообразования (потенциометрически) и формирование биопленок (визуально). Недостатком этого способа является большой перечень необходимого оборудования, реактивов и препаратов бактерий, а также участие персонала с высокой квалификацией для проведения сложных микробиологических исследований. И главное, получаемые результаты имеют очень отдаленное отношение к изучению биосовместимости металлических сплавов медицинского назначения, т.к. используемые в данном способе клетки-микроорганизмы (бифидобактерий) не являются иммунными клетками и, как правило, не участвуют в иммунных реакциях организма человека на имплантируемый материал.

Известен способ оценки биосовместимости [3], состоящий из определения показателей активности фагоцитирующей популяции клеток (моноцитов и нейтрофилов) крови индивидуума после их инкубирования с порошком исследуемого инородного материала. Биосовместимость организма с инородными материалами определяют по трем показателям бактерицидности, а именно активация сукцинатдегидрогеназы, миелопероксидазы и катионных белков и активности двух ферментов плазматической мембраны (АТФ-аза, 5′-нуклеозидаза). Полученные показатели выражают в виде индекса стимуляции T, который рассчитывают по формуле: T=N0/Nk, где N0 - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции с инородным материалом, Nk - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции без него. После этого рассчитывают среднеарифметическое значение индекса стимуляции каждого отдельного цитохимического показателя по реакции клеточной субстанции на инородный материал. Затем данные показатели суммируют, при этом используют только целую часть числа индекса стимуляции, строят шкалу биосовместимости и по ней судят о степени биосовместимости инородного материала и организма, при этом, чем меньше суммарный индекс стимуляции, тем больше инородный материал биосовместим с организмом.

Недостатком этого способа является использование дорогостоящих реактивов и оборудования, а также длительность и сложность производимых операций, выполнение которых требует квалифицированного персонала, что не позволяет проводить экспрессную оценку степени биосовместимости исследуемого металла или сплава. Другим существенным недостатком данного способа является необходимость использования порошка из исследуемого металлического материала, что не позволяет проводить оценку биосовместимости готового металлического имплантата при оптимизации технологических процессов пассивации его поверхности.

В тоже время известно, что одним из индукторов воспалительных реакций организма, а также сигнальной молекулой хемотаксиса для иммунных клеток является перекись водорода [4-7], которая образуется при контакте водных растворов, содержащих молекулярный кислород, с поверхностью различных металлов [8].

Технической задачей изобретения является создание способа экспрессной оценки степени биосовместимости металлов и их сплавов медицинского назначения.

Технический результат состоит в том, что предложенный способ оценки биосовместимости является экспрессным, простым, дешевым и не требует для его реализации специалистов высокой квалификации.

Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе экспрессной оценки биосовместимости металлов и их сплавов, состоящем из подготовки образца испытуемого материала и тестирующей среды, измерения в ней концентрации перекиси водорода C0, помещения образца в тестирующую среду и инкубирования при заданной температуре, повторного измерения концентрации перекиси водорода C1 в тестирующей среде, параметром тестирующей среды, характеризующим степень биосовместимости, является изменение концентрации перекиси водорода ΔC=C1-C0, в тестирующей среде за время инкубирования в ней образца.

Кроме того, степень биосовместимости рассчитывают по формуле:

B=-lg(V·ΔC/S·τ)-8,

где V - объем буферного раствора (л),

ΔC - изменение концентрации перекиси водорода в буферном растворе (моль/л),

S - площадь поверхности металлического образца (см2),

τ - время инкубирования (мин), что позволяет сравнивать результаты исследований степени биосовместимости металлических образцов и их сплавов разной формы и размера, причем полученные в разное время, по удобной пятибалльной шкале (от 1 до 5), т.е. чем больше значение В, тем выше биосовместимость исследуемого материала.

Кроме того, тестирующей средой является фосфатно-солевой буферный раствор, т.к. данный буферный раствор является одним из наиболее простых по химическому составу физиологических растворов, не сложен в приготовлении и состоит из недорогих реактивов, что позволяет тестировать большие по размеру металлические образцы, причем как при оптимизации технологических процессов пассивации их поверхности, так и непосредственно перед медицинским применением.

Кроме того, изменение концентрации перекиси водорода определяется способом усиленной хемилюминесценции, что позволяет использовать недорогое стандартное оборудование, работа на котором не требует специальной подготовки персонала.

Кроме того, хемилюминесценцию измеряют в системе люминол-пара-йодфенол-пероксидаза хрена, т.к. данная система является одной из наиболее чувствительных к концентрации перекиси водорода в водных растворах и поэтому позволяет количественно, с низкой погрешностью тестировать металлы с высокой биосовместимостью, образующие наномолярные концентрации перекиси водорода в фосфатно-солевом буферном растворе.

Изобретение иллюстрируется графиками (фигуры 1-3), на которых показаны кинетики образования перекиси водорода в буферном растворе при инкубировании в нем одинаковых по площади пластин из различных металлов, где на фиг. 1 приведена данная зависимость для медной пластины (Cu), на фиг. 2 для пластин из железа (Fe), алюминия (Al) и серебра (Ag) и на фиг. 3 для пластины из медицинского титана (Ti) марки ВТ-0. На всех графиках по оси абсцисс отложено время в мин, а по оси ординат концентрация перекиси водорода, причем на фиг. 1 и фиг. 2 в мкМ, а на фиг. 3 в нМ.

Предложенный способ реализуется следующим образом. Подготавливается тестирующая среда (буферный раствор), в которой любым известным способом измеряется концентрация перекиси водорода C0. Далее образец исследуемого материала (металлический имплантат) помещается в тестирующую среду и инкубируется в ней при заданной температуре при перемешивании. После инкубации снова измеряется концентрация перекиси водорода С1 и вычисляется изменение концентрации перекиси водорода ΔС=С10. Степень биосовместимости металлического имплантата вычисляется по формуле:

B=-lg(V·ΔC/S·τ)-8.

Пример конкретного применения

В данном примере способом усиленной хемилюминесценции в системе люминол-пара-йодфенол-пероксидаза хрена измеряли кинетические зависимости образования перекиси водорода в 20 мл фосфатно-солевого буферного раствора с pH=7.3÷7.5, во время инкубирования в нем металлических пластин различных металлов (Cu, Fe, Al, Ag, Ti) при температуре 20÷22°C. Площадь каждой пластины составляла 32 см2. Буферный раствор содержал 0.01 М фосфат ионов, 0.137 М NaCl, 0.0027 М КСl, 7.5 мг/л O2. Инкубирование проводили в чашках Петри, при постоянном перемешивании на шейкере. Для определения концентрации перекиси водорода регистрировали интегральную интенсивность хемилюминесценции раствора, получаемого при смешивании 100 мкл «счетного раствора» и 1 мл буферного раствора. Реакцию проводили в стеклянной пробирке объемом 5 мл, закрепленной в крышке люменометра. Исследуемый раствор вводили с помощью медицинского шприца (объемом 2 мл) через иглу, вмонтированную в крышку прибора. Предварительно определяли концентрацию перекиси водорода в исходном буферном растворе. Интенсивность люминесценции определяли с помощью люменометра «Lum-5773» и программы PowerGraph. «Счетный раствор» состоял из 0.5 М трис-HCl (pH=8.5), 0.65 мМ пара-йодфенола, 0.13 мМ люминола, 200 ед./мл пероксидазы хрена. Калибровку проводили методом добавок, используя растворы перекиси водорода с известной концентрацией, которые готовили из 30% раствора H2О2. Его концентрацию контролировали по плотности при Т=20°C.

Далее по формуле: В=-lg(V·ΔC/S·τ)-8 рассчитывали степень биосовместимости каждого металла. В расчетах использовали значения концентрации перекиси водорода, образующейся через 15 минут контакта металлических пластин (площадью 32 см2) с 20 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Концентрация перекиси водорода в исходном буферном растворе составляла величину ~1 нМ. Результаты расчетов приведены в таблице.

Полученные значения степени биосовместимости B хорошо согласуются с известными сведениями о биосовместимости рассмотренных металлов. Так титан марки ВТ-0 является одним из основных материалов для создания разного рода имплантатов, а медь, наоборот, используют при моделировании хронического воспаления у лабораторных животных, для чего медные пластины обычно зашивают животным под кожу.

Источники информации

1. Заявка США №20130266629, «MEDICAL DEVICE HAVING А SURFACE COMPRISING ANTIMICROBIAL METAL», 2013.

2. Вегера И. и др. «Биосовместимость титановых сплавов медицинского назначения», «Наука и инновации» №2 (72), 2009.

3. Патент РФ №2402773, «Способ определения биосовместимости инородного материала с организмом», 2010.

4. Klyubin, I.V., Kirpichnikova, К.М., Gamaley, I.A. «Hydrogen peroxide-induced chemotaxis of mouse peritoneal neutrophils)). European Journal of Cell Biology, 70(4), 347-351, 1996.

5. Hattori H., Subramanian K.K., Sakai J., Luo H.R., «Reactive oxygen species as signaling molecules in neutrophil chemotaxis» Communicative & Integrative Biology, 2010 May, 3(3) 278-281, 2010.

6. Niethammer P., Grabher C., Look A.T., Mitchison T.J., «A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish» Nature, 459, 996-999, 2009.

7. Enyedi В., Niethammer P., «H2O2: a chemoattractant?» Methods Enzymol, 528, 237-255, 2013.

8. Пилипенко П.Н. «Образование перекиси водорода при контакте воды с поверхностью металлов», Труды XX Международной конференции и дискуссионного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 05-15 июня 2012 года, стр. 260-261, 2012.

1. Способ экспрессной оценки биосовместимости металлов и их сплавов, состоящий из подготовки образца испытуемого материала и тестирующей среды, измерения в ней концентрации перекиси водорода C0, помещения образца в тестирующую среду и инкубирования при заданной температуре, повторного измерения концентрации перекиси водорода C1 в тестирующей среде и вычисления изменения концентрации перекиси водорода ΔC=C1-C0, характеризующего степень биосовместимости образца испытуемого материала.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что степень биосовместимости рассчитывают по формуле В=-lg(VΔC/Sτ)-8, где V - объем буферного раствора (л); ΔC - изменение концентрации перекиси водорода в тестирующей среде (моль/л); S - площадь поверхности образца (см2); τ - время инкубирования (мин).

3. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что тестирующей средой является фосфатно-солевой буферный раствор.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию перекиси водорода определяют способом усиленной хемилюминесценции.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что хемилюминесценцию измеряют в системе люминол-пара-йодфенол-пероксидаза хрена.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии и описывает спектрофотометрический способ определения общего белка в биологических жидкостях. Способ включает смешивание образца биологической жидкости с раствором реагента, содержащим следующие компоненты: бромпирогаллоловый красный, молибдат натрия оксалат натрия, янтарную кислоту и воду.

Группа изобретений относится к молекулярной биологии, биофизике, биохимии и биотехнологии и касается способа анализа взаимодействий между молекулами, флуоресцирующими в ультрафиолетовой (УФ) области спектра, включая белки, пептиды, гликопротеины, протеогликаны и другие соединения, последовательность которых содержит один или более аминокислотных остатков триптофана (Trp), и биологическими молекулами, иммобилизованными в ячейках биологического микрочипа (биочипа), при котором анализ взаимодействий производится на основе измерения интенсивности УФ-флуоресценции аминокислотных остатков триптофана.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для количественного определения карнозина в тканях и физиологических жидкостях.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии. Сущность способа состоит в том, что проводят количественное определение в ядрах сперматозоидов тиоловых групп.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации.

Изобретение относится к области нанотехнологий и молекулярной биологии. Предложен способ детекции проникновения углеродных нанотрубок (УНТ) в биологическую ткань, геном клеток которой содержит промотор гена теплового шока, сшитый с кодирующей областью дрожжевого транскрипционного фактора Gal4, и генетическую репортерную конструкцию UAS-GFP.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для прогнозирования течения энтеральной недостаточности при остром перитоните в эксперименте.

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, отличающийся тем, что обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 15% раствором ПВП-12600 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка : ПВП (1 : 6), инкубируют 10 и 20 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение спектрофотометрически при длине волны 450 нм в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при отсутствии разницы констатируют нормальную резистентность к окислению ЛНП в сыворотке крови человека.

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ определения литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) путем обработки сыворотки крови 20% раствором поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000) при объемном соотношении сыворотка: ПВП (1:0,84), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, агрегаты ммЛНП осаждают центрифугированием, декантируют, осадок ммЛНП растворяют в буфере без ПВП, добавляют аутологичные отмытые стандартизованные эритроциты человека, инкубируют в течение 48 часов при комнатной температуре, измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 620 нм, по калибровочному графику определяют степень лизиса и при лизисе более 10% констатируют повышенную литическую активность ммЛНП.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для неинвазивного определения сахара в крови. Для этого осуществляют подготовку рабочего прибора для определения сахара в крови, в котором используют пробу и реагент, при этом в качестве пробы применяют дозу слюны пациента, а в качестве реагента используют первичный конгломерат монореактива Глюкоза-Ново, где глюкозооксидаза дополнительно содержит мутаротазу.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики и лечения мужского бесплодия у инфертильных пациентов, а также в программах экстракорпорального оплодотворения за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина. Способ определения аномалии упаковки хроматина сперматозоидов человека при мужской инфертильности, раскрытый в изобретении, подразумевает определение количества ДНК в нерастворимом и растворимом хроматине и вычисление их процентного соотношения согласно формуле: , пограничное значение патологии нерастворимого хроматина(НРХ)% - 76,0±3,0, растворимого хроматина - 24,0±3,0. Технический результат, достигаемый при реализации разработанного изобретения, состоит в повышении точности определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. 1 табл.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ определения обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой, отличающийся тем, что проводят определение уреазной активности следующим образом: в одну из лунок микропланшета вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером, в две другие вносят водные растворы мочевины с фосфатным буфером, содержащие уреазу с известной концентрацией 5 и 10 Ед/л соответственно, а в остальные лунки вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером и образцами ротовой жидкости, затем во все лунки вносят фенол/нитропруссидный реагент и гипохлорит, после чего измеряют оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 546 нм и рассчитывают концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Ед/л, при значении уреазной активности выше 15,85±2,11 Ед/л регистрируют обсемененность полости рта уреазопозитивной микробиотой. Осуществление изобретения позволяет выявить необходимость противомикробной терапии для профилактики образования твердых зубных отложений и воспалительных заболеваний пародонта. 2 пр.

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа количественного определения группы стигминов в субстанциях. Сущность способа заключается в том, что в исследуемую пробу прибавляют 20-30 мл очищенной воды для аминостигмина, ривастигмина, пиридостигмина бромида или спирта этилового 95% для неостигмина метилсульфата и физостигмина салицилата. Далее смесь выдерживают при комнатной температуре и прибавляют тот же растворитель до метки с дальнейшим прибавлением к аликвотной части приготовленного раствора спиртового раствора КОН, нагреваают в течение 10 минут, охлаждают и обрабатывают щелочным раствором диазореактива 2,5 мл 0,1 М раствора NH4OH и фотоэлектроколориметрируют окрашенные растворы, раствор сравнения - раствор диазотированного n-анизидина и калия гидроксида. Использование способа позволяет с высокой точностью определять количественное содержание стигминов в субстанциях. 7 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для экспресс-анализа количества сахара в крови. Гексокиназный способ неинвазивного определения сахара в крови включает в подготовку прибора для определения сахара в крови, в котором используют пробу и реагент, помещение их в кювету для перемешивания с получением раствора, содержащего конгломерат реактива с сахаром в слюне, у которого повышается спектральная чувствительность и достигает порога на двух значениях 190 нм и 340 нм, установку кюветы в рабочий прибор, включение источника светового излучения, а также фильтра-селектора, направляемых поочередно на кварцевую кювету с упомянутым раствором, осуществление контроля оптической плотности многосекционным фотоприемником и определение значения сахара в крови посредством обработки процессором данных об оптической плотности. В качестве пробы применяют дозу слюны пациента, а в качестве реагента употребляют первичный конгломерат монореактива Глюкоза-УФ-Ново, где гексокиназа дополнительно содержит диафоразу. В качестве источника светового излучения используют лазерный диод с диапазоном длин волн 170-360 нм, а фильтр-селектор формирует пучки света с длинами волн 190 нм и 340 нм. Способ обеспечивает неинвазивное определение сахара в крови, а также позволяет упростить и повысить надежность определения сахара. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.
Наверх