Способ получения аналитической тест-системы для мультиплексной индентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов



Способ получения аналитической тест-системы для мультиплексной индентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов
Способ получения аналитической тест-системы для мультиплексной индентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов
Способ получения аналитической тест-системы для мультиплексной индентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов
Способ получения аналитической тест-системы для мультиплексной индентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов
Способ получения аналитической тест-системы для мультиплексной индентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов
Способ получения аналитической тест-системы для мультиплексной индентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов
Способ получения аналитической тест-системы для мультиплексной индентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов

Владельцы патента RU 2595835:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "ИБМХ" РАМН) (RU)

Изобретение относится к области биохимии и касается способа получения аналитической тест-системы (MRM-теста) для мультиплексной идентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, включающего выявление уникальных для белка протеотипических маркерных пептидных последовательностей; отбор по меньшей мере двух маркерных протеотипических пептидных последовательностей белка; предсказание фрагментов пептидов; предсказание MRM-теста в виде перечня маркерных пептидов, их фрагментов и наилучших параметров детекции; синтез маркерных пептидов; определение профиля переходов синтетических маркерных пептидов; оптимизацию MRM-теста в соответствии с полученными профилями; очистку пептидов; подготовку биологического образца; идентификацию белка в биологическом образце с заколом синтетических пептидов; определение значений времени удержания маркерных пептидов с внесением установленных значений в MRM-тесты; проведение мультиплексных калибровочных измерений; количественное измерение содержания маркерных пептидов в биологическом образце; и суждение о содержании интересующих белков в биологическом образце. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности и снижение временных затрат на осуществление определения протеотипических пептидов и, соответственно, целевых интересующих белков. 3 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 7 пр.

 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области биохимии и, более конкретно, протеомики. В частности, изобретение относится к способу получения аналитической тест-системы для мультиплексной идентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов.

Описание предшествующего уровня техники настоящего изобретения

Основной задачей протеомики - сравнительно молодого направления современных биохимических исследований - является проведение инвентаризации белков, которые экспрессируются в клетке, что подразумевает их максимально точное качественное и количественное определение.

Наиболее современным подходом к преодолению недостаточной специфичности и производительности анализов белков, основанных на применении антител и их аналогов, является использование уникальных возможностей масс-спектрометрической технологии мониторинга множественных (выбранных) реакций (Multiple (Selected) Reaction Monitoring, MRM, SRM). Этот метод заключается в мониторинге фрагментации пептидных ионов в гидролизованной пробе биологического происхождения [Anderson L., Hunter C.L.. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 2006; 5(4):573-588]. По методу MRM измерения проводятся на масс-спектрометре с детектором типа тройного квадруполя, обладающем высокими показателями чувствительности и превосходящем конкурентные технологии параметрами по диапазону измеряемых концентраций. Метод MRM основан на регистрации заряженных молекул, образующихся в результате ионизации и фрагментации конкретных пептидных молекул, происходящих из интересующего белка и характеризующих исключительно его. Иными словами, отдельные пептиды служат «прообразом» целого белка после его искусственного гидролиза. Такие пептиды называются протеотипическими. Для целей настоящего изобретения термины «протеотипический», «маркерный» или их сочетание взаимозаменяемы.

В отличие от традиционных иммунохимических методов регистрации белков при использовании этого подхода принципиально отсутствует возможность перекрестных реакций с другими белками, поскольку биоинформационный выбор протеотипического пептида основан, в первую очередь, на уникальности последовательности и масс-спектрометрических параметров теста [Picotti P., Aebersold R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 2012; 9(6):555-566].

Из уровня техники известно достаточное количество работ на эту тему, однако наиболее близким к настоящему изобретению аналогичным решением авторам представляется изобретение согласно международной патентной публикации WO 2009/141141, в которой раскрыт способ идентификации и количественного определения белков и пептидов с помощью масс-спектрометрии с использованием технологии мониторинга множественных реакций.

Более конкретно, указанный прототип относится к способу формирования MRM-теста для детекции и/или количественного определения одного или нескольких пептидов и/или белков, предусмативающему следующие стадии:

(1) интересующий белок/пептид, группу интересующих белков/пептидов, субпротеом или целый протеом необязательно расщепляют с последующей необязательной очисткой/разделением/обогащением с получением смеси пептидов, из которой методом масс-спектрометрии по меньшей мере один пептид по существу уникально ассоциируется с интересующим белком или целевым белком из указанной группы интересующих белков или из указанного целого протеома, причем он ассоциируется по дифференциальному количественному поведению в различных экспериментальных условиях;

(2) этот по меньшей мере один пептид синтезируется и/или генерируется по существу без последующей очистки;

(3) этот по меньшей мере один неочищенный пептид анализируется методом необязательно сопряженного с жидкостной хроматографией мониторинга множественных реакций;

(4) разработка, валидация и/или оптимизация соответствующего теста по меньшей мере одного пептида с определением MRM-координат интересующего пептида/белка и/или интересующего регулятора.

Однако указанный прототип характеризуется рядом недостатков.

Так, из текущего уровня техники следует, что использование независимого от данных режима всегда предшествует зависимому от данных (информационно-зависимому, таргетному) режиму регистрации масс-спектров. Это отражено в большом количестве публикаций, где перед разработкой MRM-теста предлагается проводить анализ баз данных масс-спектров, полученных в независимом от данных режиме [Picotti P, Aebersold R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 2012; 9(6):555-566; Gallien S, Duriez E, Demeure K, Domon B. Selectivity of LC-MS/MS analysis: implication for proteomics experiments. J Proteomics. 2013; 81:148-158]. Согласно международной патентной публикации WO 2009/141141 также предусматривается стадия масс-спектрометрического анализа биологического материала, предшествующая стадии разработки MRM-теста. В примере, приведенном в патенте, а также в варианте применения изобретения, изложенном авторами патента в публикации [Picotti P, Rinner O, Stallmach R, Dautel F, Farrah T, Domon B, Wenschuh H, Aebersold R. High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes. Nat Methods. 2010 Jan; 7(1):43-6], указывается, что в качестве первичного масс-спектрометрического анализа используется независимая от данных МС/МС фрагментация пептида, тогда как последующая разработка теста выполняется с использованием информационно-зависимого мониторинга ионов.

Как уже было сказано, основной задачей протеомики является точное качественное и количественное определение экспрессируемых в клетке белков, и естественно, что чем выше будет чувствительность метода определения, тем более достоверные и ценные результаты могут быть получены исследователем. Таким образом, в уровне техники сохраняется потребность в способе идентификации и количественного определения белков и пептидов с помощью масс-спектрометрии, который характеризовался бы большей чувствительностью.

Кроме того, осуществление способа согласно международной патентной публикации WO 2009/141141 весьма затратно по времени и другим ресурсам, и в уровне техники сохраняется потребность в более быстром и дешевом способе идентификации и количественного определения белков и пептидов с помощью масс-спектрометрии.

Раскрытие настоящего изобретения

Принципиальным отличием настоящего изобретения является то, что уже на предварительном этапе также применяется информационно-зависимый мониторинг ионов на детекторе типа тройной квадруполь. Полученные результаты позволяют говорить о том, что «таргетное», прицельное определение содержание пептидов на всех стадиях существенно повышает чувствительность метода. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает повышение чувствительности по отношению к общепринятым методам за счет использования информационно-зависимого режима на первом этапе формирования MRM-теста.

Сокращение временных затрат на получение результата также достигается за счет того, что все измерения выполняются в информационно-зависимом режиме. Поскольку современные приборы ограничены в количестве измеряемых переходов в определенный промежуток времени (до 100-150), то использование информационно-зависимого режима обеспечивает оптимальную по времени загрузку прибора. Сначала, прибор производит измерения всех переходов, относящихся к одному или нескольким пептидам. То есть для каждого пептида измеряются 15-20 переходов, что позволяет в силу технических ограничений получить данные не более чем для 5-10 пептидов за 5-20 минут. Далее, из результатов измерений отбирают наиболее интенсивные переходы (по 3-5 на пептид) и объединяются в один измерительный протокол, который при ограничении, например, 100 переходов может теперь теоретически насчитывать до 100/5=20, а в реальных условиях до 40-50 пептидов. Измерения для этого количества пептидов проводят в увеличенном градиенте 20-40 минут, что позволяет определить значения времени выхода с хроматографической колонки, реально соотносящиеся со значениями в сложном биообразце. Таким образом, согласно настоящему изобретению раскрыто формирование и использование MRM-теста, в ходе осуществления которого между операциями производится перенастройка прибора с изменением количества измеряемых переходов, осуществляемым одновременно с увеличением количества соответствующих этим переходам пептидов.

В соответствии с настоящим изобретением разработан способ, преодолевающий недостатки прототипа за счет проведения измерений в информационно-зависимом режиме на всех стадиях способа, предусматривающих использование масс-спектрометрии.

Итак, авторы настоящего изобретения разработали усовершенствованный, более эффективный способ получения аналитической тест-системы для мультиплексной идентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов. Такой способ предусматривает выполнение ряда стадий:

1) биоинформационное выявление уникальных для белка протеотипических маркерных пептидных последовательностей;

2) отбор по меньшей мере двух маркерных протеотипических пептидных последовательностей белка, наиболее пригодных для исследования методом мониторинга множественных реакций;

3) предсказание фрагментов пептидов;

4) предсказание MRM-теста в виде перечня маркерных пептидов, их фрагментов и наилучших параметров детекции методом мониторинга множественных реакций;

5) синтез одного или нескольких маркерных пептидов;

6) определение профиля переходов одного или нескольких синтетических маркерных пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях ускоренного хроматографического градиента;

7) оптимизация MRM-теста в соответствии с полученными профилями, удаление из набора пептидных фрагментов, характеризующихся наименьшими значениями интенсивности в масс-спектре;

8) очистка пептидов, синтезированных на стадии 5);

9) подготовка биологического образца, предусматривающая удаление мажорных белков;

10) идентификация белка в биологическом образце с вводом синтетических пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях нормального хроматографического градиента на основании профилей, полученных на стадии 6);

11) определение значений времени удержания маркерных пептидов с внесением установленных значений в MRM-тесты;

12) проведение мультиплексных калибровочных измерений в условиях нормального хроматографического градиента в буферном растворе очищенных синтетических пептидов на фоне смеси не имеющих отношения к ним белков и/или пептидов; и

13) количественное измерение содержания маркерных пептидов в биологическом образце в условиях нормального хроматографического градиента с вводом синтетических пептидов;

14) суждение о содержании интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, количественно определенных на стадии 13).

Таким образом, вклад авторов настоящего изобретения в уровень техники определяется, прежде всего, тем, что ими создан способ, предусматривающий проведение измерений в информационно-зависимом режиме на всех стадиях способа, предусматривающих использование масс-спектрометрии, и за счет этого обеспечивающий повышение чувствительности и снижение временных завтрат на осуществление определения протеотипических пептидов и, соответственно, целевых интересующих белков, содержание которых в исходном биологическом образце и определяет содержание содержание протеотипических пептидов.

Примеры осуществления способа согласно настоящему изобретению приведены ниже.

Краткое описание фигур

На фиг.1 проиллюстрирован отбор протеотипических пептидов и их фрагментов для белков O60543 и O95427 при помощи программного обеспечения Skyline.

На фиг.2 приведена хроматограмма целевых пептидов, полученная в изократическом режиме.

На фиг.3 приведен фрагмент таблицы интенсивностей пиков фрагментов пептидов. Затемнением выделены фрагменты, дающие наиболее интенсивный сигнал.

На фиг.4 проиллюстрирован отбор наиболее интенсивных переходов целевых пептидов для создания мультиплексного метода. На графиках по оси абсцисс отложено время выхода с колонки в минутах, а по оси ординат - количество импульсов.

На фиг.5 приведена хроматограмма целевых пептидов, полученная в режиме градиентого элюирования для установления времени удержания.

На фиг.6 приведена калибровочная кривая пептида GVMASSLQELISK.

На фиг.7 приведена калибровочная кривая пептида VTFDLYR.

На фиг.8 приведена калибровочная кривая пептида AESMFTNAVQILEQFK.

На фиг.9 приведена калибровочная кривая пептида EVTLPFLFTPFK.

Примеры реализации настоящего изобретения

Пример 1. Предсказание аминокислотной последовательности протеотипических пептидов

Предсказание производили с помощью свободного программного обеспечения Skyline на основе аминокислотных последовательностей белков O60543 и O95427 из базы данных Uniprot. Отбор двух протеотипических пептидов производили с учетом физико-химических свойств. Для белка O60543 отбирали пептиды GVMASSLQELISK и VTFDLYR, для белка O95427 - AESMFTNAVQILEQFK и EVTLPFLFTPFK. Для каждого пептида составляли список из 6-10 b- и y-ионов с зарядными состояниями +1, +2 и +3, формируемых при распаде прекурсорного пептидного иона. Отбор протеотипических пептидов и их фрагментов проиллюстрирован на фиг.1.

Пример 2. Синтез протеотипических пептидов

Пептиды получали в соответствии с протоколом твердофазного пептидного синтеза на автоматическом пептидном синтезаторе Overture (Protein Technologies, Inc.) с использованием защищенных 9-флуоренилметилоксикарбонилом (Fmoc) по α-аминогруппам производных аминокислот. В качестве твердой фазы использовали смолы с низкой загрузкой (0,35 ммоль/г активных групп) производства Novabiochem с присоединенной первой аминокислотой лизин Fmoc-Lys(Boc)-Wangresin LL или аргинин Fmoc-Arg(Pbf)-Wangresin LL. Для синтеза использовали следующие (α-N-Fmoc-L-) аминокислоты (Novabiochem):

1) аланин (Fmoc-Ala-OH);

2) метионин (Fmoc-Met-OH);

3) аспарагин (Fmoc-Asn(Trt)-OH);

4) фенилаланин (Fmoc-Phe-OH);

5) аспарагиновая кислота (Fmoc-Asp(OtBu)-OH);

6) пролин (Fmoc-Pro-OH);

7) глутамин (Fmoc-Gln(Trt)-OH);

8) серин (Fmoc-Ser(tBu)-OH);

9) глутаминовая кислота (Fmoc-Glu(OtBu)-OH);

10) треонин (Fmoc-Thr(tBu)-OH);

11) глицин (Fmoc-L-Gly-OH)

12) тирозин (Fmoc-Tyr(tBu)-OH);

13) изолейцин (Fmoc-Ile-OH);

14) лейцин (Fmoc-Leu-OH);

15) валин (Fmoc-Val-OH).

Аминокислоты были выбраны со следующими защитными группами боковых функциональных групп с учетом их конечного деблокирования трифторуксусной кислотой: аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E) - трет-бутокси (OtBu'); глутамин (Q), аспарагин (N); аргинин (R) - 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил (Pbf); серин (S), треонин (Т) и тирозин (Y) - трет-бутил (tBu). Для конденсации Fmoc-аминокислот использовали диизопропилкарбодиимид (DIC) в присутствии 1-гидроксибензотриазола (HOBt) и гексафторфосфат (1-циано-2-этокси-2-оксоэтилдезаминоокси)диэтиламиноморфолинокарбения (COMU) в присутствии 2,4,6-триметилпиридина (ТМР). В качестве растворителя в пептидном синтезе использовали N,N-диметилформамид (ос.ч) (DMF) производства «Спектр-хим», Россия.

Пример 3. Определение профиля переходов синтетических маркерных пептидов методом MRM в условиях ускоренного хроматографического градиента

В ходе одного анализа исследовали четыре пептида, разнесенных по экспериментальным аналитическим сегментам времени, где в каждом сегменте анализировали один пептид за короткий интервал времени (не более 180 секунд). Анализ проводили с помощью тройного квадрупольного масс-спектрометра Agilent 6490 TripleQuadrupole LC/MS system в изократическом режиме, позволяющем использовать только одноканальный насос, автоматический инжектор пробы и колонку. Длительность сегмента зависела от задаваемых параметров, таких как скорость забора пробы, скорость инъекции пробы, длительность промывки иглы, мертвый объем капиллярной системы, объем седла, скорость потока изократического насоса. В ходе анализа регистрировали значения интенсивности сигнала, полученного от прибора при регистрации каждого фрагмента. Полученная хроматограмма приведена на фиг.2.

Пример 4. Отбор пептидных фрагментов с оптимальными значениями интенсивности

На основе полученных данных для каждого пептида отбирали по 3-5 фрагментов с наибольшей интенсивностью и составляли один мультиплексный измерительный тест для программирования работы масс-спектрометра типа тройного квадруполя. Отбор проиллюстрирован на фиг.3 и 4.

Пример 5. Определение значений времени удержания маркерных пептидов

Проводили сочетанный анализ всех пептидов в течение одного анализа. Анализ проводили с помощью тройного квадрупольного масс-спектрометра Agilent 6490 TripleQuadrupole LC/MS system, настроенного на регистрацию 3-5 фрагментов для каждого пептида, в режиме градиентного элюирования (в течение 47 минут). Для каждого пептида устанавливали время удержания. Определение значений времени удержания проиллюстрировано на фиг.5.

Пример 6. Проведение мультиплексных калибровочных измерений

Создавали измерительный способ для детектирования и/или количественного измерения четырех указанных пептидов с использованием профиля переходов, полученного на стадии 6), и времени выхода с колонки, установленного на стадии 11). Проведение мультиплексных калибровочных измерений проиллюстрировано на фиг.6.

Пример 7. Измерение концентрации 4 исследуемых пептидов и расчет концентрации содержащих их белков в образце плазмы крови человека и в образце клеток стандартной линии HepG2

Измерительный способ для четырех указанных пептидов применяли для измерения их концентрации в биообразцах плазмы крови и иммортализованных клеток стандартной линии гепатоцеллюлярной карциномы HepG2.

Кровь человека собирали в вакуумированные пробирки с ЭДТА. Для получения плазмы пробирки центрифугировали в течение 15 мин при 2500 g. Образцы плазмы центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость фильтровали через 0,22 мкм ацетатные фильтры (Whatman, США) и хранили при -80°C. Концентрацию общего белка определяли с использованием анализа белка с применением бицинхоновой кислоты Micro BCA (Thermo Scientific, США). Из полученных образцов плазмы удаляли преобладающие 14 белков с использованием колонок MARS (мультиаффинной системы удаления) Hu-14 columns (10×100 мм) (Agilent, США) по протоколу производителя. Собранные фракции, содержащие не связанные с колонкой белки, обессоливали с использованием центрифужных колонок из ацетата целлюлозы 5K MWCO (Agilent, США) и концентрировали до конечного объема 50 мкл (из исходного объема 0,5 мкл плазмы). Концентрацию белка в конечной аликвоте измеряли с использованием анализа белка Micro ВСА, и она составляла 24,9 г/л. Клеточную культуру HepG2 выращивали на среде Игла, модифицированной по Дульбекко, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и гентамицином в концентрации 30 мкг/мл и пенициллином в концентрации 25 мкг/мл (Invitrogen, США). Клеточный осадок, отделенный центрифугированием при 300 g в течение 5 минут, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C. Клетки промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS) при pH 7,4 три раза и лизировали в буфере, содержащем 10 мМ PBS, 5 мМ ЭДТА, 10 мкМ E-64, 50 мМ PMSF, 2% SDS и 1% NP-40. Лизаты обрабатывали ультразвуком с использованием устройства типа Branson и затем осветляли центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин при 4°C. Концентрация общей белковой фракции составляла 15,7 г/л.

Далее осуществляли восстановление и алкилирование SH-групп белков, и исчерпывающее расщепление белков модифицированным свиным трипсином (Promega, США), как описано ранее [Zgoda VG, Moshkovskii SA, Ponomarenko EA, Andreewski TV, Kopylov AT, Tikhonova OV, Melnik SA, Lisitsa AV, Archakov AI. Proteomics of mouse liver microsomes: performance of different protein separation workflows for LC-MS/MS. Proteomics. 2009; 9(16):4102-4105]. Гидролизаты анализировали на масс-спектрометре типа тройного квадруполя с использованием настроек, используемых в примерах выше.

Таблица 1
Концентрация четырех исследуемых пептидов
Идентификатор белка UniProt Последовательность пептида Концентрация в плазме крови человека (моль/л) Концентрация в клетках линии HepG2 (моль/л)
O60543 GVMASSLQELISK 6,4×10-12 2,5×10-8
O60543 VTFDLYR 8,5×10-13 4,6×10-8
O95427 EVTLPFLFTPFK 1,1×10-12 2,3×10-10
O95427 AESMFTNAVQILYQFK 1,0×10-11 5,4×10-9

Для иллюстрации изобретения были использованы по 2 пептида из белков активатора клеточной гибели CIDE-A (инвентарный номер Uniprot O60543) и GPI-этаноламинфосфаттрансферазы-1 (инвентарный номер Uniprot O95427). В настоящей области техники общепринято, что белок в исходном образце и полученные в результате его расщепления пептиды в гидролизате находятся в эквимолярных концентрациях. Следовательно, для определения концентрации белка следует усреднить измеренные концентрации относящихся к нему пептидов. Таким образом, расчетная концентрация активатора клеточной гибели CIDE-A (Uniprot O60543) по таблице 1 составляет в плазме крови 3,6×10-12 моль/л, а в клетках линии HepG2 - 3,6×10-8 моль/л. Для GPI-этаноламинфосфаттрансферазы-1 эти концентрации составляют 5,6×10-12 и 2,8×10-9 моль/л, соответственно.

Несмотря на то что настоящее изобретение проиллюстрировано конкретными примерами его реализации, среднему специалисту в данном уровне техники будет очевидно, что множество признаков раскрытого способа (носители, колонки, системы растворителей, режимы элюции и детекции и т.д.) могут быть изменены, модифицированы, заменены на эквивалентные без выхода за пределы объема настоящего изобретения. Подразумевается, что все подобные изменения, модификации и замены подпадают под объем настоящего изобретения.

1. Способ получения аналитической тест-системы (MRM-теста) для мультиплексной идентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, предусматривающий следующие стадии:
1) выявление уникальных для белка протеотипических маркерных пептидных последовательностей;
2) отбор по меньшей мере двух маркерных протеотипических пептидных последовательностей белка, наиболее пригодных для исследования методом мониторинга множественных реакций;
3) предсказание фрагментов пептидов;
4) предсказание MRM-теста в виде перечня маркерных пептидов, их фрагментов и наилучших параметров детекции методом мониторинга множественных реакций;
5) синтез одного или нескольких маркерных пептидов;
6) определение профиля переходов одного и нескольких синтетических маркерных пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях ускоренного хроматографического градиента;
7) оптимизация MRM-теста в соответствии с полученными профилями, удаление из набора пептидных фрагментов, характеризующихся наименьшими значениями интенсивности в масс-спектре;
8) очистка пептидов, синтезированных на стадии 5);
9) подготовка биологического образца, предусматривающая удаление мажорных белков;
10) идентификация белка в биологическом образце с заколом синтетических пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях нормального хроматографического градиента на основании профилей, полученных на стадии 6);
11) определение значений времени удержания маркерных пептидов с внесением установленных значений в MRM-тесты;
12) проведение мультиплексных калибровочных измерений в условиях нормального хроматографического градиента в буферном растворе очищенных синтетических пептидов на фоне смеси не имеющих к ним отношения белков и/или пептидов;
13) количественное измерение содержания маркерных пептидов в биологическом образце в условиях нормального хроматографического градиента с вводом синтетических пептидов; и
14) суждение о содержании интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, количественно определенных на стадии 13).

2. Способ по п. 1, в котором выявление уникальных для белка протеотипических маркерных пептидных последовательностей и отбор маркерных протеотипических пептидных последовательностей белка, наиболее пригодных для исследования методом мониторинга множественных реакций, производятся с использованием литературных данных, данных репозиториев и/или программного обеспечения.

3. Способ по п. 1, в котором предсказание фрагментов пептидов и создание MRM-тестов в виде перечней маркерных пептидов, их фрагментов и наилучших параметров детекции методом мониторинга множественных реакций производятся с помощью программного обеспечения.

4. Способ по п. 1, в котором проведение мультиплексных калибровочных измерений в условиях нормального хроматографического градиента в буферном растворе очищенных синтетических пептидов производится на фоне матрицы Е. coli или любой другой матрицы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу определения микропримесей мышьяка и сурьмы в лекарственном растительном сырье. Способ заключается в переводе соединений мышьяка и сурьмы в соответствующие гидриды путем восстановления смесью, содержащей 40%-ный раствор иодида калия, 10%-ный раствор аскорбиновой кислоты, 4 M раствор соляной кислоты и цинк металлический.

Группа изобретений относится к области экологии и воздухотехнического оборудования и предназначена для измерения качества воздуха. Для измерения качества воздуха осуществляют отбор проб воздуха с первой частотой выборки, чтобы получить множество проб качества воздуха при использовании первого датчика.

Изобретение относится к судебной медицине, а именно к определению использования гладкоствольного оружия для нанесения огнестрельных повреждений. Предложенный способ включает выделение частиц на преграде, изучение их визуально, помещение выделенных частиц на предметное стекло в 2-3 капли дистиллированной воды, при нагревании до температуры плавления парафина на поверхности воды образуется прозрачная тонкая пленка, а при охлаждении формирующиеся кусочки приобретают первоначальные физико-механические свойства парафина, что свидетельствует об использовании гладкоствольного оружия для нанесения огнестрельных повреждений.

Изобретение относится к области фундаментальной физики и может быть использовано при исследовании теплофизических свойств сверхтекучих квантовых жидкостей. Платина-платинородиевые термопары 1 и 2 погружают в расплав чистого борного ангидрида 5.
Изобретение относится к области океанологии, в частности сейсмологии и гидробиологии, и может быть использовано для экспресс-оценки повышенной геофизической активности в морских акваториях, приводящей к землетрясениям.

Изобретение относится к измерению качества травяного покрова по видовым комплексам трав и травянистых растений на пробах, преимущественно на пойменных лугах, и может быть использовано в экологическом и технологическом мониторинге территорий с травяным покровом.
Группа изобретений относится к области маркирования нефти и нефтепродуктов и может быть использована для мониторинга транспорта нефти и нефтепродуктов, в частности для контроля потоков нефти в нефтепроводах, контроля автомобильного транспорта с углеводородной продукцией, для своевременного обнаружения утечки и хищения продукции, а также для локализации последствий происшествия.

Изобретение относится к экологии, в частности к способам экологического мониторинга окружающей среды, и может быть использовано для экспресс-оценки экологического состояния территории при строительстве пастбищ.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для прогнозирования степени трематоцидной активности растений. Способ включает фитохимический анализ растений.

Изобретение относится к проведению экспресс-анализа воздуха или смесей газов. Портативный анализатор газов с массивом пьезосенсоров включает высокопрочный полимерный корпус с насадкой-нагнетателем и защитной крышкой из фторопласта, на верхней панели корпуса расположена ячейка с массивом из трех пьезосенсоров с чувствительными пленочными покрытиями для определения компонентов воздуха и равновесной газовой фазы над полимерными изделиями, продуктами питания, топливом по совокупности их легколетучих соединений, внутри корпуса расположены миниатюрная схема возбуждения, соединенная с тремя микроконтроллерами, запрограммированными в сумме на 150 ячеек памяти для регистрации и преобразования сигналов пьезосенсоров и передачи их на моно- или полихромный дисплей для отображения аналитического сигнала в виде «визуальных отпечатков» максимумов трех сенсоров и для сохранения информации на съемном носителе памяти, приводящимися в действие автономно от встроенного компактного источника питания, на панели корпуса размещены кнопка включения прибора, кнопка работы нагнетателя и переключатель на отдельные режимы измерения: анализ топлива, полимерных материалов, пищевых продуктов и индикаторы работы пьезосенсоров и моно-/полихромный дисплей для отображения аналитического сигнала.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для раннего прогнозирования качества корнеобразования срезанных зеленых черенков плодово-ягодных культур. Для этого измеряют и определяют отношение модулей полного электрического сопротивления их растительных тканей, измеренных на двух фиксированных частотах, и по его значению выявляют и отбраковывают черенки, потенциально непригодные для укоренения. Изобретение обеспечивает способ диагностики срезанных зеленых черенков для прогнозирования их укореняемости. 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к области неразрушающего контроля материалов и изделий по условиям прочности и предназначено для контроля процесса трещинообразования хрупких тензоиндикаторов при изменении уровня напряженности в исследуемых зонах конструкции. Механобиологический способ исследования деформаций и напряжений в деталях включает нанесение на исследуемую поверхность детали хрупкого тензочувствительного покрытия, отверждение покрытия, нагружение детали и определение зоны и направленности пластических деформаций при появлении свечения исследуемой поверхности детали. При этом в тензочувствительное покрытие добавлены грамположительные облигатно-анаэробные бактерии семейства Clostridiaceae в сухих формах, пророщенных на сухих питательных средах, исходя из расчета 100-300 мг на 1 кг покрытия. Изобретение позволяет на ранних стадиях определять локальные повреждения конструкций и материалов.

Изобретение относится к ветеринарной эпизоотологии, в частности к способу прогнозирования фасциолеза жвачных животных. Способ включает обследование пастбища. В травостое пастбища определяют процентное содержание растений с различной степенью лярво-трематоцидной активности и при преимущественном содержании в травостое растений с нулевой/низкой степенью лярво-трематоцидной активности прогнозируют высокую степень риска и уровня заболеваемости животных фасциолезом. Степень лярво-трематоцидной активности оценивают по наличию в химическом составе растения веществ из группы, состоящей из фенолкарбоновых кислот, высших жирных кислот и аскорбиновой кислоты (основные действующие вещества), и группы, состоящей из ароматических карбоновых, липидных, тритерпеноидных, сесквитерпеноидных, азотсодержащих, органических кислот, аминокислот и дубильных веществ (вспомогательные действующие вещества). При содержании в растении 3 классов основных и 4-5 классов вспомогательных действующих веществ степень лярво-трематоцидной активности оценивают как высокую, 2-3 классов основных и 2-3 классов вспомогательных действующих веществ - как среднюю, 0-1 класса основных и 0-2 классов вспомогательных действующих веществ - нулевую/низкую. Использование изобретения позволит оптимизировать профилактические и противоэпизоотические мероприятия. 5 табл., 2 пр.

Изобретение относится к аналитической химии и касается способа определения селена в воде. Сущность способа заключается в том, что к анализируемому раствору добавляют 0,4 мл раствора 3%-ного щелочного борогидрида натрия восстановителя, закрывают пробкой, встряхивают и оставляют на 5 мин для восстановления селена до селеноводорода. Далее прибавляют 2,0 мл 2,3-диаминонафталина (ДАН) с массовой долей 0,1% и добавляют порциями по 2 мл гексана и встряхивают по 1 мин, переносят в делительную воронку для расслаивания и разделения фаз, переносят на фильтр и фильтруют в пробирку с предыдущей порцией, поочередно 4-5 раз экстракций для количественного извлечения комплекса гидрида селена с ДАН, затем объединенный экстракт флуориметрируют. Использование способа позволяет с высокой точностью определять концентрацию селена в питьевой воде. 1 ил., 6 табл.

Изобретение относится к экологии, а именно способу одновременного определения пестицидов разных химических классов в биологическом материале. Для этого печень рыбы гомогенизируют с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия, экстрагируют ацетонитрилом, встряхивают и отстаивают. Далее пробы центрифугируют при 3000 об/мин и добавляют сорбенты - силикагель С-18, Bondesil-PSA и безводный сульфат натрия, после чего повторяют центрифугирование. Полученный раствор упаривают, сухой остаток растворяют в ацетонитриле и анализируют с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором. Изобретение позволяет оценивать уровень загрязнения пестицидами биологических объектов при проведении экологического мониторинга. 2 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области экологии, а именно к оценке качества атмосферного воздуха населенных мест по состоянию эпифитной лихенофлоры. Для этого вычисляют индекс загрязнения воздуха (ИЗА) по жизненности лишайников в пределах 89%, сравнивая его с комплексным показателем, определяемым на учетной площадке, и коэффициента толерантности лихенофлоры по отношению к индексу загрязнения воздуха, который исчисляется по формуле ИЗА=(0,89-G/89)/0,298, где 0,89 - максимальная относительная жизненность лихенофлоры в чистом воздухе; G% - комплексный показатель жизненности лихенофлоры на площадке лихеноиндикации; 89% - теоретически возможное максимальное значение жизненности лихенофлоры в чистом воздухе, выраженное в процентах; 0,298 - коэффициент толерантности лихенофлоры к ИЗА. Значение ИЗА около 1 и наличие всех видов лишайников показывает благоприятную экологическую обстановку и качество атмосферного воздуха; при оценке в пределах 5-6 единиц оценивают повышенное загрязнение; оценка 7-13 характеризует высокое загрязнение; оценка выше 14 характеризует очень высокое загрязнение. Изобретение позволяет произвести экологическую оценку и вывести среднегодовой показатель загрязнения воздуха. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к экотоксикологии, а именно к исследованию особенностей развития оксидативного стресса у двухстворчатых моллюсков, и может быть использовано для выявления влияния техногенного загрязнения среды на состояние популяций речных и морских моллюсков. Для этого пробы гепатопанкреаса двухстворчатых моллюсков из загрязненных водоемов гомогенизируют в 10-кратном объеме 50 мМ трис-буфера рН 7,8, содержащего 2 мМ этилендиаминтетроацетат. Затем проводят анализ на содержание малонового диальдегида (МДА) и 4-гидроксиалкенов для определения уровня перекисного окисления липидов. Состояние моллюсков оценивают по результатам определения уровня окислительных повреждений липидов гепатопанкреаса по сравнению с контрольными образцами, взятыми из условно чистых водоемов. Изобретение обеспечивает возможность выявить на разных стадиях интоксикации нарушения метаболического баланса клеток, индуцированного действием загрязнителей водной среды. 3 ил., 3 пр.

Изобретение относится к измерению качества различных видовых комплексов трав и травянистых растений на пробах, преимущественно на пойменных лугах, и может быть использовано в экологическом мониторинге территорий с травяным покровом. Изобретение относится также к ландшафтам малых рек с луговой растительностью и может быть использовано при оценке видового разнообразия травы по наличию отдельных видов растений. Способ включает выделение на малой реке или ее притоке визуально по карте или натурно участка пойменного луга с травяным покровом, разметку на этом участке по течению малой реки или ее притока в характерных местах не менее трех гидрометрических створов в поперечном направлении. Вдоль каждого гидрометрического створа размечают пробные площадки с каждой стороны малой реки или ее притока. Выявляют закономерности показателей проб травы. Для подсчета разнообразия видов травяных растений на участке пойменного луга выделяют точки будущих центров комплексных пробных площадок. В каждом центре комплексных пробных площадок забивают колышки и концентрически устанавливают квадратные рамки с разными размерами сторон. Квадратные рамки устанавливают с ориентацией сторон вдоль и поперек русла малой реки или ее притока. Затем внутри каждой квадратной рамки сосчитывают количество видов травы и записывают в таблицы для каждого размера пробных площадок. После этого по каждой таблице вычисляют суммы видов травы и пробных площадок. По этим суммам вычисляют отношения к общей сумме видов травы и к общей сумме всех комплексных пробных площадок. Затем статистическим моделированием выявляют ранговые распределения по двум показателям: относительной встречаемости каждого вида травы на всех пробных площадках и разнообразия видов травы на каждой пробной площадке данного участка, после этого вычисляют коэффициент коррелятивной вариации по численности видов травы, а оценку видового состава травянистых растений осуществляют по ранговому распределению относительной встречаемости видов растений. Способ обеспечивает повышение точности учета наличия видов травяных и травянистых растений на всех пробных площадках при одновременном снижении трудоемкости анализа видового состава на них, упрощение процесса анализа видового состава только по численности видов на пробных площадках, повышение возможностей сравнения проб травы по двум показателям: относительной встречаемости каждого вида на всех пробных площадках и разнообразию (относительной встречаемости) видов травы на каждой пробной площадке данного участка, причем без срезания с пробных площадок травяных проб. 7 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 табл., 1 пр.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения диоктилфталата в равновесной газовой фазе над изделиями из ПФХ-пластизоля. Для этого применяют способ идентификации и полуколичественного определения диоктилфталата в смеси соединений, выделяющихся из ПВХ-пластизоля. Для определения диоктилфталата используют частотомер с массивом из 2-х пьезокварцевых резонаторов с собственной частотой колебаний 10 МГц, электроды которых модифицируют нанесением на них из индивидуальных растворов многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) массой пленки 3-5 мкг и полифенилового эфира (ПФЭ) массой 15-20 мкг. Модифицированные пьезокварцевые резонаторы помещают в закрытую ячейку детектирования и выдерживают в течение 5 мин для установления стабильного нулевого сигнала. Затем в пробоотборник помещают образец мягкого изделия из ПВХ-пластизоля массой 1,00 г, плотно закрывают пробкой и выдерживают при температуре 20±1°С в течение 15 мин для насыщения газовой фазы парами диоктилфталата. 5 см3 равновесной газовой фазы отбирают шприцем и инжектируют ее в закрытую ячейку детектирования и фиксируют в течение 120 с изменение частоты колебаний пьезосенсоров. Каждую секунду автоматически фиксируются отклики сенсоров, после чего регенерируют систему в течение 2 мин осушенным воздухом. Затем пробу в пробоотборнике нагревают в сушильном шкафу до 30±1°С в течение 10 мин, отбирают шприцем 5 см3 равновесной газовой фазы и повторно инжектируют в закрытую ячейку детектирования, фиксируют в течение 120 с изменение частоты колебаний пьезосенсоров при 20 и 30°С. По сигналам сенсоров автоматически рассчитывают площади под кривой для каждого сенсора: S(МУНТ), S(ПФЭ), Гц·с, и рассчитывают соотношение площадей при 20°С и 30°С соответственно - параметр . По указанным параметрам делают выводы о наличии диоктилфталата в образцах: если А30/20>20, то диоктилфталат присутствует в образцах изделий из ПВХ-пластизоля с концентрацией больше допустимого количества миграции (ДКМ, мг/дм3), если А30/20≤1, то содержание диоктилфталата на уровне допустимого количества миграции и его содержание меньше содержания других легколетучих соединений, присутствующих в пробе. Изобретение обеспечивает идентификацию и полуколичественное определение диоктилфталата, выделяющегося из ПВХ-пластизоля. 1 пр.

Изобретение относится к области обработки воздуха. Способ калибровки датчика воздуха устройства обработки воздуха включает в себя этапы, на которых: i) - очищают воздух, используя устройство обработки воздуха; ii) - измеряют первое количество воздуха, используя датчик воздуха для получения первого значения для калибровки датчика воздуха, причем первое количество воздуха представляет собой смесь окружающего воздуха и очищенного воздуха, причем устройство обработки воздуха расположено в воздухонепроницаемом пространстве, а этап 2 дополнительно включает в себя этапы, на которых: определяют, удовлетворяет ли качество первого количества воздуха в воздухонепроницаемом пространстве заданному критерию; и если качество первого количества воздуха удовлетворяет заданному критерию, измеряют первое количество воздуха, используя датчик воздуха, для получения первого значения. Это позволяет повысить точность измерений и, как следствие, оптимизировать работу устройства обработки воздуха. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2016-08-27 2016-08-27T14:26:51
Наверх