Способ диагностики тяжести течения бронхиальной астмы при снижении в гладкой мускулатуре слизистой бронхов активности миоглобинпероксидазы



Способ диагностики тяжести течения бронхиальной астмы при снижении в гладкой мускулатуре слизистой бронхов активности миоглобинпероксидазы
Способ диагностики тяжести течения бронхиальной астмы при снижении в гладкой мускулатуре слизистой бронхов активности миоглобинпероксидазы
Способ диагностики тяжести течения бронхиальной астмы при снижении в гладкой мускулатуре слизистой бронхов активности миоглобинпероксидазы

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2595847:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" (RU)

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики тяжести течения бронхиальной астмы. Способ осуществляют путем выявления пероксидазной активности миоглобина гистохимическим методом после фиксации биоптатов слизистой бронхов в 10% растворе формалина в течение 5 дней, замораживания их и приготовления срезов толщиной 5 мк, которые помещают на 1 мин в бензол и окрашивают 5-8 мин при 80°C в растворе, состоящем из 100 мг бензидина в 0,85% NaCl, раствор охлаждают и фильтруют, добавляют к 9 мл раствора 1 мл 40% раствора хлористого аммония и 1 каплю 3% раствора перекиси водорода, после проведенной реакции срезы споласкивают в 0,85% NaCl и заключают в глицерин-желатину для последующего изучения пероксидазной активности миоглобина по программе «Scion». При снижении пероксидазной активности миоглобина в гладкой мускулатуре бронхов до 27,5±1,1 усл. ед., сужении просвета бронхов до 55,0±2,3%, снижении ЖЕЛ до 69,1±4,2%, ФЖЕЛ до 64,2±3,8%, ОФВ1 до 45,7±4,4%, проходимости бронхов МОС75 до 32,4±2,9% диагностируют тяжелую форму бронхиальной астмы. 3 ил.

 

1. Цель изобретения - разработать способ определения тяжести течения бронхиальной астмы по степени активности миоглобинпероксидазы в гладких мышечных клетках слизистой оболочки бронхов.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа оценки тяжести течения бронхиальной астмы по степени активности миоглобинпероксидазы в гладких мышечных клетках слизистой оболочки бронхов.

3. Раскрытие изобретения

Пероксидазы являются гемопротеидами, которые катализуют окисление различных веществ с помощью перекиси водорода. Эти ферменты обнаружены в мышечных элементах, щитовидной железе, молочной железе. Чрезвычайно важна роль пероксидаз как сильно действующего фактора на антиокислительные ферменты [3-5]. Разработанный калориметрический метод, основанный на регистрации кинетики теплопродукции при разложении перекиси водорода, позволяет дифференцировать пероксидазный путь разложения перекисей [2]. Установлено, что в эритроцитах основным защитным фактором от перекисной деструкции гемоглобина являются пероксидазы (одна из ее разновидностей - каталаза).

4. Новая техническая задача

Определять с помощью гистохимической реакции в гладких мышечных клетках слизистой оболочки, полученной в результате забора биоптатов стенки бронхов, активность миоглобинпероксидазы, позволяющая оценить антиокислительные процессы в мышечных клетках слизистой бронхов, влияющей на степень тяжести течения бронхиальной астмы.

5. Прототипом исследования взята работа Титова В.Ю. (2003) [6] «Роль антиокислительных ферментов в защите эритроцитарного гемоглобина и внеклеточных физиологических сред от перекисной деструкции». В своей работе автор предлагает новый способ оценки защитного действия пероксидаз на антиокислительные процессы в эритроцитах периферической крови путем регистрации кинетики теплопродукции при разложении перекиси водорода с участием одной из разновидностей пероксидаз - пероксидазы эритроцитов каталазы. В отличие от вышеописанного способа в настоящей работе имеются следующие отличия:

1) Материалом для исследования у человека используется гладкая мускулатура слизистой бронхов, полученная путем биопсии.

2) Оценка антиперекисного процесса в гладких мышечных клетках проводится путем определения активности гемоглобинпероксидазы гистохимическим методом.

3) Интенсивность гемоглобинпероксидазной реакции в гладкой мускулатуре бронхов позволяет давать оценку степени тяжести течения бронхиальной астмы.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследовано 68 пациентов в возрасте 35-40 лет с диагнозом

бронхиальная астма тяжелой формы (3-я) и 85 пациентов (1-я) с легкой формой течения бронхиальной астмы (БА) в возрасте 30-35 лет. Исследования проводились на базе пульмонологического отделения клиники Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Дальневосточный центр физиологии и патологии дыхания».

6.2. Исследования проводили с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.3. Всем пациентам выполнялась бронхоскопия с последующим забором биопсийного материала. Осмотр трахеобронхиального дерева осуществляли при бронхофиброскопии, которую проводили при обследовании во время вводного периода и на этапах 12-48 недель наблюдения за больными бронхиальной астмой. Бронхофиброскопию выполняли под местной анестезией Sol. Lidocaini 2% в количестве 10-12 мл бронхофиброскопом фирмы «Olympus» BFIT-20 (Япония). У больных тяжелой и среднетяжелой БА при необходимости применяли премедикацию бронхолитиками и вентиляционную поддержку кислородом. При осмотре трахеобронхиального дерева оценивали эндоскопический признак гиперреактивности бронхов (ЭГРБ). В зависимости от выраженности развивающегося сужения бронхов выделяли три степени ЭГРБ: 1-я степень - сужение просвета бронха не более чем на 30% от исходного размера; 2-я степень - сужения просвета на 30-50%; 3-я степень - сужения просвета бронха более чем на 50% от исходного размера.

Биопсию слизистой оболочки на уровне среднедолевого бронха и сегментарных бронхов базальной пирамиды нижней доли правого легкого выполняли биопсийными щипцами FB 19-C «Olympus» (Япония) через инструментальный канал бронхофиброскопа. Определялось состояние функции внешнего дыхания (ФВД) у больных с бронхиальной астмой в % на аппарате Ultracreen (Германия) (фигура 1)·

ЖЕЛ-здоровые - 103,0±2,0; легкая форма - 94,9±3,7; тяжелая - 69,1±4,2

ФЖЕЛ-здоровые - 99,4±2,2; легкая форма - 92,3±3,0; тяжелая - 64,2±3,8

ОФВ1-здоровые - 93,0±2,4; легкая форма - 83,5±4,3; тяжелая - 45,7±4,4

МОС75-здоровые - 84,9±5,2; легкая форма - 56,2±5,0; тяжелая - 32,4±2,9.

При оценке средних параметров, характеризующих объем легких, у больных с легким течением БА достоверного снижения ЖЕЛ и ФЖЕЛ по сравнению со здоровыми лицами не установлено. Наиболее выраженное снижение функциональных параметров бронхиальной проходимости наблюдалось у больных с тяжелой формой течения БА. У них зафиксировано выраженное снижение показателей бронхиальной проходимости, вероятно обусловленное выраженными воспалительными процессами в сочетании с гладкомышечным спазмом.

6.4. На биопсийном материале выполнялась гистохимическая реакция на выявление интенсивности реакции миоглобинпероксидазы. Реакция выполнялась по рекомендации Дрюс и Энгель [1].

Ход реакции следующий:

а) Биопсийный материал в течение 5 дней фиксировали в 10% формалине, приготовленном на физиологическом растворе.

б) После этого кусочки ткани замораживают и приготовляют срезы толщиной 5-10 мк и помещают их на 1 мин в бензол.

в) Окрашивают 5-8 мин в инкубационном растворе, состоящем из 100 мг бензидина в 0,85% NaCl при 80°С. Раствор охлаждают и фильтруют. К 9 мл раствора добавляют 1 мл 40% раствора хлористого аммония и 1 каплю 3% раствора перекиси водорода. Раствор каждый раз готовят заново.

г) Споласкивают в 0,85% физиологическом растворе, заключают в глицерин-желатину и сразу исследуют под микроскопом, так как продукт реакции быстро обесцвечивается.

7. Статистический анализ и обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n1+n2-2. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений, непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

Исследование препаратов на миоглобинпероксидазу изучали под цифровым микроскопом MEIJI (Япония), связанным с компьютером с помощью цитофотометрической программы Scion (США). Цитофотометрический анализ показал, что у больных с легкой формой БА содержание миоглобинпероксидазы определяется в пределах 90,5±2,9 усл. ед., а у пациентов с тяжелой формой она резко снижается до 27,5±1,1 усл. ед.

Таким образом, вследствие накопления в гладкой мускулатуре слизистой оболочки перекисей на фоне выраженного воспаления отмечается сужение просвета бронхов до 55,0±2,3% от исходного; нарушение проходимости МОС75 - до 32,4±2,9%; ΟΦΒ1 - до 45,7±4,4%; ЖЕЛ - до 69,1±4,2%; ФЖЕЛ - до 64,2±3,8% (здоровые - 93,0±2,4%). На этом фоне активность миоглобинпероксидазы в мышцах слизистой оболочки бронхов у больных с тяжелой формой БА снижается до 27,5±1,1 усл. ед. (контроль - 90,5±2,9 усл. ед.) (фигура 2, 3).

Следовательно, гладкая мускулатура бронхов содержит большое количество перекисей и формирует резкое снижение проходимости мелких бронхов.

На фигуре 1 изображены показатели внешнего дыхания у больных здоровых, с легкой формой течения заболевания (1-я) и тяжелой формой бронхиальной астмы (3-я). Основные показатели, отражающие внешнее дыхание: ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ΟΦΒ1 и проходимость бронхов МОС25, МОС50 и МОС75 (нижние отделы бронхиального дерева).

Примечание: p - уровень значимости различий по отношению к здоровым лицам; p1 - уровень значимости различий средних значений показателей между группами больных с легким течением бронхиальной астмы и астмой средней степени тяжести; р2 - между группами больных с легким течением бронхиальной астмы и тяжелой формой течения бронхиальной астмы; р3 - между группами больных бронхиальной астмы средней степени тяжести и тяжелой формой течения бронхиальной астмы.

На фигуре 2 изображена активность миоглобинпероксидазы участка гладких мышечных клеток слизистой оболочки бронха больного бронхиальной астмой легкой степени заболевания. Интенсивность реакции цитофотометрически выполненной - 90,5±2,9 усл. ед. Реакция гистохимическая на выявление миоглобинпероксидазы по Дрюс и Энгелю [1]. Увеличение 10×100.

На фигуре 3 изображена гистохимическая реакция на миоглобинпероксидазу на участке гладких мышечных клеток слизистой оболочки бронхов у больного бронхиальной астмой тяжелой степени заболевания. Активность реакции, проанализированная цитофотометрически - 27,5±1,1 усл. ед. Реакция выполнена по методу Дрюс и Энгелю [1]. Увеличение 10×100.

Литература

1. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: «Мир». 1969. 639 с.

2. Петренко Ю.М., Титов В.Ю. Калориметрический метод определения эффективности функционирования каталазы в биообъектах // Вопросы мед. химии. 1989. Т. 35, №6. С. 143-148.

3. Сперанский С.Д., Полюхович Г.С., Сперанская Б., Терещенко СМ. Сравнительное изучение активности противогипоксических срезов при гемической гипоксии // Эксп. Клин. Фармак. 1992. Т. 55, №4. С. 38-40.

4. Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Петров В.А., Владимиров Ю.А. Механизм окисления оксигемоглобина, индуцированного перекисью водорода // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1991. Т. 112, №7. С. 46-49.

5. Титов В.Ю., Марголина А.А., Петренко Ю.М. Ингибирование нитритами каталазы важный элемент их токсичности. Возможность использования каталазы как детектора на нитриты // Агрохим. Вестник. 1997. №1. С. 8-12.

6. Титов В.Ю. Роль антиокислительных ферментов в защите эритроцитарного гемоглобина и внеклеточных физиологических сред от перекисной деструкции: возможность их использования для экологического мониторинга. Автореф. на ученую степень доктора биологических наук. 2003, г. Боровск.

7. Arduini Α., Mancinelli G., Radatti G., Hochsteia P., Cadeaas E. Possible mechanism of inhibition of nitrite induced oxidation of oxyhemoglobin by ergothioneine and uric acid // Ach. Biochem. Biphys. 1992. V. 294, №2. P. 398-402.

Способ диагностики тяжести течения бронхиальной астмы путем выявления пероксидазной активности миоглобина гистохимическим методом после фиксации биоптатов слизистой бронхов в 10% растворе формалина в течение 5 дней, замораживания их и приготовления срезов толщиной 5 мк, которые помещают на 1 мин в бензол и окрашивают 5-8 мин при 80°C в растворе, состоящем из 100 мг бензидина в 0,85% NaCl, раствор охлаждают и фильтруют, добавляют к 9 мл раствора 1 мл 40% раствора хлористого аммония и 1 каплю 3% раствора перекиси водорода, после проведенной реакции срезы споласкивают в 0,85% NaCl и заключают в глицерин-желатин для последующего изучения пероксидазной активности миоглобина по программе «Scion», и при снижении пероксидазной активности миоглобина в гладкой мускулатуре бронхов до 27,5±1,1 усл. ед., сужении просвета бронхов до 55,0±2,3%, снижении ЖЕЛ до 69,1±4,2%, ФЖЕЛ до 64,2±3,8%, ОФВ1 до 45,7±4,4%, проходимости бронхов МОС75 до 32,4±2,9% диагностируют тяжелую форму бронхиальной астмы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для внутрипортальной озонотерапии при распространенном перитоните. Озонирование проводят посредством медицинского озонатора с концентрацией озона в озонокислородной смеси не менее 1000 мкг/л.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для персонализированного назначения неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) больным люминальным В раком молочной железы.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики псориаза. Сущность способа состоит в том, что он включает исследование показателей системы свертывания крови и тромбообразования пациента: скорость роста сгустка крови, и/или задержку роста сгустка, и/или начальную скорость роста сгустка, и/или стационарную скорость роста сгустка, и/или размер сгустка.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ оценки литогенности желчи, включающий определение в желчи у обследуемого (i) показателей холестерина (ХС, ммоль/л) в сравнении со средними значениями, принятыми за норму (k), отличающийся тем, что в желчи определяют комплекс общих липидов (ОЛ, г/л), суммарную антиокислительную активность (АОА) электрохимическим методом (в нА·с), максимум вспышки хемилюминесценции (МВХЛ, в усл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования чувствительности к химиотерапии у больных с лимфопролиферативными заболеваниями. Сущность способа состоит в том, что в сыворотке крови определяют количественные уровни маркеров тимидинкиназы-1 (TK-1) и β2-микроглобулина (β2-МГ), а также после первого курса химиотерапии активность TK-1.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике и гепатологии во внутренних болезнях, и может быть использовано для оценки состояния печени у больных хроническим вирусным гепатитом С.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для оценки индивидуального генетического риска атеросклероза. Осуществляют взятие крови, выделение ДНК и генотипирование митохондриальной ДНК.

Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ прогнозирования характера поражения желчного пузыря у женщин, больных хроническим калькулезным холециститом, русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития хронического калькулезного холецистита (ХКХ). У женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, осуществляют забор крови, выделение ДНК и анализ полиморфизмов генов интерлейкинов.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). У индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, определяют возраст, уровень систолического и диастолического артериального давления, наличие отягощенного семейного анамнеза, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степень пигментации угла передней камеры, осуществляют забор периферической венозной крови и выделение ДНК, проводят анализ полиморфизма гена VEGF-A с.-958C>T (rs833061), после чего определяют значения дискриминантных показателей Dp и Dk по формулам.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы нарушения формирования фетоплацентарной системы и развития плода в период гестации при снижении количества эстрадиола в связи со снижением содержания андростендиона в синцитиотрофобласте плаценты на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре беременности. Для этого в периферической крови определяют титр антител к цитомегаловирусу, выполняют гистохимическую реакцию на андростендиондегидрогеназу в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты роженицы, измеряют количество эстрадиола в гомогенате плаценты, и при титре антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600, снижении активности реакции на андростендиондегидрогеназу до 32,1±2,88 усл. ед., уменьшении содержания эстрадиола в плаценте до 18443,2±117,53 пмоль/л определяют угрозу нарушения формирования фетоплацентарной системы и развития плода в период гестации. Способ позволяет оценить угрозу нарушения формирования фетоплацентарной системы и развития плода при простоте его исполнения. 2 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для определения угрозы нарушения ферментативной активности в плаценте и развития плода при снижении содержания пирувата на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации. Для этого в периферической крови беременных измеряют титр антител к цитомегаловирусу, содержание пирувата в гомогенате плаценты, после чего выполняют цитофотометрический анализ выполненных гистологических срезов плаценты после проведения гистохимической реакции с последующим определением содержания пируватдегидрогеназы, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, снижении содержания пирувата в гомогенате плаценты до 0,015±0,002 ммоль/л и пируватдегидрогеназы до 35,0±0,95 усл. ед. создается угроза нарушения ферментативной активности в плаценте и развития плода. Способ позволяет оценить угрозу нарушения функционирования плаценты в целом и развития плода. 2 ил.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу определения малонового диальдегида в вегетативных органах черешни, винограда, ореха грецкого и проростках озимой пшеницы. Для этого проводят экстракцию биологического материала 96% спиртом и с последующим центрифугированием. Далее супернатант обрабатывают 0,5%-ным водным раствором тиобарбитуровой кислоты и инкубируют 30 мин при 50°C. После охлаждения реакционную смесь центрифугируют. Содержание малонового диальдегида определяют методом капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре с внутренним диаметром 75 мкм и эффективной длиной 0,5 м. Анализ проводят при длине волны 254 нм в токе электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты и 0,05% масс. тетрабората натрия при положительной полярности напряжения. Расчет проводят с учетом того, что на одну молекулу малонового альдегида расходуется две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Изобретение позволяет проводить количественное определение концентрации малонового диальдегида, который служит маркером оксидативного стресса растений. 1 табл., 4 ил., 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для оценки появления признаков позднего токсикоза. Способ включает определение содержания магния в эритроцитах периферической крови и при снижении его до 0,402±0,002 ммоль/л появляются на 7 месяце гестации признаки позднего токсикоза.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ определения обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой, отличающийся тем, что проводят определение уреазной активности следующим образом: в одну из лунок микропланшета вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером, в две другие вносят водные растворы мочевины с фосфатным буфером, содержащие уреазу с известной концентрацией 5 и 10 Ед/л соответственно, а в остальные лунки вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером и образцами ротовой жидкости, затем во все лунки вносят фенол/нитропруссидный реагент и гипохлорит, после чего измеряют оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 546 нм и рассчитывают концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Ед/л, при значении уреазной активности выше 15,85±2,11 Ед/л регистрируют обсемененность полости рта уреазопозитивной микробиотой. Осуществление изобретения позволяет выявить необходимость противомикробной терапии для профилактики образования твердых зубных отложений и воспалительных заболеваний пародонта. 2 пр.

Группа изобретений относится к области медицины и иммунологии. В частности, группа изобретений относится к способам иммунологической диагностики, включающим применение как нативной молекулы, так и пептидных последовательностей фрагментов плазминогена, которые могут быть использованы в качестве универсальной системы детекции продуктов протеолиза с образованием на COOH-концах пептидной цепи лизина при проведении анализа для выявления у человека заболеваний, ассоциированных с повышенной активностью протеолитических ферментов. Группа изобретений касается также тест-системы, содержащей в качестве детектора как нативную молекулу, так и указанные пептидные последовательности. Технический результат заключается в достижении необходимой степени диссоциации комплекса антиген-антитело, присутствующего в образце, взятом у субъекта, а также в изменении конформации белков, что, в свою очередь, позволяет существенно повысить чувствительность метода определения уровня протеолитических фрагментов с C-концевым лизином, способных связываться с плазминогеном или его фрагментами. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). У индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России, из периферической венозной крови выделяют ДНК, после чего проводят анализ полиморфизмов генов TNFα, Ltα, TNFR1 и TNFR2. Среди индивидуумов без сопутствующей патологии глаз в случае выявления комбинации -308G TNFα и +1663G TNFR2 либо комбинации +36G TNFR1 и +1663G TNFR2 или при наличии сопутствующей патологии глаз как миопия, катаракта или возрастная макулярная дегенерация сетчатки в случае выявления +36A TNFR1 либо комбинации +36AA TNFR1 и +1663A TNFR2 либо +250G Ltα и +36AA TNFR1 прогнозируют повышенный риск развития ПОУГ. У индивидуумов с сопутствующей патологией глаз при выявлении +250A Ltα и +36G TNFR1 либо -308G TNFα и +36G TNFR1 прогнозируют низкий риск развития ПОУГ. Изобретение обеспечивает раннее выявление больных с ПОУГ, что позволит предупредить прогрессирование заболевания. 6 ил., 2 табл., 7 пр.
Наверх