Питательная среда для культивирования каллусной культуры болиголова пятнистого (conium maculatum l)

Авторы патента:

Медведева Юлия Валерьевна (RU)

Чурин Алексей Александрович (RU)

Филонова Мария Васильевна (RU)

Карначук Ольга Викторовна (RU)

C12N5/04 - клетки или ткани растений

A01H5/00 - Цветковые, например покрытосеменные растения

Владельцы патента RU 2596402:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ, НИ ТГУ) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для культивирования каллусной ткани болиголова пятнистого, содержащую компоненты в следующем количестве, мг/л: KNO₃ 1900; KH₂PO₄ 170; NH₄NO₃ 1650; MgSO₄×7H₂O 370; CaCl₂×2H₂O 440; FeSO₄×7H₂O 37,3; Na₂EDTA×2H₂O 27,8; KI 0,83; H₃BO₃ 6,2; MnSO₄×4H₂O 22,3; CoCl₂×6Н₂О 0,025; CuSO₄×5Н₂О 0,025; ZnSO₄×7H₂O 8,6; Na₂MoO₄×2Н₂О 0,25; тиамин-HCl 0,5-1,5; пиридоксин-HCl 0,4-0,6; никотиновая кислота 0,4-0,6; сахароза 30000; агар-агар 10000; НУК 1-3; 6-БАП 0,1-1; вода дистиллированная - остальное. Изобретение позволяет культивировать каллусную ткань, а также получить высокие значения прироста биомассы Conium maculatum. 2 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в медицине для получения сырья, содержащего биологически активные вещества, а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за выделения ядовитых соединений в питательную среду.

Область применения - медицинская (фармацевтическая) промышленность, получение нового вида сырья в качестве источника биологически активных веществ растительного происхождения (в частности, алкалоидов) для получения новых высокоэффективных лекарственных препаратов.

Питательная среда содержит KNO₃, NH₄NO₃, CaCl₂×2H₂O, MgSO₄×7H₂O, KH₂PO₄, FeSO₄×7H₂O, Na₂EDTA×2H₂O, Н₃ВО₃, MnSO₄×4H₂O, ZnSO₄×7H₂O, KI, Na₂MoO₄2H₂O, CuSO₄×5H₂O, CoCl₂×6H₂O, никотиновую кислоту, тиамин, пиридоксин, НУК, 6-БАП, сахарозу, агар-агар и воду при заданных соотношениях компонентов. Изобретение позволяет культивировать клеточную культуру Conium maculatum.

Болиголов пятнистый обладает широким спектром фармакологической активности. В народной медицине спиртовые настойки из болиголова применяются в качестве антибактериальных, гемостатических, общеукрепляющих средств, оказывают противовоспалительное, жаропонижающее и др. эффекты.

Известна питательная среда для культивирования каллусной ткани silene vulgaris (moench) garcke (Патент РФ 2169769, МПК C12N 5/04).

Питательная среда для культивирования каллусной ткани silene vulgaris (moench) garcke содержит макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: фолиевую кислоту 0,5; рибофлавин 0,5; биотин 1,0; Са-пантотенат 1,0; пиридоксин 1,0; тиамин хлорид 1,0; никотинамид 2,0; кобаламин 0,0015; кинетин 1,5 мг/л или 6-БАП 0,5 мг/л; 2,4-Д 1,5-2,0 мг/л; сахарозу 1,5%; глюкозу 1,5%; агар 8000 мг/л, воду до 1 л.

Известна питательная среда для культивирования каллусной культуры artemisia annua 1. (Патент РФ, 2393217, МПК C12N 5/04).

Питательная среда для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. содержит агаризованную среду с макро- и микросолями по Мурасиге и Скугу, витамины, сахарозу, в качестве гормонов добавляют 6-БАП (6-бензиламинопурин) и НУК (α-нафтилуксусную кислоту) в соотношении 6-БАП - 0,2/ НУК - 0,5-1,0.

Известна питательная среда для выращивания культуры ткани раувольфии змеиной - продуцента алкалоидов (Патент РФ 2081561, МПК C12N 5/02, C12N 5, А01Н 4).

среде следующего состава (мг/л): KH₂PO₄-300-500; K₂HPO₄3H₂O-300-500; (NH₄)₂SO₄-800-1000; NH₄NO₃ 2500-3800; MgSO₄7H₂O 1000-1500; Ca(NO₃)₂4H₂O - 1000-2000; NH₄Cl 100-200; FeSO₄4H₂O 60-80; NaEDTA - 100-200; Н₃ВО₃ 10-12; KJ 700-1000; CoCl₂6H₂O - 800-1000; NaMoO₄2H₂O 0,2-0,3; MnSO₄5H₂O - 0,22-0,23; CuSO₄5H₂O 0,015-0,025; ZnSO₄4H₂O - 1,7-8,6; тиамин 1-1,5; агар-агар 65000; сахароза 120000-130000.

Недостатками известных аналогов является их направленность на культивирование определенных видов растений: silene vulgaris, artemisia annua 1. раувольфии змеиной, следовательно, оптимизированная среда для выращивания этих видов не подойдет для выращивания Conium maculatum L.

Дополнительно в среду для культивирования silene vulgaris (moench) garcke добавляют фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Са-пантотенат, кобаламин и глюкозу, среда для выращивания культуры ткани раувольфии змеиной содержит повышенное содержание сахарозы, это усложняет приготовление питательной среды и увеличивает ее стоимость.

Питательные среды для выращивания каллусной ткани Conium maculatum L из литературных источников нами не выявлены.

Задачей настоящего изобретения является ускорение роста каллусной ткани с высоким выходом биомассы.

Поставленная задача решается следующим образо: культивирование ткани производится на питательной агаризованной среде MS с добавлением витаминов, фитогормонов, сахарозы.

Содержание компонентов в питательной среде Мурасиге-Скуга представлено в таблице 1.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, хлорида кальция, хелата железа, витаминов. Макро- и микросоли, хлорид кальция, хелат железа, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют сахарозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и бумагой стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. В простерилизованную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют стимуляторы роста 1-3 НУК и 0,1 - 16-БАП, перемешивают и разливают в стерильные культуральные сосуды по 15 мл в каждый.

Ткань пересаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

Прирост каллусной ткани болиголова пятнистого оценивали в виде индекса прироста массы (таблица 2), который рассчитывается по формуле:

где m₀ - начальная масса, г; m - конечная масса, г.

Технический результат - культивирование каллусной ткани Conium maculatum L, а также получение высоких значений прироста биомассы.

Пример 1

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄×7H₂O 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄×4H₂O - 32,3 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂×6H₂O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄×7H₂O - 37,3 мг/л, Na₂EDTA×2H₂O - 27,8 мг/л), CaCl₂×2H₂O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂×2H₂O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют НУК (2 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л), размещают ее по культуральным сосудам. Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

Пример 2

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄×7H₂O 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄×4H₂O - 32,3 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂×6H₂O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄×7H₂O - 37,3 мг/л, Na₂EDTA×2H₂O - 27,8 мг/л), CaCl₂×2H₂O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl -0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂×2H₂O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют НУК (2 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л), размещают ее по культуральным сосудам. Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

Пример 3

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄×7H₂O 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄×4H₂O - 32,3 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂×6H₂O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄×7H₂O - 37,3 мг/л, Na₂EDTA×2H₂O - 27,8 мг/л), CaCl₂×2H₂O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂×2H₂O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют НУК (1 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л), размещают ее по культуральным сосудам. Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

Питательная среда для культивирования каллусной ткани болиголова пятнистого, характеризующаяся тем, что содержит компоненты в следующем количестве, мг/л:

KNO₃	1900
KH₂PO₄	170
NH₄NO₃	1650
MgSO₄×7H₂O	370
CaCl₂×2H₂O	440
FeSO₄×7H₂O	37,3
Na₂EDTA×2H₂O	27,8
KI	0,83
H₃BO₃	6,2
MnSO₄×4H₂O	22,3
CoCl₂×6Н₂О	0,025
CuSO₄×5Н₂О	0,025
ZnSO₄×7H₂O	8,6
Na₂MoO₄×2Н₂О	0,25
тиамин-HCl	0,5-1,5
пиридоксин-HCl	0,4-0,6
никотиновая кислота	0,4-0,6
сахароза	30000
агар-агар	10000
НУК	1-3
6-БАП	0,1-1
вода дистиллированная	остальное

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), содержащему ДНК, кодирующую белок Cry34Ab1, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab1 и ДНК, кодирующую белок Cry3Ba1, его семени и клетке, а также к способу замедления развития устойчивости к белкам Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry3Ba1 у кукурузного корневого жука с его использованием.

Способ получения каллусной культуры болиголова пятнистого (conium maculatum l) // 2590586

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L), включающий в себя посадку семян в стерильный грунт, выращивание интактных растений в течение 1-2 месяцев с интенсивностью освещения 150 мкМ квантов/м2с, отбор эксплантов 3-4 недельного возраста, стерилизацию последовательно в 70% спирте 30 с и в 0,1% сулеме 4 мин, помещение кусочков стебля длиной 1,5-2 см на агаризованную среду Мурасиге-Скуга без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности, выделение каллуса и посадку в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста НУК и 6-БАП в условиях ламинарного бокса, при этом каллус высаживают в возрасте 30 суток, а культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности 70% в темноте, после чего проростки переносят на 6 недель на агаризованную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1,5-2,5 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3-0,8 мг/л БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса.

Способ элиминации бактериальных инфекций при культивировании клеточных культур растений с использованием наночастиц серебра // 2577995

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ элиминации бактериальной инфекции клеточных культур растений, включающий культивирование суспензионных клеточных культур с использованием антибактериального агента, где в качестве антибактериального агента используют водную суспензию наночастиц серебра диаметром 20-80 нм, которую вносят в суспензионную клеточную культуру до конечной концентрации в культуральной среде 50 мкг/мл, при этом культивирование осуществляют 24 часа в стандартных условиях.

Система контроля фотосинтетического и дыхательного со2-газообмена растений, изолированных органов и тканей in vitro // 2572349

Изобретение относится к области биохимии. Предложена система контроля фотосинтетического и дыхательного СО2-газообмена в культуре in vitro.

Способ и вещество для активируемого сайтом комплексообразования биологических молекул // 2571924

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой противомикробную композицию для желудочно-кишечного применения, содержащую смесь водорастворимого экстракта растительной ткани, содержащего полифенол, включающий танин, и экзогенного пероксида водорода; где экстракт оказывает секвестрирующий эффект на пероксид водорода в смеси и композиция уничтожает бактерии при контакте с бактериями.

Химерные вирусоподобные частицы, содержащие гемагглютинин, сходные с частицами вируса гриппа // 2569195

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения в растении или в его части химерных вирусоподобных частиц (VLP).

Способ получения клеточной суспензионной культуры трансгенного табака nicotiana tabacum l., содержащего ген uida // 2519652

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения клеточной суспензионной культуры трансгенного табака N.

Питательная среда для размножения яблони и груши in vitro // 2486237

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения. .

Растительная клеточная линия, полученная из камбия травянистого растения с запасающим корнем, и способ ее выделения // 2467067

Изобретение относится к области биохимии. .

Способ конструирования массы миокардиальных клеток и применение массы миокардиальных клеток // 2467066

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной технологии, медицине и трансплантологии. .

Комбинированное применение белков cry1ca и cry1fa для борьбы с резистентностью у насекомых // 2593961

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к совке травяной (FAW; Spodoptera frugiperda), содержащему ДНК, кодирующую белок Cry1Ca, и ДНК, кодирующую белок Cry1Fa, его семени, а также к способу предотвращения вырабатывания у насекомого совки травяной резистентности к белкам Cry1Ca и Cry1Fa с его использованием.

Органоидно-направленные наноносители // 2593956

Изобретение относится к генной инженерии. Описан способ доставки нуклеиновой кислоты в митохондрию и генетической модификации клетки, включающий воздействие на клетку композицией, содержащей по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту и по меньшей мере один органоидно-направленный наноноситель, где наноноситель доставляет по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту сквозь клеточную мембрану в митохондрию.

Получение семян гибрида lactuca sativa // 2593940

Изобретение относится к области биохимии, в частности к семени гибридного культурного салата (Lactuca sativa), которое обладает генотипом мужской стерильности, обеспечиваемым геном стерильности Ms7, а также к способу его получения, растению гибридного культурного салата, которое обладает гетерозиготным генотипом мужской стерильности, и к клетке растения гибридного культурного салата, которая обладает гетерозиготным генотипом мужской стерильности.

Трансгенное растение осины с повышенной продуктивностью и модифицированной древесиной // 2593722

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению осины со следующими признаками повышенной продуктивности - увеличенным выходом биомассы, листьями большего размера, увеличенной активностью глутаминсинтетазы и повышенной эффективностью использования азота, а также с модифицированной древесиной по сравнению с нетрансформированным растением осины, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую глутаминсинтетазу, а также к способу его получения.

Трансгенное растение березы с повышенной продуктивностью // 2593721

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению березы со следующими признаками повышенной продуктивности - увеличенным выходом биомассы, листьями большего размера, увеличенной активностью глутаминсинтетазы и повышенной эффективностью использования азота по сравнению с аналогом дикого типа, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую глутаминсинтетазу, а также к способу его получения.

Способ получения лилий, содержащих в лепестках делфинидин // 2590722

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения лилий, содержащих в лепестках делфинидин. При этом способ включает введение в лилии гена флавоноид-3′,5′-гидроксилазы (F3′5′H) из колокольчиков, введение фрагмента гена флавоноид-3′-гидроксилазы (F3′H) из лилий, введение фрагмента гена дигидрофлавонол 4-редуктазы (DFR) из лилий, синтез делфинидина в результате деятельности введенного гена F3′5′H, с подавлением при этом экспрессии эндогенного гена F3′H, который участвует в синтезе цианидина в лепестках лилий, и получение лилий, которые содержат дельфинидин в лепестках.

Способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая) // 2590703

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая), включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах, где через 7-10 дней после культивирования в стандартных условиях побеги помещают в условия с температурой 4-8°С и уровнем освещенности 500-1000 люкс на срок до 8 (лимонник китайский, береза повислая) или до 12 месяцев (рододендрон, сирень).

Применение cry1da в сочетании с cry1be для управления устойчивыми насекомыми // 2590592

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, устойчивому к кукурузной листовой совке, содержащему ДНК, кодирующую белок Cry1Da, и ДНК, кодирующую белок Cry1Be, его семени, а также к способу снижения развития устойчивости к белкам Cry1Da и Cry1Be у кукурузной листовой совки с его использованием.

Борьба с aad-1 однодольными самосевными растениями на полях двудольных сельскохозяйственных культур // 2588472

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с однодольными самосевными растениями, содержащими AAD-1 (арилоксиалканоат диоксигеназы), на поле, содержащем двудольные растения, где указанные самосевные растения содержат ген AAD-1.

Комбинированное использование белков cry1ca и cry1ab для контроля устойчивости насекомых // 2596406

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, обладающему устойчивостью к насекомым-вредителям кукурузной листовой совке и огневке сахарного тростника, содержащему ДНК, которая кодирует Cry1Ca с SEQ ID NO: 2, и ДНК, которая кодирует Cry1Ab с SEQ ID NO: 3, его семени, а также к способу понижения развития устойчивости насекомых огневки сахарного тростника и кукурузной листовой совки к белкам Cry1Ca и Cry1Ab с его использованием. Также раскрыта совокупность растений в поле, содержащая множество вышеуказанных трансгенных растений и не являющихся Bacillus thuringiensis (не-Bt) растения, и смесь семян, содержащая не-Bt семена от не Bt-растений и совокупность вышеуказанных семян. Изобретение также относится к композиции для понижения количества чешуекрылых вредителей, содержащей клетки, экспрессирующие белки Cry1Ab и Cry1Ca. Изобретение позволяет эффективно бороться с кукурузной листовой совкой и огневкой сахарного тростника. 11 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 6 пр.