Способ определения уреазной активности ротовой жидкости для скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой

Авторы патента:

Наместникова Ирина Владимировна (RU)

G01N33/52 - использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2597777:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Тверской ГМУ Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ определения обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой, отличающийся тем, что проводят определение уреазной активности следующим образом: в одну из лунок микропланшета вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером, в две другие вносят водные растворы мочевины с фосфатным буфером, содержащие уреазу с известной концентрацией 5 и 10 Ед/л соответственно, а в остальные лунки вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером и образцами ротовой жидкости, затем во все лунки вносят фенол/нитропруссидный реагент и гипохлорит, после чего измеряют оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 546 нм и рассчитывают концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Ед/л, при значении уреазной активности выше 15,85±2,11 Ед/л регистрируют обсемененность полости рта уреазопозитивной микробиотой. Осуществление изобретения позволяет выявить необходимость противомикробной терапии для профилактики образования твердых зубных отложений и воспалительных заболеваний пародонта. 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой с целью обоснованного применения противомикробных средств для профилактики образования твердых зубных отложений и воспалительных заболеваний пародонта.

Аналогом предлагаемого способа является фотометрический метод определения уреазной активности, основанный на измерении количества образующегося аммиака с помощью реактива Несслера [1].

Недостатком аналога является присутствие в реактиве Несслера двуйодистой или металлической ртути, что в связи с ее токсичностью ограничивает применение этой реакции в практическом здравоохранении.

В качестве прототипа авторы предлагают методику определения уреазной активности в моче, применяемую при осуществлении способа раннего выявления возможности инфекции мочевыводящих путей у детей 3-7 лет фотометрическим методом [2].

Суть способа в том, что для каждого образца мочи (по 0,25 мл) проводят измерение оптических плотностей в двух лунках микропланшета для выполнения иммуноферментного анализа - с 0,025 мл 10% водного раствора хлористого кальция и с 0,025 мл дистиллированной воды. Параллельно с рабочими лунками готовят 2 отрицательных и 2 положительных контроля. В одном 96-луночном микропланшете одновременно можно исследовать мочу от 46 человек. Измеряют оптические плотности контрольных и рабочих лунок с помощью микропланшетного ридера при длине волны 620 нм. Затем микропланшет с приготовленными смесями заклеивают пленкой и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа и повторно измеряют оптические плотности. Уреазную активность мочи рассчитывают по формуле:

УА (Е/л)=ΔD×11655,

где УА - уреазная активность, ΔD - разница оптической плотности опыта и контроля пробы мочи после и до термостатирования, 11655 - коэффициент перевода в Е/л, который был получен авторами опытным путем.

Недостатками прототипа являются следующие:

1. недостаточная точность метода, поскольку концентрация солей в ротовой жидкости существенно ниже, чем в моче, но реакция проводится с хлористым кальцием, при которой происходит его взаимодействие с солями мочи, что, в свою очередь, приводит к образованию плохо растворимых в воде солей, а учет реакции выполняется по определению нарастания мутности путем измерения оптической плотности при длине волны 620 нм;

2. длительность и трудозатратность при проведении исследования, поскольку время инкубации составляет 1 час и фотометрия выполняется дважды;

3. сложность перевода показателей уреазной активности в международные единицы активности ферментов (Ед/л) за счет необходимости применения рассчитанного авторами специального коэффициента перевода.

В предлагаемом нами способе определения уреазной активности ротовой жидкости для скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой перечисленные недостатки устранены.

Целью предлагаемого способа определения уреазной активности ротовой жидкости для скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой является скрининговое определение уреазной активности ротовой жидкости для оценки обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой с целью обоснованного применения противомикробных средств для профилактики образования твердых зубных отложений и воспалительных заболеваний пародонта.

Технический результат изобретения заключается в том, что в связи с низкой концентрацией солей в ротовой жидкости предложено проводить реакцию с реактивами, образующими растворимые в воде окрашенные комплексы, оптическая плотность которых пропорциональна концентрации уреазы, при этом измерение оптической плотности содержимого лунок микропланшета проводится при длине волны 546 нм.

Для определения концентрации уреазы в ротовой жидкости не применяется расчетный коэффициент, поскольку используется стандартный раствор уреазы в трех концентрациях, по измерению оптической плотности которых компьютерная программа микропланшетного ридера строит калибровочную кривую, по которой автоматически рассчитывается концентрация уреазы в образцах.

Инкубация реакционных смесей проводится в течение 20 минут с последующей однократной фотометрией.

Заявленный технический результат достигается путем измерения значений оптической плотности каждой лунки 96-луночного микропланшета при длине волны 546 нм после взаимодействия образца слюны с реактивами из коммерческого набора реагентов для определения концентрации мочевины в биологических жидкостях уреазным фенол/гипохлоритным методом (например, «Мочевина-Витал», Россия; Кат. № В 08.02) после термостатирования при температуре 37°С в течение 15 минут.

Уреазную активность определяли в 93 образцах ротовой жидкости. Ротовая жидкость для исследования собирается утром натощак и до чистки зубов в сухую стерильную посуду в объеме 0,5-1,0 мл. Для осаждения муцина ротовой жидкости с целью снижения ее вязкости (при полном сохранении уреазной активности) образец помещается в морозильную камеру холодильника (-18°С) на 5 минут. Затем проводится центрифугирование в течение 5 минут при 1500 оборотов в минуту, для продолжения анализа используется надосадочная жидкость. Используются реактивы из коммерческого набора реагентов для определения концентрации мочевины в биологических жидкостях уреазным фенол/гипохлоритным методом («Мочевина-Витал», Россия; Кат. № В 08.02).

В лунку 1 (отрицательный контроль, концентрация уреазы - 0 Ед/л) вносят 90 мкл фосфатного буфера (50 ммоль/л, рН 7,0), 10 мкл водного раствора мочевины (5 ммоль/л) и 10 мкл дистиллированной воды.

В лунки 2 и 3 (лунки с известной концентрацией уреазы для построения калибровочной кривой) вносят по 90 мкл фосфатного буфера (50 ммоль/л, рН 7,0), по 10 мкл водного раствора мочевины (5 ммоль/л) и по 10 мкл растворов уреазы (концентрацией 5, 10 Е/л соответственно), приготовленных из раствора уреазы (10 Е/л), входящего в состав набора.

Следующие лунки микропланшета (93 лунки) - опытные, в них вносят по 90 мкл фосфатного буфера (50 ммоль/л, рН 7,0), по 10 мкл водного раствора мочевины (5 ммоль/л) и по 10 мкл образцов ротовой жидкости.

Содержимое лунок осторожно перемешивают, инкубируют 5 минут при температуре 20-25°С. Затем во все лунки вносят по 100 мкл фенол/нитропруссидного реагента и гипохлорита, осторожно перемешивают и инкубируют 15 минут при температуре 37°С.

После инкубации измеряют значение оптических плотностей на микропланшетном ридере «Zenith 1100» (Anthos, Австрия) при длине волны 546 нм согласно инструкции. Предварительно в программе микропланшетного ридера обозначают лунки с отрицательным контролем, количество лунок и концентрацию в них уреазы (в Ед/л) и лунки с образцами ротовой жидкости. На основании фотометрии программа микропланшетного ридера строит калибровочную кривую, по которой программа автоматически рассчитывает концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Ед/л.

Уреаза в ротовой жидкости имеет микробное происхождение, следовательно, повышенная концентрация уреазы в ротовой жидкости является следствием обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой (актиномицеты, стафилококки, протеи, клебсиеллы и другие). Также известно, что повышенное содержание уреазы в ротовой жидкости вносит вклад в ее защелачивание, что, в свою очередь, является фактором, способствующим образованию твердых зубных отложений, что приводит либо к развитию, либо к усугублению протекания воспалительных заболеваний пародонта. Таким образом, определение уреазной активности ротовой жидкости может быть использовано для опосредованного скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой с целью обоснованного включения противомикробных средств в комплекс мер по профилактике образования твердых зубных отложений и, следовательно, воспалительных заболеваний пародонта.

Опытным путем нами при проведении опосредованного скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой у 26 добровольцев, не имеющих воспалительных заболеваний пародонта, и 48 пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями пародонта определено, что максимально допустимой величиной показателя уреазной активности, характерной для практически здоровых пациентов является значение 15,85±2,11 Ед/л. Превышение этого значения в 95% случаев характерно для обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1

Пациент К., 40 лет, обратился по поводу хронического пародонтита. Уреазная активность ротовой жидкости составила - 34,4 Ед/л. Заключаем, что в составе микробиоценоза полости рта имеется уреазопозитивная микробиота. Данному пациенту показано включение в комплекс лечебно-профилактических мер местного применения противомикробных средств и слабокислых растворов для гигиены полости рта, а также следует после употребления алкалогенных пищевых продуктов (сыр, орехи и другие) употреблять нейтральные, слабокислые напитки или фрукты.

Пример 2

Пациент H., 38 лет, обратился по поводу хронического пародонтита. Уреазная активность ротовой жидкости составила - 10,2 Ед/л. Заключаем, что в составе микробиоценоза полости рта мало уреазопозитивной микробиоты. Данному пациенту не показано включение в комплекс лечебно-профилактических мер местного применения противомикробных средств и слабокислых растворов для гигиены полости рта, а также нет необходимости после употребления алкалогенных пищевых продуктов (сыр, орехи и другие) употреблять нейтральные, слабокислые напитки или фрукты.

Список литературы

1. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям / Под ред. Л.Г. Смирновой и Е.А. Кост. - М.: Медгиз, 1960. - 963 с.

2. Способ раннего выявления возможности инфекции мочевыводящих путей у детей 3-7 лет фотометрическим методом / Федотова Т.А., Горшкова М.А., Сергеева С.Ф., Калинина О.В., Брянцева В.М. // Патент на изобретение зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 29.04.2014. №2521201.

Способ определения обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой, заключающийся в количественном определении уреазной активности, отличающийся тем, что определение уреазной активности проводят следующим образом: в одну из лунок микропланшета вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером, не содержащий уреазы, в две другие вносят водные растворы мочевины с фосфатным буфером, содержащие уреазу с известной концентрацией 5 и 10 Ед/л соответственно, а в остальные лунки вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером и образцами ротовой жидкости, затем во все лунки вносят фенол/нитропруссидный реагент и гипохлорит, после чего измеряют оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 546 нм и рассчитывают концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Ед/л, и при значении уреазной активности в ротовой жидкости выше 15,85±2,11 Ед/л регистрируют обсемененность полости рта уреазопозитивной микробиотой.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики и лечения мужского бесплодия у инфертильных пациентов, а также в программах экстракорпорального оплодотворения за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина.

Способ экспрессной оценки биосовместимости металлов и их сплавов по пилипенко п.н. // 2595812

Изобретение относится к медицинской технике, точнее к технике лабораторных исследований, в частности к способам проведения анализа биосовместимости металлических материалов, изделий и имплантатов.

Спектрофотометрический способ определения белка в биологических жидкостях // 2593361

Изобретение относится к биохимии и описывает спектрофотометрический способ определения общего белка в биологических жидкостях. Способ включает смешивание образца биологической жидкости с раствором реагента, содержащим следующие компоненты: бромпирогаллоловый красный, молибдат натрия оксалат натрия, янтарную кислоту и воду.

Способ и устройство для анализа взаимодействий биологических молекул на биологическом микрочипе на основе флуоресценции аминокислотных остатков триптофана // 2588816

Группа изобретений относится к молекулярной биологии, биофизике, биохимии и биотехнологии и касается способа анализа взаимодействий между молекулами, флуоресцирующими в ультрафиолетовой (УФ) области спектра, включая белки, пептиды, гликопротеины, протеогликаны и другие соединения, последовательность которых содержит один или более аминокислотных остатков триптофана (Trp), и биологическими молекулами, иммобилизованными в ячейках биологического микрочипа (биочипа), при котором анализ взаимодействий производится на основе измерения интенсивности УФ-флуоресценции аминокислотных остатков триптофана.

Способ определения карнозина в биологических материалах // 2585115

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для количественного определения карнозина в тканях и физиологических жидкостях.

Способ диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии в системе. // 2584592

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии. Сущность способа состоит в том, что проводят количественное определение в ядрах сперматозоидов тиоловых групп.

Способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии и диагностикум определения мужского бесплодия // 2582914

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации.

Способ детекции проникновения углеродных нанотрубок в биологическую ткань // 2582286

Изобретение относится к области нанотехнологий и молекулярной биологии. Предложен способ детекции проникновения углеродных нанотрубок (УНТ) в биологическую ткань, геном клеток которой содержит промотор гена теплового шока, сшитый с кодирующей областью дрожжевого транскрипционного фактора Gal4, и генетическую репортерную конструкцию UAS-GFP.

Способ прогнозирования энтеральной недостаточности при остром перитоните в эксперименте // 2580664

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для прогнозирования течения энтеральной недостаточности при остром перитоните в эксперименте.

Способ экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови человека // 2578027

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, отличающийся тем, что обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 15% раствором ПВП-12600 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка : ПВП (1 : 6), инкубируют 10 и 20 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение спектрофотометрически при длине волны 450 нм в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при отсутствии разницы констатируют нормальную резистентность к окислению ЛНП в сыворотке крови человека.

Способ оценки влияния снижения магния в эритроцитах периферической крови беременных на развитие позднего токсикоза // 2596798

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для оценки появления признаков позднего токсикоза. Способ включает определение содержания магния в эритроцитах периферической крови и при снижении его до 0,402±0,002 ммоль/л появляются на 7 месяце гестации признаки позднего токсикоза.

Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза // 2596791

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу определения малонового диальдегида в вегетативных органах черешни, винограда, ореха грецкого и проростках озимой пшеницы.

Способ определения угрозы функционирования плаценты при снижении пирувата на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации // 2596493

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для определения угрозы нарушения ферментативной активности в плаценте и развития плода при снижении содержания пирувата на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации.

Способ оценки снижения количества эстрадиола в связи со снижением содержания андростендиона в синцитиотрофобласте плаценты на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре беременности // 2596487

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы нарушения формирования фетоплацентарной системы и развития плода в период гестации при снижении количества эстрадиола в связи со снижением содержания андростендиона в синцитиотрофобласте плаценты на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре беременности.

Способ диагностики тяжести течения бронхиальной астмы при снижении в гладкой мускулатуре слизистой бронхов активности миоглобинпероксидазы // 2595847

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики тяжести течения бронхиальной астмы. Способ осуществляют путем выявления пероксидазной активности миоглобина гистохимическим методом после фиксации биоптатов слизистой бронхов в 10% растворе формалина в течение 5 дней, замораживания их и приготовления срезов толщиной 5 мк, которые помещают на 1 мин в бензол и окрашивают 5-8 мин при 80°C в растворе, состоящем из 100 мг бензидина в 0,85% NaCl, раствор охлаждают и фильтруют, добавляют к 9 мл раствора 1 мл 40% раствора хлористого аммония и 1 каплю 3% раствора перекиси водорода, после проведенной реакции срезы споласкивают в 0,85% NaCl и заключают в глицерин-желатину для последующего изучения пероксидазной активности миоглобина по программе «Scion».

Способ внутрипортальной озонотерапии при распространенном перитоните // 2594512

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для внутрипортальной озонотерапии при распространенном перитоните. Озонирование проводят посредством медицинского озонатора с концентрацией озона в озонокислородной смеси не менее 1000 мкг/л.

Способ персонализированного назначения неоадъювантной химиотерапии больным люминальным в раком молочной железы // 2594251

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для персонализированного назначения неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) больным люминальным В раком молочной железы.

Способ диагностики псориаза // 2594250

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики псориаза. Сущность способа состоит в том, что он включает исследование показателей системы свертывания крови и тромбообразования пациента: скорость роста сгустка крови, и/или задержку роста сгустка, и/или начальную скорость роста сгустка, и/или стационарную скорость роста сгустка, и/или размер сгустка.

Способ биохимической оценки метаболических нарушений в желчи при литогенезе // 2593340

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ оценки литогенности желчи, включающий определение в желчи у обследуемого (i) показателей холестерина (ХС, ммоль/л) в сравнении со средними значениями, принятыми за норму (k), отличающийся тем, что в желчи определяют комплекс общих липидов (ОЛ, г/л), суммарную антиокислительную активность (АОА) электрохимическим методом (в нА·с), максимум вспышки хемилюминесценции (МВХЛ, в усл.

Способ прогнозирования чувствительности к химиотерапии у больных с лимфопролиферативными заболеваниями // 2593020

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования чувствительности к химиотерапии у больных с лимфопролиферативными заболеваниями. Сущность способа состоит в том, что в сыворотке крови определяют количественные уровни маркеров тимидинкиназы-1 (TK-1) и β2-микроглобулина (β2-МГ), а также после первого курса химиотерапии активность TK-1.

Способ определения содержания продуктов протеолиза в плазме крови и диагностическая тест-система для его осуществления // 2597782

Группа изобретений относится к области медицины и иммунологии. В частности, группа изобретений относится к способам иммунологической диагностики, включающим применение как нативной молекулы, так и пептидных последовательностей фрагментов плазминогена, которые могут быть использованы в качестве универсальной системы детекции продуктов протеолиза с образованием на COOH-концах пептидной цепи лизина при проведении анализа для выявления у человека заболеваний, ассоциированных с повышенной активностью протеолитических ферментов. Группа изобретений касается также тест-системы, содержащей в качестве детектора как нативную молекулу, так и указанные пептидные последовательности. Технический результат заключается в достижении необходимой степени диссоциации комплекса антиген-антитело, присутствующего в образце, взятом у субъекта, а также в изменении конформации белков, что, в свою очередь, позволяет существенно повысить чувствительность метода определения уровня протеолитических фрагментов с C-концевым лизином, способных связываться с плазминогеном или его фрагментами. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 2 пр.