Антисмысловая регуляция экспрессии gcgr

Авторы патента:

ФРЕЙЕР Сьюзан М. (US)

БХАНОТ Санжай (US)

C12N15/113 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

A61P3/08 - для лечения глюкозного гомеостаза (панкреатические гормоны A61P 5/48)

A61K31/7088 - соединения, содержащие три или более нуклеозида или нуклеотида

Владельцы патента RU 2598709:

АЙСИС ФАРМАСЬЮТИКАЛС, ИНК. (US)

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены соединение, способное ингибировать экспрессию рецептора глюкагона (GCGR), состоящее из 12-30 соединенных нуклеозидов, композиция, снижающая экспрессию GCGR, способы лечения метаболического заболевания, снижения или задержки начала повышения уровней глюкозы в крови, профилактики заболевания, ассоциированного с GCGR, применение предложенного соединения для приготовления лекарственного средства. Предложенные соединение, композиция и способы могут быть использованы в медицине для снижения экспрессии мРНК и белка GCGR при лечении или профилактике заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ. 17 н. и 41 з.п. ф-лы, 31 табл., 19 пр.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла с именем BIOL0161USSEQ.txt, созданного 19 сентября 2012 г., размером 60 кБ. Информация о перечне последовательностей в электронном формате полностью включена сюда посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Здесь представлены способы, соединения и композиции для снижения экспрессии GCGR мРНК и белка в организме животного. Такие способы, соединения и композиции можно применять, например, для лечения, профилактики, задержки или ослабления заболеваний, связанных с нарушениями обмена веществ, в частности, с нарушениями, связанными с диабетом.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Инсулин и глюкагон представляют собой два гормона поджелудочной железы, участвующие в регуляции гомеостаза и метаболизма глюкозы. Глюкагон секретируется си-клетками островков поджелудочной железы и регулирует гомеостаз глюкозы путем регуляции продукции глюкозы в печени (Quesada et al., J. Endocrinol. 2008. 199: 5-19). Основной функцией глюкагона является противодействие действию инсулина.

Нарушение регуляции метаболизма глюкозы может быть вызвано либо дефектной секрецией и/или действием инсулина, либо нарушением супрессии глюкагона после приема пищи (Shah et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 1999. 277: E283-E290). Показано, что ингибирование секреции глюкагона после приема пищи у пациентов с диабетом значительно снижает уровень глюкозы в крови, что указывает на значительный вклад глюкагона в гипергликемию у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (Shah et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000. 85: 4053-4059).

Диабет 2 типа характеризуется нарушением секреции и/или действия инсулина, и также для многих субъектов характерны неадекватные уровни циркулирующего глюкагона натощак и после приема пищи. Увеличение коэффициента глюкагон/инсулин, вероятно, является важным фактором, определяющим гипергликемию у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (Baron et al., Diabetes. 1987. 36: 274-283). Отсутствие подавления секреции глюкагона после приема пищи у пациентов с СД 2 типа также играет важную роль в патогенезе гипергликемии после приема пищи (Henkel et al., Metabolism. 2005. 54: 1168-1173).

Глюкагон оказывает действие на ткани-мишени посредством активации его рецептора GCGR. Рецептор глюкагон является 62 кДа белком, который является членом класса В семейства рецепторов, сопряженных с G-белком (Brubaker et al., Recept. Channels. 2002. 8: 179-88). Активация GCGR приводит к передаче сигнала G-белками (G_sα и _Gq), причем G_sα активирует аденилатциклазу, вызывая продукцию цАМФ, что приводит к увеличению уровней протеинкиназы А. Сигнальный путь GCGR в печени приводит к увеличению продукции глюкозы в печени путем индукции гликогенолиза и глюконеогенеза наряду с ингибированием гликогенеза (Jiang and Zhang. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003. 284: E671-E678). GCGR экспрессируется также во внепеченочных тканях, которые включают сердце, гладкие мышцы кишечника, почки, головной мозг и жировую ткань (Hansen et al., Peptides. 1995. 16: 1163-1166).

Антисмысловое ингибирование GCGR обеспечивает уникальное преимущество по сравнению с традиционными низкомолекулярными ингибиторами, заключающееся в том, что антисмысловые ингибиторы не основаны на конкурентном связывании соединения с белком и ингибируют активность непосредственно за счет снижения экспрессии GCGR. Типичным патентом США, описывающим антисмысловые ингибиторы GCGR, является патент США №7750142, полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки. Антисмысловая технология становится эффективным средством снижения экспрессии определенных генных продуктов и, следовательно, может оказаться исключительно полезной в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских вариантах применения для регуляции GCGR.

В настоящее время отсутствуют приемлемые варианты лечения расстройств обмена веществ. Соответственно, цель настоящей заявки заключается в обеспечении соединений и способов для лечения таких заболеваний и расстройств. Настоящее изобретение относится к обнаружению новых, сильнодействующих ингибиторов экспрессии гена GCGR.

Все документы или части документов, цитируемые в настоящей заявке, включая патенты, патентные заявки, статьи, книги и монографии, но не ограничиваясь ими, включены в настоящую заявку посредством ссылок в виде частей обсуждаемых здесь документов, а также во всей своей полноте.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Здесь представлены способы, соединения и композиции для регуляции экспрессии GCGR и лечения, профилактики, задержки или ослабления заболеваний, связанных с нарушениями обмена веществ, в частности, нарушениями, связанными с диабетом, и/или их симптомом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Следует понимать, что как предшествующее общее описание, так и последующее подробное описание являются лишь иллюстративными и пояснительными и не ограничивают приведенного здесь описания, указанного в формуле изобретения. Использование единственного числа здесь включает множественное число, если иное не указано определенным образом. При использовании здесь, союз "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, использование термина "включая", а также других форм, таких как "включает" и "включенный", не является ограничивающим. Кроме того, такие термины как "элемент" или "компонент" охватывают как элементы и компоненты, содержащие один блок, так и элементы и компоненты, которые включают более чем одну субъединицу, если иное не указано определенным образом.

Заголовки разделов, использованные здесь, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие описанный объект изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в настоящей заявке, включая патенты, патентные заявки, статьи, книги и монографии, но не ограничиваясь ими, включены в настоящую заявку посредством ссылок как в виде частей обсуждаемых здесь документов, так и полностью.

Определения

Если не представлены конкретные определения, номенклатура, используемая в этой связи, а также процедуры и методики аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные здесь, являются хорошо известными методикам и обычно используются в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа можно использовать стандартные методики. В допустимых случаях все документы или части документов, цитируемые в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь этим, патенты, заявки, опубликованные заявки и другие журнальные публикации, учетные номера GENBANK и связанная с ними информация о последовательностях, получаемая из таких баз данных как Национальный центр биотехнологической информации (NCBI), и другие данные, цитируемые в настоящей заявке, включены в настоящую заявку посредством ссылок как в виде частей обсуждаемых документов, так и полностью.

Если не указано иное, то следующие термины имеют следующие значения:

"2′-O-метоксиэтил" (также 2′-МОЕ и 2′-O(СН₂)₂-ОСН₃) относится к O-метоксиэтильной модификации 2′-положения фурозильного кольца. 2′-O-метоксиэтил-модифицированная сахароза является модифицированной сахарозой.

"2′-O-метоксиэтилнуклеотид" означает нуклеотид, содержащий 2′-O-метоксиэтил-модифицированную группу сахарозы.

"3′-сайт-мишень" относится к нуклеотиду нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарному 3′-концевому нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.

"5′-сайт-мишень" относится к нуклеотиду нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарному 5′-концевому нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.

"5-метилцитозин" означает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5′-положении. 5′-метилцитозин является модифицированным нуклеиновым основанием.

"Приблизительно" означает в пределах ±10% от указанного значения. Например, если указано, что "маркер может быть повышен приблизительно на 50%", подразумевается, что маркер может быть повышен на 45-55%.

"Активный фармацевтический агент" означает вещество или вещества в составе фармацевтической композиции, которые обеспечивают терапевтически благоприятный эффект при введении субъекту. Например, в некоторых вариантах воплощения антисмысловой олигонуклеотид, мишенью которого является GCGR, является активным фармацевтическим агентом.

"Активная область-мишень" или "область-мишень" означает область, являющуюся мишенью одного или более активных антисмысловых соединений. "Активные антисмысловые соединения" означают антисмысловые соединения, которые снижают уровни целевой нуклеиновой кислоты или белка-мишени.

"Ожирение" или "тучность" относится к состоянию ожирения или чрезмерно высокому количеству жира или жировой ткани по отношению к мышечной массе тела. Количество жира включает как аспекты распределения жира в организме, так и размер и массу отложений жировой ткани. Распределение жира в организме можно оценить путем измерений кожных складок, соотношений окружности талии и бедер или таких методик как УЗИ, компьютерная томография или магнитно-резонансная томография. По данным Центра по контролю и профилактике заболеваний люди с индексом массы тела (ИМТ) от 30 и более считаются тучными. Термин "ожирение", при использовании здесь, включает состояния, при которых увеличение жира в организме выходит за пределы физических потребностей в результате чрезмерного накопления жировой ткани в организме. Термин "ожирение" включает следующие состояния: ожирение с началом заболевания во взрослом возрасте; алиментарное ожирение; эндогенное или воспалительное ожирение; эндокринное ожирение; семейное ожирение; гиперинсулиновое ожирение; гиперпластическо-гипертрофическое ожирение; ожирение при гипогонадизме; ожирение при гипотиреозе; пожизненное ожирение; патологическое ожирение и экзогенное ожирение, но не ограничивается ими.

"Сопутствующее введение" означает совместное введение двух агентов любым способом, при котором фармакологические эффекты обоих агентов проявляются у пациента одновременно. Сопутствующее введение не требует введения обоих агентов в составе одной фармацевтической композиции, в одной и той же лекарственной форме или одним и тем же путем введения. Эффекты обоих препаратов не обязательно проявляются сами по себе в одно и то же время. Указанные эффекты должны лишь взаимно перекрываться в течение некоторого периода времени, и их продолжительность не обязательно должна быть одинакова.

"Введение" означает предоставление агента животному и включает, не ограничиваясь этим, введение медицинским работником и самостоятельное введение.

"Агент" означает активное вещество, которое может обеспечить терапевтический благоприятный эффект при введении в организм животного. "Первый агент" означает терапевтическое соединение, представленное здесь. Например, первый агент может являться антисмысловым олигонуклеотидом, мишенью которого является GCGR. "Второй агент" означает второе терапевтическое соединение, описанное здесь (например, второй антисмысловой олигонуклеотид, мишенью которого является GCGR), и/или терапевтическое соединение для воздействия на мишени, отличающиеся от GCGR.

"Облегчение" относится к уменьшению по меньшей мере одного показателя, признака или симптома ассоциированного заболевания, расстройства или состояния. Степень тяжести показателей можно определить с помощью субъективных или объективных средств, известных специалистам в данной области техники.

"Животное" относится к человеку или животному, не являющемуся человеком, включая, но не ограничиваясь этим, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и не являющихся человеком приматов, в том числе обезьян и шимпанзе, но не ограничиваясь ими.

"Антисмысловая активность" означает любую обнаруживаемую или измеримую активность, относящуюся к гибридизации антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах воплощения антисмысловая активность является уменьшением количества или экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или белка, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью.

"Антисмысловое соединение" означает олигомерное соединение, способное подвергаться гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью за счет водородных связей.

"Антисмысловое ингибирование" означает снижение уровней нуклеиновой кислоты-мишени или уровней белка-мишени в присутствии антисмыслового соединения, комплементарного нуклеиновой кислоте-мишени, по сравнению с уровнями нуклеиновой кислоты-мишени или уровнями белка-мишени в отсутствие антисмыслового соединения.

"Антисмысловой олигонуклеотид" означает одноцепочечный олигонуклеотид, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, дающей возможность гибридизации с соответствующей областью или сегментом нуклеиновой кислоты-мишени.

"Бициклическая сахароза" означает фурозильное кольцо, модифицированное путем образования мостика между двумя негеминальными кольцевьми атомами. Бициклическая сахароза является модифицированной сахарозой.

"Бициклическая нуклеиновая кислота" или "БНА" относится к нуклеозиду или нуклеотиду, в котором фуранозная часть нуклеозида или нуклеотида включает мостик, соединяющий два атома углерода в фуранозном кольце, тем самым образуя бициклическую кольцевую систему.

"Кэп-структура" или "концевая кэп-группа" означает химическую модификацию, внедренную на любом конце антисмыслового соединения.

"Химически различная область" относится к области антисмыслового соединения, которая некоторым образом химически отличается от другой области того же антисмыслового соединения. Например, область, содержащая 2′-O-метоксиэтилнуклеотиды, химически отличается от области, содержащей нуклеотиды без 2′-O-метоксиэтильных модификаций.

"Химерное антисмысловое соединение" означает антисмысловое соединение, которое имеет по меньшей мере две химически различные области.

"Совместное введение" означает введение двух или более агентов субъекту. Указанные два или более агентов могут находиться в составе одной фармацевтической композиции или могут находиться в раздельных фармацевтических композициях. Каждый из указанных двух или более агентов можно вводить одинаковым путем или различными путями введения. Совместное введение охватывает параллельное или последовательное введение.

"Холестерин" является стериновой молекулой, присутствующей в клеточных мембранах всех животных тканей. Холестерин должен транспортироваться в плазме крови животных липопротеинами, включающими липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины промежуточной плотности (ЛППП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП). "Холестерин плазмы" относится к сумме всех липопротеинов (ЛПОНП, ЛППП, ЛПНП, ЛПВП), этерифицированному и/или неэтерифицированному холестерину, присутствующему в плазме или сыворотке.

"Комплементарность" означает способность к спариванию между нуклеиновыми основаниями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.

"Смежные нуклеиновые основания" означает нуклеиновые основания, непосредственно примыкающие друг к другу.

"Дезоксирибонуклеотид" означает нуклеотид, имеющий атом водорода по 2′-положению сахарозной части нуклеотида. Дезоксирибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из множества заместителей.

"Сахарный диабет" или "диабет" является синдромом, характеризующимся расстройством метаболизма и аномально высоким уровнем сахара в крови (гипергликемией) в результате недостаточного уровня инсулина или снижения чувствительности к инсулину. Характерными симптомами являются избыточный диурез (полиурия) из-за высокого уровня глюкозы в крови, избыточная жажда и повышенное потребление жидкости (полидипсия) для компенсации повышенного мочеиспускания, затуманенное зрение из-за влияния высокого уровня глюкозы в крови на оптическую систему глаза, необъяснимая потеря веса и вялость.

"Диабетическая дислипидемия" или "сахарный диабет 2 типа с дислипидемией" означает состояние, характеризующееся сахарным диабетом 2 типа, пониженным ЛПВП-X, повышенным уровнем триглицеридов и повышенным уровнем небольших плотных частиц ЛПНП.

"Разбавитель" означает ингредиент композиции, не обладающий фармакологической активностью, но являющийся фармацевтически необходимым или желательным. Например, разбавитель в композиции для инъекций может являться жидкостью, например, физиологическим раствором.

"Дислипидемия" относится к расстройству метаболизма липидов и/или липопротеинов, в том числе избыточной продукции или недостаточности липидов и/или липопротеинов. Дислипидемии могут проявляться повышением уровня липидов, например, холестерина и триглицеридов, а также липопротеинов, например, холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП).

"Дозированная форма" означает форму, в которой представлен фармацевтический агент, например, пилюлю, таблетку или другую дозированную форму, известную в данной области техники. В некоторых вариантах воплощения дозированная форма представляет собой флакон, содержащий лиофилизированный антисмысловой олигонуклеотид. В некоторых вариантах воплощения дозированная форма представляет собой флакон, содержащий восстановленный антисмысловой олигонуклеотид.

"Доза" означает определенное количество фармацевтического агента, вводимое при однократном приеме или в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах воплощения дозу можно вводить в одном, двух или более болюсах, таблетках или инъекциях. Например, в некоторых вариантах воплощения, где желательно подкожное введение, для желательной дозы необходим объем, с трудом вводимый путем однократной инъекции; таким образом, для достижения желательной дозы можно использовать две или более инъекции. В некоторых вариантах воплощения фармацевтический агент вводят путем вливания, выполняемого в течение длительного периода времени или непрерывно. Дозы можно определять как количество фармацевтического агента в час, день, неделю или месяц.

"Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" означает количество активного фармацевтического агента, достаточное для осуществления желаемого физиологического результата у индивида, нуждающегося в агенте. Эффективное количество может варьироваться от индивида к индивиду в зависимости от здоровья и физического состояния индивида, подлежащего лечению, таксономической группы индивидов, подлежащих лечению, состава композиции, оценки медицинского состояния индивида и других значимых факторов.

"Полностью комплементарный" или "на 100% комплементарный" означает, что каждому нуклеиновому основанию последовательности нуклеиновых оснований первой нуклеиновой кислоты соответствует комплементарное нуклеиновое основание во второй последовательности нуклеиновых оснований второй нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения первая нуклеиновая кислота является антисмысловым соединением, а нуклеиновая кислота-мишень является второй нуклеиновой кислотой.

"Гэпмер" означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, поддерживающих расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, имеющими один или более нуклеозидов, причем нуклеозиды, содержащиеся во внутренней области, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, содержащихся во внешних областях. Внутренняя область может называться "сегментом разрыва", а внешние области могут называться "сегментами крыльев".

"С расширенным разрывом" означает химерное антисмысловое соединение, имеющее сегмент разрыва из 12 или более смежных 2′-дезоксирибонуклеозидов, расположенных между и в непосредственной близости от 5′- и 3′-сегментов крыльев, имеющих от одного до шести нуклеозидов.

"Рецептор глюкагона" или "GCGR" означает любую нуклеиновую кислоту или белок GCGR.

"Экспрессия GCGR" означает уровень мРНК, транскрибируемой с гена, кодирующего GCGR, или уровень белка, транслируемого с мРНК. Экспрессию GCGR можно определять известными в данной области техники способами, например, нозерн- или вестерн-блоттингом.

"Нуклеиновая кислота GCGR" означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую GCGR. Например, в некоторых вариантах воплощения нуклеиновая кислота GCGR включает последовательность ДНК, кодирующую GCGR, последовательность РНК, транскрибируемую с ДНК, кодирующей GCGR (в том числе геномной ДНК, включающей интроны и экзоны), и последовательность мРНК, кодирующую GCGR. "мРНК GCGR " означает мРНК, кодирующую белок GCGR.

"Глюкоза" является моносахаридом, используемым клетками в качестве источника энергии, и интермедиатом воспаления. "Глюкоза плазмы" относится к глюкозе, присутствующей в плазме.

"Гибридизация" означает отжиг комплементарных молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты включают антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень.

"Гиперлипидемия" или "гиперлипемия" представляет собой состояние, характеризующееся повышенным содержанием липидов в сыворотке или циркулирующих липидов (в плазме). Это состояние проявляется аномально высокой концентрацией жиров. Липидные фракции циркулирующей крови представляют собой холестерин, липопротеины низкой плотности, липопротеины очень низкой плотности и триглицериды.

"Гипертриглицеридемия" означает состояние, характеризующееся повышенными уровнями триглицеридов.

"Выявление" или "выбор животного с метаболическим расстройством" означает выявление или выбор субъекта с диагнозом метаболического заболевания или метаболического расстройства или выявление, или выбор субъекта с любым симптомом метаболического заболевания, включая метаболический синдром, гипергликемию, гипертриглицеридемию, гипертензию, повышенную инсулинорезистентность, пониженную чувствительность к инсулину, избыточную массу тела и/или избыток жира или любую комбинацию вышеперечисленного, но не ограничиваясь ими. Такое выявление можно осуществить любым способом, включая, но не ограничиваясь этим, стандартные клинические анализы или оценки, например, измерение глюкозы в сыворотке или циркулирующей глюкозы (в плазме) крови, измерение триглицеридов в сыворотке или циркулирующих триглицеридов (в плазме), измерение артериального давления, измерение жира, измерение массы тела и т.п.

"Непосредственно примыкающий" означает отсутствие промежуточных элементов между непосредственно примыкающими элементами.

"Индивид" или "субъект", или "животное" означает человека или животное, не являющееся человеком, выбранное для лечения или терапии.

"Ингибирование экспрессии или активности" относится к снижению или блокаде экспрессии или активности РНК или белка и не обязательно указывает на полную ликвидацию экспрессии или активности.

Инсулинорезистентность определяют как состояние, при котором нормального количества инсулина недостаточно для получения нормального ответа жировых, мышечных клеток и клеток печени на инсулин. Инсулинорезистентность жировых клеток приводит к гидролизу хранящихся триглицеридов, что повышает уровень свободных жирных кислот в плазме крови. Инсулинорезистентность в мышцах снижает поглощение глюкозы, в то время как инсулинорезистентность в печени снижает хранение глюкозы, причем оба указанные эффекта служат для повышения уровня глюкозы в крови. Высокие уровни инсулина и глюкозы в плазме, обусловленные инсулинорезистентностью, часто приводят к метаболическому синдрому и диабету 2 типа.

"Чувствительность к инсулину" является мерой эффективности переработки глюкозы в организме индивида. Индивид с высокой чувствительностью к инсулину эффективно перерабатывает глюкозу, в то время как индивид с низкой чувствительностью к инсулину неэффективно перерабатывает глюкозу.

"Межнуклеозидная связь" относится к химической связи между нуклеозидами.

"Внутривенное введение" означает введение в вену.

"Связанные нуклеозиды" означает соседние нуклеозиды, связанные друг с другом.

"Гиполипидемическая терапия" или "гиполипидемический агент" означает терапевтическую схему для обеспечения снижения уровня одного или более липидов у субъекта. В некоторых вариантах воплощения гиполипидемическую терапию осуществляют для снижения уровня одного или более из АроВ, общего холестерина, ЛПНП-Х, ЛПОНП-Х, ЛППП-Х, не-ЛПВП-Х, триглицеридов, мелких плотных частиц ЛПНП и Lp(a) у субъекта. Примеры гиполипидемических терапевтических средств включают статины, фибраты и ингибиторы МТР.

"Основные факторы риска" относится к факторам, способствующим высокому риску конкретного заболевания или состояния. В некоторых вариантах воплощения основные факторы риска развития коронарной болезни сердца включают, без ограничения, курение, гипертензию, низкий ЛПВП-Х, семейный анамнез коронарной болезни сердца, возраст и другие факторы, описанные здесь.

"Метаболическое заболевание" или "метаболическое расстройство" относится к состоянию, характеризующемуся изменением или нарушением метаболической функции. "Метаболический" и "метаболизм" представляют собой термины, хорошо известные в данной области техники и обычно включающие весь спектр биохимических процессов, протекающих в живом организме. Метаболические заболевания или расстройства включают ожирение, диабет, гипергликемию, преддиабет, неалкогольную жировую дистрофию печени (НАЖДП), метаболический синдром, инсулинорезистентность, диабетическую дислипидемию или гипертриглицеридемию, или их комбинацию, но не ограничиваются ими.

"Метаболический синдром" означает состояние, характеризующееся кластеризацией липидных и нелипидных факторов сердечно-сосудистого риска метаболического происхождения. В некоторых вариантах воплощения метаболический синдром выявляют по наличию любых 3-х из следующих факторов: окружность талии более 102 см у мужчин или более 88 см у женщин; уровень триглицеридов в сыворотке по меньшей мере 150 мг/дл; ЛПВП-Х менее 40 мг/дл у мужчин и менее 50 мг/дл у женщин; артериальное давление по меньшей мере 130/85 мм рт.ст.; и уровень глюкозы натощак по меньшей мере 110 мг/дл. Эти детерминанты легко измерить в клинической практике (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).

"Несовпадение" или "некомплементарное нуклеиновое основание" относится к случаю, когда нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты неспособно спариваться с соответствующим нуклеиновым основанием второй нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты-мишени.

"Смешанная дислипидемия" означает состояние, характеризующееся повышенными уровнями холестерина и триглицеридов.

"Модифицированная межнуклеозидная связь" относится к замещению или любому изменению природной межнуклеозидной связи (т.е. фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).

"Модифицированное нуклеиновое основание" относится к любому нуклеиновому основанию, кроме аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. "Немодифицированное нуклеиновое основание" означает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).

"Модифицированный нуклеозид" означает нуклеозид, независимо имеющий модифицированную сахарозную группу или модифицированное нуклеиновое основание.

"Модифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, независимо имеющий модифицированную сахарозную группу, модифицированную межнуклеозидную связь или модифицированное нуклеиновое основание. "Модифицированный нуклеозид" означает нуклеозид, независимо имеющий модифицированную сахарозную группу или модифицированное нуклеиновое основание.

"Модифицированный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, включающий по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.

"Модифицированная сахароза" относится к замещению или изменению природной сахарозы.

"Мотив" означает схему химически различных областей в антисмысловом соединении.

"Природная межнуклеозидная связь" означает 3′-5′-фосфодиэфирную связь.

"Природная сахарозная группа" означает сахарозу, присутствующую в ДНК (2′-Н) или РНК (2′-ОН).

"Неалкогольная жировая дистрофия печени" или "НАЖДП" означает состояние, характеризующееся жировым воспалением печени, не обусловленным чрезмерным употреблением алкоголя (например, потреблением алкоголя свыше 20 г/сутки). В некоторых вариантах воплощения НАЖДП связана с инсулинорезистентностью и метаболическим синдромом. НАЖДП охватывает спектр заболеваний, начиная от простого накопления триглицеридов в гепатоцитах (стеатоз печени) до стеатоза печени с воспалением (стеатогепатита), фиброза и цирроза печени.

"Неалкогольный стеатогепатит" (НАСГ) происходит при прогрессировании НАЖБП за стадию отложения триглицеридов. Для развития НАСГ требуется "второй удар", способный индуцировать некроз, воспаление и фиброз. Потенциальные факторы второго удара можно разделить на широкие группы: факторы, вызывающие усиление окислительного стресса, и факторы, способствующие экспрессии провоспалительных цитокинов.

"Нуклеиновая кислота" относится к молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты, двуцепочечные нуклеиновые кислоты, малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (миРНК) и микроРНК. Нуклеиновая кислота может также включать комбинацию этих элементов в одной молекуле.

"Нуклеиновое основание" означает гетероциклическую группу, способную спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.

"Последовательность нуклеиновых оснований" означает порядок смежных нуклеиновых оснований независимо от любой модификации сахарозы, связи или нуклеинового основания.

"Нуклеозид" означает нуклеиновое основание, связанное с сахарозой.

"Нуклеозидный миметик" включает структуры, используемые для замены сахарозы или сахарозы и основания и, необязательно, связи в одном или более положений олигомерного соединения, например, нуклеозидные миметики, имеющие морфолиновые, циклогексенильные, циклогексильные, тетрагидропиранильные, бицикло или трициклогруппы, сахарозные миметики, например, нефуранозные сахарозные единицы.

"Нуклеотид" означает нуклеозид, имеющий фосфатную группу, ковалентно присоединенную к сахарозному фрагменту нуклеозида.

"Нуклеотидный миметик" включает структуры, используемые для замены нуклеозида и связи в одном или более положений олигомерного соединения, например, пептидные нуклеиновые кислоты или морфолиногруппы (морфолиногруппы, соединенные -N(H)-C(=O)-O- или другой нефосфодиэфирной связью).

"Олигомерное соединение" или "олигомер" относится к полимерной структуре, содержащей две или более субструктур и способной к гибридизации с областью молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения олигомерные соединения являются олигонуклеозидами. В некоторых вариантах воплощения олигомерные соединения являются олигонуклеотидами. В некоторых вариантах воплощения олигомерные соединения являются антисмысловыми соединениями. В некоторых вариантах воплощения олигомерные соединения являются антисмысловыми олигонуклеотидами. В некоторых вариантах воплощения олигомерные соединения являются химерными олигонуклеотидами.

"Олигонуклеотид" означает полимер из соединенных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным независимо друг от Друга.

"Парентеральное введение" означает введение посредством инъекции или вливания. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение. Введение может быть непрерывным или постоянным, или краткосрочным, или периодическим.

"Пептид" означает молекулу, образованную путем соединения по меньшей мере двух аминокислот посредством амидных связей. Пептид относится к полипептидам и белкам.

"Фармацевтический агент" означает вещество, обеспечивающее терапевтический благоприятный эффект при введении в организм индивида. Например, в некоторых вариантах воплощения антисмысловой олигонуклеотид, мишенью которого является GCGR, является фармацевтическим агентом.

"Фармацевтическая композиция" означает смесь веществ, подходящую для введения в организм индивида. Например, фармацевтическая композиция может включать один или более активных агентов и стерильный водный раствор.

"Фармацевтически приемлемый носитель" означает среду или разбавитель, который не оказывает вреда структуре олигонуклеотида. Некоторые из таких носителей обеспечивают возможность составления фармацевтических композиций в виде, например, таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и пастилок, для перорального введения субъекту. Например, фармацевтически приемлемый носитель может являться стерильным водным раствором.

"Фармацевтически приемлемое производное" охватывает фармацевтически приемлемые соли, конъюгаты, пролекарства или изомеры соединений, описанных здесь.

"Фармацевтически приемлемые соли" означает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е. соли, сохраняющие желательную биологическую активность исходного олигонуклеотида и не придающие ему нежелательного токсического действия.

"Фосфортиоатная связь" означает связь между нуклеозидами, где фосфодиэфирная связь модифицирована путем замены одного из немостиковых атомов кислорода атомом серы. Фосфортиоатная связь является модифицированной межнуклеозидной связью.

"Фрагмент" означает определенное количество смежных (т.е. соединенных) нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения фрагмент представляет собой определенное количество смежных нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах воплощения фрагмент представляет собой определенное количество смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения.

"Предотвратить" относится к задержке или предупреждению наступления или развития заболевания, расстройства или состояния на период времени от нескольких минут до неопределенного срока. Термин "предотвратить" также означает снижение риска развития заболевания, расстройства или состояния.

"Пролекарство" означает терапевтический агент, который получают в неактивной форме, преобразующейся в активную форму в организме или его клетках под действием эндогенных ферментов или других химических веществ или условий.

"Побочные эффекты" означает физиологические реакции, относящиеся к лечению и не являющиеся желательными эффектами. В некоторых вариантах воплощения побочные эффекты включают реакции в месте инъекции, аномалии анализов функции печени, аномалии функции почек, гепатотоксичность, нефротоксичность, аномалии центральной нервной системы, миопатии и недомогание. Например, повышение уровня аминотрансфераз в сыворотке может указывать на гепатотоксичность или аномалию функции печени. Например, повышение уровня билирубина может указывать на гепатотоксичность или аномалии функции печени.

"Одноцепочечный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, не гибридизованный с комплементарной цепью.

"Специфически гибридизуемый" относится к антисмысловому соединению, обладающему достаточной степенью комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью для получения желательного эффекта при минимальном или отсутствующем взаимодействии с нуклеиновыми кислотами, не являющимися мишенями, в условиях, когда желательно специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае анализов in vivo и при лечении.

"Статин" означает агент, ингибирующий активность ГМГ-КоА-редуктазы.

"Подкожное введение" означает введение непосредственно под кожу.

"Адресное воздействие" или "для адресного воздействия" означает процесс конструирования и выбора антисмыслового соединения, специфически гибридизующегося с нуклеиновой кислотой-мишенью и вызывающего желательный эффект.

Все из терминов "нуклеиновая кислота-мишень", "РНК-мишень" и "РНК-транскрипт-мишень" относятся к нуклеиновой кислоте, способной являться мишенью антисмысловых соединений.

"Сегмент-мишень" означает последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую происходит адресное воздействие антисмыслового соединения. "5′-сайт-мишень" относится к концевому 5′-нуклеотиду сегмента-мишени. "3′-сайт-мишень" относится к концевому 3′-нуклеотиду сегмента-мишени.

"Терапевтически эффективное количество" означает количество агента, обеспечивающее терапевтический благоприятный эффект для индивида.

"Терапевтическое изменение образа жизни" означает изменения питания и образа жизни, предназначенные для снижения массы жира/жировой ткани и/или холестерина. Такое изменение может снизить риск развития сердечного заболевания и может включать рекомендации по потреблению общего ежедневного количества калорий, общего жира, насыщенных жиров, полиненасыщенных жиров, мононенасыщенных жиров, углеводов, белка, холестерина, нерастворимых волокон, а также рекомендации по физической активности.

"Триглицерид" или "ТГ" означает липид или нейтральный жир, состоящий из глицерина в сочетании с тремя молекулами жирной кислоты.

"Диабет 2 типа" (также известный как "сахарный диабет 2 типа" и ранее называвшийся "сахарным диабетом 2 типа", "инсулин-независимым сахарным диабетом (ИНСД)", "диабетом, связанным с ожирением" или "диабетом зрелого возраста") представляет собой метаболическое расстройство, в первую очередь характеризующееся инсулинорезистентностью, относительной недостаточностью инсулина и гипергликемией.

"Лечить" относится к введению фармацевтической композиции животному для стимуляции изменения или улучшения заболевания, расстройства или состояния.

"Немодифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, состоящий из природных нуклеиновых оснований, сахарозных групп и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах воплощения немодифицированный нуклеотид является РНК-нуклеотидом (т.е. β-D-рибонуклеозидами) или ДНК-нуклеотидом (т.е. β-D-дезоксирибонуклеозидом).

Некоторые варианты воплощения

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способы, соединения и композиции для ингибирования экспрессии GCGR.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR. В некоторых вариантах воплощения нуклеиновая кислота GCGR является любой из последовательностей, приведенных под учетным номером GENBANK NM_000160.3 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO:1) или под учетным номером GENBANK NW_926918.1, обрезанной от нуклеотидов 16865000 до 16885000 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах воплощения GCGR обладает последовательностью макака-резуса, приведенной как SEQ ID NO:3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, состоят из 12-30 соединенных нуклеозидов и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединение или композиция, представленное здесь, является или включает ISIS NOs:449884, 459014, 398471, 448766 или 459157.

В некоторых вариантах воплощения указанное соединение или композиция является или включает ISIS NO:449884.

В некоторых вариантах воплощения указанное соединение или композиция является или включает ISIS NO:459014.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 15-30 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, состоят из 15-30 соединенных нуклеозидов и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединение или композиция, представленное здесь, является или включает ISIS NO:449884.

В некоторых вариантах воплощения соединение или композиция, представленное здесь, является или включает ISIS NO:459014.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-21 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-21 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-35 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-35 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 2O-35 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:11, 17, 31, 80 или 85.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, могут состоять из 17-35 соединенных нуклеозидов и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NO:11.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-30 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-30 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-25 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-25 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, описанные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-24 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-24 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-23 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-23 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-22 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-22 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-21 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-21 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарной фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4-115.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, и обладают последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16 или 17 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:11, 17, 31, 80 или 85.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают соль модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, дополнительно включают фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых вариантах воплощения последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% комплементарна любой из SEQ ID NOs:1-3 согласно измерению на всем протяжении модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах воплощения последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида обладает по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью с любой из SEQ ID NOs:4-115 согласно измерению на всем протяжении модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах воплощения последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида обладает по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью с любой из SEQ ID NOs:11, 17, 31, 80 или 85 согласно измерению на всем протяжении модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах воплощения последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида обладает по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью с SEQ ID NO:11 согласно измерению на всем протяжении модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах воплощения последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида обладает по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%или 100% идентичностью с SEQ ID NO:80 согласно измерению на всем протяжении модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах воплощения мишенью антисмысловых соединений или модифицированных олигонуклеотидов является область нуклеиновой кислоты GCGR. В некоторых вариантах воплощения такие соединения или олигонуклеотиды, мишенью которых является область нуклеиновой кислоты GCGR, имеют непрерывный фрагмент из нуклеиновых оснований, комплементарный фрагменту из нуклеиновых оснований равной длины указанной области. Например, указанный фрагмент может являться фрагментом из по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований, комплементарным фрагменту равной длины области, указанной здесь. В некоторых вариантах воплощения мишенью таких соединений или олигонуклеотида являются следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:2: 6691-6707, 7267-7280, 7267-7283, 7267-7284, 7267-7285, 7267-7286, 7267-7287, 7267-7457, 7268-7284, 7268-7285, 7268-7286, 7268-7287, 7269-7285, 7269-7286, 7269-7287, 727O-7285, 727O-7286, 727O-7287, 7271-7287, 7291-7312, 7292-7308, 7292-7309, 7292-7310, 7292-7311, 7292-7312, 7293-7309, 7293-7310, 7293-7311, 7293-7312, 7294-7310, 7294-7311, 7294-7312, 7295-7310, 7295-7311, 7295-7312, 7296-7312, 7316-7332, 7316-7333, 7316-7334, 7316-7335, 7316-7336, 7317-7333, 7317-7334, 7317-7335, 7317-7336, 7318-7334, 7318-7335, 7318-7336, 7319-7334, 7319-7335, 7319-7336, 732O-7336, 7339-7405, 7339-7406, 7339-7407, 7339-7408, 7339-7409, 7341-7354, 7341-7357, 7341-7358, 7341-7359, 7341-7360, 7341-7361, 7342-7358, 7342-7359, 7342-7360, 7342-7361, 7343-7359, 7343-7360, 7343-7361, 7344-7360, 7344-7361, 7345-7361, 7347-7456, 7365-7381, 7365-7382, 7365-7383, 7365-7384, 7365-7385, 7366-7382, 7366-7383, 7366-7384, 7366-7385, 7367-7383, 7367-7384, 7367-7385, 7368-7383, 7368-7384, 7368-7385, 7369-7385, 7388-7382, 7389-7407, 7389-7408, 7389-7409, 739O-7406, 739O-7407, 739O-7408, 739O-7409, 7391-7407, 7391-7408, 7391-7409, 7392-7407, 7392-7408, 7392-7409, 7393-7409, 7413-7433, 7414-7430, 7414-7431, 7414-7432, 7414-7433, 7415-7431, 7415-7432, 7415-7433, 7416-7432, 7416-7433, 7417-7433, 7437-7453, 7437-7454, 7437-7455, 7437-7456, 7437-7457, 7438-7454, 7438-7455, 7438-7456, 7438-7457, 7439-7455, 7439-7456, 7439-7457, 744O-7455, 744O-7456, 744O-7457, 7441-7457, 774O-7756, 7782-7798, 7782-7801, 7782-7913, 7783-7799, 7785-7801, 7785-7913, 7897-7913, 803O-8049, 8132-8151, 8133-8152, 8133-8155, 8133-8156, 8133-8157, 8133-8159, 8139-8155, 8139-8156, 8139-8157, 8139-8159, 814O-8156, 814O-8157, 814O-8159, 8141-8157, 8141-8159, 8141-8160, 8143-8159, 8144-8160, 8386-8402, 8448-8464, 8454-8473, 9002-9019, 9002-9020, 9002-9021, 9002-9026, 9003-9019, 9003-9020, 9003-9021, 9003-9026, 9004-9020, 9004-9021, 9004-9026, 9008-9027, 901O-9026, 913O-9146, 9245-9264, 9246-9262, 9249-9265, 9592-9611, 9804-9823, 9808-9824, 10667-10683, 10667-10684, 10667-10695, 10668-10684, 10668-10695, 10676-10683, 10676-10684, 10676-10695, 10718-10734, 10772-10788, 11667-11686, 11667-11691, 11667-11695, 11675-11691, 11675-11695, 11676-11695, 11724-11741, 11724-11743, 11725-11741, 11725-11743, 11818-11834, 11819-11835, 11819-11838, 11819-11842, 11826-11842, 11962-11978, 12025-12044, 12025-12046, 12025-12049, 12025-12051, 12025-12052, 12026-12042, 12026-12044, 12026-12046, 12026-12047, 12026-12048, 12026-12049, 12026-12050, 12026-12051, 12026-12055, 12027-12046, 12027-12049, 12027-12051, 12027-12052, 12028-12044, 12028-12046, 12028-12047, 12028-12048, 12028-12049, 12028-12050, 12028-12051, 12028-12055, 12029-12045, 12029-12046, 12029-12047, 12029-12048, 12029-12049, 12029-12050, 12029-12051, 12029-12055, 1203O-12046, 1203O-12047, 1203O-12048, 1203O-12049, 1203O-12050, 1203O-12051, 1203O-12055, 12031-12045, 12031-12048, 12031-12049, 12031-12050, 12031-12051, 12031-12055, 12032-12048, 12032-12049, 12032-12050, 12032-12051, 12032-12052, 12032-12055, 12033-12049, 12033-12050, 12033-12051, 12033-12052, 12033-12055, 12035-12051, 12035-12055, 12036-12055, 12175-12091, 12175-12094, 12178-12194, 13003-13022, 13034-13050, 13303-13022, 13314-13333, 13366-13382, 1349O-13509, 13515-13534, 14138-14157, 14779-14795, 15007-15023, 15075-15094, 15075-15113, 15075-15121, 15075-15127, 15075-15133, 15094-15113, 15094-15121, 15094-15127, 15094-15133, 15102-15121, 15102-15127, 15102-15133, 15108-15127, 15108-15133, 15114-15133, 15374-15390, 15716-15735, 15742-15761, 15742-15762, 15743-15762, 15744-15760, 15744-15762, 15744-15763, 15744-15764, 15744-15765, 15745-15764, 15745-15765, 15746-15760, 15746-15762, 15746-15763, 15746-15764, 15746-15765, 15747-15763, 15747-15764, 15747-15765, 15748-15764, 15748-15765 и 15749-15765.

В некоторых вариантах воплощения мишенью следующих антисмысловых соединений является область SEQ ID NO:2, нуклеиновая кислота, кодирующая GCGR человека и демонстрирующая по меньшей мере 70% ингибирование последовательности гена GCGR: ISIS NOs:325568, 310457, 449823, 450035, 449881, 449882, 398457, 449883, 449884, 449885, 450039, 449894, 449895, 450040, 398471, 449905, 449906, 449907, 449908, 449910, 449912, 398486, 449916, 449917, 449922, 450049, 450050, 448762, 448766, 450054, 449759, 449760, 436034, 450059, 448799, 449938, 448802, 398585, 449944, 449945, 448806, 450061, 449948, 449949, 449951, 398504, 449952, 449953, 449954, 448817, 449955, 449956, 449958, 448818, 449960, 448819, 449797, 448840, 449967, 448848, 448850, 449819, 448860, 449836, 450074, 448890, 448897, 448901, 448903, 448905, 449851, 449856, 449858, 449859, 449860, 449861, 315163, 459032, 459046, 459076, 459157, 459010, 459011, 459058, 459088, 459087, 459086, 459083, 459082, 459158, 448754, 448718, 448730, 448738, 436140, 398455, 398470, 398491, 398501, 398503, 398506, 398507, 398508, 304535, 304538, 304539, 436141 и 436164.

В некоторых вариантах воплощения мишенью следующих антисмысловых соединений является область SEQ ID NO:2, нуклеиновая кислота, кодирующая GCGR человека и демонстрирующая по меньшей мере 75% ингибирование последовательности гена GCGR: ISIS NOs:325568, 310457, 449823, 450035, 449881, 449882, 398457, 449883, 449884, 449885, 450039, 449894, 449895, 450040, 398471, 449905, 449906, 449907, 449908, 449910, 449912, 398486, 449916, 449917, 449922, 450049, 450050, 448762, 448766, 450054, 449759, 449760, 450059, 448799, 449938, 448802, 398585, 449944, 449945, 448806, 450061, 449948, 449949, 449951, 398504, 449952, 449953, 449954, 448817, 449955, 449956, 449958, 448818, 449960, 448819, 449797, 448840, 449967, 448848, 448850, 449819, 448860, 449836, 450074, 448890, 448897, 448901, 448903, 448905, 449851, 449856, 449858, 449859, 449860, 449861, 459032, 459076, 459157, 459010, 459011, 459058, 459088, 459087, 459086, 459083, 459082, 459158, 448754, 448718, 448738, 436140, 398455, 398470, 398491, 398501, 398503, 398506, 398507, 398508, 304535, 304538, 304539, 436141 и 436164.

В некоторых вариантах воплощения мишенью следующих антисмысловых соединений является область SEQ ID NO:2, нуклеиновая кислота, кодирующая GCGR человека и демонстрирующая по меньшей мере 80% ингибирование последовательности гена GCGR: ISIS NOs:310457, 449823, 450035, 449881, 449882, 398457, 449883, 449884, 449885, 450039, 449894, 449895, 450040, 398471, 449905, 449906, 449907, 449908, 449910, 449912, 398486, 449916, 449917, 449922, 450049, 450050, 448762, 448766, 450054, 449759, 449760, 450059, 448799, 449938, 448802, 398585, 449944, 449945, 448806, 450061, 449948, 449949, 449951, 398504, 449952, 449953, 449954, 448817, 449955, 449956, 449958, 448818, 449960, 448819, 449797, 448840, 449967, 448848, 448850, 449819, 449836, 450074, 448890, 448897, 448901, 448903, 448905, 449851, 449856, 449858, 449859, 449860, 449861, 459032, 459076, 459157, 459010, 459011, 459088, 459087, 459086, 459083, 459082, 459158, 448718, 436140, 398455, 398470, 398491, 398501, 398503, 398506, 398507, 398508, 304535, 304538, 304539, 436141 и 436164.

В некоторых вариантах воплощения мишенью следующих антисмысловых соединений является область SEQ ID NO:2, нуклеиновая кислота, кодирующая GCGR человека и демонстрирующая по меньшей мере 85% ингибирование последовательности гена GCGR: ISIS NOs:310457, 449823, 449881, 449882, 398457, 449883, 449884, 449885, 450039, 449894, 449895, 449905, 449906, 449907, 449910, 398486, 449916, 449917, 449922, 450049, 448766, 449760, 450059, 449938, 448802, 398585, 449945, 448806, 450061, 449948, 449949, 449951, 398504, 449952, 449953, 449954, 448817, 449955, 449956, 449958, 449960, 448819, 449967, 448848, 449836, 450074, 448890, 448903, 449851, 449856, 449858, 449859, 449860, 459157, 459010, 459011, 459088, 459087, 459086, 459083, 459082, 459158, 436140, 398455, 398470, 398503, 398506, 398507, 398508, 304535, 304538, 304539, 436141 и 436164.

В некоторых вариантах воплощения мишенью следующих антисмысловых соединений является область SEQ ID NO:2, нуклеиновая кислота, кодирующая GCGR человека и демонстрирующая значение IC₅₀ менее 3 мкМ: ISIS NOs:304535, 304538, 304539, 398455, 398457, 398470, 398471, 398486, 398491, 398501, 398503, 398504, 398506, 398507, 398508, 398585, 436034, 436140, 436141, 436164, 448718, 448730, 448738, 448754, 448762, 448766, 448799, 448802, 448806, 448817, 448818, 448819, 448840, 448848, 448850, 448860, 448890, 448897, 448901, 448903, 448905, 449884, 459009, 459010, 459011, 459014, 459024, 459032, 459040, 459046, 459058, 459063, 459076, 459082, 459083, 459086, 459087, 459088, 459157 и 459158.

В некоторых вариантах воплощения мишенью следующих антисмысловых соединений является область SEQ ID NO:2, нуклеиновая кислота, кодирующая GCGR человека и демонстрирующая значение IC₅₀ менее 1 мкМ: ISIS NOs:304535, 304538, 304539, 398455, 398457, 398470, 398471, 398486, 398491, 398501, 398503, 398504, 398506, 398507, 398508, 398585, 436034, 436140, 436141, 436164, 448718, 448730, 448738, 448754, 448762, 448766, 448799, 448802, 448806, 448817, 448818, 448819, 448840, 448848, 448850, 448860, 448890, 448897, 448901, 448903, 448905, 449884, 459009, 459010, 459011, 459024, 459032, 459040, 459046, 459058, 459063, 459076, 459082, 459083, 459086, 459087, 459088, 459157 и 459158.

В некоторых вариантах воплощения мишенью следующих антисмысловых соединений является область SEQ ID NO:2, нуклеиновая кислота, кодирующая GCGR человека и демонстрирующая значение IC₅₀ менее 0,5 мкМ: ISIS NOs:304535, 304538, 304539, 398455, 398457, 398470, 398471, 398486, 398491, 398501, 398503, 398504, 398506, 398507, 398508, 398585, 436034, 436140, 436141, 436164, 448718, 448730, 448738, 448754, 448762, 448799, 448802, 448806, 448817, 448818, 448819, 448840, 448848, 448850, 448860, 448890, 448897, 448901, 448903, 448905, 449884, 459009, 459010, 459011, 459024, 459040, 459046, 459058, 459063, 459076, 459082, 459083, 459086, 459087, 459088, 459157 и 459158.

В некоторых вариантах воплощения мишенью следующих антисмысловых соединений является область SEQ ID NO:2, нуклеиновая кислота, кодирующая GCGR человека и демонстрирующая значение IC₅₀ менее 0,3 мкМ: ISIS NOs:304535, 304538, 398455, 398457, 398470, 398471, 398486, 398504, 398506, 398507, 436164, 448718,448730, 448762, 446766, 448799, 448802, 448806, 448817, 448819, 448848, 448850, 448860, 448890, 448897, 448905, 449884, 459010, 459011, 459040, 459046, 459076, 459082, 459083, 459086, 459087, 459088, 459157 и 459158.

В некоторых вариантах воплощения мишенью следующих антисмысловых соединений является область SEQ ID NO:2, нуклеиновая кислота, кодирующая GCGR человека и демонстрирующая значение IC₅₀ менее 0,2 мкМ: ISIS NOs:304538, 398457, 398486, 398504, 398506, 398507, 448730, 448802, 448819, 448848, 448850, 448890, 449884, 459010, 459011, 459040, 459076, 459082, 459083, 459157 и 459158.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, причем указанные соединенные нуклеозиды включают по меньшей мере фрагмент из 8 смежных нуклеиновых оснований, комплементарный фрагменту из нуклеиновых оснований равной длины, расположенному в пределах области, выбранной из нуклеотидов 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432, 744O-7456 или 10716-10734 SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах воплощения указанный модифицированный олигонуклеотид имеет фрагмент из по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 смежных нуклеиновых оснований, комплементарный фрагменту равной длины, расположенному в пределах области, выбранной из нуклеотидов 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432, 744O-7456 или 10716-10734 SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах воплощения указанный модифицированный олигонуклеотид на 90, 95, 99 или 100% комплементарен нуклеиновой кислоте, кодирующей GCGR человека, например, SEQ ID No:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из по меньшей мере 17 соединенных нуклеозидов, на 60% комплементарный области, выбранной из нуклеотидов 7267-7287, 727O-7286, 7292-7312, 7295-7311, 7316-7336, 7319-7335, 7341-7361, 7344-7360, 7365-7385, 7368-7384, 7389-7409, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7457, 744O-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734 или 15743-15762 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из по меньшей мере 17 соединенных нуклеозидов, на 70% комплементарный области, выбранной из нуклеотидов 7267-7287, 727O-7286, 7292-7312, 7295-7311, 7316-7336, 7319-7335, 7341-7361, 7344-7360, 7365-7385, 7368-7384, 7389-7409, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7457, 744O-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734 или 15743-15762 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из по меньшей мере 17 соединенных нуклеозидов, на 80% комплементарный области, выбранной из 7267-7287, 727O-7286, 7292-7312, 7295-7311, 7316-7336, 7319-7335, 7341-7361, 7344-7360, 7365-7385, 7368-7384, 7389-7409, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7457, 744O-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734 или 15743-15762 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из по меньшей мере 17 соединенных нуклеозидов, на 90% комплементарный области, выбранной из нуклеотидов 7267-7287, 727O-7286, 7292-7312, 7295-7311, 7316-7336, 7319-7335, 7341-7361, 7344-7360, 7365-7385, 7368-7384, 7389-7409, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7457, 744O-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734 или 15743-15762 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из по меньшей мере 17 соединенных нуклеозидов, на 95% комплементарный области, выбранной из нуклеотидов 7267-7287, 727O-7286, 7292-7312, 7295-7311, 7316-7336, 7319-7335, 7341-7361, 7344-7360, 7365-7385, 7368-7384, 7389-7409, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7457, 744O-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734 или 15743-15762 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из по меньшей мере 17 соединенных нуклеозидов, на 99% комплементарный области, выбранной из нуклеотидов 7267-7287, 727O-7286, 7292-7312, 7295-7311, 7316-7336, 7319-7335, 7341-7361, 7344-7360, 7365-7385, 7368-7384, 7389-7409, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7457, 744O-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734 или 15743-15762 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из по меньшей мере 17 соединенных нуклеозидов, на 100% комплементарный области, выбранной из нуклеотидов 7267-7287, 727O-7286, 7292-7312, 7295-7311, 7316-7336, 7319-7335, 7341-7361, 7344-7360, 7365-7385, 7368-7384, 7389-7409, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7457, 744O-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734 или 15743-15762 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, на 60% комплементарный нуклеотидам 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432 и 744O-7456 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, на 70% комплементарный нуклеотидам 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432 и 744O-7456 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, на 80% комплементарный нуклеотидам 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432 и 744O-7456 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, на 90% комплементарный нуклеотидам 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432 и 744O-7456 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, на 95% комплементарный нуклеотидам 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432 и 744O-7456 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, на 99% комплементарный нуклеотидам 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432 и 744O-7456 SEQ ID NO:2.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединения, включающие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, на 100% комплементарный нуклеотидам 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432 и 744O-7456 SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах воплощения такие соединения или олигонуклеотиды, мишенью которых является область нуклеиновой кислоты GCGR, имеют фрагмент из смежных нуклеиновых оснований, комплементарный фрагменту из нуклеиновых оснований равной длины, расположенному в пределах области 727O-7286, 7295-7311, 7319-7335, 7344-7360, 7368-7384, 7392-7408, 7416-7432, 744O-7456 или 10718-10734 SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах воплощения следующие нуклеотидные области SEQ ID NO:2 при адресном воздействии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов проявляют по меньшей мере 65% ингибирование: 7267-7287, 727O-7286, 7292-7312, 7295-7311, 7316-7336, 7319-7335, 7341-7361, 7344-7360, 7365-7385, 7368-7384, 7389-7409, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7457, 744O-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734 или 15743-15762.

В некоторых вариантах воплощения последовательности нуклеиновых оснований, перечисленные в следующих SEQ ID NOs, проявляют по меньшей мере 70% ингибирование нуклеиновой кислоты GCGR: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34,35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 и 115.

В некоторых вариантах воплощения последовательности нуклеиновых оснований, перечисленные в следующих SEQ ID NOs, проявляют по меньшей мере 75% ингибирование нуклеиновой кислоты GCGR: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 84, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 и 115.

В некоторых вариантах воплощения последовательности нуклеиновых оснований, перечисленные в следующих SEQ ID NOs, проявляют по меньшей мере 80% ингибирование нуклеиновой кислоты GCGR: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 84, 85, 86, 87, 90,91, 92,93, 95, 96, 99, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,115.

В некоторых вариантах воплощения последовательности нуклеиновых оснований, перечисленные в следующих SEQ ID NOs, проявляют по меньшей мере 85% ингибирование нуклеиновой кислоты GCGR: 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 31, 34, 36, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 66, 67, 68, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 85, 86, 87, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 102, 103, 104, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115.

В некоторых вариантах воплощения последовательности нуклеиновых оснований, перечисленные в следующих SEQ ID NOs, проявляют по меньшей мере 90% ингибирование нуклеиновой кислоты GCGR: 5, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 19, 24, 26, 38, 42, 43, 44, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 57, 58, 62, 67, 76, 85, 86, 91, 92, 93, 95, 96, 102, 107, 109, 111, 112, 113, 114 и 115.

В некоторых вариантах воплощения последовательности нуклеиновых оснований, перечисленные в следующих SEQ ID NOs, проявляют по меньшей мере 95% ингибирование нуклеиновой кислоты GCGR: 9, 10, 24, 43, 52, 58, 86, 91, 92, 109, 111 и 112.

В некоторых вариантах воплощения соединения, представленные здесь, обладают большим терапевтическим потенциалом, чем ISIS NOs:315163, 325568 и 310457 (описанные в патенте США №7399853 и опубликованной патентной заявке США №US2007-0087987, включенных в настоящий документ посредством ссылки). В некоторых вариантах воплощения соединения, представленные здесь, обладают лучшим ингибированием in vivo, чем ISIS NOs:315163, 325568 и 310457. В некоторых вариантах воплощения соединения, представленные здесь, обладают лучшим профилем переносимости, чем ISIS NOs:315163, 325568 и 310457.

В некоторых вариантах воплощения соединение, представленное здесь, состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах воплощения указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 соединенных нуклеозидов. В некоторых вариантах воплощения указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 соединенного нуклеозида. В некоторых вариантах воплощения указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 соединенных нуклеозидов. В некоторых вариантах воплощения указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 соединенных нуклеозидов. В некоторых вариантах воплощения указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 18 соединенных нуклеозидов. В некоторых вариантах воплощения указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 соединенных нуклеозидов. В некоторых вариантах воплощения указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 соединенных нуклеозидов.

В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере одна межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида является модифицированной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах воплощения каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.

В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере один нуклеозид указанного модифицированного олигонуклеотида включает модифицированное нуклеиновое основание. В некоторых вариантах воплощения указанное модифицированное нуклеиновое основание является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения модифицированный олигонуклеотид включает:

а) сегмент разрыва, состоящий из соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает модифицированную сахарозу.

В некоторых вариантах воплощения модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 соединенных нуклеозидов, сегмент разрыва состоит из десяти соединенных дезоксинуклеозидов, сегмент 5′-крыла состоит из пяти соединенных нуклеозидов, сегмент 3′-крыла состоит из пяти соединенных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый цитозин является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 соединенных нуклеозидов, сегмент разрыва состоит из десяти соединенных дезоксинуклеозидов, сегмент 5′-крыла состоит из трех соединенных нуклеозидов, сегмент 3′-крыла состоит из четырех соединенных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый цитозин является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 соединенных нуклеозидов, сегмент разрыва состоит из десяти соединенных дезоксинуклеозидов, сегмент 5′-крыла состоит из пяти соединенных нуклеозидов, сегмент 3′-крыла состоит из шести соединенных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый цитозин является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 соединенных нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований, комплементарных фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 соединенных нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований, комплементарных фрагменту равной длины любой из SEQ ID NO:2, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 19 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:4, 17, 24, 30, 31, 35, 37, 39, 40, 43, 48, 52, 56, 58, 60, 62, 63, 65, 68, 69, 70, 71, 72, 79, 79, 79, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 и 115, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 19 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:17 или 31, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 16 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NO:17, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 16 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NO:31, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований, комплементарных фрагменту равной длины любой из SEQ ID NOs:1-3, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований, комплементарных фрагменту равной длины любой из SEQ ID NO:2, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 16 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 33, 34, 36, 38, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 59, 61, 64, 66, 67, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 83, 84, 88, 89 и 97, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 16 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:11 или 80, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 16 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NO:11, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 16 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NO:80, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 21 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NOs:85 и 96, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из шести соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 21 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 20 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NO:85, причем указанный модифицированный олигонуклеотид включает: а) сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов; б) сегмент 5′-крыла, состоящий из пяти соединенных нуклеозидов; и в) сегмент 3′-крыла, состоящий из шести соединенных нуклеозидов. Сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью, а каждый остаток цитозина является 5-метилцитозином.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ снижения экспрессии GCGR у животного, включающий введение указанному животному соединения, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 12 до 30 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 15 до 30 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 18 до 21 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 17 до 35 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 17 до 25 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 17 до 24 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 17 до 23 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 17 до 22 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 17 до 21 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 17 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 20 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 21 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ профилактики, облегчения или лечения метаболического заболевания у животного, включающий введение указанному животному соединения, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 12 до 30 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 17 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. Примеры метаболических заболеваний или расстройств включают диабет, гипергликемию, преддиабет, ожирение, неалкогольную жировую дистрофию печени (НАЖДП), метаболический синдром, инсулинорезистентность, диабетическую дислипидемию или гипертриглицеридемию, или их комбинацию, но не ограничиваются ими.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ профилактики, облегчения или лечения ожирения у животного, включающий введение указанному животному соединения, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 12 до 30 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 17 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной

20 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной

21 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение или композиция включает соединение ISIS NOs:449884, 459014, 398471, 448766 или 459157. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение или композиция включает соединение ISIS NO:449884. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение или композиция включает соединение ISIS NO:459014.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ профилактики, облегчения или лечения диабета у животного, включающий введение указанному животному соединения, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 12 до 30 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 17 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 20 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 21 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение или композиция включает соединение ISIS NOs:449884, 459014, 398471, 448766 или 459157. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение или композиция включает соединение ISIS NO:449884. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение или композиция включает соединение ISIS NO:459014.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ снижения массы тела у животного, включающий введение указанному животному соединения, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 12 до 30 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 17 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения снижение массы тела у животного предотвращает, облегчает или лечит метаболическое заболевание. В некоторых вариантах воплощения снижение массы тела у животного предотвращает, облегчает или лечит диабет. В некоторых вариантах воплощения снижение массы тела у животного предотвращает, облегчает или лечит ожирение. В некоторых вариантах воплощения снижение массы тела у животного предотвращает, облегчает или лечит метаболический синдром. В некоторых вариантах воплощения снижение массы тела у животного предотвращает, облегчает или лечит инсулинорезистентность. В некоторых вариантах воплощения снижение массы тела у животного предотвращает, облегчает или лечит гипергликемию. В некоторых вариантах воплощения снижение массы тела у животного предотвращает, облегчает или лечит НАЖДП. В некоторых вариантах воплощения снижение массы тела у животного предотвращает, облегчает или лечит диабетическую дислипидемию. В некоторых вариантах воплощения уровни глюкозы снижаются по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100%.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ снижения уровня глюкозы у животного, включающий введение указанному животному соединения, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной от 12 до 30 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения указанное соединение включает модифицированный олигонуклеотид длиной 17 соединенных нуклеозидов, мишенью которого является GCGR. В некоторых вариантах воплощения снижение уровня глюкозы у животного предотвращает, облегчает или лечит метаболическое заболевание. В некоторых вариантах воплощения снижение уровня глюкозы у животного предотвращает, облегчает или лечит диабет. В некоторых вариантах воплощения снижение уровня глюкозы у животного предотвращает, облегчает или лечит ожирение. В некоторых вариантах воплощения снижение уровня глюкозы у животного предотвращает, облегчает или лечит метаболический синдром. В некоторых вариантах воплощения снижение уровня глюкозы у животного предотвращает, облегчает или лечит инсулинорезистентность. В некоторых вариантах воплощения снижение уровня глюкозы у животного предотвращает, облегчает или лечит гипергликемию. В некоторых вариантах воплощения снижение уровня глюкозы у животного предотвращает, облегчает или лечит НАЖДП. В некоторых вариантах воплощения снижение уровня глюкозы у животного предотвращает, облегчает или лечит диабетическую дислипидемию. В некоторых вариантах воплощения уровень глюкозы снижается по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100%.

В некоторых вариантах воплощения GCGR обладает последовательностью человека, представленной в любой из последовательностей с учетными номерами GENBANK: учетным номером GENBANK NM_000160.3 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO:1) или учетным номером GENBANK NW_926918.1, обрезанной от нуклеотида 16865000 до 16885000 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах воплощения GCGR обладает последовательностью макака-резуса, представленной в SEQ ID NO:3.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают соль вышеприведенных соединений и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанная композиция включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-35 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NOs:11, 17, 31, 80 или 85, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанная композиция включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 2O-25 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 20 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NOs:11, 17, 31, 80 или 85, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанная композиция включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 20 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NOs:11, 17, 31, 80 или 85, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают соль вышеприведенных соединений и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанная композиция включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-35 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NO:11, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанная композиция включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-25 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NO:16, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанная композиция включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NO:16, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых вариантах воплощения соединения или композиции, представленные здесь, включают соль вышеприведенных соединений и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанная композиция включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-35 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NO:80, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанная композиция включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-25 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NO:45, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанная композиция включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NO:45, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ лечения животных с заболеванием или состоянием, связанным с GCGR, включающий: а) выявление указанного животного с заболеванием или состоянием, связанным с GCGR, и б) введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, по меньшей мере на 90% комплементарной любой из SEQ ID NOs:1-3, согласно измерению на всем протяжении указанного модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах воплощения терапевтически эффективное количество соединения, введенное животному, лечит или ослабляет заболевание или состояние, связанное с GCGR, или его симптом у животного. В некоторых вариантах воплощения заболевание или состояние, связанное с GCGR, является ожирением. В некоторых вариантах воплощения заболевание или состояние, связанное с GCGR, является диабетом.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ лечения животных с заболеванием или состоянием, связанным с GCGR, включающий: а) выявление указанного животного с заболеванием или состоянием, связанным с GCGR, и б) введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, по меньшей мере на 100% комплементарной любой из SEQ ID NOs:1-3, согласно измерению на всем протяжении указанного модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах воплощения терапевтически эффективное количество соединения, введенное животному, лечит или ослабляет заболевание или состояние, связанное с GCGR, или его симптом у животного. В некоторых вариантах воплощения заболевание или состояние, связанное с GCGR, является ожирением. В некоторых вариантах воплощения заболевание или состояние, связанное с GCGR, является диабетом.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способы лечения, профилактики или облегчения метаболического заболевания. В некоторых вариантах воплощения указанное метаболическое заболевание является ожирением, диабетом, гипергликемией, преддиабетом, неалкогольной жировой дистрофией печени (НАЖДП), метаболическим синдромом, инсулинорезистентностью, диабетической дислипидемией или гипертриглицеридемией, или их комбинацией.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способы, включающие введение соединения, как описано здесь, в организм животного. В некоторых вариантах воплощения указанный способ включает введение в организм животного модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 17-35 соединенных нуклеозидов и обладающего последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 20 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NOs:11, 17, 31, 80 или 85.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способы, включающие введение соединения, как описано здесь, в организм животного. В некоторых вариантах воплощения указанный способ включает введение в организм животного модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 17-35 соединенных нуклеозидов и обладающего последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, приведенной в SEQ ID NO:1, 17, 31, 80 или 85.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способы, включающие введение соединения, как описано здесь, в организм животного. В некоторых вариантах воплощения указанный способ включает введение в организм животного модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 17-35 соединенных нуклеозидов и обладающего последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, выбранной из последовательностей нуклеиновых оснований, приведенных в SEQ ID NO:11.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способы, включающие введение соединения, как описано здесь, в организм животного. В некоторых вариантах воплощения указанный способ включает введение в организм животного модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 17-35 соединенных нуклеозидов и обладающего последовательностью нуклеиновых оснований, включающей по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований, выбранной из последовательностей нуклеиновых оснований, приведенных в SEQ ID NO:80.

В некоторых вариантах воплощения указанное животное является человеком.

В некоторых вариантах воплощения указанное введение предотвращает, лечит, облегчает или замедляет прогрессирование метаболического заболевания, как описано здесь.

В некоторых вариантах воплощения указанное введение предотвращает, лечит, облегчает или замедляет прогрессирование ожирения, как описано здесь.

В некоторых вариантах воплощения указанное введение предотвращает, лечит, облегчает или замедляет прогрессирование диабета, как описано здесь.

В некоторых вариантах воплощения указанное соединение вводят совместно со вторым агентом.

В некоторых вариантах воплощения указанное соединение и указанный второй агент вводят сопутствующим образом.

В некоторых вариантах воплощения указанное введение является парентеральным введением.

Некоторые варианты воплощения дополнительно обеспечивают способ снижения экспрессии мРНК или белка GCGR у животного, включающий введение указанному животному соединения или композиции, как описано здесь, с целью снижения экспрессии мРНК или белка GCGR у указанного животного. В некоторых вариантах воплощения указанное животное является человеком. В некоторых вариантах воплощения снижение экспрессии мРНК или белка GCGR предотвращает, лечит, облегчает или замедляет прогрессирование метаболического заболевания. В некоторых вариантах воплощения метаболическое заболевание или состояние является диабетом. В некоторых вариантах воплощения метаболическое заболевание или состояние является ожирением.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ лечения человека с метаболическим заболеванием, включающий выявление человека с указанным заболеванием и введение указанному человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное лечение ослабляет симптом, выбранный из группы, состоящей из метаболического синдрома, гипергликемии, гипертриглицеридемии, гипертензии, повышения уровня глюкозы, повышения инсулинорезистентности, снижения чувствительности к инсулину, чрезмерной массы тела и/или чрезмерного количества жира, или любой их комбинации.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ лечения человека с ожирением, включающий выявление человека с указанным заболеванием и введение указанному человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное лечение ослабляет симптом, выбранный из группы, состоящей из метаболического синдрома, гипергликемии, гипертриглицеридемии, гипертензии, повышения уровня глюкозы, повышения инсулинорезистентности, снижения чувствительности к инсулину, чрезмерной массы тела и/или чрезмерного количества жира, или любой их комбинации

Некоторые варианты воплощения обеспечивают способ лечения человека с диабетом, включающий выявление человека с указанным заболеванием и введение указанному человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное лечение ослабляет симптом, выбранный из группы, состоящей из метаболического синдрома, гипергликемии, гипертриглицеридемии, гипертензии, повышения уровня глюкозы, повышения инсулинорезистентности, снижения чувствительности к инсулину, чрезмерной массы тела и/или чрезмерного количества жира, или любой их комбинации

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ ослабления или профилактики метаболического заболевания, включающий введение в организм человека терапевтически эффективного количества соединения или композиции, как описано здесь, тем самым ослабляя или предотвращая метаболическое заболевание.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ ослабления или профилактики ожирения, включающий введение в организм человека терапевтически эффективного количества соединения или композиции, как описано здесь, тем самым ослабляя или предотвращая диабет.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ ослабления или профилактики диабета, включающий введение в организм человека терапевтически эффективного количества соединения или композиции, как описано здесь, тем самым ослабляя или предотвращая диабет.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения симптома метаболического заболевания, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-35 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым ослабляя симптом метаболического заболевания у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения симптома диабета, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-35 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым ослабляя симптом диабета у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения симптома метаболического заболевания, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым ослабляя симптом метаболического заболевания у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения симптома диабета, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым ослабляя симптом диабета у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения симптома метаболического заболевания, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым ослабляя симптом метаболического заболевания у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения симптома диабета, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым ослабляя симптом диабета у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ снижения скорости прогрессирования симптома, ассоциированного с метаболическим заболеванием, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-35 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым снижая скорость прогрессирования симптома метаболического заболевания у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ снижения скорости прогрессирования симптома, ассоциированного с диабетом, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-35 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым снижая скорость прогрессирования симптома диабета у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ снижения скорости прогрессирования симптома, ассоциированного с метаболическим заболеванием, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым снижая скорость прогрессирования симптома метаболического заболевания у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ снижения скорости прогрессирования симптома, ассоциированного с диабетом, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым снижая скорость прогрессирования симптома диабета у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ снижения скорости прогрессирования симптома, ассоциированного с метаболическим заболеванием, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым снижая скорость прогрессирования симптома метаболического заболевания у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ снижения скорости прогрессирования симптома, ассоциированного с диабетом, включающий введение в организм человека, нуждающегося в этом, соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 соединенных нуклеозидов, причем указанный модифицированный олигонуклеотид специфически гибридизуется с SEQ ID NO:1, 2 или 3, тем самым снижая скорость прогрессирования симптома диабета у человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способы и соединения для изготовления медикамента для лечения, профилактики или облегчения метаболического заболевания.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способы и соединения для изготовления медикамента для лечения, профилактики или облегчения ожирения.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способы и соединения для изготовления медикамента для лечения, профилактики или облегчения диабета.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способы и соединения для изготовления медикамента для лечения, профилактики или облегчения метаболического синдрома.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, облегчения или профилактики метаболического заболевания.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, облегчения или профилактики ожирения.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, облегчения или профилактики диабета.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединение, как описано здесь, для лечения, профилактики или облегчения метаболического заболевания, как описано здесь, путем комбинированной терапии с дополнительным агентом или терапевтическим средством, как описано здесь. Агенты или терапевтические средства можно вводить совместно или сопутствующим образом.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают соединение, как описано здесь, для лечения, профилактики или облегчения диабета, как описано здесь, путем комбинированной терапии с дополнительным агентом или терапевтическим средством, как описано здесь. Агенты или терапевтические средства можно вводить совместно или сопутствующим образом.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, профилактики или облегчения метаболического заболевания, как описано здесь, путем комбинированной терапии с дополнительным агентом или терапевтическим средством, как описано здесь. Агенты или терапевтические средства можно вводить совместно или сопутствующим образом.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, профилактики или облегчения ожирения, как описано здесь, путем комбинированной терапии с дополнительным агентом или терапевтическим средством, как описано здесь. Агенты или терапевтические средства можно вводить совместно или сопутствующим образом.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, профилактики или облегчения диабета, как описано здесь, путем комбинированной терапии с дополнительным агентом или терапевтическим средством, как описано здесь. Агенты или терапевтические средства можно вводить совместно или сопутствующим образом.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, профилактики или облегчения метаболического заболевания, как описано здесь, у пациента, впоследствии принимающего дополнительный агент или терапевтическое средство, как описано здесь.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, профилактики или облегчения ожирения, как описано здесь, у пациента, впоследствии принимающего дополнительный агент или терапевтическое средство, как описано здесь.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, профилактики или облегчения диабета, как описано здесь, у пациента, впоследствии принимающего дополнительный агент или терапевтическое средство, как описано здесь.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают применение соединения, как описано здесь, при производстве медикамента для лечения, профилактики или облегчения метаболического синдрома, как описано здесь, у пациента, впоследствии принимающего дополнительный агент или терапевтическое средство, как описано здесь.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают набор для лечения, профилактики или облегчения метаболического заболевания, как описано здесь, причем указанный набор включает:

(i) соединение, как описано здесь; и, в качестве альтернативы,

(ii) дополнительный агент или терапевтическое средство, как описано здесь.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают набор для лечения, профилактики или облегчения ожирения, как описано здесь, причем указанный набор включает:

(i) соединение, как описано здесь; и, в качестве альтернативы,

(ii) дополнительный агент или терапевтическое средство, как описано здесь.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают набор для лечения, профилактики или облегчения диабета, как описано здесь, причем указанный набор включает:

(i) соединение, как описано здесь; и, в качестве альтернативы,

(ii) дополнительный агент или терапевтическое средство, как описано здесь.

Некоторые варианты воплощения обеспечивают набор для лечения, профилактики или облегчения метаболического синдрома, как описано здесь, причем указанный набор включает:

(i) соединение, как описано здесь; и, в качестве альтернативы,

(ii) дополнительный агент или терапевтическое средство, как описано здесь.

Набор, как описано здесь, может дополнительно включать инструкции по применению указанного набора для лечения, профилактики или облегчения метаболического заболевания, как описано здесь, путем комбинированной терапии, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное метаболическое заболевание является ожирением. В некоторых вариантах воплощения указанное метаболическое заболевание является диабетом.

Антисмысловые соединения

Олигомерные соединения включают олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК, но не ограничиваются ими. Олигомерное соединение может быть "антисмысловым" по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, что означает его способность подвергаться гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью за счет водородных связей.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловое соединение обладает последовательностью нуклеиновых оснований, которая при записи в направлении от 5′ к 3′ включает обращенный комплемент сегмента-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на которую он оказывает адресное воздействие. В некоторых из таких вариантов воплощения антисмысловой олигонуклеотид обладает последовательностью нуклеиновых оснований, которая при записи в направлении от 5′ к 3′ включает обращенный комплемент сегмента-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на которую он оказывает адресное воздействие.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловое соединение, мишенью которого является нуклеиновая кислота GCGR, обладает длиной от 10 до 30 нуклеотидов. Другими словами, антисмысловые соединения состоят из 1O-30 соединенных нуклеиновых оснований. В других вариантах воплощения антисмысловое соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-80, 10-50, 15-30, 18-21, 20-80, 20-35, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21 или 20 соединенных нуклеиновых оснований. В некоторых из таких вариантов воплощения антисмысловое соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 соединенных нуклеиновых оснований в длину или диапазона, определенного любыми двумя из вышеприведенных значений.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловое соединение включает укороченный или обрезанный модифицированный олигонуклеотид. Указанный укороченный или обрезанный модифицированный олигонуклеотид может иметь делецию одиночного нуклеозида с 5′ конца (5′-укорачивание) или, в качестве альтернативы, с 3′-конца (3′-укорачивание). Укороченный или обрезанный олигонуклеотид может иметь делецию двух нуклеозидов с 5′ конца или, в качестве альтернативы, может иметь делецию двух субъединиц с 3′-конца. В качестве альтернативы делегированные нуклеозиды могут быть распределены по всему протяжению модифицированного олигонуклеотида, например, в антисмысловом соединении, имеющем делецию одного нуклеозида с 5′-конца и делецию одного нуклеозида с 3′-конца.

Если в удлиненном олигонуклеотиде присутствует одиночный дополнительный нуклеозид, указанный дополнительный нуклеозид может быть расположен на 5′- или 3′-конце олигонуклеотида. При наличии двух или более дополнительных нуклеозидов указанные добавленные нуклеозиды могут находиться рядом друг с другом, например, в олигонуклеотиде, имеющем два нуклеозида, добавленных по 5′-концу (5′-добавление) или, в качестве альтернативы, по 3′-концу (3′-добавление) олигонуклеотида. В качестве альтернативы добавленные нуклеозиды могут быть распределены по всему протяжению антисмыслового соединения, например, в олигонуклеотиде, имеющем один нуклеозид, добавленный по 5′-концу, и одну субъединицу, добавленную по 3′-концу.

Можно увеличить или уменьшить длину антисмыслового соединения, например, антисмыслового олигонуклеотида, и/или внедрить несоответствующие основания без устранения активности. Например, в статье Woolfet al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992) протестировали способность серии антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13-25 нуклеиновых оснований стимулировать расщепление РНК-мишени в модели инъекции в ооцит.Антисмысловые олигонуклеотиды длиной 25 нуклеиновых оснований с 8 или 11 несоответствующими основаниями вблизи концов антисмысловых олигонуклеотидов смогли стимулировать специфическое расщепление мРНК-мишени, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, не содержавшие несоответствий. Аналогичным образом специфическое расщепление мишени достигалось с помощью антисмысловых олигонуклеотидов размером 13 нуклеиновых оснований, в том числе олигонуклеотидов, содержавших 1 или 3 несоответствия.

Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) продемонстрировали способность олигонуклеотида со 100% комплементарностью к мРНК bcl-2, содержавшего 3 несовпадения с мРНК bcl-xL, снижать экспрессию как bcl-2, так и bcl-xL m vitro и in vivo. Более того, указанный олигонуклеотид продемонстрировал мощную противоопухолевую активность in vivo.

Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) протестировали способность серии тандемных антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеиновых оснований и антисмысловых олигонуклеотидов длиной 28 и 42 нуклеиновых основания, включающих последовательность из двух или трех тандемных антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, блокировать трансляцию ДГФР человека в анализе ретикулоцитов кролика. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеиновых оснований по отдельности мог ингибировать трансляцию, хотя и на более скромном уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды длиной 28 или 42 нуклеиновых основания.

Мотивы антисмысловых соединений

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, имеют химически модифицированные субъединицы, упорядоченные в структуры или мотивы для придания антисмысловым соединениям таких свойств как расширенная ингибиторная активность, повышенное сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к разрушению нуклеазами in vivo.

Химерные антисмысловые соединения обычно содержат по меньшей мере одну область, модифицированную таким образом, что это придает повышенную устойчивость к разрушению нуклеазами, повышенное поглощение клетками, повышенное сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью и/или повышенную ингибиторную активность. Вторая область химерного антисмыслового соединения, необязательно, может служить субстратом для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет цепь РНК в составе двуцепочечной структуры РНК:ДНК.

Антисмысловые соединения, имеющие гэпмерный мотив, считаются химерными антисмысловыми соединениями. Внутренняя область гэпмера, имеющая множество нуклеотидов, поддерживающих расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, имеющими множество нуклеотидов, химически отличающихся от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив, сегмент разрыва обычно служит в качестве субстрата для эндонуклеазного расщепления, в то время как сегменты крыльев включают модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах воплощения области в составе гэпмера различаются по типам сахарозных групп, включающих каждую отдельную область. Типы сахарозных групп, используемые для различения областей гэпмера, в некоторых вариантах воплощения включают β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2′-модифицированные нуклеозиды (например, 2′-модифицированные нуклеозиды могут включать, в числе прочего, 2′-МОЕ и 2′-O-СН₃) и нуклеозиды, модифицированные бициклическими сахарозами (например, нуклеозиды, модифицированные бициклическими сахарозами, могут включать нуклеозиды, имеющие ограниченный этил). В некоторых вариантах воплощения крылья могут включать несколько модифицированных сахарозных групп, в том числе, например, 2′-МОЕ и ограниченный этил. В некоторых вариантах воплощения крылья могут включать несколько модифицированных и немодифицированных сахарозных групп. В некоторых вариантах воплощения крылья могут включать различные комбинации 2′-МОЕ-нуклеозидов, нуклеозидов, содержащих ограниченный этил, и 2′-дезоксинуклеозидов.

Каждая отдельная область может включать однородные сахарозные группы, вариантные или чередующиеся сахарозные группы. Мотив "крыло-разрыв-крыло" часто описывается как "X-Y-Z", где "X" представляет длину 5′-крыла, "Y" представляет длину разрыва, a "Z" представляет длину 3′-крыла. "X" и "Z" могут включать однородные, вариантные или чередующиеся сахарозные группы. В некоторых вариантах воплощения "X" и "Y" могут включать один или более 2′-дезоксинуклеозидов. "Y" может включать 2′-дезоксинуклеозиды. Как используется здесь, гэпмер, описанный как "X-Y-Z", имеет такую конфигурацию, что разрыв располагается в непосредственной близости относительно каждого из 5′-крыла и 3′-крыла. Таким образом, промежуточные нуклеотиды между 5′-крылом и разрывом или разрывом и 3′-крылом отсутствуют.Любое из антисмысловых соединений, описанных здесь, может иметь гэпмерный мотив. В некоторых вариантах воплощения "X" и "Z" являются одинаковыми, в других вариантах воплощения они различаются. В некоторых вариантах воплощения "Y" составляет от 8 до 15 нуклеозидов. X, Y или Z могут содержать любое количество из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеозидов.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, содержат гэпмерный мотив 3-10-4. В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, содержат гэпмерный мотив 5-10-5. В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, содержат гэпмерный мотив 5-10-6.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, содержат гэпмерный мотив 3-10-3.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, содержат гэпмерный мотив 4-10-4.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, содержат гэпмерный мотив 4-10-5.

Нуклеиновые кислоты-мишени, области-мишени и нуклеотидные последовательности

В некоторых вариантах воплощения нуклеиновая кислота GCGR является любой из последовательностей, приведенных под учетным номером GENBANK NM_000160.3 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO:1), учетным номером GENBANK NW_926918.1, обрезанной от нуклеотида 16865000 до 16885000 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO:2); и последовательностью макака-резуса, представленной в SEQ ID NO:3.

Понятно, что последовательность, представленная в каждой SEQ ID NO в Примерах, содержащихся здесь, не зависит от каких-либо модификаций сахарозной группы, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. В связи с этим антисмысловые соединения, определяемые SEQ ID NO, могут независимо включать в одну или более модификаций сахарозной группы, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Антисмысловые соединения, описываемые номером Isis (Isis No), обозначают комбинацию последовательности нуклеиновых оснований и мотива.

В некоторых вариантах воплощения область-мишень является структурно определенной областью нуклеиновой кислоты-мишени. Например, область-мишень может охватывать 3′-UTR, 5′-UTR, экзон, интрон, переход экзон/интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области GCGR можно получить по учетному номеру из баз данных последовательностей, например, NCBI, и такая информация включена в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах воплощения область-мишень может включать последовательность от 5′-сайта-мишени одного сегмента-мишени в пределах области-мишени до 3′-сайта-мишени другого сегмента-мишени в пределах той же области-мишени.

Воздействие на мишень включает определение по меньшей мере одного сегмента-мишени, с которым гибридизуется антисмысловое соединение, так что возникает желательный эффект. В некоторых вариантах воплощения желательным эффектом является снижение уровня мРНК нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах воплощения желательным эффектом является снижение уровня белка, кодируемого нуклеиновой кислотой-мишенью, или фенотипическое изменение, ассоциированное с нуклеиновой кислотой-мишенью.

Область-мишень может содержать один или более сегментов-мишеней. Множественные сегменты-мишени в пределах области-мишени могут перекрываться. В качестве альтернативы они могут не перекрываться. В некоторых вариантах воплощения сегменты-мишени в пределах области-мишени отделены друг от друга не более чем приблизительно 300 нуклеотидами. В некоторых вариантах воплощения сегменты-мишени в пределах области-мишени отделены друг от друга количеством нуклеотидов, равным, приблизительно равным, не превышающим или приблизительно не превышающим 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, или являющимся диапазоном, определяемым любыми двумя из предшествующих значений. В некоторых вариантах воплощения сегменты-мишени в пределах области-мишени отделены друг от друга не более чем или приблизительно не более чем 5 нуклеотидами нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах воплощения сегменты-мишени являются непрерывными. Рассматриваются области-мишени, определенные диапазоном, имеющим исходную нуклеиновую кислоту, которая является любым из 5′-сайтов-мишеней или 3′-сайтов-мишеней, перечисленных здесь.

Подходящие сегменты-мишени могут находиться в 5′-UTR, в кодирующей области, в 3′-UTR, интроне, экзоне или переходе экзон/интрон. Сегменты-мишени, содержащие стартовый кодон или стоп-кодон, также являются подходящими сегментами-мишенями. Подходящий сегмент-мишень может специфически исключать некоторую структурно определенную область, например, стартовый кодон или стоп-кодон.

Определение подходящих сегментов-мишеней может включать сравнение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с другими последовательностями в пределах генома. Например, для выявления областей сходства между различными нуклеиновыми кислотами можно использовать алгоритм BLAST. Это сравнение может предотвратить выбор последовательностей антисмысловых соединений, способных гибридизоваться неспецифическим образом с последовательностями, отличающимися от выбранной нуклеиновой кислоты-мишени (т.е. последовательностями, не являющимися мишенями, или неспецифическими последовательностями).

Активность (например, определенная по процентному уменьшению уровней нуклеиновой кислоты-мишени) антисмысловых соединений может меняться в пределах активной области-мишени. В некоторых вариантах воплощения снижение уровней мРНК GCGR указывает на ингибирование экспрессии GCGR. Снижение уровней белка GCGR также указывает на ингибирование экспрессии мРНК-мишени. Кроме того, фенотипические изменения указывают на ингибирование экспрессии GCGR. В некоторых вариантах воплощения снижение уровней глюкозы, снижение уровней липидов и снижение массы тела может указывать на ингибирование экспрессии GCGR. В некоторых вариантах воплощения облегчение симптомов, ассоциированных с метаболическим заболеванием, может указывать на ингибирование экспрессии GCGR. В некоторых вариантах воплощения облегчение симптомов, ассоциированных с диабетом, может указывать на ингибирование экспрессии GCGR. В некоторых вариантах воплощения снижение инсулинорезистентности указывает на ингибирование экспрессии GCGR. В некоторых вариантах воплощения снижение биомаркеров диабета может указывать на ингибирование экспрессии GCGR.

Гибридизация

В некоторых вариантах воплощения гибридизация происходит между антисмысловым соединением, описанным здесь, и нуклеиновой кислотой GCGR. Наиболее распространенный механизм гибридизации включает образование водородных связей (например, образование водородных связей по Уотсону-Крику, Хугстену или обратное хугстеновское образование водородных связей) между комплементарными нуклеиновыми основаниями молекул нуклеиновой кислоты.

Гибридизация может происходить в различных условиях. Жесткие условия зависят от последовательности и определяются в зависимости от природы и состава молекул нуклеиновых кислот, подлежащих гибридизации.

Способы определения возможности специфической гибридизации последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, представленные здесь, способны специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой GCGR.

Комплементарность

Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень комплементарны друг другу, если достаточное количество нуклеиновых оснований антисмыслового соединения может образовывать водородные связи с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени, так что происходит желательный эффект (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени, например, нуклеиновой кислоты GCGR).

Антисмысловое соединение может гибридизоваться с одним или более сегментов нуклеиновой кислоты GCGR таким образом, что промежуточные или смежные сегменты не участвуют в событии гибридизации (например, петлевые структуры, несоответствия или шпилечные структуры).

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, представленные здесь, или их определенный фрагмент являются или являются по меньшей мере на 70, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100% комплементарными нуклеиновой кислоте GCGR, области-мишени, сегменту-мишени или их определенному фрагменту. Процент комплементарности антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью можно определить с помощью стандартных рабочих способов.

Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения комплементарны области-мишени и, следовательно, должны специфически гибридизоваться, должно быть на 90 процентов комплементарным. В этом примере оставшиеся некомплементарные нуклеиновые основания могут быть сгруппированы или рассредоточены среди комплементарных нуклеиновых оснований и не обязательно должны примыкать друг к другу или к комплементарным нуклеиновым основаниям. Таким образом, антисмысловое соединение длиной 18 нуклеиновых оснований, имеющее 4 (четыре) некомплементарных нуклеотидных основания, окруженные двумя областями полной комплементарности с нуклеиновой кислотой-мишенью, обладает 77,8% общей комплементарности с нуклеиновой кислотой-мишенью и, таким образом, находится в рамках настоящего изобретения. Процентную комплементарность антисмыслового соединения и области нуклеиновой кислоты-мишени можно определить в рабочем порядке, используя программное обеспечение BLAST (простейшие инструменты поиска локального выравнивания) и программное обеспечение PowerBLAST, известное в данной области техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичности или комплементарности последовательности можно определить, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Мэдисон, штат Висконсин, США), использующей алгоритм Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489), используя настройки по умолчанию.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, представленные здесь, или их определенные фрагменты, полностью комплементарны (т.е. на 100% комплементарны) нуклеиновой кислоте-мишени или ее определенному фрагменту. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарно нуклеиновой кислоте GCGR или области-мишени, или сегменту-мишени, или их последовательности-мишени. Как используется здесь, "полностью комплементарный" означает, что каждое нуклеиновое основание антисмыслового соединения способно к точному спариванию оснований с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени. Например, антисмысловое соединение длиной 20 нуклеиновых оснований полностью комплементарно последовательности-мишени длиной 400 нуклеотидных оснований, при условии, что существует соответствующий фрагмент нуклеиновой кислоты-мишени длиной 20 нуклеиновых оснований, полностью комплементарный антисмысловому соединению. Термин "полностью комплементарный" также можно использовать по отношению к указанному фрагменту первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, фрагмент из 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения длиной 30 нуклеиновых оснований может быть "полностью комплементарным" последовательности-мишени длиной 400 нуклеиновых оснований. Фрагмент из 20 нуклеиновых оснований олигонуклеотида длиной 30 нуклеиновых оснований полностью комплементарен последовательности-мишени, если последовательность-мишень имеет соответствующий фрагмент из 20 нуклеиновых оснований, где каждое нуклеиновое основание комплементарно фрагменту из 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения. В то же время все антисмысловое соединение из 30 нуклеиновых оснований может быть или не быть полностью комплементарно последовательности-мишени, в зависимости от того, являются ли остальные 10 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения также комплементарными последовательности-мишени.

Положение некомплементарного нуклеинового основания может находиться на 5′-конце или на 3′-конце антисмыслового соединения. В качестве альтернативы некомплементарное нуклеиновое основание или основания могут находиться внутри антисмыслового соединения. При наличии двух или более некомплементарных нуклеиновых оснований они могут быть смежными (то есть соединенными) или несмежными. В одном варианте воплощения некомплементарное нуклеиновое основание расположено в сегменте крыла гэпмерного антисмыслового олигонуклеотида.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, длина которых равна или составляет до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеиновых оснований, включают не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного(ых) нуклеинового(ых) основания(й) по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, например, нуклеиновой кислоте GCGR, или ее определенному фрагменту.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, длина которых равна или составляет до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеиновых оснований, включают не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного(ых) нуклеинового(ых) основания(й) по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, например, нуклеиновой кислоте GCGR, или ее определенному фрагменту.

Антисмысловые соединения, представленные здесь, также включают соединения, комплементарные фрагменту нуклеиновой кислоты-мишени. Как используется здесь, "фрагмент" относится к определенному количеству смежных (т.е. соединенных) нуклеиновых оснований в пределах области или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени. "Фрагмент" также может относиться к определенному количеству смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 8 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 12 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 13 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 14 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 15 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 16 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 17 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 18 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 19 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанные антисмысловые соединения комплементарны фрагменту сегмента-мишени длиной по меньшей мере 20 нуклеиновых оснований. Кроме того, рассматриваются антисмысловые соединения, комплементарные фрагменту сегмента-мишени, длина которого составляет по меньшей мере 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеиновых оснований или равна диапазону, определяемому любыми двумя из указанных значений.

Идентичность

Антисмысловые соединения, представленные здесь, также обладают определенной процентной идентичностью конкретной нуклеотидной последовательности, SEQ ID NO, или соединению, представленному определенным номером Isis, или их фрагменту. Как используется здесь, антисмысловое соединение идентично последовательности, описанной здесь, если оно обладает аналогичной способностью к спариванию нуклеиновых оснований. Например, РНК, содержащая урацил вместо тимидина в описанной ДНК-последовательности, считается идентичной указанной последовательности ДНК, так как и урацил, и тимидин спариваются с аденином. Кроме того, рассматриваются укороченные и удлиненные варианты антисмысловых соединений, описанных здесь, а также соединения, имеющие основания, неидентичные по отношению к антисмысловым соединениям, представленным здесь. Неидентичные основания могут располагаться рядом друг с другом или распределяться по всему антисмысловому соединению. Процентную идентичность антисмыслового соединения рассчитывают в соответствии с количеством оснований, обладающих идентичной способностью к спариванию оснований по отношению к последовательности, с которой его сравнивают.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения или их фрагменты по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны одному или более из антисмысловых соединений или SEQ ID NOs, или их фрагменту, описанному здесь.

Модификации

Нуклеозид является комбинацией основание-сахароза. Часть нуклеозида, являющаяся нуклеиновым основанием (также называемая основанием), как правило, является гетероциклической основной группой. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, дополнительно включающие фосфатную группу, ковалентно присоединенную к сахарозному фрагменту нуклеозида. Для нуклеозидов, включающих пентафуранозильную сахарозу, фосфатная группа может быть связана с 2′-, 3′- или 5′-гидроксильной группой сахарозы. Олигонуклеотиды образуются за счет ковалентного связывания смежных нуклеозидов друг с другом с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В пределах структуры олигонуклеотида фосфатные группы часто называют группами, образующими межнуклеозидные связи олигонуклеотида.

Модификации антисмысловых соединений охватывают замены или изменения межнуклеозидных связей, сахарозных групп или нуклеиновых оснований. Модифицированные антисмысловые соединения часто являются предпочтительными перед природными формами ввиду их желательных свойств, например, повышенного поглощения клетками, повышенного сродства к нуклеиновой кислоте-мишени, повышенной стабильности в присутствии нуклеаз или повышенной ингибиторной активности.

Химически модифицированные нуклеозиды также можно использовать для увеличения сродства связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с его нуклеиновой кислотой-мишенью. Следовательно, часто можно получить сопоставимые результаты с использованием более коротких антисмысловых соединений, которые имеют такие химически модифицированные нуклеозиды.

Модифицированные межнуклеозидные связи

Природная межнуклеозидная связь РНК и ДНК представляет собой 3′-5′-фосфодиэфирную связь. Антисмысловые соединения, имеющие одну или более модифицированных, т.е. неприродных, межнуклеозидных связей, часто являются предпочтительными перед антисмысловыми соединениями, имеющими природные межнуклеозидные связи, ввиду их желательных свойств, например, повышенного поглощения клетками, повышенного сродства к нуклеиновой кислоте-мишени и повышенной стабильности в присутствии нуклеаз.

Олигонуклеотиды с модифицированными межнуклеозидными связями включают межнуклеозидные связи, сохраняющие атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, не имеющие атомов фосфора. Типичные фосфоросодержащие межнуклеозидные связи включают фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидаты и фосфортиоаты, но не ограничиваются ими. Хорошо известны способы получения фосфоросодержащих и не содержащих фосфора связей.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, содержат одну или более модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах воплощения указанные модифицированные межнуклеозидные связи являются фосфоротиоатными связями. В некоторых вариантах воплощения каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.

Модифицированные сахарозные группы

Антисмысловые соединения, представленные здесь, могут, необязательно, содержать один или более нуклеозидов с модифицированными сахарозными группами. Такие модифицированные по сахарозе нуклеозиды могут придавать антисмысловым соединениям повышенную устойчивость к нуклеазам, повышенное сродство связывания или какое-либо другое благоприятное биологическое свойство. В некоторых вариантах воплощения указанные нуклеозиды включают химически модифицированную рибофуранозную кольцевую группу. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, без ограничения, добавление групп-заместителей (в том числе 5′- и 2′-групп-заместителей); формирование мостика из негеминальных кольцевых атомов с образованием бициклических нуклеиновых кислот (БНК); замещение атома кислорода в рибозильном кольце S, N(R) или C(R1)(R)2 (R=Н, С₁-С₁₂-алкил или защитная группа); и их комбинации. Примеры химически модифицированных сахароз включают 2′-F-5′-метилзамещенный нуклеозид (см. международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 21/08/08 по отношению к другим описанным 5′, 2′-бисзамещенным нуклеозидам), замену атома кислорода рибозильного кольца атомом S с последующим замещением по 2′-положению (см. патентную заявку США US 2005/0130923, опубликованную 16 июня 2005 г.) или, в качестве альтернативы, 5′-замещение БНК (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 22/11/07, где запертая нуклеиновая кислота замещена, например, 5′-метильной или 5′-винильной группой).

Примеры нуклеозидов, имеющих модифицированные сахарозные группы, включают, без ограничения, нуклеозиды, содержащие 5′-винильные, 5′-метильные (R или S), 4′-S, 2′-F, 2′-ОСН₃ и 2′-O(СН₂)2OCH₃-группы-заместители. Заместитель в 2′-положении также можно выбрать из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C₁-C_1O-алкила, OCF₃, O(СН₂)2SCH₃, O(CH₂)2-O-N(Rm)(Rn) и O-CH₂-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждая Rm и Rn независимо является Н или замещенным или незамещенным C₁-C_1O-алкилом.

Как используется здесь, "бициклические нуклеозиды" относится к модифицированным нуклеозидам, включающим бициклическую сахарозную группу. Примеры бициклических нуклеозидов включают, без ограничения, нуклеозиды, содержащие мостик между 4′- и 2′-атомами рибозильного кольца. В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, представленные здесь, включают один или более бициклических нуклеозидов, в которых мостик включает 4′-2′-бициклический нуклеозид. Примеры таких 4′-2′-бициклических нуклеозидов включают, не ограничиваясь этим, одну из формул: 4′-(СН₂)-O-2′ (LNA); 4′-(CH₂)-S-2′; 4′-(CH₂)2-O-2′ (ENA); 4′-СН(СН₃)-O-2′ и 4′-СН(CH₂OCH₃)-O-2′, и их аналоги (см. патент США 7399845, опубликованный 15 июля 2008 г.); 4′-С(СН₃)(СН₃)-O-2′ и его аналоги (см. международную заявку РСТ WO 2009/006478, опубликованную 8 января 2009 г.); 4′-СН₂-Н(ОСН₃)-2′ и его аналоги (см. международную заявку РСТ WO 2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008 г.); 4′-СН₂-O-N(СН₃)-2′ (см. патентную заявку США US 2004/0171570, опубликованную 2 сентября 2004 г.); 4′-CH₂-N(R)-O-2′, где R является Н, С₁-С₁₂-алкилом или защитной группой (см. патент США 7427672, опубликованный 23 сентября 2008 г.); 4′-СН₂-С(Н)(СН₃)-2′ (см. Chattopadhyaya, et ей., J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134); и 4′-СН₂-С(=СН₂)-2′ и его аналоги (см. международную заявку РСТ WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 г.). Также см., например: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumaretal., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США под номерами США 6670461, 7053207, 6268490, 6770748, 6794499, 7034133, 6525191, 7399845; опубликованные международные заявки РСТ WO 2004/106356, WO 94/14226, WO 2005/021570 и WO 2007/134181; патентные публикации США под номерами US 2004/0171570, US 2007/0287831 и US 2008/0039618; и патенты США под номерами 12/129154, 60/989574, 61/026995, 61/026998, 61/056564, 61/086231, 61/097787 и 61/099844; и международные заявки РСТ под номерами PCT/US 2008/064591, PCT/US2008/066154 и PCT/US 2008/068922. Каждый из вышеуказанных бициклических нуклеозидов можно получить, имея одну или более стереохимических сахарозных конфигураций, в том числе, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (см. международную заявку PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 г. как WO 99/14226).

В некоторых вариантах воплощения бициклические сахарозные группы БНК-нуклеозидов включают, не ограничиваясь ими, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между 4′- и 2′-положением пентофуранозильной сахарозной группы, причем такие мостики независимо включают 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R_a)(R_b)]_n-, -C(R_a)=C(R_b)-, -C(R_a)=N-, -C(=NR_a)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R_a)₂-, -S(=O)_x- и -N(R_a)-;

где:

x равен О, 1 или 2;

правей 1, 2, 3 или 4;

каждая R_a и R_b, независимо, является Н, защитной группой, гидроксилом, C₁-C₁₂-алкилом, замещенным С₁-С₁₂-алкилом, С₂-С₁₂-алкенилом, замещенньш С₂-С₁₂-алкенилом, С₂-С₁₂-алкинилом, замещенным С₂-С₁₂-алкинилом, С₅-C_2O-арилом, замещенным С₅-C_2O-арилом, гетероциклическим радикалом, замещенньш гетероциклическим радикалом, гетероарилом, замещенным гетероарилом, С₅-С₇-алициклическим радикалом, замещенньш С₅-С₇-алициклическим радикалом, атомом галогена, OJ₁, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, COOJ₁, ацилом (С(=O)-Н), замещенным ацилом, CN, сульфонилом (S(=O)₂-J₁) или сульфоксилом (S(=O)-J₁); и

каждая J₁ и J₂, независимо, является Н, С₁-С₁₂-алкилом, замещенным Ci-Сп-алкилом, С₂-С₁₂-алкенилом, замещенным С₂-С₁₂-алкенилом, С₂-С₁₂-алкинилом, замещенньш С₂-С₁₂-алкинилом, С₅-C_2O-арилом, замещенньш С₅-C_2O-арилом, ацилом (С(=O)-Н), замещенньш ацилом, гетероциклическим радикалом, замещенньш гетероциклическим радикалом, С₁-С₁₂-аминоалкилом, замещенньш С₁-С₁₂-аминоалкилом или защитной группой.

В некоторых вариантах воплощения мостик бициклической сахарозной группы является -[C(R_a)(R_b)]n-, -[C(R_a)(R_b)]n-O-, -C(R_aR_b)-N(R)-O- или -C(R_aR_b)-O-N(R)-. В некоторых вариантах воплощения указанный мостик является 4′-СН₂-2′, 4′-(СН₂)₂-2′, 4′-(СН₂)₂-2′, 4′-СН₂-O-2′, 4′-(СН₂)₂-O-2′, 4′-CH₂-O-N(R)-2′ и 4′-CH₂-N(R)-O-2′-, где каждая R, независимо, является Н, защитной группой или С₁-С₁₂-алкилом.

В некоторых вариантах воплощения бициклические нуклеозиды дополнительно определяют по изомерной конфигурации. Например, нуклеозид, включающий 4′-2′-метиленокси-мостик, может находиться в конфигурации a-L или в конфигурации β-D. Ранее α-L-метиленокси (4′-СН₂-O-2′) БНК включили в антисмысловые олигонуклеотиды, демонстрировавшие антисмысловую активность (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

В некоторых вариантах воплощения бициклические нуклеозиды включают (A) α-L-метиленокси (4′-СН₂-O-2′) БНК, (В) β-D-метиленокси (4′-СН₂-O-2′) БНК, (С) этиленокси (4′-(СН₂)₂-O-2′) БНК, (D) аминоокси (4′-CH₂-O-N(R)-2′) БНК, (Е) оксиамино (4′-СН₂-N(R)-O-2′) БНК, (F) метил(метиленокси) (4′-СН(СН₃)-O-2′) БНК, (G) метилентио (4′-СН₂-S-2′) БНК, (Н) метиленамино (4′-CH₂-N(R)-2′) БНК, (I) метил карбоциклическую (4′-СН₂-СН(СН₃)-2′) БНК и (J) пропилен карбоциклическую (4′-(СН₂)₃-2′) БНК, как изображено ниже, но не ограничиваются ими:

где Вх является группой основания, а R независимо является Н, защитной группой или С₁-С₁₂-алкилом.

В некоторых вариантах воплощения бициклический нуклеозид имеет Формулу I:

где:

Вх является гетероциклической основной группой;

-Q_a-Q_b-Q_c- является -CH₂-N(R_c)-CH₂-, -C(=O)-N(R_c)-CH₂-, -CH₂-O-N(R_c)-, -СН₂-N(R_c)-O- или -N(R_c)-O-CH₂;

Re является С₁-С₁₂-алкилом или аминозащитной группой; и

каждая из Т_а и T_b независимо является Н, гидрокси-защитной группой, группой конъюгата, реакционноспособной фосфорсодержащей группой, фосфорсодержащей группой или ковалентным присоединением к среде-носителю.

В некоторых вариантах воплощения бициклический нуклеозид имеет Формулу II:

где:

Вх является гетероциклической основной группой;

Za является C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкинилом, ацилом, замещенным ацилом, замещенным амидом, тиолом или замещенной тиогруппой.

В одном варианте воплощения каждая из замещенных групп независимо является моно- или полизамещенной группой-заместителем, независимо выбранной из галогена, оксо, гидроксила, OJ_c, NJ_cJ_d, SJ_c, N₃, OC(=X)J_c и NJ_eC(=X)NJ_cJ_d, где каждая J_c, J_d и J_e независимо является Н, C₁-С₆-алкилом или замещенным C₁-С₆-алкилом, а Х является О или NJ_c.

В некоторых вариантах воплощения бициклический нуклеозид имеет Формулу III:

где:

Вх является гетероциклической основной группой;

Z_b является C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкинилом или замещенным ацилом (С(=O)-).

В некоторых вариантах воплощения бициклический нуклеозид имеет Формулу IV:

где:

Вх является гетероциклической основной группой;

R_d является C₁-С₆-алкилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом или замещенным С₂-С₆-алкинилом;

каждая из q_a, q_b, q_c и q_d независимо является Н, атомом галогена, C₁-С₆-алкилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом или замещенным С₂-С₆-алкинилом, C₁-С₆-алкоксилом, замещенным C₁-С₆-алкоксилом, ацилом, замещенным ацилом, C₁-С₆-аминоалкилом или замещенным C₁-С₆-аминоалкилом.

В некоторых вариантах воплощения бициклический нуклеозид имеет Формулу V:

где:

Вх является гетероциклической основной группой;

каждая из q_a, q_b, q_e и q_f независимо является атомом водорода, атомом галогена, С₁-С_′12-алкилом, замещенным С₁-С₁₂-алкилом, С₂-С₁₂-алкенилом, замещенным C₂-C₁₂-алкенилом, С₂-С₁₂-алкинилом, замещенным С₂-С₁₂-алкинилом, С₁-С₁₂-алкокси, замещенным С₁-С₁₂-алкокси, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k;

или q_e и q_f совместно являются =C(q_g)(q_h);

каждая из q_g и q_h независимо является Н, атомом галогена, С₁-С₁₂-алкилом или замещенным С₁-С₁₂-алкилом.

Описан синтез и получение метиленокси (4′-СН₂-O-2′) БНК-мономеров аденина, цитозина, гуанина, 5-метилцитозина, тимина, урацила наряду с их олигомеризацией, а также их свойства распознавания нуклеиновых кислот (см., например, Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). БНК и их получение также описаны в WO 98/39352 и WO 99/14226.

Кроме того, получены аналоги метиленокси (4′-СН₂-O-2′) БНК, метиленокси (4′-СН₂-O-2′) БНК и 2′-тио-БНК (см., например, Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Кроме того, описано получение заблокированных аналогов нуклеозидов, включающее двуцепочечные олигодезоксирибонуклеотидные структуры в качестве субстратов для полимераз нуклеиновых кислот (см., например, Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области техники описан синтез 2′-амино-БНК, нового конформационно ограниченного олигонуклеотидного аналога с высоким сродством (см., например, Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, были получены 2′-амино- и 2′-метиламино-БНК и ранее сообщалось о температурной стабильности их двуцепочечных структур с комплементарными цепями РНК и ДНК.

В некоторых вариантах воплощения бициклический нуклеозид имеет Формулу VI:

где:

Вх является гетероциклической основной группой;

каждая из q_i, q_j, q_k и q_l независимо является Н, галогеном, C₁-С₁₂-алкилом, замещенным С_2-С₁₂-алкилом, С₂-С₁₂-алкенилом, замещенным С₂-С₁₂-алкенилом, C₂-C₁₂-алкинилом, замещенным С₂-С₁₂-алкинилом, С₁-С₁₂-алкоксилом, замещенным C₁-С₁₂-алкоксилом, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO2J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)-NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k; и

q_i и q_j или q_i и q_k совместно являются =C(q_g)(q_h), где каждая из q_g и q_h независимо является Н, атомом галогена, С₁-С₁₂-алкилом или замещенным С₁-С₁₂-алкилом.

Описан карбоциклический бициклический нуклеозид, имеющий 4′-(СН₂)₃-2′-мостик, и алкенильный аналог, мостик 4′-СН=СН-СН₂-2′ (см., например, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 77, 7731-7740). Кроме того, описаны синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов наряду с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (см., например, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).

Как используется здесь, "4′-2′-бициклический нуклеозид" или "от 4′- до 2′-бициклический нуклеозид" относится к бициклическому нуклеозиду, включающему фуранозное кольцо, включающее мостик, соединяющий 2′-атом углерода и 4′-атом углерода.

Как используется здесь, термин "моноциклические нуклеозиды" относится к нуклеозидам, включающим модифицированные сахарозные группы, не являющиеся бициклическими сахарозными группами. В некоторых вариантах воплощения сахарозная группа или аналог сахарозной группы нуклеозида может быть модифицирован или замещен по любому положению.

Как используется здесь, "2′-модифицированная сахароза" означает фуранозильную сахарозу, модифицированную по 2′-положению. В некоторых вариантах воплощения такие модификации включают заместители, выбранные из: галогенида, включая замещенный и незамещенный алкокси, замещенный и незамещенный тиоалкил, замещенный и незамещенный аминоалкил, замещенный и незамещенный алкил, замещенный и незамещенный аллил и замещенный и незамещенный алкинил, но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах воплощения 2′-модификации выбраны из заместителей, включающих, но не ограничивающихся этим: O[(СН₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(СН₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂, ОСН₂С(=O)N(Н)СН₃ и O(СН₂)_nON[(СН₂)_nCH₃]2, где пит равны от 1 до приблизительно 10. Другие 2′-заместители также можно выбрать из: С₁-С₁₂-алкила; замещенного алкила; алкенила; алкинила; алкарила; аралкила; O-алкарила или O-аралкила; SH; SCH₃; OCN; Cl; Br; CN; CF₃; OCF₃; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂; N₃; NH₂; гетероциклоалкила; гетероциклоалкарила; аминоалкиламино; полиалкиламино; замещенного силила; РНК-расщепляющей группы; репортерной группы; интеркалирующего агента; группы для улучшения фармакокинетических свойств и группы для улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения, и других заместителей, обладающих сходными свойствами. В некоторых вариантах воплощения модифицированные нуклеозиды включают 2′-МОЕ-боковую цепь (см., например, Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Описано, что такое 2′-МОЕ-замещение обладает улучшенным сродством связывания по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и другими модифицированными нуклеозидами, например, 2′-O-метил, O-пропил и O-аминопропил. Кроме того, показано, что олигонуклеотиды, имеющие 2′-МОЕ-заместитель, являются антисмысловыми ингибиторами экспрессии генов с перспективными свойствами для применения in vivo (см., например, Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 63O-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).

Как используется здесь, "модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид" или "модифицированный ТНР-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий шестичленную тетрагидропирановую "сахарозу", замещенную аналогично пентофуранозильному остатку в обычных нуклеозидах (суррогат сахарозы). Модифицированные ТНР-нуклеозиды включают, не ограничиваясь ими, то, что в данной области техники называют гекситной нуклеиновой кислотой (HNA), анитной нуклеиновой кислотой (AHA), маннитной нуклеиновой кислотой (MNA) (см. Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854), фторированной HNA (F-HNA) или соединения, имеющие Формулу X:

где независимо для каждого из по меньшей мере одного тетрагидропиранового аналога нуклеозида формулы X:

Вх является гетероциклической основной группой;

каждая из Т₃ и Т₄ независимо является группой межнуклеозидной связи, соединяющей тетрагидропирановый аналог нуклеозида с антисмысловым соединением, либо одна из Т₃ и Т₄ является группой межнуклеозидной связи, соединяющей тетрагидропирановый аналог нуклеозида с антисмысловым соединением, а другая из Т₃ и Т₄ является Н, гидроксил-защитной группой, группой присоединенного конъюгата или 5′-или 3′-концевой группой;

каждая из q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ независимо является Н, C₁-С₆-алкилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом или замещенным С₂-С₆-алкинилом; и

одна из R₁ и R₂ является атомом водорода, а другая выбрана из атома галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, OC(=X)J₁, OC(=X)NJ₁J₂, NJ₃C(=X)NJ₁J₂ и CN, где Х является О, S или NJ₁, а каждая из J₁, J₂ и J₃ независимо является Н или C₁-С₆-алкилом.

В некоторых вариантах воплощения представлены модифицированные ТНР-нуклеозиды Формулы X, где каждая из q_m, q_n, q_p, q_r, q_s, q_t и q_u является Н. В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере одна из q_m, q_n, q_p, q_r, q_s, q_t и q_u не является Н. В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере одна из q_m, q_n, q_p, q_r, q_s, q_t и q_u является метилом. В некоторых вариантах воплощения представлены ТНР-нуклеозиды формулы X, где одна из R₁ и R₂ является F. В некоторых вариантах воплощения R₁ является атомом фтора, a R₂ является Н, R₁ является метокси, а R₂ является Н, и R₁ является метоксиэтокси, а R₂ является Н.

Как используется здесь, "2′-модифицированный" или "2′-замещенный" относится к нуклеозиду, включающему сахарозу, включающую заместитель по 2′-положению, не являющийся Н или ОН. 2′-модифицированные нуклеозиды включают, не ограничиваясь ими, бициклические нуклеозиды, где мостик, соединяющий два атома углерода сахарозного кольца, соединяет 2′-атом углерода и другой атом углерода сахарозного кольца, и нуклеозиды с 2′-заместителями, не образующими мостика, например, аллилом, амино, азидо, тио, O-аллилом, O-C₁-С₁₀-алкилом, -OCF₃, O-(СН₂)₂-O-СН₃, 2′-O(СН₂)2SCH₃, O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n) или O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n), где каждая из R_m и R_n независимо является Н или замещенным или незамещенным C₁-С₁₀-алкилом. 2′-модифицированные нуклеозиды могут дополнительно включать другие модификации, например, по другим положениям сахарозы и/или нуклеинового основания.

Как используется здесь, "2′-F" относится к сахарозе, включающей фторзамещенную группу по 2′-положению.

Как используется здесь, каждый из терминов "2′-ОМе" или "2′-ОСН₃" или "2′-O-метил" относится к сахарозе, включающей -ОСН₃-группу по 2′-положению сахарозного кольца.

Как используется здесь, "олигонуклеотид" относится к соединению, включающему множество соединенных нуклеозидов. В некоторых вариантах воплощения один или более из указанного множества нуклеозидов модифицированы. В некоторых вариантах воплощения олигонуклеотид включает один или более рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).

В данной области техники известны многие другие суррогаты сахароз на основе бицикло- и трицикло-кольцевых систем, которые можно использовать для модификации нуклеозидов для включения в антисмысловые соединения (см, например, обзорную статью: Leumann, J. С, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).

Такие кольцевые системы могут подвергаться различным дополнительным заменам для повышения активности.

Специалистам в данной области техники известны многие способы получения модифицированных сахароз.

В нуклеотидах, содержащих модифицированные сахарозные группы, сохраняются группы нуклеиновых оснований (природные, модифицированные или их комбинации) для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения включают один или более нуклеотидов, содержащих модифицированные сахарозные группы. В некоторых вариантах воплощения указанная модифицированная сахарозная группа является 2′-МОЕ. В некоторых вариантах воплощения 2′-МОЕ-модифицированные нуклеотиды упорядочены в составе гэпмерного мотива. В некоторых вариантах воплощения указанная модифицированная сахарозная группа является cEt. В некоторых вариантах воплощения cEt-модифицированные нуклеотиды упорядочены в составе крыльев гэпмерного мотива.

Модифицированные нуклеиновые основания

Модификации или замены нуклеиновых оснований (или оснований) структурно отличаются, но функционально взаимозаменяемы с природными или синтетическими модифицированными нуклеиновыми основаниями. Как природные, так и модифицированные нуклеиновые основания способны участвовать в образовании водородных связей. Такие модификации по нуклеиновому основанию могут придавать антисмысловому соединению устойчивость к нуклеазам, сродство связывания или какое-либо другое благоприятное биологическое свойство. Модифицированные нуклеиновые основания включают синтетические и природные нуклеиновые основания, например, 5-метилцитозин (5-me-С). Некоторые замены нуклеиновых оснований, включая замену 5-метилцитозином, особенно полезны для усиления сродства связывания антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью. Например, показано, что замена на 5-метилцитозин повышает стабильность двуцепочечной структуры нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, В., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278).

Дополнительные немодифицированные нуклеиновые основания включают 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинил (-С≡С-СН₃) урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные производные аденина и гуанина, 5-гало, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные производные урацила и цитозина, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.

Гетероциклические основные группы также включают группы, в которых пуриновое или пиримидиновое основание замещено другими гетероциклами, например, 7-деазааденином, 7-деазагуанозином, 2-аминопиридином и 2-пиридоном. Нуклеиновые основания, особенно полезные для повышения сродства связывания антисмысловых соединений, включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.

В некоторых вариантах воплощения антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, содержат одно или более модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения расширенные за счет разрыва антисмысловые олигонуклеотиды, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, содержат одно или более модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах воплощения указанное модифицированное нуклеиновое основание является 5-метилцитозином. В некоторых вариантах воплощения каждый цитозин является 5-метилцитозином.

Композиции и способы составления фармацевтических композиций

Антисмысловые олигонуклеотиды можно смешать с фармацевтически приемлемым активным или инертным веществом для изготовления фармацевтических композиций или составов. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от ряда критериев, включая путь введения, степень развития заболевания или вводимую дозу, не ограничиваясь этим.

Антисмысловые соединения, мишенью которых является нуклеиновая кислота GCGR, можно использовать в фармацевтической композиции путем объединения антисмыслового соединения с подходящим фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буфер (PBS). PBS является разбавителем, пригодным для применения в композициях, доставляемых парентеральным путем. Соответственно, в одном варианте воплощения в способах, описанных здесь, применяют фармацевтическую композицию, включающую антисмысловое соединение, мишенью которого является нуклеиновая кислота GCGR, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах воплощения указанный фармацевтически приемлемый разбавитель является PBS. В некоторых вариантах воплощения указанное антисмысловое соединение является антисмысловым олигонуклеотидом.

Фармацевтические композиции, включающие антисмысловые соединения, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких эфиров, или любой другой олигонуклеотид, который при введении в организм животного, в том числе человека, способен обеспечить (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток. Соответственно, например, настоящее описание также распространяется на фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, пролекарства, фармацевтически приемлемые соли таких пролекарств и другие биоэквиваленты. Подходящие фармацевтически приемлемые соли включают соли натрия и калия, но не ограничиваются ими.

Фармацевтически приемлемые соли соединений, описанных здесь, можно получить с помощью способов, известных в данной области техники. Обзор фармацевтически приемлемых солей см. в справочнике Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002). Натриевые соли антисмысловых олигонуклеотидов полезны и хорошо переносятся при терапевтическом введении в организм человека. Соответственно, в одном варианте воплощения соединения, описанные здесь, представлены в виде соли натрия.

Пролекарство может включать внедрение дополнительных нуклеозидов по одному или обоим концам антисмыслового соединения, отщепляемых эндогенными нуклеазами в организме с образованием активного антисмыслового соединения.

Конъюгированные антисмысловые соединения

Антисмысловые соединения можно ковалентно присоединить к одной или более групп или конъюгатов, усиливающих активность, распределение в клетке или поглощение клеткой полученных антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные конъюгатные группы включают группы холестерина и липидов. Дополнительные конъюгатные группы включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.

Антисмысловые соединения также можно модифицировать, включая одну или несколько стабилизирующих групп, которые обычно присоединяют к одному или обоим концам антисмысловых соединений для усиления их свойств, например, устойчивости к нуклеазам. Стабилизирующие группы включают кэп-структуры. Указанные концевые модификации защищают антисмысловое соединение, содержащее концевые структуры нуклеиновых кислот, от разрушения экзонуклеазами, и могут помочь в доставке и/или локализации в клетке. Кэп может присутствовать на 5′-конце (5′-кэп) или на 3′-конце (3′-кэп), или на обоих концах. Кэп-структуры хорошо известны в данной области техники и включают, например, обращенные дезоксиструктуры, лишенные оснований. Кроме того, для кэпирования одного или обоих концов антисмыслового соединения с целью придания устойчивости к нуклеазам можно использовать 3′ и 5′-стабилизирующие группы, в том числе группы, описанные в WO 03/004602, опубликованной 16 января 2003 г.

Культуры клеток и обработка антисмысловыми соединениями

Действие антисмысловых соединений на уровень, активность или экспрессию нуклеиновых кислот GCGR можно протестировать in vitro на различных типах клеток. Типы клеток, используемых для таких анализов, доступны у коммерческих поставщиков (например, в Американской колекции типовых культур, Манассас, штат Виргиния, США; Zen-Bio, Inc., Ресерч-Трайэнгл-Парк, штат Северная Каролина, США; Clonetics Corporation, Уолкерсвилл, штат Мэриленд, США); указанные клетки культивируют согласно инструкциям производителя с использованием доступных для приобретения реагентов (например, Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, штат Калифорния, США). Иллюстративные типы клеток включают клетки HepG2 и первичные гепатоциты, но не ограничиваются ими.

Тестирование антисмысловых олигонуклеотидов in vitro

Здесь описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть модифицированы соответствующим для обработки образом другими антисмысловыми соединениями.

В целом клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами при достижении культурой приблизительно 60-80% конфлюэнтности.

Один из реагентов, обычно используемых для внедрения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает катионный липидный реагент для трансфекции LIPOFECTIN® (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с LIPOFECTIN® в OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США) с целью достижения желательной конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN®, обычно находящейся в диапазоне 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Еще один из реагентов, используемых для внедрения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTAMINE 2000® в среде с ограниченным содержанием сыворотки OPTI-MEM® I (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США) с целью достижения желательной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE®, обычно находящейся в диапазоне 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Еще один из реагентов, используемых для внедрения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает Cytofectin® (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с Cytofectin® в среде с ограниченным содержанием сыворотки OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США) с целью достижения желательной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации Cytofectin®, обычно находящейся в диапазоне 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Еще одна методика, используемая для внедрения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает электропорацию.

Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами с помощью обычных способов. Клетки обычно собирают через 16-24 ч после обработки антисмысловым олигонуклеотидом, после чего измеряют уровни РНК или белка нуклеиновых кислот-мишеней способами, известными в данной области техники и описанными здесь. В целом при обработке в нескольких повторностях данные представляют в виде среднего значения по повторным обработкам.

Используемая концентрация антисмыслового олигонуклеотида зависит от линии клеток. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для конкретной линии клеток хорошо известны в данной области техники. Антисмысловые олигонуклеотиды обычно используют в концентрациях от 1 нМ до 300 нМ при трансфекции LIPOFECTAMINE2000®, липофектином или цитофектином. Антисмысловые олигонуклеотиды обычно используют в более высоких концентрациях (от 625 нМ до 20000 нМ) при трансфекции с помощью электропорации.

Выделение РНК

Анализ РНК можно выполнить, используя общую РНК клеток или поли(А)+мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники. РНК получают с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, например, с помощью реагента TRIZOL® (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США) в соответствии с протоколами, рекомендованными изготовителем.

Анализ ингибирования уровней или экспрессии мишени

Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты GCGR можно анализировать с помощью разнообразных способов, известных в данной области техники. Например, количественную оценку уровня нуклеиновой кислоты-мишени можно выполнить, например, с помощью нозерн-блоттинга, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени. Анализ РНК можно выполнить, используя общую РНК клеток или поли(А)+мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники. Нозерн-блоттинг также является стандартной процедурой, известной в данной области техники. Количественную ПЦР в реальном времени удобно осуществлять с использованием доступной для приобретения системы обнаружения последовательностей ABI PRISM® 7600, 7700 или 7900, PE-Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния, США, в соответствии с инструкциями производителя.

Количественный ПЦР-анализ в реальном времени уровней мРНК-мишени

Количественную оценку уровня РНК-мишени можно осуществлять путем количественной ПЦР в реальном времени с использованием доступной для приобретения системы обнаружения последовательностей ABI PRISM® 7600, 7700 или 7900 (PE-Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния, США), в соответствии с инструкциями производителя. Способы осуществления количественной ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники.

До осуществления ПЦР в реальном времени выделенную РНК подвергают реакции обратной транскриптазы (ОТ), которая продуцирует комплементарную ДНК (кДНК), которую затем используют в качестве субстрата для ПЦР-амплификации в реальном времени. Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени осуществляют последовательно в одной и той же лунке. Реагенты для ОТ и ПЦР в реальном времени получили из Invitrogen (Карлсбад, штат Калифорния, США). Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени проводят способами, известными специалистам в данной области техники.

Целевые количества гена (или РНК), полученные путем ПЦР в реальном времени, нормируют либо по уровню экспрессии гена, экспрессия которого является постоянной, например, циклофилина А, либо путем количественной оценки общей РНК с использованием RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Карлсбад, штат Калифорния, США). Экспрессию циклофилина А измеряют с помощью ПЦР в реальном времени, выполняемой одновременно с мишенью, в многоканальном режиме или раздельно. Количественную оценку общей РНК выполняют, используя реагент для количественной оценки РНК RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Юджин, штат Орегон, США). Способы количественной оценки РНК с помощью RIBOGREEN® описаны в статье Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Для измерения флуоресценции RIBOGREEN® используют прибор CYTOFLUOR® 4000 (РЕ Applied Biosystems).

Разработаны зонды и праймеры для гибридизации с нуклеиновой кислотой GCGR. Способы конструирования зондов и праймеров для ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники и могут включать использование такого программного обеспечения как PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния, США).

Анализ уровней белка

Антисмысловое ингибирование нуклеиновых кислот GCGR можно оценивать путем измерения уровня белка GCGR. Уровни белка GCGR можно оценивать или определять количественно с помощью различных способов, хорошо известных в данной области техники, например, иммунопреципитации, вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга), твердофазного иммуноферментного анализа (твердофазного ИФА), количественного анализа белка, анализов активности белков (например, анализов активности каспазы), иммуногистохимии, иммуноцитохимии или флуоресцентной сортировки клеток (FACS). Антитела к мишени можно идентифицировать и получить из различных источников, например, каталога антител MSRS (Aerie Corporation, Бирмингем, штат Мичиган, США), или изготовить с помощью общепринятых способов получения моноклональных или поликлональных антител, хорошо известных в данной области техники. Доступны для приобретения антитела, пригодные для обнаружения GCGR человека и крысы.

Тестирование антисмысловых соединений in vivo

Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигонуклеотиды, тестируют на животных с целью оценки их способности ингибировать экспрессию GCGR и производить фенотипические изменения. Тестирование можно проводить на здоровых животных или на экспериментальных моделях заболеваний. Для введения животным получают состав антисмысловых олигонуклеотидов в фармацевтически приемлемом разбавителе, например, фосфатно-солевом буфере. Введение включает введение парентеральным путем. После периода лечения антисмысловыми олигонуклеотидами из ткани выделяют РНК и измеряют изменения в экспрессии нуклеиновой кислоты GCGR. Кроме того, измеряют изменения уровней белка GCGR.

Некоторые показания

В некоторых вариантах воплощения представлены способы лечения индивида, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения индивид страдает метаболическим заболеванием.

Как показано в примерах, приведенных ниже, соединения, мишенью которых является GCGR, как описано здесь, снижают тяжесть физиологических симптомов метаболических заболеваний, в том числе метаболического синдрома, сахарного диабета, инсулинорезистентности, диабетической дислипидемии, гипертриглицеридемии, ожирения и увеличения веса. В некоторых экспериментах указанные соединения снижали уровень глюкозы в крови, например, животные продолжали испытывать симптомы, но указанные симптомы были ослаблены по сравнению с животными, не получавшими лечения. Вместе с тем, в других экспериментах, по-видимому, указанные соединения ослабляли симптомы диабета; например, животные, получавшие лечение в течение более длительного периода времени, испытывали менее тяжелые симптомы, чем животные, получавшие указанные соединения в течение более короткого периода времени. Вместе с тем, в других экспериментах, по-видимому, указанные соединения подавляли увеличение массы тела; например, животные, получавшие лечение в течение более длительного периода времени, испытывали менее тяжелые симптомы, чем животные, получавшие указанные соединения в течение более короткого периода времени. Вместе с тем, в других экспериментах, по-видимому, указанные соединения ингибировали гипертриглицеридемию; например, животные, получавшие лечение в течение более длительного периода времени, испытывали менее тяжелые признаки и/или симптомы, чем животные, получавшие указанные соединения в течение более короткого периода времени. Способность соединений, примеры которых приведены ниже, восстанавливать функции организма демонстрирует, что симптомы указанного заболевания можно изменить за счет лечения с применением соединения, как описано здесь.

Сахарный диабет характеризуется многочисленными физическими и физиологическими признаками и/или симптомами. Любой симптом, который, как известно специалисту в данной области техники, связан с сахарным диабетом 2 типа, можно улучшить или иным образом регулировать, как изложено выше в способах, описанных выше. В некоторых вариантах воплощения симптом или признак является физическим симптомом или признаком, например, повышенным уровнем глюкозы, повышенной массой тела, частым мочеиспусканием, необычной жаждой, сильным голодом, сильной утомляемостью, размытым зрением, частыми инфекциями, покалыванием или онемением конечностей, сухой и зудящей кожей, потерей массы тела, медленно заживающими язвами и опухшими деснами. В некоторых вариантах воплощения симптом или признак является физиологическим симптомом или признаком, выбранным из группы, состоящей из повышенной инсулинорезистентности, повышенного уровня глюкозы, увеличения массы жировой ткани, снижения скорости метаболизма, снижения клиренса глюкозы, снижения переносимости глюкозы, снижения чувствительности к инсулину, снижения чувствительности печени к инсулину, увеличения размера и массы жировой ткани, повышенного содержания жира и повышенной массы тела.

В некоторых вариантах воплощения указанный физический симптом или признак является повышенным уровнем глюкозы. В некоторых вариантах воплощения указанный признак или симптом является увеличением массы тела. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является частым мочеиспусканием. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является необычной жаждой. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является сильным голодом. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является сильной утомляемостью. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является размытым зрением. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является частыми инфекциями. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является покалыванием или онемением конечностей. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является сухой и зудящей кожей. В некоторых вариантах воплощения указанный признак или симптом является потерей массы тела. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является медленно заживающими язвами. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом является распухшими деснами. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является повышенной инсулинорезистентностью. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является повышенным уровнем глюкозы. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является повышенной массой жира. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является сниженной скоростью метаболизма. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является сниженным клиренсом глюкозы. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является сниженной переносимостью глюкозы. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является сниженной чувствительностью к инсулину. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является сниженной чувствительностью печени к инсулину. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является повышенным размером и массой жировой ткани. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является повышенным количеством жира. В некоторых вариантах воплощения указанный симптом или признак является повышенной массой тела.

В некоторых вариантах воплощения введение антисмыслового соединения, мишенью которого является нуклеиновая кислота GCGR, приводит к снижению экспрессии GCGR по меньшей мере на приблизительно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или к снижению, описываемому диапазоном, определяемым любыми двумя из указанных значений.

В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции, включающие антисмысловое соединение, мишенью которого является GCGR, применяют для изготовления медикамента для лечения пациента, страдающего от или подверженного метаболическому заболеванию.

В некоторых вариантах воплощения способы, описанные здесь, включают введение соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид, содержащий фрагмент из смежных нуклеиновых оснований, как описано здесь, последовательности, приведенной в SEQ ID NO:11 (ISIS 449884).

Некоторые комбинированные терапевтические средства

В некоторых вариантах воплощения одну или более из фармацевтических композиций, описанных здесь, вводят совместно с одним или более другими фармацевтическими агентами. В некоторых вариантах воплощения такие один или более других фармацевтических агентов предназначены для лечения того же заболевания, расстройства или состояния, что и одна или более фармацевтических композиций, описанных здесь. В некоторых вариантах воплощения такие один или более других фармацевтических агентов предназначены для лечения иного заболевания, расстройства или состояния по сравнению с одной или более фармацевтическими композициями, описанными здесь. В некоторых вариантах воплощения такие один или более других фармацевтических агентов предназначены для лечения нежелательного побочного эффекта одной или более фармацевтических композиций, описанных здесь. В некоторых вариантах воплощения одну или более из фармацевтических композиций вводят совместно с еще одним фармацевтическим агентом для лечения нежелательного эффекта указанного другого фармацевтического агента. В некоторых вариантах воплощения одну или более из фармацевтических композиций вводят совместно с еще одним фармацевтическим агентом для получения комбинированного эффекта. В некоторых вариантах воплощения одну или более из фармацевтических композиций вводят совместно с еще одним фармацевтическим агентом для получения синергического эффекта.

В некоторых вариантах воплощения первый агент и один или более из вторых агентов вводят одновременно. В некоторых вариантах воплощения указанный первый агент и один или более из вторых агентов вводят в разное время. В некоторых вариантах воплощения указанный первый агент и один или более из вторых агентов изготовлены вместе друг с другом в одном фармацевтическом составе. В некоторых вариантах воплощения указанный первый агент и один или более из вторых агентов изготавливают раздельно.

В некоторых вариантах воплощения указанное второе соединение вводят перед введением фармацевтической композиции, описанной здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное второе соединение вводят после введения фармацевтической композиции, описанной здесь. В некоторых вариантах воплощения указанное второе соединение вводят одновременно с введением фармацевтической композиции, описанной здесь. В некоторых вариантах воплощения доза совместно вводимого второго соединения аналогична дозе, подлежащей введению при введении второго соединения самого по себе. В некоторых вариантах воплощения доза совместно вводимого второго соединения ниже дозы, подлежащей введению при введении второго соединения самого по себе. В некоторых вариантах воплощения доза совместно вводимого второго соединения выше дозы, подлежащей введению при введении второго соединения самого по себе.

В некоторых вариантах воплощения совместное введение второго соединения усиливает эффект первого соединения, так что совместное введение указанных соединений приводит к эффекту, превышающему эффект от введения первого соединения самого по себе. В некоторых вариантах воплощения совместное введение приводит к эффектам, аддитивным по сравнению с эффектами соединений при их введении по отдельности. В некоторых вариантах воплощения совместное введение приводит к эффектам, превышающим аддитивные по сравнению с эффектами соединений при их введении по отдельности. В некоторых вариантах воплощения указанное первое соединение является антисмысловым соединением. В некоторых вариантах воплощения указанное второе соединение является антисмысловым соединением.

В некоторых вариантах воплощения вторые агенты включают агенты, снижающие уровень глюкозы, но не ограничиваются ими. Агенты, снижающие уровень глюкозы, могут включать терапевтическое изменение образа жизни, агонист PPAR, ингибитор дипептидилпептидазы (IV), аналог GLP-1, инсулин или аналог инсулина, стимулятор секреции инсулина, ингибитор SGLT2, аналог амилина человека, бигуанид, ингибитор альфа-глюкозидазы или их комбинацию, но не ограничиваются ими. Агент, снижающий уровень глюкозы, может включать метформин, сульфонилмочевину, розиглитазон, меглитинид, тиазолидиндион, ингибитор альфа-глюкозидазы или их комбинацию, но не ограничивается ими. Сульфонилмочевина может являться ацетогексамидом, хлорпропамидом, толбутамидом, толазамидом, глимепиридом, глипизидом, глибуридом или гликлазидом. Меглитинид может являться натеглинидом или репаглинидом. Тиазолидиндион может являться пиоглитазоном или розиглитазоном. Альфа-глюкозидаза может являться акарбозой или миглитолом.

В некоторых вариантах воплощения терапевтическое средство, снижающее уровень глюкозы, является аналогом GLP-1. В некоторых вариантах воплощения аналог GLP-1 является эксендином-4 или лираглутидом.

В других вариантах воплощения терапевтическое средство, снижающее уровень глюкозы, является сульфонилмочевиной. В некоторых вариантах воплощения сульфонилмочевина является ацетогексамидом, хлорпропамидом, толбутамидом, толазамидом, глимепиридом, глипизидом, глибуридом или гликлазидом.

В некоторых вариантах воплощения препарат, снижающий уровень глюкозы, является бигуанидом. В некоторых вариантах воплощения бигуанид является метформином, и в некоторых вариантах воплощения уровень глюкозы в крови снижается без усиления молочнокислого ацидоза по сравнению с молочнокислым ацидозом, наблюдаемым после лечения только метформином.

В некоторых вариантах воплощения препарат, снижающий уровень глюкозы, является меглитинидом. В некоторых вариантах воплощения меглитинид является натеглинидом или репаглинидом.

В некоторых вариантах воплощения препарат, снижающий уровень глюкозы, является тиазолидиндионом. В некоторых вариантах воплощения тиазолидиндион является пиоглитазоном, розиглитазоном или троглитазоном. В некоторых вариантах уровень глюкозы в крови снижается без большего увеличения массы тела, чем увеличение массы тела, наблюдаемое при лечении только розиглитазоном.

В некоторых вариантах воплощения препарат, снижающий уровень глюкозы, является ингибитором альфа-глюкозидазы. В некоторых вариантах воплощения ингибитор альфа-глюкозидазы является акарбозой или миглитолом.

В некоторых вариантах воплощения совместно вводимый агент, снижающий уровень глюкозы, является ISIS 113715.

В некоторых вариантах воплощения терапевтическое средство, снижающее уровень глюкозы, является терапевтическим изменением образа жизни.

В некоторых вариантах воплощения вторые агенты включают агенты, снижающие уровень липидов, но не ограничиваются ими. Агент, снижающий уровень липидов, может включать аторвастатин, симвастатин, розувастатин и эзетимиб, но не ограничивается ими. В некоторых из таких вариантов воплощения агент, снижающий уровень липидов, вводят перед введением фармацевтической композиции, описанной здесь. В некоторых из таких вариантов воплощения агент, снижающий уровень липидов, вводят после введения фармацевтической композиции, описанной здесь. В некоторых из таких вариантов воплощения агент, снижающий уровень липидов, вводят одновременно с введением фармацевтической композиции, описанной здесь. В некоторых из таких вариантов воплощения доза совместно вводимого агента, снижающего уровень липидов, аналогична дозе, подлежащей введению при введении агента, снижающего уровень липидов, самого по себе. В некоторых из таких вариантов воплощения доза совместно вводимого агента, снижающего уровень липидов, ниже дозы, подлежащей введению при введении агента, снижающего уровень липидов, самого по себе. В некоторых из таких вариантов воплощения доза совместно вводимого агента, снижающего уровень липидов, выше дозы, подлежащей введению при введении агента, снижающего уровень липидов, самого по себе.

В некоторых вариантах воплощения совместно вводимый агент, снижающий уровень липидов, является ингибитором ГМГ-КоА-редуктазы. В некоторых из таких вариантов воплощения ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы является статином. В некоторых из таких вариантов воплощения статин выбран из аторвастатина, симвастатина, правастатина, флувастатина и розувастатина.

В некоторых вариантах воплощения совместно вводимый агент, снижающий уровень липидов, является ингибитором всасывания холестерина. В некоторых из таких вариантов воплощения ингибитор всасывания холестерина является эзетимибом.

В некоторых вариантах воплощения совместно вводимый агент, снижающий уровень липидов, является совместно составленным ингибитором ГМГ-КоА-редуктазы и ингибитором всасывания холестерина. В некоторых из таких вариантов воплощения указанный совместно составленный агент, снижающий уровень липидов, является эзетимибом/симвастатином.

В некоторых вариантах воплощения совместно вводимый агент, снижающий уровень липидов, является ингибитором микросомального транспортного белка триглицеридов (ингибитором МТР).

В некоторых вариантах воплощения совместно вводимый агент, снижающий уровень липидов, является олигонуклеотидом, мишенью которого является АроВ.

В некоторых вариантах воплощения вторые агенты включают агент или препарат против ожирения, но не ограничиваются им. Такие агенты против ожирения включают орлистат, сибутрамин или римонабант, но не ограничиваются ими; их можно вводить, как описано выше, в качестве агентов, снижающих количество жировой ткани или массу тела. В некоторых вариантах воплощения указанное антисмысловое соединение можно совместно вводить с препаратом для подавления аппетита. Такие препараты для подавления аппетита включают диэтилпропиона тенуат, мазиндол, орлистат, фендиметразин, фентермин и сибутрамин, но не ограничиваются ими; их можно вводить, как описано здесь. В некоторых вариантах воплощения агенты против ожирения основаны на действии на ЦНС, например, сибутрамин, но не ограничиваются им, или основаны на GLP-1, например, лираглутид, но не ограничиваются им.

Составы

Соединения, представленные здесь, также можно смешивать, конъюгировать или иным образом связывать с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, липосомами, молекулами, мишенями которых являются рецепторы, или другими составами для содействия процессам поглощения, распределения и/или всасывания. Типичные патенты США, содержащие информацию о получении таких составов для содействия процессам поглощения, распределения и/или всасывания, включают патенты США 5108921, 5354844, 5416016, 5459127, 5521291, 5543158, 5547932, 5583020, 5591721, 4426330, 4534899, 5013556, 5108921, 5213804, 5227170, 5264221, 5356633, 5395619, 5416016, 5417978, 5462854, 5469854, 5512295, 5527528, 5534259, 5543152, 5556948, 5580575 и 5595756, каждый из которых включен сюда посредством ссылки, но не ограничиваются ими.

Антисмысловые соединения, представленные здесь, можно включать в фармацевтическую композицию или состав. Фармацевтические композиции могут включать любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких эфиров, или любое другое соединение, которое при введении в организм животного, в том числе человека, способно обеспечить (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток.

Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений, представленных здесь, т.е. солям, сохраняющим желательную биологическую активность исходного соединения и не придающим ему нежелательного токсического действия. Термин "фармацевтически приемлемая соль" включает соль, полученную из фармацевтически приемлемых нетоксичных кислот или оснований, в том числе неорганических или органических кислот и оснований. Для олигонуклеотидов предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей и их применение дополнительно описаны в патенте США 6287860, полностью включенном сюда посредством ссылки. Показано, что соли натрия являются подходящими формами олигонуклеотидных препаратов.

Термин "фармацевтически приемлемое производное" охватывает фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты, сложные эфиры, пролекарства, полиморфы, изомеры, изотопно меченые варианты соединений, описанных здесь, но не ограничивается ими.

Фармацевтические композиции, описанные здесь, можно вводить различными путями в зависимости от предпочтительности местного или системного применения и от обрабатываемой области. Введение может быть парентеральным. Парентеральное введение включает подкожную, внутривенную или внутримышечную инъекцию или вливание, но не ограничивается ими.

Парентеральное введение предпочтительно для адресного воздействия на экспрессию GCGR в печени и плазме. Считается, что олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну 2′-O-метоксиэтил-модификацию, особенно пригодны для парентерального введения.

Фармацевтические составы, описанные здесь, которые можно представить в виде дозированной лекарственной формы, можно получить в соответствии с традиционными методиками, широко известными в фармацевтической промышленности. Такие методики включают этап объединения активных ингредиентов с фармацевтическим(и) носителем(ями) или вспомогательным(и) веществом(ами). В общем случае составы получают путем равномерного и тщательного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями, или и теми и другими.

Композиции, описанные здесь, также можно составить в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Суспензии также могут содержать стабилизаторы.

Фармацевтические композиции, описанные здесь, включают растворы, эмульсии и составы, содержащие липосомы, но не ограничиваются ими. Фармацевтические композиции и составы, описанные здесь, могут включать один или более усилителей проницаемости, носителей, вспомогательных веществ или других активных или неактивных ингредиентов.

Составы включают липосомные составы. Для целей настоящего изобретения термин "липосома" означает везикулу, состоящую из амфифильных липидов, упорядоченных в виде сферического бислоя или бислоев. Липосомы являются моноламеллярными или мультиламеллярными везикулами, обладающими мембраной, сформированной из липофильного материала, и водным содержимьм, содержащим доставляемую композицию. Катионные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые, как считается, взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК, образуя стабильный комплекс. Считается, что липосомы, являющиеся рН-чувствительными или отрицательно заряженными, захватывают ДНК, а не образуют с ней комплекс. Как катионные, так и некатионные липосомы используют для доставки ДНК в клетки.

Липосомы также включают "стерически стабилизированные" липосомы; этот термин в настоящем описании относится к липосомам, включающим один или более специализированных липидов, которые при внедрении в липосомы приводят к улучшению времени жизни в крови по сравнению с липосомами, в которых такие специализированные липиды отсутствуют. Липосомы и их применение дополнительно описаны в патенте США 6287860, полностью включенном сюда посредством ссылки.

В еще одном варианте воплощения составы включают составы на основе физиологического раствора. В некоторых вариантах воплощения состав состоит из соединений, описанных здесь, и физиологического раствора. В некоторых вариантах воплощения состав главным образом состоит из соединений, описанных здесь, и физиологического раствора. В некоторых вариантах воплощения физиологический раствор является фармацевтически приемлемым физиологическим раствором. В некоторых вариантах воплощения физиологический раствор является забуференным физиологическим раствором. В некоторых вариантах воплощения физиологический раствор является фосфатно-солевым буфером (PBS).

В некоторых вариантах воплощения состав не содержит липосом. В некоторых вариантах воплощения состав не содержит стерически стабилизированных липосом. В некоторых вариантах воплощения состав не содержит фосфолипидов. В некоторых вариантах воплощения состав главным образом состоит из соединений, описанных здесь, и физиологического раствора и не содержит липосом.

Фармацевтические составы и композиции также могут включать поверхностно активные вещества. Поверхностно активные вещества и их применение дополнительно описаны в патенте США 6287860, полностью включенном сюда посредством ссылки.

В одном варианте воплощения настоящее изобретение использует различные усилители проницаемости для эффективной доставки нуклеиновых кислот, в частности, олигонуклеотидов. Усилители проницаемости и их применение дополнительно описаны в патенте США 6287860, полностью включенном сюда посредством ссылки.

Специалист в данной области техники должен осознавать, что составы изготавливают с применением стандартных методик в соответствии с их предполагаемым применением, т.е. путем введения.

Композиции и составы для парентерального введения, в том числе подкожной, внутривенной и внутримышечной инъекции или вливания, могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, например, усилители проницаемости, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества, не ограничиваясь ими.

В другом родственном варианте воплощения композиции, представленные здесь, могут содержать одно или более антисмысловых соединений, в частности, олигонуклеотидов, мишенью которых является первая нуклеиновая кислота, и одно или более дополнительных антисмысловых соединений, мишенью которых является вторая нуклеиновая кислота-мишень. В качестве альтернативы композиции, представленные здесь, могут содержать два или более антисмысловых соединений, мишенями которых являются разные области одной и той же нуклеиновой кислоты-мишени. В данной области техники известно большое количество примеров антисмысловых соединений. Два или более объединенных соединений можно применять совместно или последовательно.

Прием доз

Прием доз зависит от тяжести и реакции заболевания, подлежащего лечению, причем курс лечения продолжается от нескольких дней до нескольких месяцев или пока лечение не подействует, или до ослабления болезненного состояния. Оптимальную схему введения можно рассчитать на основании измерений накопления лекарственного средства в организме пациента. Оптимальные дозировки могут варьировать в зависимости от относительной эффективности отдельных олигонуклеотидов; в общем случае их можно оценить на основании значений ЕС₅₀, эффективных in vitro и в животных моделях in vivo. В общем случае дозировка составляет от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела и может вводиться один или несколько раз в сутки, в неделю, в месяц или в год, или с желательным интервалом. После успешного лечения для пациента может быть желательна поддерживающая терапия для предотвращения рецидива болезненного состояния, в ходе которой олигонуклеотид вводят в поддерживающих дозах, в диапазоне от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела один или несколько раз в день.

Хотя настоящее изобретение специфически описано по отношению к некоторым из его предпочтительных вариантов воплощения, следующие примеры служат только для иллюстрирования изобретения и не должны ограничивать его. Каждая из библиографических ссылок, учетных номеров GenBank и т.п., упоминающихся в настоящей заявке, полностью включена сюда посредством ссылки.

Некоторые соединения

Протестировано влияние приблизительно семисот семидесяти семи вновь сконструированных и ранее описанных антисмысловых соединений различной длины, содержащих различные мотивы и каркасные структуры, на мРНК GCGR человека in vitro в нескольких типах клеток (Пример 1). Новые соединения сравнивали с ранее сконструированными соединениями, в том числе ISIS 310457, ISIS 315163 и ISIS 325568, которые, как определили ранее, являются одними из самых мощных антисмысловых соединений in vitro (см., например, патентную публикацию США №патент США №7399853 и опубликованную патентную заявку США №US2007-0087987). Из указанных приблизительно семисот семидесяти семи вновь сконструированных и ранее описанных антисмысловых соединений представлены только соединения, выбранные для дальнейшего исследования на основании их эффективности in vitro. Дозозависимое ингибирование с помощью выбранных соединений протестировали в первичных гепатоцитах яванского макака и клетках HepG2 (Примеры 5-13). Из 120 соединений, протестированных в анализах зависимости доза-ответ, выбрали 33 антисмысловых олигонуклеотида для анализов переносимости in vivo.

Выбранные в конечном счете 33 олигонуклеотида, ISIS 304538 (SEQ ID NO:112), ISIS 304539 (SEQ ID NO:113), ISIS 325568 (SEQ ID NO:4), ISIS 398457 (SEQ ID NO:9), ISIS 398471 (SEQ ID NO:17), ISIS 398486 (SEQ ID NO:24), ISIS 398491 (SEQ ID NO:105), ISIS 398506 (SEQ ID NO:108), ISIS 398507 (SEQ ID NO:109), ISIS 398508 (SEQ ID NO:110), ISIS 436034 (SEQ ID NO:35), ISIS 436140 (SEQ ID NO:102), ISIS 436141 (SEQ ID NO:114), ISIS 448718 (SEQ ID NO:99), ISSI 448730 (SEQ ID NO:100), ISIS 448754 (SEQ ID NO:98), ISIS 448766 (SEQ ID NO:31), ISIS 448817 (SEQ ID NO:52), ISIS 448818 (SEQ ID NO:56), ISIS 448819 (SEQ ID NO:58), ISIS 448848 (SEQ ID NO:62), ISIS 448860 (SEQ ID NO:65), ISIS 448890 (SEQ ID NO:68), ISIS 449884 (SEQ ID NO:11), ISIS 449954 (SEQ ID NO:51), ISIS 449956 (SEQ ID NO:54), ISIS 459014 (SEQ ID NO:80), ISIS 459024 (SEQ ID NO:89), ISIS 459032 (SEQ ID NO:81), ISIS 459040 (SEQ ID NO:82), ISIS 459046 (SEQ ID NO:83), ISIS 459076 (SEQ ID NO:84) и ISIS 459157 (SEQ ID NO:85), протестировали на переносимость в модели мыши CD1, а также в модели крысы Sprague-Dawley.

Указанные соединения комплементарны областям 548-567, 2016-2035 и 2018-2037 SEQ ID NO:1, и 6682-6698, 7267-7283, 7270-7286, 7292-7308, 7295-7311, 7316-7332, 7317-7333, 7319-7335, 7341-7357, 7344-7360, 7365-7381, 7368-7384, 7389-7405, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7453, 7440-7456, 7783-7799, 803O-8049, 8133-8152, 8141-8160, 8144-8160, 9002-9021, 9008-9027, 9245-9264, 9246-9262, 9804-9823, 10676-10695, 10718-10734, 12030-12049, 12031-12050, 12031-12047, 12032-12051, 12033-12052, 12033-12049, 12036-12055, 12175-12194, 12178-12194, 13490-13509, 14138-14157, 15075-15094, 15743-15762, 15744-15763, 15745-15764 и 15746-15765 SEQ ID NO:2.

В моделях in vivo измеряли массу тела и массу органов, маркеры функции печени (например, аланинтрансаминазу, аспартаттрансаминазу и билирубин) и маркеры функции почек (например, АМК и креатинин). В модели мыши ISIS 304538, ISIS 325568, ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398491, ISIS 436140, ISIS 448754, ISIS 448766, ISIS 448818, ISIS 449884, ISIS 449956, ISIS 459014, ISIS 459024, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS 459046, ISIS 459076 и ISIS 459157 хорошо переносились, согласно уровням трансаминаз (Пример 11). В модели крысы Sprague-Dawley ISIS 325568, ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398491, ISIS 436140, ISIS 448730, ISIS 448754, ISIS 448817, ISSI 448818, ISIS 448848, ISIS 449884, ISIS 449956, ISIS 459014, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS 459046, ISIS 459076 и ISIS 459157 считались хорошо переносимыми, согласно уровням маркеров функции как печени, так и почек (Пример 12).

Девять соединений, ISIS 325568 (SEQ ID NO:4), ISIS 398471 (SEQ ID NO:17), ISIS 436140 (SEQ ID NO:102), ISIS 448766 (SEQ ID NO:31), ISIS 449884 (SEQ ID NO:11), ISIS 459014 (SEQ ID NO:80), ISIS 459032 (SEQ ID NO:81), ISIS 459040 (SEQ ID NO:82) и ISIS 459157 (SEQ ID NO:85), выбрали на основании моделей переносимости и проанализировали на долгосрочные эффекты переносимости в модели крысы CD/1GS в течение 13 недель (Пример 13). Измеряли массу органов, маркеры функции печени (например, аланинтрансаминазу, аспартаттрансаминазу и билирубин) и маркеры функции почек (например, АМК и креатинин). Кроме того, протестировали вязкость указанных девяти соединений; установлено, что вязкость была оптимальна для всех олигонуклеотидов (Пример 14).

Период полувыведения ISIS 449884, продемонстрировавшего очень хорошую переносимость во всех трех моделях in vivo, протестировали в печени мыши CD1 (Пример 15). Рассчитанный период полувыведения ISIS 449884 составил 15 дней.

Окончательная оценка указанных исследований (Примеры 11-15) привела к выбору восьми олигонуклеотидов, обладающих последовательностью нуклеиновых оснований SEQ ID NO:17 (ISIS 398471), 102 (ISIS 436140), 31 (ISIS 448766), 11 (ISIS 449884), 80 (ISIS 459014), 81 (ISIS 459032), 82 (ISIS 459040) или 85 (ISIS 459157). Указанные соединения комплементарны областям 7267-7283, 727O-7286, 7292-7308, 7295-7311, 7316-7332, 7319-7335, 7341-7357, 7344-7360, 7437-7453, 7365-7381, 7368-7384, 7389-7405, 7392-7408, 7416-7432, 744O-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734, 15743-15762 SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах воплощения соединения, мишенями которых являются перечисленные области, как дополнительно описано здесь, включают модифицированный олигонуклеотид, содержащий определенный нуклеотидный фрагмент последовательности, упомянутой в SEQ ID NOs, как дополнительно описано здесь. В некоторых вариантах воплощения соединения, мишенями которых являются перечисленные области или содержащие нуклеотидный фрагмент последовательности, упомянутой в перечисленных в SEQ ID NOs, могут быть различной длины, как дополнительно описано здесь, и могут содержать один из различных мотивов, как дополнительно описано здесь. В некоторых вариантах воплощения соединение, мишенью которого является область, или содержащее нуклеотидный фрагмент последовательности, упомянутой в перечисленных SEQ ID NOs, обладает определенной длиной и мотивом, как указано в ISIS NOs:398471, 436140, 448766, 449884, 459014, 459032, 459040 и 459157.

Активность, фармакокинетический профиль и переносимость указанных восьми соединений протестировали на яванских макаках (Пример 16). Лечение с помощью некоторых из указанных соединений вызывало снижение экспрессии мРНК GCGR в ткани печени. Конкретно, лечение с помощью ISIS 449884, ISIS 459157 и ISIS 325568 вызывало значительное снижение экспрессии мРНК GCGR в ткани печени по сравнению с PBS-контролем. Отмечено, что ISIS 449884 вызывало наибольшее снижение экспрессии мРНК GCGR по сравнению с PBS-контролем. Повышенный уровень глюкагона является последствием ингибирования уровней мРНК GCGR. Лечение с помощью ISIS 325568, ISIS 448766, ISIS 459157 и ISIS 449884 вызывало значительное повышение уровней глюкагона в плазме, причем ISIS 449884 вызывало наибольшее повышение. Таким образом, с точки зрения активности, ISIS 449884 являлось наиболее эффективным в исследовании на обезьянах. Лечение указанными соединениями, в частности, лечение ISIS 449884, хорошо переносилось обезьянами.

Соответственно, здесь представлены антисмысловые соединения с улучшенными одной или более характеристиками. В некоторых вариантах воплощения соединения, описанные здесь, являются эффективными в силу того, что они обладают по меньшей мере одним из значений IC₅₀ m vitro менее 0,1 мкМ, менее 0,2 мкМ, менее 0,4 мкМ, менее 0,35 мкМ, менее 0,3 мкМ, менее 2,5 мкм, менее 2,0 мкМ, менее 1,5 мкМ, менее 1,0 мкМ, при доставке в клетки линии HepG2 с использованием электропорации, как описано в Примерах 8-11. В некоторых из таких вариантов воплощения указанные соединения комплементарны одной или более из областей 548-567, 2016-2035 и 2018-2037 SEQ ID NO:1, и 6682-6698, 7267-7283, 7270-7286, 7292-7308, 7295-7311, 7316-7332, 7317-7333, 7319-7335, 7341-7357, 7344-7360, 7365-7381, 7368-7384, 7389-7405, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7453, 7440-7456, 7783-7799, 8030-8049, 8133-8152, 8141-8160, 8144-8160, 9002-9021, 9008-9027, 9245-9264, 9246-9262, 9804-9823, 10676-10695, 10718-10734, 12030-12049, 12031-12050, 12031-12047, 12032-12051, 12033-12052, 12033-12049, 12036-12055, 12175-12194, 12178-12194, 13490-13509, 14138-14157, 15075-15094, 15743-15762, 15744-15763, 15745-15764 и 15746-15765 SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах воплощения соединения, описанные здесь, хорошо переносятся, на что указывает по меньшей мере одно из повышения значения АЛТ или ACT не более чем приблизительно в 100 раз, приблизительно в 60 раз, приблизительно в 50 раз, приблизительно в 40 раз, приблизительно в 30 раз, приблизительно в 25 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 5 раз, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 3 раза или приблизительно в 2 раза по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор; или увеличение массы печени, селезенки или почки не более чем приблизительно на 30%, приблизительно на 20%, приблизительно на 15%, приблизительно на 12%, приблизительно на 10%, приблизительно на 5% или приблизительно на 2%, как описано в Примерах. В некоторых из таких вариантов воплощения указанные соединения комплементарны одной или более из областей 7267-7283, 7270-7286, 7292-7308, 7295-7311, 7316-7332, 7319-7335, 7341-7357, 7344-7360, 7437-7453, 7365-7381, 7368-7384, 7389-7405, 7392-7408, 7416-7432, 7440-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734, 15743-15762 SEQ ID NO:2.

ПРИМЕРЫ

Неограничивающее описание и включение посредством ссылок Хотя определенные соединения, композиции и способы, описываемые в настоящей заявке, были специфически описаны в рамках определенных вариантов воплощения, следующие примеры служат лишь для иллюстрирования соединений, описанных здесь, и не должны ограничиваться только такими же соединениями. Каждая из библиографических ссылок, упоминающихся в настоящей заявке, полностью включена сюда посредством ссылки.

Пример 1: Антисмысловое ингибирование рецептора глюкагона человека (GCGR) в клетках HepG2

Сконструировали антисмысловые олигонуклеотиды, мишенью которых являлась нуклеиновая кислота GCGR, и протестировали их воздействие на мРНК GCGR in vitro. Кроме того, протестировали ISIS 310457, описанное в более ранней публикации (WO 2007/035771). Культивируемые клетки HepG2 при плотности 40000 клеток на лунку трансфицировали 4000 нМ антисмыслового олигонуклеотида с помощью электропорации. После периода обработки продолжительностью приблизительно 24 часа из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов человека RTS1508 (прямая последовательность GACACCCCCGCCAATACC, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:116; обратная последовательность CCGCATCTCTTGAACACGAA, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:117; последовательность зонда TTGGCACCACAAAGT, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:118). Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками. Всего протестировали 309 олигонуклеотидов. В Таблице 1 показаны только олигонуклеотиды, выбранные для анализов зависимости доза-ответ.

Вновь сконструированные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблице 1 были сконструированы в виде 3-10-4 МОЕ-гэпмеров или 5-10-5 МОЕ-гэпмеров. 3-10-4 МОЕ-гэпмеры обладали длиной 17 нуклеозидов, причем центральный сегмент разрыва включал десять 2′-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментом крыла с 5′-направления, включавшим три нуклеозида, и сегментом крыла с 3′-направления, включавшим четыре нуклеозида. 5-10-5 МОЕ-гэпмеры обладали длиной 20 нуклеозидов, причем центральный сегмент разрыва включал десять 2′-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами крыльев с 5′-направления и 3′-направления, включавшими по пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид в сегменте 5′-крыла и каждый нуклеозид в сегменте 3′-крыла содержал модификацию 2′-МОЕ. Межнуклеозидные связи на всем протяжении каждого гэпмера являлись фосфоротиоатными (P=S) связями. Все остатки цитозина на всем протяжении каждого гэпмера являлись остатками 5-метилцитозина. "Сайт инициации" означал последний 5′-нуклеозид, являвшийся мишенью гэпмера в последовательности гена человека. "Стоп-сайт" означал последний 3′-нуклеозид, являвшийся мишенью гэпмера в последовательности гена человека. Мишенью каждого гэпмера из перечисленных в Таблице 1 являлась либо мРНК GCGR человека, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:1 (учетный номер GENBANK NM_000160.3), либо геномная последовательность GCGR человека, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:2 (учетный номер GENBANK NW_926918.1, укороченная с нуклеотида 16865000 до 16885000). "н/д" указывает, что указанная конкретная последовательность гена не являлась мишенью указанного антисмыслового олигонуклеотида.

Таблица 1
Ингибирование уровней мРНК GCGR человека химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, мишенями которых являлись SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2
ISIS NO	SEQ ID NO:1 сайт инициации	SEQ ID NO:1 стоп-сайт	Последовательность	% ингибирования	Мотив	SEQ ID NO:2 сайт инициации	SEQ ID NO:2 стоп-сайт	SEQ ID NO
310457	548	564	GCACTTTGTGGTGCCAAGGC	88	5-10-5	н/д	н/д	4
449823	1098	1114	GCACCCCAGCCGATGCC	91	3-10-4	н/д	н/д	5
450035	н/д	н/д	AGCCCTGGCCGGTCCTT	82	3-10-4	6691	6707	6
449881	н/д	н/д	TCCCGAGGTGCCCAATG	89	3-10-4	7267	7283	7
						7292	7308
						7316	7332
						7341	7357
						7365	7381
						7389	7405
7437	7453
449882	н/д	н/д	TTCCCGAGGTGCCCAAT	87	3-10-4	7268	7284	8
						7293	7309
						7317	7333
						7342	7358
						7366	7382
						7390	7406
						7414	7430
7438	7454
398457	н/д	н/д	GGGTTCCCGAGGTGCCCAAT	95	3-10-4	7268	7287	9
						7293	7312
						7317	7336
						7342	7361
						7366	7385
7390	7409

						7414	7433
7438	7457
449883	н/д	н/д	GTTCCCGAGGTGCCCAA	98	3-10-4	7269	7285	10
						7294	7310
						7318	7334
						7343	7359
						7367	7383
						7391	7407
						7415	7431
7439	7455
449884	н/д	н/д	GGTTCCCGAGGTGCCCA	94	3-10-4	7270	7286	11
						7295	7311
						7319	7335
						7344	7360
						7368	7384
						7392	7408
						7416	7432
7440	7456
449885	н/д	н/д	GGGTTCCCGAGGTGCCC	93	3-10-4	7271	7287	12
						7296	7312
						7320	7336
						7345	7361
						7369	7385
						7393	7409
						7417	7433
7441	7457
450039	н/д	н/д	TGATCTCACCCAGCCCT	88	3-10-4	7740	7756	13
449894	н/д	н/д	AAGGTGACACCAGCCTG	92	3-10-4	7782	7798	14
449895	н/д	н/д	CTGAAGGTGACACCAGC	90	3-10-4	7785	7801	15
450040	н/д	н/д	TTCCAGCTGAGCACCCA	84	3-10-4	7897	7913	16
398471	н/д	н/д	TCCACAGGCCACAGGTGGGC	80	5-10-5	8133	8152	17
449905	н/д	н/д	GCATCCACAGGCCACAG	85	3-10-4	8139	8155	18
449906	н/д	н/д	AGCATCCACAGGCCACA	90	3-10-4	8140	8156	19
449907	н/д	н/д	CAGCATCCACAGGCCAC	85	3-10-4	8141	8157	20
449908	н/д	н/д	CTCAGCATCCACAGGCC	84	3-10-4	8143	8159	21
449910	н/д	н/д	AGCCACTGGGAGCACCC	85	3-10-4	8386	8402	22
449912	н/д	н/д	GGCTCTGCCCCAACTCT	82	3-10-4	8448	8464	23
398486	н/д	н/д	GTGAGCAGCCATGCAGGCTT	95	5-10-5	9002	9021	24
449916	н/д	н/д	GAGCAGCCATGCAGGCT	86	3-10-4	9003	9019	25
449917	н/д	н/д	TGAGCAGCCATGCAGGC	90	3-10-4	9004	9020	26
449922	н/д	н/д	GCCAGGTGAGCAGCCAT	86	3-10-4	9010	9026	27
450049	н/д	н/д	AGGGACAGGCACCTGCG	87	3-10-4	9130	9146	28

450050	н/д	н/д	GCCTGGATTTTAGCCTC	84	3-10-4	9249	9265	29
448762	н/д	н/д	CGGGGTGGCAACAGCTACAC	80	5-10-5	9592	9611	30
448766	н/д	н/д	GCAAGGCTCGGTTGGGCTTC	86	5-10-5	9804	9823	31
450054	н/д	н/д	TGCAAGGCTCGGTTGGG	82	3-10-4	9808	9824	32
449759	176	192	GCAGAGCAGCAGAGCCT	80	3-10-4	10667	10683	33
449760	177	193	GGCAGAGCAGCAGAGCC	88	3-10-4	10668	10684	34
436034	185	204	GGCAGCTGAGTGGCAGAGCA	72	5-10-5	10676	10695	35
450059	281	297	GCATGCCTCTGGGCAGC	88	3-10-4	10772	10788	36
448799	н/д	н/д	AGGCACAGGCTGAAAGGCTC	80	5-10-5	11667	11686	37
449938	н/д	н/д	AGGCCAGGCACAGGCTG	92	3-10-4	11675	11691	38
448802	н/д	н/д	GCTGAGGCCAGGCACAGGCT	87	5-10-5	11676	11695	39
398585	н/д	н/д	GGCTGCATAAGCACCCAGGA	87	5-10-5	11724	11743	40
449944	н/д	н/д	CTGCATAAGCACCCAGG	84	3-10-4	11725	11741	41
449945	н/д	н/д	CCCAGCTCTGTGGCTCA	90	3-10-4	11819	11835	42
448806	н/д	н/д	GTCCCCAGCTCTGTGGCTCA	96	5-10-5	11819	11838	43
450061	н/д	н/д	GCAAGTCCCCAGCTCTG	91	3-10-4	11826	11842	44
449948	н/д	н/д	CGCCCTGGCACTGTCTG	88	3-10-4	11962	11978	45
449949	н/д	н/д	GTGTCCAGGCCATGATA	88	3-10-4	12026	12042	46
449951	н/д	н/д	AAGTGTCCAGGCCATGA	93	3-10-4	12028	12044	47
398504	н/д	н/д	CCCAAGTGTCCAGGCCATGA	91	5-10-5	12028	12047	48
449952	н/д	н/д	CAAGTGTCCAGGCCATG	90	3-10-4	12029	12045	49
449953	н/д	н/д	CCAAGTGTCCAGGCCAT	91	3-10-4	12030	12046	50
449954	н/д	н/д	CCCAAGTGTCCAGGCCA	92	3-10-4	12031	12047	51
448817	н/д	н/д	CACCCCAAGTGTCCAGGCCA	98	5-10-5	12031	12050	52
449955	н/д	н/д	CCCCAAGTGTCCAGGCC	94	3-10-4	12032	12048	53
449956	н/д	н/д	ACCCCAAGTGTCCAGGC	89	3-10-4	12033	12049	54
449958	н/д	н/д	GCACCCCAAGTGTCCAG	93	3-10-4	12035	12051	55
448818	н/д	н/д	CCCTGCACCCCAAGTGTCCA	83	5-10-5	12036	12055	56
449960	н/д	н/д	AAACCTGTGGCTGCCAC	93	3-10-4	12175	12191	57
448819	н/д	н/д	GCCAAACCTGTGGCTGCCAC	95	5-10-5	12175	12194	58
449797	733	749	GGACAGGCTGTAGCCCA	83	3-10-4	13034	13050	59
448840	н/д	н/д	GGCTCACTCCATCACTGAGC	82	5-10-5	13314	13333	60
449967	н/д	н/д	CCACCTGCCTGGCTGCC	89	3-10-4	13366	13382	61
448848	1024	1043	GTGCAGGTACAGGCCCTCCA	92	5-10-5	13490	13509	62
448850	1049	1068	GGAGGGTGGCCAGGCCCAGC	80	5-10-5	13515	13534	63
449819	1093	1109	CCAGCCGATGCCCAGGT	82	3-10-4	13559	13575	64
448860	н/д	н/д	GGCCAGTGTCCTGGTGTCCT	79	5-10-5	14138	14157	65
449836	1467	1483	GCCACCAGCAGGCCCTG	87	3-10-4	14779	14795	66

450074	н/д	н/д	GGGCTGAGGCCAACCTG	91	3-10-4	15007	15023	67
448890	н/д	н/д	GCCACCCAGCATCGCCACGG	86	5-10-5	15075	15094	68
448897	н/д	н/д	CCCTGCTGGGCACAGCTATG	83	5-10-5	15094	15113	69
448901	н/д	н/д	CACAAGCTCCCTGCTGGGCA	82	5-10-5	15102	15121	70
448903	н/д	н/д	GAGCGACACAAGCTCCCTGC	86	5-10-5	15108	15127	71
448905	н/д	н/д	GGTGCAGAGCGACACAAGCT	81	5-10-5	15114	15133	72
449851	1646	1662	GGCTGCCACCACCCCTC	88	3-10-4	15374	15390	73
449856	2016	2032	CTTTATTGTTGGAGGAC	85	3-10-4	15744	15760	74
449858	2018	2034	CTCTTTATTGTTGGAGG	85	3-10-4	15746	15762	75
449859	2019	2035	GCTCTTTATTGTTGGAG	91	3-10-4	15747	15763	76
449860	2020	2036	AGCTCTTTATTGTTGGA	88	3-10-4	15748	15764	77
449861	2021	2037	GAGCTCTTTATTGTTGG	81	3-10-4	15749	15765	78

Пример 2: Антисмысловое ингибирование рецептора глюкагона человека (GCGR) в клетках HepG2

Сконструировали дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды, мишенью которых являлась нуклеиновая кислота GCGR, и протестировали их воздействие на мРНК GCGR in vitro. Кроме того, протестировали ISIS 315163 (ACCTGGAAGCTGCTGTACAT (SEQ ID NO 79); сайт инициации в SEQ ID NO:1 является 702; сайт инициации в SEQ ID NO:2 является 13003), описанное в более ранней публикации (WO 2004/096016). Культивируемые клетки HepG2 при плотности 40000 клеток на лунку трансфицировали 1000 нМ антисмыслового олигонуклеотида с помощью электропорации. После периода обработки продолжительностью приблизительно 24 часа из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени и набора праймеров и зондов человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками. Всего протестировали 156 антисмысловых олигонуклеотидов. В Таблице 2 показаны только олигонуклеотиды, выбранные для анализов зависимости доза-ответ.

Вновь сконструированные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблице 2 были сконструированы в виде 3-10-3 МОЕ, 3-10-4 МОЕ 4-10-4 МОЕ, 4-10-5 МОЕ или 5-10-6 МОЕ-гэпмеров. 3-10-3 МОЕ-гэпмеры обладали длиной 16 нуклеозидов, причем центральный сегмент разрыва включал десять 2′-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами крыльев с 5′-направления и 3′-направления, включавшими по три нуклеозида. 3-10-4 МОЕ-гэпмеры обладали длиной 17 нуклеозидов, причем центральный сегмент разрыва включал десять 2′-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментом крыла с 5′-направления, включавшим три нуклеозида, и сегментом крыла с 3′-направления, включавшим четыре нуклеозида. 4-10-4 МОЕ-гэпмеры обладали длиной 18 нуклеозидов, причем центральный сегмент разрыва включал десять 2′-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами крыльев с 5′-направления и 3′-направления, включавшими по четыре нуклеозида. 4-10-5 МОЕ-гэпмеры обладали длиной 19 нуклеозидов, причем центральный сегмент разрыва включал десять 2′-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментом крыла с 5′-направления, включавшим четыре нуклеозида, и сегментом крыла с 3′-направления, включавшим пять нуклеозидов. 5-10-6 МОЕ-гэпмеры обладали длиной 21 нуклеозидов, причем центральный сегмент разрыва включал десять 2′-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментом крыла с 5′-направления, включавшим пять нуклеозидов, и сегментом крыла с 3′-направления, включавшим шесть нуклеозидов. Каждый нуклеозид в сегменте 5′-крыла и каждый нуклеозид в сегменте 3′-крыла содержал модификацию 2′-МОЕ. Межнуклеозидные связи на всем протяжении каждого гэпмера являлись фосфоротиоатными (P=S) связями. Все остатки цитозина на всем протяжении каждого гэпмера являлись остатками 5-метилцитозина. "Сайт инициации" означал последний 5′-нуклеозид, являвшийся мишенью гэпмера в последовательности гена человека. "Стоп-сайт" означал последний З′-нуклеозид, являвшийся мишенью гэпмера в последовательности гена человека. Мишенью каждого гэпмера из перечисленных в Таблице 2 являлась либо мРНК GCGR человека, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:1 (учетный номер GENBANK NM_000160.3), либо геномная последовательность GCGR человека, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:2 (учетный номер GENBANK NW_926918.1, укороченная с нуклеотида 16865000 до 16885000). "н/д" указывает, что указанная конкретная последовательность гена не являлась мишенью указанного антисмыслового олигонуклеотида.

Таблица 2
Ингибирование уровней мРНК GCGR человека химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, мишенями которых являлись SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2
ISIS NO	SEQ ID NO:1 сайт инициации	SEQ ID NO:1 стоп сайт	Последовательность	% ингибирования	Мотив	SEQ ID NO:2 сайт инициации	SEQ ID N0:2 стоп-сайт	SEQ ID N0
315163	702	721	ACCTGGAAGCTGCTGTACAT	38	5-10-5	13003	13022	79
459014	227	243	GGGCAATGCAGTCCTGG	62	3-10-4	10718	10734	80
459032	н/д	н/д	GAAGGTGACACCAGCCT	83	3-10-4	7783	7799	81
459040	н/д	н/д	GCTCAGCATCCACAGGC	63	3-10-4	8144	8160	82
459046	н/д	н/д	TGGATTTTAGCCTCCTC	73	3-10-4	9246	9262	83
459076	н/д	н/д	GCCAAACCTGTGGCTGC	84	3-10-4	12178	12194	84
459157	н/д	н/д	GGGTTCCCGAGGTGCCCAATG	92	5-10-6	7267	7287	85
						7292	7312
						7316	7336
						7341	7361
						7365	7385
						7389	7409
7437	7457
459010	н/д	н/д	GGTTCCCGAGGTGCCC	100	3-10-3	7271	7286	86
						7296	7311
						7320	7335
						7345	7360
						7369	7384
						7393	7408
						7417	7432
7441	7456
459011	н/д	н/д	GGGTTCCCGAGGTGCC	89	3-10-3	7272	7287	87
						7297	7312
						7321	7336
						7346	7361
						7370	7385
						7394	7409
						7418	7433
7442	7457
459058	н/д	н/д	GAGGCCAGGCACAGGCT	75	3-10-4	11676	11692	88
459024	н/д	н/д	CGGTCCTTGGAGGATGC	63	3-10-4	6682	6698	89
459088	н/д	н/д	GTTCCCGAGGTGCCCAATG	89	4-10-5	7267	7285	90
						7292	7310
						7316	7334
						7341	7359
						7365	7383
						7389	7407
7437	7455
459087	н/д	н/д	GGTTCCCGAGGTGCCCAAT	95	4-10-5	7268	7286	91
						7293	7311
						7317	7335
						7342	7360
						7366	7384
						7390	7408
						7414	7432
7438	7456
459086	н/д	н/д	GGGTTCCCGAGGTGCCCAA	96	4-10-5	7269	7287	92
						7294	7312
						7318	7336
						7343	7361
						7367	7385
						7391	7409
						7415	7433
7439	7457
459083	н/д	н/д	GGTTCCCGAGGTGCCCAA	91	4-10-4	7269	7286	93
						7294	7311
						7318	7335
						7343	7360
						7367	7384
						7391	7408
						7415	7432
7439	7456
459009	н/д	н/д	GTTCCCGAGGTGCCCA	61	3-10-3	7270	7285	94
						7295	7310
						7319	7334
						7344	7359
						7368	7383
						7392	7407
						7416	7431
7440	7455
459082	н/д	н/д	GGGTTCCCGAGGTGCCCA	91	4-10-4	7270	7287	95
						7295	7312
						7319	7336
						7344	7361
						7368	7385
						7392	7409
						7416	7433
7440	7457
459158	н/д	н/д	GGGTTCCCGAGGTGCCCAATA	94	5-10-6	7413	7433	96
459063	н/д	н/д	CCAGCTCTGTGGCTCAG	62	3-10-4	11818	11834	97

Пример 3: Антисмысловое ингибирование рецептора глюкагона человека (GCGR) в клетках HepG2

Сконструировали дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды, мишенью которых являлась нуклеиновая кислота GCGR, и протестировали их воздействие на мРНК GCGR in vitro. Кроме того, протестировали ISIS 315163. Кроме того, протестировали ISIS 325568, описанное в более ранней публикации (WO 2007/035771). Культивируемые клетки HepG2 при плотности 40000 клеток на лунку трансфицировали 2000 нМ антисмыслового олигонуклеотида с помощью электропорации. После периода обработки продолжительностью приблизительно 24 часа из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени и набора праймеров и зондов человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками. Всего протестировали 78 антисмысловых олигонуклеотидов. В Таблице 3 показаны только олигонуклеотиды, выбранные для анализов зависимости доза-ответ.

Вновь сконструированные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблице 3 были сконструированы в виде 5-10-5 МОЕ-гэпмеров. Гэпмеры обладали длиной 20 нуклеозидов, причем центральный сегмент разрыва включал десять 2′-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами крыльев с 5′-направления и 3′-направления, включавшими по пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид в сегменте 5′-крыла и каждый нуклеозид в сегменте 3′-крыла содержал модификацию 2′-МОЕ. Межнуклеозидные связи на всем протяжении каждого гэпмера являлись фосфоротиоатными (P=S) связями. Все остатки цитозина на всем протяжении каждого гэпмера являлись остатками 5-метилцитозина. "Сайт инициации" означал последний 5′-нуклеозид, являвшийся мишенью гэпмера в последовательности гена человека. "Стоп-сайт" означал последний 3′-нуклеозид, являвшийся мишенью гэпмера в последовательности гена человека. Мишенью каждого гэпмера из перечисленных в Таблице 3 являлась либо мРНК GCGR человека, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:1 (учетный номер GENBANK NM_000160.3), либо геномная последовательность GCGR человека, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:2 (учетный номер GENBANK NW_926918.1, укороченная с нуклеотида 16865000 до 16885000). "н/д" указывает, что указанная конкретная последовательность гена не являлась мишенью указанного антисмыслового олигонуклеотида.

Таблица 3
Ингибирование уровней мРНК GCGR человека химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, мишенями которых являлись SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2
ISIS NO	SEQ ID NO:1 сайт инициации	SEQ ID NO:1 стоп-сайт	Последовательность	% ингибирования	Мотив	SEQ ID NO:2 сайт инициации	SEQ ID NO:2 стоп-сайт	SEQ ID N0
315163	702	721	ACCTGGAAGCTGCTGTACAT	42	5-10-5	13003	13022	79
325568	548	567	GCACTTTGTGGTGCCAAGGC	58	2-16-2	н/д	н/д	4
448754	н/д	н/д	CCTGGATTTTAGCCTCCTCC	79	5-10-5	9245	9264	98
448718	н/д	н/д	TGGGTCTCTGATAGTGAGGC	81	5-10-5	8030	8049	99
448730	н/д	н/д	GCTCAGCATCCACAGGCCAC	74	5-10-5	8141	8160	100

448738

н/д

GCCAAGCCTGGCTCTGCCCC

5-10-5

8454

8473

101

Пример 4: Антисмысловое ингибирование рецептора глюкагона человека (GCGR) в клетках HepG2

Сконструировали дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды, мишенью которых являлась нуклеиновая кислота GCGR, и протестировали их воздействие на мРНК GCGR in vitro. Кроме того, протестировали ISIS 315163 и ISIS 325568. Культивируемые клетки HepG2 при плотности 40000 клеток на лунку трансфицировали 5000 нМ антисмыслового олигонуклеотида с помощью электропорации. После периода обработки продолжительностью приблизительно 24 часа из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени и набора праймеров и зондов человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками. Всего протестировали 234 антисмысловых олигонуклеотида. В Таблице 4 показаны только олигонуклеотиды, выбранные для анализов зависимости доза-ответ.

Вновь сконструированные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблице 4 были сконструированы в виде 5-10-5 МОЕ-гэпмеров. Гэпмеры обладали длиной 20 нуклеозидов, причем центральный сегмент разрыва включал десять 2′-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами крыльев с 5′-направления и 3′-направления, включавшими по пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид в сегменте 5′-крыла и каждый нуклеозид в сегменте 3′-крыла содержал модификацию 2′-МОЕ. Межнуклеозидные связи на всем протяжении каждого гэпмера являлись фосфоротиоатными (P=S) связями. Все остатки цитозина на всем протяжении каждого гэпмера являлись остатками 5-метилцитозина. "Сайт инициации" означал последний 5′-нуклеозид, являвшийся мишенью гэпмера в последовательности гена человека. "Стоп-сайт" означал последний 3′-нуклеозид, являвшийся мишенью гэпмера в последовательности гена человека. Мишенью каждого гэпмера из перечисленных в Таблице 4 являлась либо мРНК GCGR человека, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:1 (учетный номер GENBANK NM_000160.3), либо геномная последовательность GCGR человека, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:2 (учетный номер GENBANK NW_926918.1, укороченная с нуклеотида 16865000 до 16885000). "н/д" указывает, что указанная конкретная последовательность гена не являлась мишенью указанного антисмыслового олигонуклеотида.

Таблица 4
Ингибирование уровней мРНК GCGR человека химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, мишенями которых являлись SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2
ISIS NO	SEQ ID NO:1 сайт инициации	SEQ ID N0:1 стоп-сайт	Последовательность	% ингибирования	Мотив	SEQ ID NO:2 сайт инициации	SEQ ID N0:2 стоп-сайт	SEQ ID NO
315163	702	721	ACCTGGAAGCTGCTGTACAT	71	5-10-5	13003	13022	79
325568	548	567	GCACTTTGTGGTGCCAAGGC	79	2-16-2	н/д	н/д	4
436140	2015	2034	CTCTTTATTGTTGGAGGACA	93	5-10-5	15743	15762	102
398455	2014	2033	TCTTTATTGTTGGAGGACAT	89	5-10-5	15742	15761	103
398470	н/д	н/д	CCACAGGCCACAGGTGGGCT	85	5-10-5	8132	8151	104
398491	н/д	н/д	AGCCAGGTGAGCAGCCATGC	81	5-10-5	9008	9027	105
398501	н/д	н/д	AAGTGTCCAGGCCATGATAT	84	5-10-5	12025	12044	106
398503	н/д	н/д	CCAAGTGTCCAGGCCATGAT	92	5-10-5	12027	12046	107
398506	н/д	н/д	ACCCCAAGTGTCCAGGCCAT	89	5-10-5	12030	12049	108
398507	н/д	н/д	GCACCCCAAGTGTCCAGGCC	97	5-10-5	12032	12051	109
398508	н/д	н/д	TGCACCCCAAGTGTCCAGGC	87	5-10-5	12033	12052	110
304535	1988	2007	GCACATGGGACGTGCCGACA	98	5-10-5	15716	15735	111
304538	2016	2035	GCTCTTTATTGTTGGAGGAC	95	5-10-5	15744	15763	112
304539	2018	2037	GAGCTCTTTATTGTTGGAGG	92	5-10-5	15746	15765	113
436141	2017	2036	AGCTCTTTATTGTTGGAGGA	93	5-10-5	15745	15764	114
436164	Н/д	Н/д	GGTTCCCGAGGTGCCCAATG	92	5-10-5	7267	7286	115
						7292	7311
						7316	7335
						7341	7360
						7365	7384
						7389	7408
7437	7456

Пример 5: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в первичных гепатоцитах яванского макака

Гэпмеры из Примера 1, проявлявшие значительное ингибирование GCGR человека т vitro, протестировали при различных условиях в первичных гепатоцитах яванского макака. Клетки высевали при плотности 24000 клеток на лунку и трансфицировали концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,4 мкМ, 1,1 мкМ, 3,3 мкМ и 10,0 мкМ с помощью электропорации, как описано в Таблице 5. После периода обработки продолжительностью приблизительно 16 часов из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов GCGR человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Кроме того, в Таблице 5 представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC₅₀) каждого олигонуклеотида, рассчитанная путем построения графика процента ингибирования экспрессии мРНК GCGR от использованных концентраций олигонуклеотидов и отметки концентрации олигонуклеотида, при которой достигалось 50% ингибирование экспрессии мРНК GCGR по сравнению с контролем. Как показано в Таблице 5, уровни мРНК GCGR в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, значительно снижались в зависимости от дозы.

Таблица 5
Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в первичных гепатоцитах яванского макака с помощью электропорации
ISIS №	0,4 мкМ	1,1 мкМ	3,3 мкМ	10,0 мкМ	IC₅₀ (мкМ)
315163	23	39	73	88	2,0
398457	64	69	71	68	<0,3
449759	24	47	75	85	1,3
449760	43	49	77	86	0,7
449797	38	54	69	93	0,8
449819	30	36	56	85	1,7
449823	29	31	43	82	2,5
449836	29	37	62	85	1,6
449851	14	36	73	93	1,6
449856	0	39	70	88	2,1
449858	16	27	65	86	2,1
449859	57	76	92	96	<0,3
449860	41	66	86	91	0,5
449881	27	49	67	70	1,5
449882	33	33	53	71	2,3
449883	63	66	75	76	<0,3
449884	64	77	74	71	<0,3
449885	67	74	71	76	<0,3
449894	55	56	74	78	<0,3
449895	44	60	71	72	0,5
449905	47	59	65	69	0,4
449906	52	66	75	80	<0,3
449907	35	36	62	70	1,8
449908	21	48	67	69	1,8
449910	7	16	51	61	4,8

449912	21	45	66	60	2,3
449916	16	40	55	55	3,9
449917	45	67	72	71	0,3
449922	39	48	60	67	1,3
449938	5	22	44	41	>10,0
449944	6	0	25	62	7,0
449945	22	36	57	64	2,8
449948	0	19	45	60	5,2
449949	0	16	41	52	7,8
449951	26	40	55	61	2,9
449952	21	28	52	62	3,8
449953	15	22	49	59	4,8
449954	0	53	60	58	3,4
449955	30	43	61	66	1,9
449956	10	40	52	64	3,3
449958	17	46	54	67	2,6
449960	10	22	46	63	4,7
449967	0	16	36	49	9,8
450035	0	35	41	60	5,0
450039	18	30	51	60	4,2
450040	0	21	41	66	4,7
450049	22	27	59	68	2,9
450050	28	22	49	61	4,7
450054	0	11	22	25	>10,0
450059	11	41	64	78	2,1
450061	13	29	49	60	4,4
450074	15	27	40	61	5,4

Пример 6: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2

Гэпмеры из Примера 5, проявлявшие значительное ингибирование мРНК GCGR in vitro, отобрали и протестировали при различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 40000 клеток на лунку и трансфицировали концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ с помощью электропорации, как описано в Таблице 6. После периода обработки продолжительностью приблизительно 16 часов из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов GCGR человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Кроме того, в Таблице 6 представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC₅₀) каждого олигонуклеотида. Как показано в Таблице 6, уровни мРНК GCGR в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, значительно снижались в зависимости от дозы.

Таблица 6
Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2 с помощью электропорации
ISIS №	0,12 мкМ	0,37 мкМ	1,11 мкМ	3,33 мкМ	10,00 мкМ	IC₅₀ (мкМ)
315163	0	3	26	62	88	2,2
398457	47	81	94	97	97	<0,1
449760	0	26	64	91	97	0,8
449797	0	16	42	84	95	1,2
449819	0	17	40	79	93	1,3
449851	4	28	65	94	97	0,7
449859	36	51	89	95	95	0,2
449860	30	53	77	86	94	0,3
449882	0	19	57	85	97	1,0
449883	7	49	84	92	96	0,5
449884	67	87	95	94	97	<0,1
449885	44	83	77	97	95	<0.1
449894	1	34	78	87	98	0,7
449895	0	31	29	84	95	1,1
449906	12	26	67	93	95	0,7

Пример 7: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2

Гэпмеры из Примера 5, проявлявшие значительное ингибирование мРНК GCGR in vitro, дополнительно отобрали и протестировали при различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 40000 клеток на лунку и трансфицировали концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,04 мкМ, 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ с помощью электропорации, как описано в Таблице 7. После периода обработки продолжительностью приблизительно 16 часов из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов GCGR человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Кроме того, в Таблице 7 представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC₅₀) каждого олигонуклеотида. Уровни мРНК GCGR в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, значительно снижались в зависимости от дозы. "н/д" означает отсутствие данных для указанного ISIS-олигонуклеотида и указанной конкретной концентрации. Для дальнейших исследований выбрали ISIS 398457, ISIS 449884 и ISIS 449954, вызывавшие значительное снижение уровней мРНК GCGR. Важно, что ISIS 449884 продемонстрировало в десять-пятьдесят раз более низкую IC₅₀, чем стандартное соединение ISIS 315163 в прямых сравнительных исследованиях, представленных в Примерах 5-7.

Таблица 7
Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2 с помощью электропорации
ISIS №	0,04 мкМ	0,12 мкМ	0,37 мкМ	1,11 мкМ	3,33 мкМ	10,00 мкМ	IC₅₀ (мкМ)
315163	22	9	22	45	67	93	1,5
398457	36	62	88	99	99	100	0,1
449856	8	24	49	73	92	95	0,4
449858	28	27	41	80	93	97	0,3
449859	16	40	72	89	97	98	0,2
449860	32	38	46	78	94	98	0,2
449883	25	27	68	92	98	100	0,2
449884	42	59	93	99	100	н/д	<0,04
449885	18	60	84	97	98	н/д	0,1
449894	8	31	44	83	96	99	0,3
449951	0	32	62	86	98	99	0,4
449954	9	40	57	86	99	99	0,2

Пример 8: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в первичных гепатоцитах яванского макака

Гэпмеры из исследований, описанных в Примерах 1-7, дополнительно протестировали в различных дозах в первичных гепатоцитах яванского макака. Клетки высевали при плотности 35000 клеток на лунку и трансфицировали концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 750 нМ, 1500 нМ, 3000 нМ, 6000 нМ и 12000 нМ с помощью электропорации, как указано в Таблице 8. После периода обработки продолжительностью приблизительно 16 часов из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов GCGR человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 8, уровни мРНК GCGR значительно снижались в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами.

Таблица 8
Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в первичных гепатоцитах яванского макака с помощью электропорации
ISIS №	750,0 нМ	1500,0 нМ	3000,0 нМ	6000,0 нМ	12000,0 нМ
398457	85	89	92	89	85
398471	78	85	87	85	87
436140	81	93	96	97	96
448754	44	59	80	80	81
448766	79	90	88	87	83
448818	19	13	58	64	76
449884	89	92	89	87	90
459014	51	63	79	82	84
459032	78	85	88	88	87
459040	70	77	81	89	83
459046	34	38	65	61	80
459076	31	39	67	79	77
459157	89	87	88	88	86

Пример 9: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в первичных гепатоцитах яванского макака

Гэпмеры из Примера 8, проявлявшие значительное ингибирование GCGR человека in vitro, дополнительно отобрали и протестировали при различных дозах в первичных гепатоцитах яванского макака. Кроме того, протестировали ISIS 325568 (GCACTTTGTGGTGCCAAGGC (SEQ ID NO:4); сайт инициации в SEQ ID NO:1-548), описанное в более ранней публикации (BIOL066USL). Клетки высевали при плотности 35000 клеток на лунку и трансфицировали концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,006 мкМ, 0,020 мкМ, 0,063 мкМ, 0,200 мкМ, 0,632 мкМ, 2,000 мкМ, 6,325 мкМ и 20,000 мкМ с помощью электропорации, как указано в Таблице 9. После периода обработки продолжительностью приблизительно 16 часов из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов GCGR человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Кроме того, в Таблице 9 представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC₅₀) каждого олигонуклеотида. Уровни мРНК GCGR в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, значительно снижались в зависимости от дозы.

Таблица 9
Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в первичных гепатоцитах яванского макака с помощью электропорации
ISIS №	0,006 мкМ	0,020 мкМ	0,063 мкМ	0,200 мкМ	0,632 мкМ	2,000 мкМ	6,325 мкМ	20,000 мкМ	IC₅₀ (мкМ)
325568	0	0	0	0	0	42	75	93	3,1
398471	0	4	7	24	62	65	65	59	0,4
448766	5	0	0	2	28	51	57	34	0,6
449884	0	12	61	59	71	68	72	62	0,1
459014	1	0	2	23	15	47	69	74	2,6
459032	0	6	4	33	55	68	72	61	0,5
459157	0	12	29	69	69	72	73	62	0,1

На основании данных ингибирования, ISIS 398471, ISIS 448766, ISIS 449884, ISIS 459014, ISIS 459032 и ISIS 459157 выбрали для тестирования в модели мыши in vivo.

Пример 10: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2

Гэпмеры из исследований, описанных в Примерах 1, 4 и 9, дополнительно протестировали в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 40000 клеток на лунку и трансфицировали концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ с помощью электропорации, как указано в Таблице 10. После периода обработки продолжительностью приблизительно 1 6 часов из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов GCGR человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 10, уровни мРНК GCGR значительно снижались в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами.

Таблица 10
Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2 с помощью электропорации
ISIS №	0,12 мкМ	0,37 мкМ	1,11 мкМ	3,33 мкМ	10,00 мкМ	IC₅₀ (мкМ)
398455	35	57	81	94	94	0,2
398457	33	79	91	97	98	0,1
398470	37	48	86	92	96	0,2
398471	33	50	86	92	87	0,2
398486	50	47	85	91	98	0,1
398491	25	61	73	96	92	0,3
398501	35	43	85	98	98	0,3
398503	21	58	80	97	99	0,3
398504	51	57	91	92	98	0,1
398506	40	71	96	98	99	0,1
398507	59	85	97	98	Н/Д	<0,1
398508	22	48	90	94	98	0,3
398585	25	57	84	88	93	0,3
436034	34	56	61	81	92	0,3

На основании результатов ингибирования, ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398486, ISIS 398491, ISIS 398506, ISIS 398507, ISIS 398508 и ISIS 436034 выбрали для тестирования в модели мыши.

Пример 11: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2

Гэпмеры из исследования, описанного в Примере 4, дополнительно протестировали в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 40000 клеток на лунку и трансфицировали концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,04 мкМ, 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ с помощью электропорации, как указано в Таблице 11. После периода обработки продолжительностью приблизительно 16 часов из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов GCGR человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками. Уровни мРНК GCGR значительно снижались в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами.

Таблица 11
Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2 с помощью электропорации
ISIS №	0,04 мкМ	0,12 мкМ	0,37 мкМ	1,11 мкМ	3,33 мкМ	10,00 мкМ	IC₅₀ (мкМ)
304535	21	31	55	90	99	96	0,2
304538	27	42	73	91	100	95	0,1
304539	15	33	56	87	95	93	0,3
436140	4	27	57	85	94	95	0,3
436141	19	27	64	84	92	95	0,3
436164	12	37	75	94	94	96	0,2

На основании результатов ингибирования, ISIS 304538, ISIS 304539, ISIS 436140 и ISIS 436141 выбрали для тестирования в модели мыши.

Пример 12: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2

Гэпмеры из исследования, описанного в Примерах 1, 3, 8 и 9, дополнительно протестировали в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 40000 клеток на лунку и трансфицировали концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ с помощью электропорации, как указано в Таблице 12. После периода обработки продолжительностью приблизительно 16 часов из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов GCGR человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками. Уровни мРНК GCGR значительно снижались в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами.

Таблица 12
Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2 с помощью электропорации
ISIS №	0,12 мкМ	0,37 мкМ	1,11 мкМ	3,33 мкМ	10,00 мкМ	IC₅₀ (мкМ)
448718	35	64	74	90	92	0,2
448730	44	67	87	94	85	0,1
448738	31	52	75	95	97	0,3
448754	40	47	81	95	96	0,3
448762	43	62	75	96	97	0,2
448766	36	59	88	94	85	0,2
448799	42	53	92	96	99	0,2
448802	43	70	88	97	93	0,1
448806	39	60	82	97	96	0,2
448817	35	62	95	88	92	0,2
448818	29	52	74	97	98	0,3
448819	73	89	97	Н/Д	93	<0,1
448840	31	58	80	83	98	0,3
448848	71	92	98	98	99	<0,1
448850	54	60	74	88	94	<0,1
448860	41	58	73	92	98	0,2
448890	49	60	83	94	99	0,1
448897	50	52	80	92	97	0,2
448901	29	58	81	91	99	0,3
448903	32	48	73	91	99	0,3
448905	43	49	76	89	97	0,2

На основании результатов ингибирования, ISIS 448718, ISIS 448730, ISIS 448754, ISIS 448766, ISIS 448817, ISIS 448818, ISIS 448819, ISIS 448848, ISIS 448860 и ISIS 448890 выбрали для тестирования в модели мыши.

Пример 13: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2

Гэпмеры из исследования, описанного в Примерах 1, 2, 8 и 9, дополнительно протестировали в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 40000 клеток на лунку и трансфицировали концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ с помощью электропорации, как указано в Таблице 13. После периода обработки продолжительностью приблизительно 16 часов из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК GCGR с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зондов GCGR человека RTS1508. Уровни мРНК GCGR корректировали в зависимости от общего содержания РНК, измеренного с помощью RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процентного ингибирования GCGR по сравнению с необработанными контрольными клетками. Уровни мРНК GCGR значительно снижались в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами.

Таблица 13
Дозозависимое антисмысловое ингибирование GCGR человека в клетках HepG2 с помощью электропорации
ISIS №	0,12 мкМ	0,37 мкМ	1,11 мкМ	3,33 мкМ	10,00 мкМ	IC₅₀ (мкМ)
398457	62	84	95	98	97	<0,1
459009	26	47	80	96	97	0,3
459010	56	90	96	98	97	<0,1
459011	46	81	97	95	96	<0,1
459024	29	56	74	89	95	0,3
459032	40	61	74	97	98	0,2
459040	48	65	84	96	95	0,1
459046	36	54	77	96	98	0,2
459058	21	46	88	95	98	0,3
459063	34	42	79	97	99	0,3
459076	32	72	84	98	99	0,1
459082	46	71	92	97	97	0,1
459083	53	71	90	96	97	<0,1
459086	24	72	92	96	97	0,2
459087	23	67	94	97	98	0,2
459088	34	61	86	95	98	0,2
459157	50	74	92	97	97	<0,1
459158	54	81	94	97	99	<0,1

На основании результатов ингибирования, ISIS 459024, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS 459046, ISIS 459076 и ISIS 459157 выбрали для тестирования в модели мыши.

Пример 14: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, мишенью которых являлся GCGR человека, у мышей CD1

Мыши CD1® (Чарльз-Ривер, штат Массачусетс, США) являются многоцелевой моделью мыши, часто используемой в исследованиях безопасности и эффективности. Мышей лечили ISIS-антисмысловыми олигонуклеотидами, выбранными из вышеописанных исследований, и оценивали изменения в уровнях различных биохимических маркеров плазмы.

Лечение

Группам самцов мышей CD1 возрастом шесть недель дважды в неделю в течение 6 недель подкожно вводили 50 мг/кг ISIS 304538, ISIS 304539, ISIS 325568, ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398486, ISIS 398491, ISIS 398506, ISIS 398507, ISIS 398508, ISIS 436034, ISIS 436140, ISIS 436141, ISIS 448718, ISIS 448730, ISIS 448754, ISIS 448766, ISIS 448817, ISIS 448818, ISIS 448819, ISIS 448848, ISIS 448860, ISIS 448890, ISIS 449884, ISIS 449954, ISIS 449956, ISIS 459014, ISIS 459024, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS 459046, ISIS 459076 и ISIS 459157. Одной группе самцов мышей CD1 возрастом шесть недель дважды в неделю в течение 6 недель подкожно вводили PBS. Мышей умерщвляли через 48 часов после введения последней дозы, после чего собирали органы и плазму для дальнейшего анализа.

Биохимические маркеры плазмы

Для оценки действия ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени и почек измеряли уровни трансаминаз, билирубина, альбумина и азота мочевины в плазме с помощью автоматизированного клинического биохимического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк, США). Результаты представлены в Таблице 14. ISIS-олигонуклеотиды, вызывавшие изменения в уровнях любого из маркеров функции печени или почек за пределами ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов диапазона, исключили из дальнейших исследований.

Таблица 14
Действие лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на биохимические маркеры плазмы у мышей CD1 на 6 неделе
	АЛТ (МЕ/л)	ACT (МЕ/л)	Билирубин (мг/дл)	Альбумин (мг/дл)	АМК (мг/дл)
PBS	26	37	0,20	3,2	24
ISIS 304538	71	93	0,18	3,4	24
ISIS 304539	151	126	0,21	3,4	22
ISIS 325568	47	67	0,20	3,1	18
ISIS 398457	26	45	0,28	3,6	25
ISIS 398471	33	46	0,21	3,6	28
ISIS 398486	447	381	0,22	3,5	28
ISIS 398491	56	54	0,20	3,3	28
ISIS 398506	884	823	0,35	3,4	25
ISIS 398507	2381	895	0,28	3,9	24

ISIS 398508	643	227	0,20	3,4	25
ISIS 436034	1481	696	0,38	3,4	23
ISIS 436140	40	62	0,20	3,0	25
ISIS 436141	232	163	0,20	3,3	21
ISIS 448718	378	221	0,20	2,9	25
ISIS 448730	852	398	1,40	3,5	27
ISIS 448754	71	84	0,20	3,4	28
ISIS 448766	47	46	0,26	3,5	23
ISIS 448817	211	144	0,25	3,6	24
ISIS 448818	33	52	0,17	3,1	23
ISIS 448819	196	188	0,25	3,5	23
ISIS 448848	1677	855	0,61	3,1	17
ISIS 448860	951	536	0,22	3,3	20
ISIS 448890	402	345	0,17	3,0	18
ISIS 449884	38	51	0,23	3,5	23
ISIS 449954	1465	1229	0,28	3,7	23
ISIS 449956	55	63	0,17	2,9	21
ISIS 459014	27	50	0,17	3,2	22
ISIS 459024	52	54	0,23	3,3	22
ISIS 459032	50	55	0,22	3,2	21
ISIS 459040	37	70	0,14	3,1	22
ISIS 459046	41	81	0,19	3,0	20
ISIS 459076	33	50	0,21	3,0	22
ISIS 459157	25	43	0,21	3,2	21

Пример 15: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, мишенью которых являлся GCGR человека, у крыс Sprague-Dawley

Крысы Sprague-Dawley являются многоцелевой моделью, используемой при оценках безопасности и эффективности. Крыс лечили ISIS-антисмысловыми олигонуклеотидами из исследования, описанного в Примере 14, и оценивали изменения в уровнях различных биохимических маркеров плазмы.

Лечение

Самцов крыс Sprague-Dawley в возрасте семь недель содержали при 12-часовом цикле света/темноты и кормили кормом для здоровых крыс Purina, рацион 5001, вволю. Группам из четырех самцов крыс Sprague-Dawley дважды в неделю в течение 4 недель подкожно вводили 50 мг/кг ISIS 304538, ISIS 304539, ISIS 325568, ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398486, ISIS 398491, ISIS 398506, ISIS 398507, ISIS 398508, ISIS 436034, ISIS 436140, ISIS 436141, ISIS 448718, ISIS 448730, ISIS 448754, ISIS 448766, ISIS 448817, ISIS 448818, ISIS 448819, ISIS 448848, ISIS 448860, ISIS 448890, ISIS 449884, ISIS 449954, ISIS 449956, ISIS 459014, ISIS 459024, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS 459046, ISIS 459076 и ISIS 459157. Крыс умерщвляли через сорок восемь часов после введения последней дозы, после чего собирали органы и плазму для дальнейшего анализа.

Функция печени

Для оценки действия ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряли уровни трансаминаз в плазме с помощью автоматизированного клинического биохимического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк, США). Измеряли уровни АЛТ (аланинтрансаминазы) и ACT (аспартаттрансаминазы) в плазме; результаты представлены в Таблице 16 и выражены в МЕ/л. Кроме того, с помощью этого же клинического биохимического анализатора измеряли уровни билирубина в плазме;

результаты также представлены в Таблице 16. Значения АЛТ и ACT также выражены в виде кратного увеличения по сравнению с PBS-контролем и представлены в Таблице 17. ISIS-олигонуклеотиды, вызывавшие изменения в уровнях любого из маркеров функции печени за пределами ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов диапазона, исключили из дальнейших исследований.

Таблица 16
Действие лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на функцию печени у крыс Sprague-Dawley
	АЛТ (МЕ/л)	ACT (МЕ/л)	Билирубин (мг/дл)
PBS	49	74	0,13
ISIS 304538	127	206	0,17
ISIS 304539	48	70	0,10
ISIS 325568	66	89	0,13
ISIS 398457	59	98	0,10
ISIS 398471	57	78	0,10
ISIS 398486	778	734	0,28
ISIS 398491	121	211	0,13
ISIS 398506	236	287	0,57
ISIS 398507	424	231	0,25
ISIS 398508	305	302	0,31
ISIS 436034	338	385	0,30
ISIS 436140	58	92	0,13
ISIS 436141	55	108	0,15
ISIS 448718	99	115	0,13

ISIS 448730	92	110	0,13
ISIS 448754	131	79	0,10
ISIS 448766	70	102	0,10
ISIS 448817	102	169	0,16
ISIS 448818	92	188	0,19
ISIS 448819	261	211	0,11
ISIS 448848	105	125	0,14
ISIS 448860	203	248	0,79
ISIS 448890	224	204	0,22
ISIS 449884	134	121	0,15
ISIS 449954	548	706	1,19
ISIS 449956	100	133	0,21
ISIS 459014	64	138	0,16
ISIS 459024	150	182	2,38
ISIS 459032	109	109	0,11
ISIS 459040	67	95	0,11
ISIS 459046	60	127	0,09
ISIS 459076	57	114	0,14
ISIS 459157	52	85	0,15

Таблица 17
Кратное увеличение АЛТ и ACT по сравнению с PBS-контролем в экспериментальных группах крыс Sprague-Dawley
ISIS №	АЛТ	ACT
304538	4,1	3,6
304539	0,8	0,8
325568	1,2	1,4
398457	0,9	1,1
398471	0,9	0,9
398486	12,2	8,3
398491	1,9	2,4
398506	7,6	5,0
398507	13,6	4,0
398508	9,8	5,3
436034	10,8	6,7
436140	1,9	1,6
436141	1,8	1,9
448718	3,2	2,0
448730	1,4	1,2
448754	2,1	0,9
448766	1,1	1,2
448817	2,0	2,4
448818	1,9	2,4
448819	5,0	3,0
448848	2,0	1,8

448860	4,1	3,2
448890	4,5	2,6
449884	2,6	1,7
449954	11,1	9,0
449956	2,0	1,7
459014	1,3	1,8
459024	3.1	2,3
459032	2,1	1,6
459040	1,3	1,4
459046	1,1	1,8
459076	1,2	1,5
459157	1,0	1,2

Функция почек

Для оценки действия ISIS-олигонуклеотидов на функцию почек измеряли уровни азота мочевины крови (АМК) и креатинина в плазме с помощью автоматизированного клинического биохимического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк, США). Результаты представлены в Таблице 18 и выражены в мг/дл.

Таблица 18
Действие лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на маркеры функции почек (мг/дл) у крыс Sprague-Dawley
	АМК (мг/дл)	Креатинин (мг/дл)
PBS	16	0,27
ISIS 304538	18	0,35
ISIS 304539	21	0,32
ISIS 325568	15	0,31
ISIS 398457	18	0,32
ISIS 398471	19	0,33
ISIS 398486	20	0,34
ISIS 398491	21	0,32
ISIS 398506	18	0,44
ISIS 398507	16	0,33
ISIS 398508	18	0,41
ISIS 436034	17	0,33
ISIS 436140	16	0,42
ISIS 436141	25	0,42
ISIS 448718	17	0,4
ISIS 448730	21	0,35
ISIS 448754	23	0,36
ISIS 448766	21	0,35

ISIS 448817	17	0,33
ISIS 448818	20	0,52
ISIS 448819	16	0,31
ISIS 448848	19	0,34
ISIS 448860	25	0,38
ISIS 448890	19	0,39
ISIS 449884	16	0,34
ISIS 449954	19	0,45
ISIS 449956	30	0,52
ISIS 459014	20	0,45
ISIS 459024	25	0,59
ISIS 459032	13	0,22
ISIS 459040	21	0,33
ISIS 459046	19	0,3
ISIS 459076	21	0,39
ISIS 459157	17	0,31

Пример 16: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, мишенью которых являлся GCGR человека, у крыс CD/IGS

Крысы CD/IGS являются многоцелевой моделью, используемой при оценках безопасности и эффективности. Крыс лечили ISIS-антисмысловыми олигонуклеотидами, выбранными в ходе исследования, описанного в Примерах 14 и 15, и оценивали изменения в уровнях различных биохимических маркеров плазмы.

Лечение

Самцов крыс CD/IGS в возрасте десять-двенадцать недель содержали при 12-часовом цикле света/темноты и кормили кормом для здоровых крыс Purina, рацион 5001, вволю. Группам из четырех крыс CD/IGS дважды в неделю в течение 13 недель подкожно вводили 30 мг/кг ISIS 325568, ISIS 398471, ISIS 436140, ISIS 448766, ISIS 449884, ISIS 459014, ISIS 459032, ISIS 459040 и ISIS 459157. Группе из 6 крыс дважды в неделю в течение 13 недель подкожно вводили PBS; данную группу использовали в качестве контрольной. Отбор образцов крови выполняли в различные моменты времени. Через сорок восемь часов после введения последней дозы измеряли массу тела, крыс умерщвляли и собирали органы и плазму для дальнейшего анализа.

Масса органов

Массу печени, сердца, легких, селезенки и почек измеряли в конце исследования;

результаты представлены в Таблице 19. ISIS-олигонуклеотиды, вызывавшие изменения массы органов за пределами ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов диапазона, исключили из дальнейших исследований.

Таблица 19
Масса органов крыс CD/IGS после лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на 13 неделе, выраженная в граммах (г)
	Сердце	Печень	Легкие	Селезенка	Почки
PBS	1,8	21,3	1,9	1,0	4,1
ISIS 325568	1.3	16,9	2,6	2,1	3,6
ISIS 398471	1,6	19,8	2,1	1,6	3,3
ISIS 436140	1,4	22,7	2,4	2,4	4,9
ISIS 448766	1,5	22,6	2,2	2.3	3,4
ISIS 449884	1,6	19,0	2,0	1,3	3,3
ISIS 459014	1,6	16,4	1,9	1,0	3,2
ISIS 459032	1,6	33,3	2,8	6,1	4,0
ISIS 459040	1,5	18,7	2,7	2,3	4,5
ISIS 459157	1,4	19,4	2,1	1,5	3,3

Функция печени

Для оценки действия ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени измеряли уровни различных биохимических маркеров плазмы через 8,5 недель (день 57) и 13 недель (день 90) с помощью автоматизированного клинического биохимического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк, США). Измеряли уровни АЛТ (аланинтрансаминазы) и ACT (аспартаттрансаминазы) в плазме; результаты представлены в Таблицах 20 и 21 и выражены в МЕ/л. Кроме того, с помощью этого же клинического биохимического анализатора измеряли уровни билирубина и АМК в плазме; результаты также представлены в Таблицах 20 и 21. ISIS-олигонуклеотиды, вызывавшие изменения в уровнях любого из маркеров функции печени за пределами ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов диапазона, исключили из дальнейших исследований.

Таблица 20
Действие лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на маркеры функции печени у крыс CD/IGS в день 57
	АЛТ, МЕ/л	ACT, МЕ/л	Билирубин, мг/дл	АМК, мг/дл
Физиологический раствор	28	48	0,12	12,7
325568	38	59	0,09	16,7
398471	29	49	0,10	10,4
436140	28	45	0,08	11,0
448766	31	64	0,08	13,2
449884	45	55	0,11	12,1

459014	27	44	0,13	23,2
459032	98	172	0,23	14,6
459040	25	43	0,08	14,1
459157	26	48	0,09	15,8

Таблица 21
Действие лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на маркеры функции печени у крыс CD/IGS в день 80
	АЛТ	ACT	Билирубин	АМК
PBS	47	71	0,22	17,9
ISIS 325568	57	102	0,15	19,6
ISIS 398471	59	88	0,18	18,8
ISIS 436140	43	70	0,19	23,3
ISIS 448766	77	168	0,18	22,3
ISIS 449884	95	105	0,23	20,1
ISIS 459014	58	108	0,26	21,4
ISIS 459032	221	422	0,53	18,3
ISIS 459040	56	98	0,16	14,1
ISIS 459157	67	138	0,34	19,4

Функция почек

Для оценки действия ISIS-олигонуклеотидов на функцию почек измеряли уровни общего белка и креатинина в моче и оценивали соотношение общего белка мочи и креатинина. Результаты представлены в Таблице 22.

Таблица 22
Действие лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на соотношение белка мочи/креатинина в почках крыс CD/IGS
	перед введением дозы	неделя 8	неделя12
PBS	1,1	0,7	0,7
ISIS 325568	1,1	3,6	5,2
ISIS 398471	0,8	4,4	4,6
ISIS 436140	1,1	5,4	15,6
ISIS 448766	0,9	5,4	7,0
ISIS 449884	0,9	3,2	3,7
ISIS 459014	1,0	3,6	3,3
ISIS 459032	1,0	4,5	6,0
ISIS 459040	0,8	4,8	5,6
ISIS 459157	1,2	3,3	4,1

Пример 17: Измерение вязкости ISIS-антисмысловых олигонуклеотидов, мишенью которых является GCGR человека

Вязкость антисмысловых олигонуклеотидов, выбранных в ходе исследования, описанного в Примере 16, измеряли с целью отсева антисмысловых олигонуклеотидов с вязкостью более 40 сПз. Олигонуклеотиды с вязкостью выше 40 сПз должны быть слишком вязкими для введения в организм субъектов.

ISIS-олигонуклеотиды (32-35 мг) взвешивали в стеклянном флаконе, добавляли 120 мкл воды и растворяли антисмысловой олигонуклеотид путем нагрева флакона при 50°С. Часть (75 мкл) предварительно нагретого образца переносили пипеткой в микровискозиметр (Cambridge). Температуру микровискозиметра устанавливали на 25°С и измеряли вязкость образца. Другую часть (20 мкл) предварительно нагретого образца переносили пипеткой в 10 мл воды для УФ-считывания при 260 нм и 85°С (прибор Сагу UV). Результаты представлены в Таблице 23 и показывают, что вязкость всех растворов антисмысловых олигонуклеотидов являлась оптимальной и соответствовала вышеуказанному критерию.

Таблица 23
Вязкость и концентрация ISIS-антисмысловых олигонуклеотидов, мишенью которых является GCGR человека
ISIS №	Мотив	Вязкость (сПз)	Концентрация (мг/мл)
398471	5-10-5	27	173
436140	5-10-5	6	162
448766	5-10-5	4	142
449884	3-10-4	4	145
459014	3-10-4	9	167
459032	3-10-4	7	154
459040	3-10-4	11	157
459157	5-10-6	5	144

Пример 18: Фармакокинетика антисмыслового олигонуклеотид а в печени мыши CD1

Мышей CD1 лечили ISIS 449884 и оценивали период полувыведения олигонуклеотида, а также время разрушения и выведения олигонуклеотида из печени.

Лечение

Группе из десяти мышей CD1 дважды в неделю в течение 2 недель подкожно вводили 50 мг/кг ISIS 449884. Группы по пять мышей в каждой умерщвляли через 3 дня и 56 дней после введения последней дозы. Печень собирали для анализа.

Измерение концентрации олигонуклеотида

Измеряли концентрацию полноразмерного олигонуклеотида, а также общую концентрацию олигонуклеотида (в том числе разрушенной формы). Использованный способ являлся модификацией ранее опубликованных способов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), заключавшихся в экстракции фенол-хлороформом (жидкость-жидкость) с последующей твердофазной экстракцией. Перед экстракцией добавляли внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-членный 2′-O-метоксиэтил-модифицированный фосфортиоатный олигонуклеотид GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, обозначаемый здесь как SEQ ID NO:119). Концентрации в образце ткани рассчитывали с использованием калибровочных кривых с нижним пределом количественного определения (LLOQ) приблизительно 1,14 мкг/г. Затем рассчитывали период полувыведения с помощью программного обеспечения WinNonlin (PHARSIGHT).

Результаты представлены в Таблице 24 и выражены в мкг/г ткани печени. Рассчитанный период полувыведения ISIS 449884 составил 15,1 дней.

Таблица 24
Концентрация олигонуклеотида ISIS 449884 в печени мышей CD1
	Концентрация полноразмерной формы (мкг/г)
День 3	118,7
День 56	10,9

Пример 19: Эффект ISIS-антисмысловых олигонуклеотидов, мишенью которых являлся GCGR человека, у яванских макаков

Яванских макаков лечили ISIS-антисмысловыми олигонуклеотидами, выбранными в ходе исследований, описанных в Примерах 14-18. Оценивали эффективность и переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, а также их фармакокинетический профиль в печени и почках. Протестированные антисмысловые олигонуклеотиды человека также обладали перекрестной реакционноспособностью с геномной последовательностью резуса (обозначаемой здесь как SEQ ID NO:3). Чем больше комплементарность между олигонуклеотидом человека и последовательностью макака-резуса, тем больше вероятность перекрестной реакционноспособности олигонуклеотида человека с последовательностью макака-резуса. Сайт инициации и стоп-сайт каждого олигонуклеотида в SEQ ID NO:3 представлены в Таблице 25. "Сайт инициации" означал последний 5′-нуклеотид, являвшийся мишенью гэпмера в последовательности гена макака-резуса.

Таблица 25
Антисмысловые олигонуклеотиды, комплементарные SEQ ID NO.
Сайт инициации	Последовательность	ISIS №	Мотив	SEQ ID NO
1495	TCCACAGGCCACAGGTGGGC	398471	5-10-5	17
8857	CTCTTTATTGTTGGAGGACA	436140	5-10-5	102
3196	GCAAGGCTCGGTTGGGCTTC	448766	5-10-5	31
639	GGTTCCCGAGGTGCCCA	449884	3-10-4	11
666
716
744
799
826
4131	GGGCAATGCAGTCCTGG	459014	3-10-4	80
1142	GAAGGTGACACCAGCCT	459032	3-10-4	81
1506	GCTCAGCATCCACAGGC	459040	3-10-4	82
636	GGGTTCCCGAGGTGCCCAATG	459157	5-10-6	85
663
713
741
796
823

Лечение

Перед исследованием обезьян содержали в карантине в течение 5-недельного периода, во время которого животных ежедневно обследовали для оценки общего состояния здоровья. Возраст обезьян составлял 2-3 года, масса тела - от 2 до 5 кг. Девяти группам по пять рандомизированных самцов яванских макаков, каждому, подкожно вводили ISIS-олигонуклеотид или PBS с помощью иглы из нержавеющей стали и шприца соответствующего размера в интракапсулярную область и внешнюю часть бедра. Обезьяны получали 40 мг/кг ISIS 325568, ISIS 398471, ISIS 436140, ISIS 448766, ISIS 449884, ISIS 459014, ISIS 459032, ISIS 459040 или ISIS 459157 четыре раза в неделю в течение первой недели (в дни 1, 3, 5 и 7) в качестве нагрузочных доз, а затем раз в неделю в течение недель 2-13. Контрольной группе из 8 яванских макаков подкожно вводили PBS три раза подряд четырежды в неделю в течение первой недели (дни 1, 3, 5 и 7), а затем раз в неделю в течение недель 2-13.

За период исследования обезьян обследовали два раза в день на наличие признаков заболевания или дистресса. Животных, испытывавших более чем кратковременную или легкую боль или дистресс в связи с лечением, травмой или заболеванием, лечили с привлечением ветеринарного персонала и с применением одобренных анальгетиков или агентов, облегчающих боль, после консультаций с руководителем исследования. Животных с плохим состоянием здоровья или находящихся в предположительно предсмертном состоянии выявляли с целью дальнейшего мониторинга и возможной эвтаназии. Например, одно животное из группы, получавшей ISIS 436140, подвергли эвтаназии в день 86 и одно животное из группы, получавшей ISIS 459040, подвергли эвтаназии в день 71. Запланированную эвтаназию животных проводили в день 93 путем обескровливания после анестезии, вызванной кетамином/ксилазином, и введения пентобарбитала натрия. Протоколы, описанные в настоящем Примере, были одобрены Комитетом учреждения по уходу за животными и их использованию (IACUC).

Снижение уровня мишени в печени

Анализ РНК

В день 93 РНК экстрагировали из ткани печени для анализа GCGR с помощью ПЦР в реальном времени с использованием набора праймеров и зондов человека RTS1508. Кроме того, провели анализы с использованием набора праймеров и зондов человека и макака-резуса RTS1479 (прямая последовательность ATCTCCTGCCCCTGGTACCT, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:120; обратная последовательность GGTCCACGCACCCACTGA, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:121; последовательность зонда ACCGCTTCGTGTTCAAGAGATGCG, обозначаемая здесь как SEQ ID NO:122). Результаты представлены в виде процентного ингибирования мРНК GCGR по сравнению с PBS-контролем, нормированного по отношению к конститутивному гену циклофилина. Аналогичные результаты получили при нормировании с помощью RIBOGREEN^®. Как показано в Таблице 26, лечение с помощью ISIS-антисмысловых олигонуклеотидов привело к значительному снижению мРНК GCGR по сравнению с PBS-контролем. Конкретно, лечение с помощью ISIS 449884 привело к наиболее значительному снижению экспрессии мРНК GCGR.

Таблица 26
Процент ингибирования мРНК GCGR в печени яванского макака по сравнению с PBS-контролем
ISIS №	RTS1508/Ribogree n	RTS1479/Ribogree n	RTS1508/циклофилин	RTS 1479/циклофили н
325568	59	49	68	59
398471	27	16	39	30

448766	49	37	55	42
449884	78	75	79	75
459014	25	21	39	32
459157	63	62	72	69

Анализ уровней глюкагона

Уровни глюкагона в плазме измеряли перед введением дозы и на 3, 6, 7 и 10 неделе лечения. Поскольку уровни глюкагона менялись в зависимости от уровня стресса у животных, обезьянам до отбора крови вводили кетамин путем внутримышечной инъекции. Перед пробоотбором животных держали голодными в течение ночи. Приблизительно 1,8-2,0 мл крови отбирали из бедренной вены и помещали в пробирки с K₂-ЭДТА, содержащие 10 мкл/мл ингибитора ДПП-IV и 250 тыс. МЕ/мл апротинина. Пробирки переворачивали для смешивания крови с растворами, а затем помещали в воду со льдом. Образцы крови центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин при 4-8°С в течение 30 мин после отбора крови.

Повышение уровней глюкагона являлось следствием ингибирования уровней GCGR. Уровни глюкагона измеряли с помощью автоматизированного клинического биохимического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк, США). Результаты представлены в Таблице 27 и показывают, что ингибирование уровней рецептора глюкагона за счет лечения антисмысловым олигонуклеотидом привело к значительному повышению уровней глюкагона в плазме. Конкретно, лечение с помощью ISIS 449884 привело к повышению уровней глюкагона в зависимости от времени.

Таблица 27
Уровни глюкагона в печени яванского макака после антисмысловой терапии (пг/мл)
	Перед введением	Неделя3	Неделя 6	Неделя7	Неделя 10
PBS	268	231	248	170	304
ISIS 325568	271	759	726	760	850
ISIS 398471	322	317	279	132	220
ISIS 448766	404	560	572	313	411
ISIS 449884	257	439	631	716	1018
ISIS 459014	348	281	245	122	180
ISIS 459157	369	471	486	538	828

Исследования переносимости

Измерения массы органов и тела

Для оценки влияния ISIS-олигонуклеотидов на общее состояние здоровья животных измеряли массу тела и органов в день 93. Измеренные значения массы тела представлены в Таблице 28. Измеренные значения массы органов также представлены в Таблице 28. Результаты показывают, что влияние лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на массу тела и органов находилось в пределах ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов диапазона. Конкретно, лечение с помощью ISIS 448994 хорошо переносилось с точки зрения массы тела и органов обезьян.

Таблица 28
Конечные значения массы тела и органов яванского макака по сравнению с уровнями до приема препарата
	Масса тела (кг)	Селезенка (г)	Почка (г)	Печень (г)
PBS	2,6	4	12	60
ISIS 325568	2,6	8	16	69
ISIS 398471	2,6	5	13	71
ISIS 436140	2,7	13	23	98
ISIS 448766	2,7	9	18	80
ISIS 449884	2,6	5	14	70
ISIS 459014	2,6	5	12	65
ISIS 459032	2,5	5	13	65
ISIS 459040	2,7	5	13	69
ISIS 459157	2,5	7	12	68

Функция печени

Для оценки влияния ISIS-олигонуклеотидов на функцию печени выполняли отбор образцов крови у всех групп, участвующих в исследовании. Образцы крови отбирали из бедренной вены в день 95, через 48 часов после введения дозы. Перед пробоотбором крови обезьян держали голодными в течение ночи. Кровь собирали в пробирки, содержащие антикоагулянт K2-EDTA, которые центрифугировали для получения плазмы. Уровни различных функциональных маркеров печени измеряли с помощью биохимического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). Измеряли уровни АЛТ и ACT в плазме; результаты представлены в Таблице 29 и выражены в МЕ/л. Аналогично измеряли уровень маркера функции печени - билирубина; результаты представлены в Таблице 29 и выражены в мг/дл. Результаты показывают, что лечение антисмысловыми олигонуклеотидами не оказывало влияния на функцию печени за пределами ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов диапазона. Конкретно, лечение с помощью ISIS 448994 хорошо переносилось с точки зрения функции печени обезьян.

Таблица 29
Влияние лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на маркеры функции печени в плазме яванского макака
	АЛТ (МЕ/л)	ACT (МЕ/л)	Билирубин (мг/дл)
PBS	42	42	0,18
ISIS 325568	31	31	0,14
ISIS 398471	56	39	0,16
ISIS 448766	89	43	0,14
ISIS 449884	44	43	0,14
ISIS 459014	24	39	0,16
ISIS 459157	47	34	0,18

Функция почек

Для оценки влияния ISIS-олигонуклеотидов на функцию почек выполняли отбор образцов крови у всех групп, участвующих в исследовании. Образцы крови отбирали из бедренной вены в день 95, через 48 часов после введения дозы. Перед пробоотбором крови обезьян держали голодными в течение ночи. Кровь собирали в пробирки, содержащие антикоагулянт K₂-EDTA, которые центрифугировали для получения плазмы. Уровни АМК и креатинина измеряли с помощью биохимического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). Результаты представлены в Таблице 30 и выражены в мг/дл.

Результаты биохимического анализа плазмы показывают, что большинство ISIS-олигонуклеотидов не оказывало влияния на функцию почек за пределами ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов диапазона. Конкретно, лечение с помощью ISIS 449884 хорошо переносилось с точки зрения функции почек обезьян.

Таблица 30
Влияние лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на уровни АМК и креатинина в плазме (мг/дл) у яванских макаков
	АМК	Креатинин
PBS	17	0,60
ISIS 325568	16	0,52
ISIS 398471	16	0,50

ISIS 448766	13	0,54
ISIS 449884	17	0,59
ISIS 459014	18	0,60
ISIS 459157	17	0,58

Гематология

Для оценки влияния ISIS-олигонуклеотидов на гематологические параметры у яванских макаков на 11 неделе выполняли отбор образцов крови (приблизительно 1,3 мл) в пробирки, содержащие К2-ЭДТА, у каждого из доступных животных, участвовавших в исследовании. В образцах анализировали количество эритроцитов (RBC), количество лейкоцитов (WBC), количество отдельных видов лейкоцитов, например, моноцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, а также количество тромбоцитов, содержание гемоглобина и гематокрит, с помощью гематологического анализатора ADVIA120 (Bayer, США). Данные представлены в Таблицах 31 и 32.

Результаты показывают, что олигонуклеотиды не вызывали изменений гематологических параметров за пределами ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов в указанной дозе диапазона. Конкретно, лечение с помощью ISIS 448994 хорошо переносилось с точки зрения гематологических параметров обезьян.

Таблица 31
Влияние лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на различные клетки крови яванских макаков
	RBC (×10⁶/мкл)	Тромбоциты (×10³/мкл)	WBC (×10³/мкл)	Нейтрофилы (×10³/мкл)	Лимфоциты (×10³/мкл)	Моноциты (×10³/мкл)
PBS	5,4	499	11,5	5,8	5,2	0,28
ISIS 398471	5,4	568	9,1	2,9	5,8	0,21
ISIS 448766	4,9	422	8,6	4,1	3,9	0,34
ISIS 449884	5,2	415	10,0	4.4	5,1	0,25
ISIS 459014	5,1	433	9,8	4,6	4,7	0,26
ISIS 459157	5,3	357	8,0	3,8	3,8	0,26
ISIS 325568	5,1	376	11,7	5,2	5,7	0,55

Таблица 32
Влияние лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на гематологические параметры яванских макаков
	Гемоглобин (г/дл)	Гематокрит (%)
PBS	13,1	43
ISIS 398471	13,1	44
ISIS 448766	12,3	41
ISIS 449884	12,6	41
ISIS 459014	13,2	44
ISIS 459157	13,2	43
ISIS 325568	13,3	44

В целом, результаты исследования показывают, что ISIS 449884 является самым мощным и хорошо переносимым соединением из протестированных по отношению к ингибированию рецептора глюкагона, и является важным кандидатом для лечения метаболических заболеваний, например, диабета, ожирения, инсулинрезистентности и инсулиновой недостаточности.

1. Соединение, способное ингибировать экспрессию GCGR, включающее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований:
а) включающей фрагмент, состоящий из по меньшей мере 12 смежных нуклеиновых оснований, комплементарный фрагменту равной длины нуклеотидов 6691-8473 или 9002-9824 SEQ ID NO: 2,
б) включающей фрагмент, состоящий из 20 смежных нуклеиновых оснований, комплементарный нуклеотидам 15743-15762 SEQ ID NO: 2, или
в) состоящий из 17 смежных нуклеиновых оснований, комплементарных нуклеотидам 10718-10734 SEQ ID NO: 2.

2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида.

3. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 96% комплементарен SEQ ID NO: 2.

4. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 97% комплементарен SEQ ID NO: 2.

5. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 98% комплементарен SEQ ID NO: 2.

6. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 99% комплементарен SEQ ID NO: 2.

7. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид на 100% комплементарен SEQ ID NO: 2.

8. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью.

9. Соединение по п. 8, отличающееся тем, что каждая межнуклеозидная связь является фосфортиоатной межнуклеозидной связью.

10. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что по меньшей мере один нуклеозид указанного модифицированного олигонуклеотида включает модифицированную сахарозу.

11. Соединение по п. 10, отличающееся тем, что по меньшей мере одна модифицированная сахароза является бициклической сахарозой.

12. Соединение по п. 11, отличающееся тем, что каждая из по меньшей мере одной бициклической сахарозы включает мостик 4′-CH2-N(R)-O-2′, где R независимо является Н, С1-С12-алкилом или защитной группой.

13. Соединение по п. 11, отличающееся тем, что каждая из по меньшей мере одной бициклической сахарозы включает мостик 4′-СН(СН3)-O-2′.

14. Соединение по п. 10, отличающееся тем, что по меньшей мере одна модифицированная сахароза включает 2′-O-метоксиэтильную группу.

15. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что по меньшей мере один нуклеозид включает модифицированное нуклеиновое основание.

16. Соединение по п. 15, отличающееся тем, что указанное модифицированное нуклеиновое основание является 5-метилцитозином.

17. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид включает:
сегмент разрыва, состоящий из соединенных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5′-крыла, состоящий из соединенных нуклеозидов; и
сегмент 3′-крыла, состоящий из соединенных нуклеозидов;
причем сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает модифицированную сахарозу.

18. Соединение по п. 17, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид включает:
сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов; и
сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов;
причем сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает модифицированную сахарозу.

19. Соединение по п. 17, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид включает:
сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов; и
сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов;
причем сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-О-метоксиэтил-модифицированную сахарозу; и каждая межнуклеозидная связь является фосфортиоатной связью.

20. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 соединенных нуклеозидов.

21. Соединение по п. 17, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 соединенных нуклеозидов.

22. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 17-30 соединенных нуклеозидов.

23. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 17-25 соединенных нуклеозидов.

24. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 17-24 соединенных нуклеозидов.

25. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 17-23 соединенных нуклеозидов.

26. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 17-22 соединенных нуклеозидов.

27. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 17-21 соединенных нуклеозидов.

28. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид включает последовательность нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 11, 17, 31, 81, 82, 85 или 102.

29. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из последовательности нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 11, 17, 31, 81, 82, 85 или 102.

30. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид обладает последовательностью нуклеиновых оснований, включающей фрагмент, состоящий из по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований, комплементарный фрагменту равной длины, состоящему из нуклеотидов 7267-7283, 7270-7286, 7292-7308, 7295-7311, 7316-7332, 7319-7335, 7341-7357, 7344-7360, 7437-7453, 7365-7381, 7368-7384, 7389-7405, 7392-7408, 7416-7432, 7440-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160 или 9804-9823 SEQ ID NO: 2
и указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 96% комплементарен SEQ ID NO: 2.

31. Соединение, способное ингибировать экспрессию GCGR, включающее модифицированный одноцепочечный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 11, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид включает:
сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов;
сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов;
причем сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь указанного модифицированного олигонуклеотида является фосфортиоатной связью, а каждый остаток цитозина указанного модифицированного олигонуклеотида является 5-метилцитозином.

32. Соединение, способное ингибировать экспрессию GCGR, включающее модифицированный одноцепочечный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 80, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид включает:
сегмент разрыва, состоящий из десяти соединенных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5′-крыла, состоящий из трех соединенных нуклеозидов;
сегмент 3′-крыла, состоящий из четырех соединенных нуклеозидов;
причем сегмент разрыва расположен между сегментом 5′-крыла и сегментом 3′-крыла, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2′-O-метоксиэтил-модифицированную сахарозу, каждая межнуклеозидная связь указанного модифицированного олигонуклеотида является фосфортиоатной связью, а каждый остаток цитозина указанного модифицированного олигонуклеотида является 5-метилцитозином.

33. Соединение, способное ингибировать экспрессию GCGR, включающее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов и обладающий последовательностью нуклеиновых оснований, включающей фрагмент из по меньшей мере 12 смежных нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 11, 17, 31, 81, 82 или 85, причем мишенью указанного модифицированного олигонуклеотида является SEQ ID NO: 2.

34. Композиция, снижающая экспрессию GCGR, включающая эффективное количество соединения по любому из пп. 1-33 или его фармацевтически приемлемого производного и по меньшей мере один из фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя.

35. Способ предотвращения, лечения, облегчения или замедления прогрессирования метаболического заболевания или состояния, включающий введение животному эффективного количества соединения по любому из пп. 1-33.

36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что животное является человеком.

37. Способ по п. 35, отличающийся тем, что заболевание или состояние является диабетом.

38. Способ по п. 35, отличающийся тем, что заболевание или состояние является диабетом 2 типа.

39. Способ снижения уровней глюкозы в крови животного, включающий введение указанному животному эффективного количества соединения по любому из пп. 1-33.

40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что животное является человеком.

41. Способ по п. 39, отличающийся тем, что уровни глюкозы в крови являются уровнями глюкозы в плазме или уровнями глюкозы в сыворотке.

42. Способ по п. 39, отличающийся тем, что животное страдает диабетом.

43. Способ профилактики или задержки начала заболевания или состояния, ассоциированного с GCGR, у животного, включающий введение животному терапевтически или профилактически эффективного количества соединения по любому из пп. 1-33.

44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что животное является человеком.

45. Способ по п. 43, отличающийся тем, что заболевание или состояние является диабетом.

46. Способ по п. 43, отличающийся тем, что заболевание или состояние является диабетом 2 типа.

47. Способ профилактики или задержки начала повышения уровней глюкозы в крови животного, включающий введение животному терапевтически или профилактически эффективного количества соединения по любому из пп. 1-33.

48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что животное является человеком.

49. Способ по п. 47, отличающийся тем, что уровни глюкозы в крови являются уровнями глюкозы в плазме или уровнями глюкозы в сыворотке.

50. Способ по п. 47, отличающийся тем, что животное страдает диабетом.

51. Применение соединения по любому из пп. 1-33 для предотвращения, лечения, облегчения или замедления прогрессирования метаболического заболевания или состояния у животного.

52. Применение соединения по любому из пп. 1-33 для снижения уровней глюкозы в крови животного.

53. Применение соединения по любому из пп. 1-33 для профилактики или задержки начала заболевания или состояния, ассоциированного с GCGR, у животного.

54. Применение соединения по любому из пп. 1-33 для задержки начала повышения уровней глюкозы в крови животного.

55. Применение соединения по любому из пп. 1-33 для приготовления лекарственного средства для предотвращения, лечения, облегчения или замедления прогрессирования метаболического заболевания или состояния у животного.

56. Применение соединения по любому из пп. 1-33 для приготовления лекарственного средства для снижения уровней глюкозы в крови животного.

57. Применение соединения по любому из пп. 1-33 для приготовления лекарственного средства для профилактики или задержки начала заболевания или состояния, ассоциированного с GCGR, у животного.

58. Применение соединения по любому из пп. 1-33 для приготовления лекарственного средства для задержки начала повышения уровней глюкозы в крови животного.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу повышения экспрессии полинуклеотида альфа-L-идуронидазы (IDUA), и может быть использовано в медицине.

Органоидно-направленные наноносители // 2593956

Изобретение относится к генной инженерии. Описан способ доставки нуклеиновой кислоты в митохондрию и генетической модификации клетки, включающий воздействие на клетку композицией, содержащей по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту и по меньшей мере один органоидно-направленный наноноситель, где наноноситель доставляет по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту сквозь клеточную мембрану в митохондрию.

Способ ингибирования репликации вич в клетках млекопитающих и у людей // 2593948

Изобретение относится к области биохимии. Представлен способ ингибирования репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), включающий обработку клеток млекопитающего агентом, выбранным из группы пептидов, интерферирующей РНК или антисмыслового олигонуклеотида, разрушающим структуру белков виментина и/или кератина-10 цитоскелетных промежуточных филаментов (IF) в клетке млекопитающего.

Антисмысловые композиции и способы их получения и применения // 2593939

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой фармацевтические составы для перорального введения антисмыслового олигонуклеотида против SMAD7, фармацевтически приемлемые таблетки для перорального применения антисмыслового олигонуклеотида против SMAD7, а также пероральную дозированную форму, содержащие указанный антисмысловой олигонуклеотид и энтеросолюбильное покрытие, содержащее сополимер этилакрилата-метакриловой кислоты.

Трансгенное растение осины с повышенной продуктивностью и модифицированной древесиной // 2593722

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению осины со следующими признаками повышенной продуктивности - увеличенным выходом биомассы, листьями большего размера, увеличенной активностью глутаминсинтетазы и повышенной эффективностью использования азота, а также с модифицированной древесиной по сравнению с нетрансформированным растением осины, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую глутаминсинтетазу, а также к способу его получения.

Трансгенное растение березы с повышенной продуктивностью // 2593721

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению березы со следующими признаками повышенной продуктивности - увеличенным выходом биомассы, листьями большего размера, увеличенной активностью глутаминсинтетазы и повышенной эффективностью использования азота по сравнению с аналогом дикого типа, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую глутаминсинтетазу, а также к способу его получения.

Модуляция экспрессии транстиретина // 2592669

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к одноцепочечным модифицированным олигонуклеотидам, способным ингибировать экспрессию транстиретина в клетке.

Sdf-1-связывающие нуклеиновые кислоты // 2590709

Изобретение относится к области биохимии. Представлены варианты молекулы нуклеиновой кислоты, связывающейся с SDF-1.

Антигенная композиция и ее терапевтическое применение для профилактики и лечения онкологических заболеваний, рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез гибридного белка, а также способ получения белка // 2590701

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к рекомбинантной плазмидной ДНК, созданной при помощи новых праймеров CTTCCATATGGAACGAAGGCGTTTGTG и TGTGGATCCAGCTAGTTAGGCATGAAA. Указанная рекомбинантная плазмидная ДНК используется для получения рекомбинантного белка PRAME-F, состоящего из пептида MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH слитого с последовательностью природного белка PRAME, путём её экспрессии в бактериальных клетках.

Лечение заболеваний, связанных с альфа-субъединицей потенциалзависимого натриевого канала (scna), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена scna // 2588654

Изобретение относится к биохимии. Описаны антисмысловые олигонуклеотиды, которые увеличивают экспрессию указанного гена альфа-субъединицы потенциалзависимого натриевого канала (SCNA) in vivo или in vitro по сравнению с нормальным контролем.

Композиция для лечения метаболических расстройств // 2586742

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой композицию, содержащую витамин В9, или фолиевую кислоту, или фолацин, и мио-инозит и альфа-липоевую кислоту для применения в куративном лечении синдрома поликистоза яичников, бесплодия и нарушений менструального цикла.

Пиколинамидные и пиримидин-4-карбоксамидные соединения, способ их получения и фармацевтическая композиция, включающая их // 2566827

Изобретение относится к амидным соединениям структурной формулы 1, которые обладают ингибирующей активностью в отношении 11β-HSD1 фермента. В формуле 1 X представляет N или CR, и Y представляет N или СН при условии, что X и Y не являются в одно и то же время углеродом; Z представляет N или СН; R1 и R2 представляют независимо водород, (С3-С10)циклоалкил, норборнил, адамантил или норадамантил, или R1 и R2 могут быть связаны друг с другом вместе с атомами азота, к которым они присоединены, образуя (С5-С10) насыщенный или ненасыщенный гетероцикл или сконденсированный гетероцикл, при условии, что R1 и R2 не являются в одно и то же время водородом; L представляет одинарную связь, -СО-, -SO2-, -(CR21R22)-(СН2)c- (с представляет целое число 0-5), , -СО(CR21R22)d- (d представляет целое число 1-6), (С3-С10)циклоалкилен, (С6-С20)арилен или 5-6-членный гетероарилен, включающий один или два гетероатома, выбранных из N; R21 и R22 представляют независимо водород или (C1-С10)алкил, R представляет водород или гидроксил; R4 и R5 независимо представляют водород или (С1-С10)алкил, или R4 и R5, связанные вместе, образуют 6-членный ненасыщенный карбоцикл; R6 и R7 представляют независимо водород, (С1-С10)алкил или галоген; R31-R38, R41-R43 и R46 представляют независимо водород или (С1-С10)алкил; и m и n независимо представляют целое число 0-3 при условии, что m+n представляют целое число 2 или более.

Композиции метформина с уменьшенной массой // 2564901

Изобретение относится к фармацевтике, в частности к фармацевтическим композициям метформина в форме спрессованной таблетки. Композиция также включает карбоксиметилцеллюлозу натрия, гидроксипропилметилцеллюлозу 2208, диоксид кремния или коллоидный диоксид кремния и стеарат магния.

Гетероциклические агонисты рецепторов желчных кислот tgr5, фармацевтическая композиция, способы их получения и применения // 2543485

Изобретение относится к соединениям общей формулы I, или их рацемической смеси, или индивидуальным оптическим изомерам, или фармацевтически приемлемым солям, обладающим свойствами агониста рецепторов желчных кислот TGR.

Способ коррекции ожирения гиноидного типа // 2531928

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для коррекции ожирения гиноидного типа. Для этого определяют тип нарушения пищевого поведения и проводят его психофизиологическую коррекцию.

4-триметиламмониобутираты в качестве ингибиторов срт2 // 2502727

Настоящее изобретение относится к новым 4-триметиламмониобутиратам формулы I, где А1, R1, m и n являются такими, как определено в описании и в формуле изобретения, а также к их фармацевтически приемлемым солям.

Производные бензилбензола и способы их применения // 2497526

Изобретение относится к соединению общей формулы IA: или его фармацевтически приемлемой соли. Также изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество указанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли.

Фармацевтические композиции, содержащие ера и сердечно-сосудистое средство, и способ их применения // 2489145

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой фармацевтическую композицию для снижения триглицеридов у индивидуума, нуждающегося в этом, где фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере 95% ЕРА по массе от всех жирных кислот, присутствующих в композиции, и ингибитор редуктазы HMG-CoA.

Новый состав // 2483716

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается фармацевтического состава, включающего ингибитор дипептидилпептидазы IV (DPP-IV), предпочтительно вилдаглиптин от 1,5 до 20% и метформин от 80 до 98,5%.

Производные пиперидина/пиперазина // 2470017

Изобретение относится к ингибитору DGAT формулы (I), его N-оксиду, фармацевтически приемлемой соли и сольвату, фармацевтической композиции на его основе и его применению для лечения заболеваний, опосредованных активностью DGAT, таких как ожирение и диабет.