Способ получения антибиотиков

 

ОПИ САНИ Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ к пАтенту

60юа Советскик

Социалистическил

Респу4лик

Зависимый от патента ¹

Заявлено 28.Ч1.1968 (№ 1249734/30-15)

Приоритет ЗОЛ"1.1967 (№ 41894/67, Япония)

Опубликовано 17.1Ч.1970. Бюллетень ¹ 15

Комитет по делам иао4ретений и открытит при Совете Министров

СССР

Дата опубликования описания 8.Х.1970

Авторы изобретения

Иностранцы

Сабуро Сузуки, Киеси Исоно и Жунсаку Нагацу (Япония) Иностранная фирма

«Рикагаку Кенкушо» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ (CH3)п

R С

C0HNC

I н ысн

НСОН

HOCH

С Н,ОСОКИН, ОН ОН

С00Н сн;сн=

Изобретение относится к способу, получения антибиотиков биологическим путем с,использованием в качестве грибов-продуцентов представителей класса Streptomyces и культивированием последних .на питательных средах, содержащих источники углерода, азота,и минеральных элементов.

Для получения комплекса полиоксинов J, К и 1 общей формулы в которой R — гидроксил, когда п=1 или О; и R означает когда в=О; в качестве гриба-продуцента берут Streptomyces cacaoi var. asoensIs штаммы

АТСС 19093 и АТСС 19094 и полученную смесь полиоксинов J, К и 1 разделяют. Куль5 тивирование штаммов ведут в аэробных условиях глубинным методом при,перемешиванпп питательной среды, содержащей источники углерода, азота и минера Ibных элементов, предпочтительно при температуре 25 — 35 С в

10 течение .времени, достаточного для достижения максимального выхода гoTOBblx продуктов.

В качестве, источника углерода используют крахмал, декстрины, глюкозу, глицерин, маль15 тозу и фруктозу.

В качестве источника азота применяют мясные экстракты, пептон, кукурузный экстракт, соевую муку, размолотьш арахис, хлопковый жмых и дрожжи.

20 B качестве источника минеральных элементов берут хлористый натрий, хлористый калий, карбонат кальция,и фосфаты.

Разделение полученной смеси,полиоксинов

J, К и 1 произ водят на колонках с целлюло25 зой с использованием смеси растворителей: бутанола, уксусной кислоты и воды, взятых в соотношении соответственно 4: 1: 2.

Если R — гидроксил, à n= 1, то этот антибиотик называется полиоксином J; если R

269820

COOHN ! б0

65 обозначает СН вЂ” СН,= () N, à n=0, то антибиотик называется полиоксином К; если

R — гидроксил, à n=0, то антибиотик назы,вается полиокси ном 1.

Штаммы АТСС 19093 и АТСС 19094 являются мутантами S. cacaoi и относятся к группе S. griseus. Второй штамм почти идентичен первому, но отличается по окраске на обратной,стороне arapa Чапека, Ниже приводится более подробная характеристика обоих штаммов (типы 1 и 2).

1. Наблюдения под микроокопом.

Хороший рост,наблюдается при 20 — 32 С.

Воздушный мицелий моноподиально разветвлен на синтетическом и протеинсодержащем

arapax. Спорофоры образуют открытые спирали и не скручиваются, Форма и размер спо р асимметричная стержнеподобная (1,5 — 1,8.

° 0,5 — 0,7 мк) или овальная (1,2 — 1,0. 1,0—

0,7 мк), поверхность спор гладкая.

Il. Культуральные п ризнаки S. сасао1 var.

asoensis.

Arap Чапека, 27 С.

Тип 1 хорошо растет в бесцветном виде или бело-желтом и образует обильный воздушный мицелий, который по виду порошкообразен и меняется от белого до дымчато-серого.

Обратная:сторона бледно-оливково-желтая без растворимого пигмента.

Тип 2 образует воздушный мицелий, который по виду порошкообразен и меняется от белого до дымчато-iceporo. Обратная сторона с желтым оттенком бледно-розового цвета.

Глицериновый агар Чапека, 27 С:

Тип 1 растет хорошо, бледно-оливково-темно-желтого цвета. Образуется незначительное количество (или вовсе не образуется) тонкого белого воздушного мицелпя. Обратная сторона блед но-оливково-желтая или кремовая, без растворимого пигмента.

У типа 2 не об разуется воздушного мицелия, остальное, как у типа 1.

Питательный агар, 27 С:

Тип 1 растет хорошо, скручен, дымчато-серый, образуется незначительное количество воздушного мицелия, цвет которого меняется от белого до светло-серого. Обратная сторона коричневато-желтого цвета и дает коричневый растворимый пигмент.

Тип 2 растет, как тип 1, образует незначительное количество воздушного мицелия белого или беловато-серого цвета. Получается меньше растворимого пигмента, чем у типа 1.

Глюкозопептоновый агар, 27 С:

Тип 1 имеет цвет от кремового до светло-серо-оливкового. Образуется небольшое количество серого .воздушного мицелия или вовсе не образуется. Обратная сторона светло-коричневая и дает светло коричневый пигмент.

Тип 2 растет скудно со слабым образованием белого или светло-серого воздушного мицелия в последний период выращивания.

Обратная сторона оливково-желтая.

Глюкозоаспарагиновый агар, 27 С:

Тип 1 растет скрученным и меняет окраску от белой до желтой, образует воздушный мицелий .от белого до светло-серого или серого цвета. Обратная еторона бронзово-желтая и не дает растворимого пигмента.

Тип 2 дает незначительный рост воздушного мицелия, но идет незначительное образовалие бело-серого воздушного мицелия, Крахмальный агар, 27 С:

Тип 1 растет хорошо, бесцветный или оливково-коричневый, образует большое количество порошкообразного светло-мышиного воздушного мицелия. Обратная сторона оливково-желтая и не дает растворимого пигмента.

Гидролизующая активность по крахмалу нормальная.

Тип 2 — то же, что для типа 1.

Кальциймалеатный агар, 27 С:

Тип 1 растет бесцветным или светло-коричневым iH желтым, образует обильный воздушный мицелий мышиного цвета. Обратная сторона кремово-желтая и дает некоторое количество светлого желто-коричневого растворимого пигмента.

Тип 2 — то же, что тип 1.

Тирозиновый araip, 27 С:

Тип 1 дает рост слабь1й, коричневый цвет и не об разует воздушного мицелия.

Обратная сторона кремового цвета и не дает растворимого пигмента.

Тип 2 — то же, что тип 1.

Яичноальбуминовый агар, 27 С:

Тип 1 растет хорошо, бесцветный или белый, не образует значительных количеств воздушного мицелия, но иногда в последний период выращивания дает очень небольшой белый воздушный мицелий. Обратная сторона белая и не дает растворимого пигмента.

Тип 2 — то же, что тип 1.

Агар на овсяной муке, 27 С:

Тип 1 растет оливково-желтого цвета и образует некоторое количество светло-серого воздушного мицелия. Иногда не образуется воздушный мицелий. Обратная сторона бесц ветна и не дает растворимого пигмента.

Ти п 2 — то же, что тип 1.

Картофельная масса, 27 С:

Тип 1 растет хорошо, темно-оливковый цвет, образует бледно-серый воздушный,мицелий.

Среда меняет цвет до светло-дымчато-серого.

Тип 2 — то же, что тип 1.

Желатиновая культура, .полученная путем инокуляции уколом, 18 С:

Тип 1 растет хорошо со слабым ожижением желатины. Образуется B:íåáoëüøîì количестве темно-ко ричневый растворимый пигмент.

Тип 2 не дает ожижения желатины.

Глюкозный бульон, 27 С:

Тип 1 .растет хорошо на поверхности и под поверхностью раствора и дает растворимый коричневый пигмент.

Тип 2 — то же, что тип 1.

Раствор Каспекса, 27 С:

269820

Фруктоза

Мальтоза

Инулин

Инозитол

Раффиноза

Арабиноза

Галактоза

Ксилоза

Манноза

Рамноза а нзито ч

Салицин

ы об

+++

+++

+++

++

+++

+++

1

Глюкоза

Сахароза

Крахмал

Лактоза

+++

+++

++

++

++

Тип 1 растет хорошо на:поверхности и на дпе раствора и образует на поверхности тонкие пленки вместе с небольшим количеством белого воздушного мпцелия. Не образует растворимого пигмента.

Тип 2 не дает пленок на поверхности.

Образование меланина: оба типа 1 и 2 не образуют.

Восстановление нитратов: оба типа 1 и 2 слегка положительны.

Целлюлозная среда.

На синтетическом,культуральном растворе, содержащем в качестве источника углерода целлюлозу, роста,нет.

Питательный агар (мясо, пептон и глюкоза).

Тип 1 растет хорошо, светло-оливково-желтого цвета, скручен, образует незначительное количество белого воздушного мицелия, который,иногда не образуется. Обратная сто!рона культуры окрашена в белый цвет, тип 1 дает небольшое количество черного растворимого пигмента.

Тип 2 растет хорошо, кремово-желтого цвета без образования воздушного мицелия. Обратная сторона гладкая. Тип 2 подобен типу1 во всех других отношениях.

Лефлеровекая сыворотка, 27 С:

Тип 1 растет хорошо, оливково-желтый цвет, сильно скручен и,не образует мицелия.

Образует черный растворимый пигмент:в небольшом количестве.

Тип 2 — то же, что тип 1.

Лекмусовое молоко, 27 С:

Тип 1 растет, образуя, коричневые кружки на поверхности и не вызывает коагуляции или пептонизации. На 20-й день после начала выращивания рН 4,0 — 5,0.

Тип 2 растет в виде, кружков на поверхности и вызывает постепенную коагуляцию со слабой пептонизацией. На 20-й день после начала выращивания рН 7,8 — 8,0.

I II. Физиологические свойства.

Оптимальные условия для роста: рН 6 — 8 (типы 1 и 2); температура 25 — 30 С (типы 1 и

2); облигатный аэроб (типы 1 и 2).

Критические условия для возможного роста: рН 9 и 4 (тип 1); 10 и 4 (тип 2); температура 18 и 37 С (типы 1 и 2).

Тирозиназа: реакция слабо положительна (типы 1 и 2) .

Пептонизация молока: тип 1 — отрицательна, тип 2 — положительна.

Разложение целлюлозы ооа типа 1 и 2 отрицательны.

Хромогенная функция: слабо положительна и иногда отрицательна.

IV. Использование источников углерода.

Использование источников углерода, определенное по Т. G. Pritham:

Тип 1 Тип 2

Условн е означения:

+++ — хороший рост;

15 ++ — средний рост;

+ — слабый рост.

Как правило, концентрация антибиотиков в культуре достигает максимума через 40—

120 час культивирования. Поскольку это вре20 мя максимальной концентрации зависит от условий аэрации и перемешивания даже при одной и той же температуре и среде, желательно в каждом случае определять это время.

25 Для выделения антибиотиков из культурной среды можно применять обычные физикохимические методы. Например, сначала можно определить мицелий фильтрованием с добавкой способствующего фильтрованию веще30 ства, например кислоты или нейтральной диатомовой земли, затем фильтрат сорбировать на активированном угле при кислом или нейтральном значении рН. Лнтибиотики можно элюировать из активированного угля с помо35 щью растворителя антибиотиков, например смеси воды и смешивающегося с водой растворителя, например метанола, этанола, пропанола, бутанола, ацетанола, ацетона, уксусной кислоты или пиридина. Поскольку поли40 скспны являются амфотерными соединениями, они сор бируются на катионообменной илп анионообменной смолах и алюируются соответствующей кислотой, щелочью или раствором соли. Например, фильтрат культуры пос45 ле подкислення можно пропустить через колонну с Доуекс 50 %Х8 (тип Н). Полиоксины сорбируются на этой смоле и алюируются с нее водным раствором 5 /О-ного хлористого натрия или фосфатным буфером рН 4,3. По50 лученный таким образом сырой порошок полиоксинового комплекса можно очистить хроматографией на колонке с помощью ионообменника, например сульфоэтилсефадекса, сульфоэтилцеллюлозы или сульфометилцеллюлозы, или способом зонного электрофореза.

Полное разделение полиоксинов J, К и может быть достигнуто распределительной хроматографией на порошке целлюлозы или

60 на силикагеле. Ее осуществляют соответствующим растворителем, например смесью воды и смешпвающегося с водой растворителя — метанола, этанола, пропанола, бутанола, ацетона, уксусной кислоты, пиридина или 75%-ного

65 фенола. В этом случае полиоксины J, К и L

269820 элюируют вместе с другими полиоксинами и р а з дел я ют.

При перекристаллизации из водного спирта полиоксины J, К и 1:получают раздельно i« виде бесцветного порошка. Ниже приводятся физико-химические свойства полиоксинов J, К и L.

Температура,разложения: хотя полиоксины

J, К и L»e дают точной температуры разложения, очевидно, что они постепенно разла- 10 гаются без плавления при температуре выше

200 C.

Элементарный состав: вес.

JС41,,71 Н 5,25 N 13,90

К С 44,25 Н 5,07 N 13,92 15

1 С 40,45 Н 5,09 N 14,37

Остальное кислород.

Молекуляр ный вес: J, К и 1 являются амфотерными соединениями, их молекулярный вес определяют титрованием их эквивалент- 20 ных весов: J 499; К 590; N 495.

Брутто-формула — J: С,H);N.-Oä,. К:

: C H NgOд, 1: CggHggNзO„.

Содержание элементов, высчитанное из молекулярного веса: 25

J для ClzH2aN50gs.

Вычислено, %: С 41,55; Н 5,13; N 14,25; мол. в. 491,41.

К для CnHaoNeOn.

Вычислено, %: С 45,05; Н 5,16; N 14,33; 30 мол. в. 586,53.

L для СыНгз1ЧзО, Вычислено, о/ : С 40,26; Н 4,86; N 14,67; мол. в. 477,40.

Удельное оптическое вращение: J (а) — 35

+31,7 (С=l В ВОДе), К (Q)p — 165 (С= l в воде), 1 (и), +34,4 (С= l в воде).

Ультрафиолетовый спектр поглощения для

J, К и 1 максимум при:

J:0,05 NHC 3,,ДД., =264 ммк (E,",", 158)

0,05N NaOH Х„„„. =267 ммк (Есм 133)

К:0)05N НС! 3, =259 ммк (ГС„138)

0,05N NaOH Х„„, =262 ммк (Е„", 109)

1: 0,05N НС1 Х „,=259 ммк (Е,170)

0,05N NaOH Л„„„=262 ммк (F,132).

В результате исследований выяснено, что поглощение для J происходит вследствие наличия в молекуле хромофора тимина. и что 50 поглощен

Инфракрасный спектр поглощения: инфракрасные спектры поглощения для J, К и измерены на таблетках бромистого калия.

Основное поглощение идет при длинах волн:

J 3300 †34, 1680, 1600, 1475, 1408, 1350, 1278, 1125, 1060, 783, 572 см >, К 3300 †34, 1690, 1640, 1470, 1378, 1315, 1283, 1127, 1058, 780, 565 см ; L 3300 †34, 1670, 1600, 1460, 1412, 1350, 1275, 1120, 1060, 770, 570 см

Величины Rf определены путем проявления системой растворителей бутанол †укс«ая Кислота — вода (4: 1; 2) с помощью фильтро- 65

8 вальной бумаги N51 (Тойо Роси КО): J 0,08;

К 0,22; L 0,08. В этом случае .величина Rf для

А в качестве стандарта равна 0,19.

Растворимость: J, К и 1 легко растворимы в воде, но трудно растворимы в мета ноле, этаноле, ацетоне, хлороформе, бензоле и эфире.

Цветные реакции: J, К, 1 дают положительную нингидринную и диазо-реакции и реакцию Tollens и отрицательную реакцию Fehling на 2,4-динитрофенилгидразин, Molish, нитропрусид натрия хлористого железа и на реакцию Sakaguchi.

Величина Рк: J, К, 1 являются амфотерными соединениями, каждое из них имеет .по три титруемые группы. Их величины Рк равны: J 3,0; 7,1; 9,9; К 3,0; 7,2; 9,3; 1 3,0; 7,1; 9,4.

Стойкость: J, К и 1 несколько нестойки в щелочных растворах, но черезвычайно стойки в кислых и нейтральных растворах. При нагревании при 100 С в течение 15 мин не происходит разложения при рН от 2,0 до 7,0.

J, К и L также стойки к ультрафиолетовому освещению. Их фунгицидное действие сохраняется после облучения;растворов на расстоянии 30 см ультрафиолетовой лампой мощностью 20 or в течение 24 час.

Ниже описана биологическая активность полиоксинов J, К и L.

Антимикробные спектры. В табл. 1 показан антимикробный спектр полиоксинов J, К и L.

Минимальную подавляющую концентрацию определяют через 48 час инкуби рования в среде из ка ртофельно-сахарозного агара указанных микроорганизмов.

Эффективность: полиоксины J, К и L высокоэффективны против Alternaria kikuchiana, Cladosporium fulvum, Gugnardia laricina, Cochliobolus miyabeanus, Sclегоtinia cinerea.

Фитотоксичность и токсичность. При испытаниях на растениях риса и различных растениях полиоксины J, К и 1 нефитотоксичны в концентрации 200 ч./млн. и выше. Следов фитотоксичности не обнаружено даже при концентрации 800 ч./млн. на растениях .риса и концентрации 200 ч./млн для других растений, например яблони, груши и томатов.

При испытании на токсичность «а мышах полиокси ны J, К и L нетокси;ны: при внутрен.нем влиянии 500 мг/кг, пр«приеме внутрь

15 г/кг.

П ри испытании на токсичность на кроликах растворы 400 мг/мл не давали раздражения при введении в коньюгтивный мешочек кролика.

Не обнаружено кожной токсичности.

При испытании на токсичность на рыбах полиоксины J, К и 1 при концентрации

10 ч./млн нетоксичны,при экспозиции в течение 75 час.

Суммируя вьппеуказанное, можно сказать, что полиоксины J, К и 1 являются антибиотиками с предохранительными и лечебными свойствами и эффективны проТНВ различных болезней, вызываемых фитопатогенами, без

269820

Таблица 1

Минигиааbuàÿ подавляющая концентрация мкг, мл

Тест-обьект

6,25

12,5

1,56 100

6,25

12,5

6,25

12,5

6,25

6,25

1,56

3,12

3,12 (50

3,12

1,56

1.56

12,5

1,56

>50

50 (50

50 50

50 50

50 50

50, 50

50, 50

50 50

50 50

50 50

50 50

50 50

50 50

50 . 50

>50, )50

50 50

50 50

50 50

50 50

50 50

50 50

50 50

50 50

Антимикробньй спектр пояиоксинов 1, К и 1

Alternaria kikuchiana

Cochliobolus miyabeanus

Pellicularia sasakii

P iricularia or yzae

Gugnardia laricina

Corticium rolfsii

Sclегоtinia cinerea

Cladosporium fulvum

-Ielminthosporium sigmoideum

Trichophyton astегоides

Trichophyton interdigitaiis

Trichophyton rubrum

Candida albicans

Candida tropical is

Candida crusei

Cryptococcus neoformoins

Aspergillus furniga (us

Aspergillus terreus

lucor racemosus

Nocardis astегоides

Trichomonas vaginalis

Staphylococcus аигеиа 209 р

Мicrococcus luteus

Bacillus subtilis

lycobacterium smegmatis

iiiycobacterium 607

Mycobacterium phlei

Mycobacterium ECG

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Serratia marscens

Proteus vu1 gari s

Xanthomonas oryzae фитотокспчного и токсичного действия. Эти антибиотики полезны в качестве ссльскохозяй ственных фунгицидов для защиты растений.

Пример 1. Готовят культу римо среду следующего состава, г: глюкоза 15 крахмал 50 соевая мука 20 сульфат аммония 5 сухие дрожжи 10 хлористый натрий 5 карбонат кальция 2 вода 1000 мл рН среды доводят до 7,6 и стерилизуют при температуре 120 С в течение 20 мин.

Штамм S. cacaoi var. asoensis, тип 1, АТСС

19093 вносят в питательную среду и ферментируют в ней при 27 С при перемешивании, которое продолжают до достижения максимального выхода антибиотиков. Проводят анализ, используя в качестве тест-организмов

Allernaria Kikuchiana, Cochliobolns rniyabeanus. При выращивании S. cacaoi var. asoensis, тип 1 в 300 мл колбе Эрленшейера, содержащей 70 мл среды, максимальный выход достипнут через 72 — 96 час. При внесении выращенного бульона в течение 48 час в фермента5

65 ционный резервуар, содержащий 400 л такой же среды, и ферментации при,перемешцвапии со скоростью 200 об)мпн и аэрации 400 л/мин получают максимум антибиотика через 96—

120 час ферментации.

Выход 1800 икг/мл в пересчете на полиоксин В.

Выделение и очистку проводят следующим образом.

430 л фсрментированиого бульона подкисляют до рН 2,0 !О e-ной соляной кислотой, затем нагревают до 70 С и добавляют 9 кг диатомовой земли, затем фильтруют на фильтр-прессе. Фильтрат обрабатывают 8:.г акrnâèðoваиного угля и 8 кг диатомной земли. перемешивают и фильтруют. Лктивироваииый уголь промывают 350 л воды. Активные составляющие элюируют дважды по 100 л

60% -ного, водного ацетона. Элюированный раствор выпаривают в вакууме. Таким образом, получают 4 л жидкости. содержащсй н жньш проди кт.

Добавляют 50 л ацетона, полученный осадок сушат при пониженном давлении и получают 920 г сырого порошка коричневого цвета. 300 г этого порошка растворяют в воде и подкисляют до рН 2.0. Подкисленный раствор пропускают через колонку, заполненную 4,5 л

Доуекс %Х8 (50 — 100 меш, форме Н). После промывания водой антибиотики элюируют

5а/,-ным водным раствором хлористого натрия.

Активные элюаты собирают и обрабатывают активированным углем для удаления неорганических солей. После упаривания элюатов после обработки угля получают 60 г свстлокоричневого порошка.

Его снова хроматографируют на Лоуекс

%Х8. Порошок растворяют в О,! М раствор фосфатного оуфера (рН 2.0) и сорбируют колонкой, заполненной 2 л Доуекс 50 iiA Х8 (100 †2 меш), которая была оуферироваиа фосфатным буфером (рН 2,0), Антибиотики элюируют О,! М фосфатным буфером (рН

4,3). Активные элюаты обрабатывают углем для мдаления неорганических солей. Получают 35 г светло-желтого порошка. Его очищают хроматографически с помощью сульфоэтилсефадекса, представляющего собой сильно кислую ионообмсииую смолу сульфоэтильного типа. Этот порошок помещают в 50 г колонку с сульфоэтиaccфедексом (SE — С вЂ” 25), заранее промытую буферным 0.01 Ч фосфатиым буфером (рН 2,0). Антибиотики элюируют последовательно, повышая концентрацию буфера до 0,1 М. Таким образом получают 18 г очищенного белого порошка полиок:инового комплекса.

Разделяют полиоксины J, K и 1 счсдующим ооразом.

Полу nеHHbIÉ пол HoкcilHоabln i

4 — Cl (-100 — 200 мсш.) ..

Выходящий раствор соединяют с водными промывками. Полученный раствор уиаривают

269820

20

В-00 !

COHNCU

Н ХСН

1 нСОН

25 он он

65 под пониженным давлением, и получают 10 г белого порошка, представляющего собой смесь полиоксинов Л, В, С, Н, J, К и L. (В этом, случае полиоксины D, E u F сорбируются на смоле).

Для,разделения полиоксинов J, К и 1 применяют «роматографирование на колонке с целлюлозой. Используют распределителыную хроматографию на колонке с целлюлозой (55 — 100 мм) с помощью системы растворителей бутанол — уксусная кислота — вода (4: 1:

: 2). Сначала элюируют полиоксин Н, затем полиоксины К, А, J, 1 и В.

Если они не по.тностью разделились, то снова проводят хроматографирование на колонке с целлюлозой с помощью 75%.-ного фекола в качестве растворителя для полного разделения полиоксинов J, К и L.

Из 10 г полиоксинового,комплекса получают 0,1 г полиоксина J; 0,06 г полиоксина К и

0,08 г полиоксина L.

Наконец, проводят кристаллизацию из водного этанола. Полиоксины J, К и 1 получают в виде бесцветного порошка.

Пример 2, Готовят культуральную среду следующего состава, г: саха роза 60 глюкоза 15 сухие дрожжи 35 соевая мука 15 фосфат калия 2 карбонат кальция 4 вода 1000 мл рН среды не регулируют и ведут ферментацию по примеру 1. Концентрация полиоксина достигает 3 мг/мл в пересчете на активность полиоксина В через 72 — 96 час после инокуляции штаммом типа 1.

При использовании в качестве испытательного микроорганизма Alternaria kikuchiana выход составляет 300 мкг/мл в пересчете,а полиоксин В.

Полиоксины J, К и 1 выделяют из питательной среды по примеру 1. Выход: полиоксин J

0,5 г, полиоксин К 0,3 г и полиоксин 1 0,4 г из

28 г полиоксинового .комплекса.

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, г: растворимый крахмал 70 глюкоза 5 соевая мука 15 хлористый натрий 2 карбонат кальция 4 вода 1000 мл рН среды доводят до 7,0 и ведут ферментацию по примеру 1, за исключением того, что проводят инокуляцию штаммом типа 2 (АТСС 19094) .

Концентрация полиоксинов достигает

7 мг/мл в пересчете на активность полиоксина В за время от 72 до 96 час после ичокуляции среды.

Выход 7000 мкг/мл в пересчете на полиоксин В при испытании на микроорганизме

Alternaria 1<11 I ciIiana, Полиокси ны J, К и 1 выделяют из питательной среды по примеру 1. Выход: полиоксин J

1,2 г, полиоксин К 0,65 г и полиоксин L 0,8 г из 62 г полиоксинового комплекса.

Предмет изобретения

1. Способ получения антибиотиков, включающий культивирование гриба-продуцента из класса Streptomyces .на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных элементов, при температуре предпочтительно 25 — 35 С в течение времени, достаточного для достижения максимального выхода готовых, продуктов, и выделение последних, отличающийся тем, что, с целью получения комплекса |полиоксинов J, К и 1 общей формулы! носн!

СН,OCON Н 2 в:кото рой R —.гидроксил, когда n= 1 или 0;

СООН и R означает 011 - СН = N— когда n=0; в качестве гриба-продуцента берут Streptomyces cacaoi Var. asoeIIsis штаммы АТСС 19093 и АТСС 19094, и полученную смесь полиоксинов J, К и 1 разделяют.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирова|ние штаммов АТСС 19093 и

АТСС 19094 ведут в аэробных условиях глубинным методом при перемешивании питательной среды.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют крахмал, декстрины, глюкозу, глицерин, мальтозу и фруктозу.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качест1ве источ ника азота применяют мясные экстракты, пептон, кукурузный экстракт, соевую муку, размолотый арахис, хлопковый жмых и дрожжи.

5. С пособ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника минеральных элементов берут хлористый натрий, хлористый калий, карбонат кальция и фосфаты.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что разделение полиоксинов J, К и L производят с помощью хроматографии "на,колонках с целлюлозой с использованием смеси растворителей бутанола, уксусной кислоты и воды.

7. Спосоо по п. 6, отличающийся тем, что растворители берут соответственно в соотношении 4:1:2,