Штаммы вида streptococcus pneumoniae (варианты) и способ получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью



Штаммы вида streptococcus pneumoniae (варианты) и способ получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью
Штаммы вида streptococcus pneumoniae (варианты) и способ получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью
Штаммы вида streptococcus pneumoniae (варианты) и способ получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью
Штаммы вида streptococcus pneumoniae (варианты) и способ получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью
Штаммы вида streptococcus pneumoniae (варианты) и способ получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью

 


Владельцы патента RU 2601158:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) (RU)

Заявленная группа изобретений относится к области иммунологии. Штаммы вида Streptococcus pneumoniae депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационными номерами 296, 297, 298. Данные штаммы обладают внутривидовой перекрестной протективной активностью и могут быть использованы для получения белоксодержащих фракций. Предложен способ получения белоксодержащих фракций из указанных штаммов для разработки пневмококковых вакцин. Для этого штамм культивируют, микробные клетки отделяют микрофильтрацией, инактивируют диметилкетоном с последующей водной экстракцией и ультрафильтрацией до получения белоксодержащей фракции с молекулярной массой 30-100 кДа и лиофильным высушиванием. Получают эффективные препараты с внутривидовой иммуногенной активностью в отношении соответствующих серотипов S. pneumoniae, которые могут быть использованы в качестве противопневмококковой вакцины широкого спектра действия. 4 н.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и иммунологии, в частности к методам получения белоксодержащих фракций, предназначенных для разработки противопневмококковых вакцин с внутривидовой иммуногенной активностью.

Известен способ получения вакцины на основе капсульных полисахаридов этиологически значимых серотипов Streptococcus pneumoniae. Современная полисахаридная пневмококковая вакцина содержит набор капсульных полисахаридов, полученных из 23 серотипов пневмококка. Многолетние наблюдения подтвердили эффективность и безопасность 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакцины. Несмотря на это за последние годы выявлены серьезные недостатки: отсутствует выраженный бустерный эффект при ревакцинации, что свидетельствует о недостаточном развитии иммунологической памяти; недостаточная эффективность у детей до 2-х лет и некоторых других групп риска; вакцинация не предупреждает бактерионосительства и формирования антибиотикорезистености штаммов и не защищает от приобретающих значимость бескапсульных штаммов [Клинико-иммунологические аспекты применения поликомпонентной пневмококковой вакцины «Пневмо 23» у детей с атопической бронхиальной астмой. Методические рекомендации МЗ РФ. Владивосток, 2004; Reinert R.R. Pneumococcal conjugate vaccines - a European perspective. Int. J. Med. Microbiol. 2004; 294(5):277-294; Харит С.М. Пневмококковые вакцины. В кн.: Вакцины и вакцинация: национальное руководство. Под ред. В.В. Зверева, Б.Ф. Семенова, P.M. Хаитова. М.: ГОЭТАР-Медиа, 2011; 880 с.]. Кроме того, технологический процесс приготовления и контроля этой вакцины сложен, трудоемок, что определяет высокую стоимость вакцины.

Наличие существенных недостатков 23-валентной пневмококковой вакцины вызвало интерес к разработке других направлений конструирования пневмококковых вакцин: на основе поверхностных белков, бескапсульных штаммов, ДНК-вакцин, использования адъювантов. Наиболее результативным оказался метод конъюгации полисахаридов с протеинами. Такой метод способствует переключению иммунного ответа на Т-зависимый даже у детей первых месяцев жизни и формированию Т- и В-клеточной памяти [ Cohen A., Fridkin М., Cohen I.R. Self heat-shock protein (hsp60) peptide serves in a conjugate vaccine against a lethal pneumococcal infection. J. Infect. Dis. 1999; 179:403-413; Nurkka A., Ahman H., Korkeila N. et al. Serum and salivary anti-capsular antibodies in infants and children immunized with the heptavalent pneumococcal conjugate

vaccine. Pediatr. Inf. Dis. J. 2001; 20:25-33; Wuorimaa T., Kayhty H., Eskola J. et al. Activation of cell-mediated immunity following immunization with pneumococcal conjugate or polysaccharide vaccine. Scand. J. Immunol. 2001; 53:422-428].

В настоящее время выпускается коммерческий препарат «Превенар», в котором в качестве белка-носителя используют рекомбинантный дифтерийный анатоксин (CRM197), конъюгированный с капсульными полисахаридными антигенами пневмококка. В состав вакцины в качестве адъюванта входит алюминия фосфат. Широкие исследования, проведенные в различных регионах мира, свидетельствуют о безопасности и иммуногенности этого препарата. Установлено, что в популяции в результате иммунизации снижается циркуляция штаммов, серотипы которых входят в вакцину. Однако при этом ряд исследователей отмечают возрастающую роль других серотипов, что приводит к изменению спектра циркулирующих серотипов пневмококка, в том числе в сторону появления высоковирулентых штаммов [Pelton S.I., Huot Н., Finkelstein J.A. et al. Emergence of 19A as virulent and multidrug resistant pneumococcus in Massachusetts following universal immunization of infants with pneumococcal conjugate vaccine. Pediatr. Infect. Dis. J. 2007; 26(6):468-472; Poland G.A. The prevention of pneumococcal disease by vaccines: promises and challenges. Infect. Dis. Clin. Nort. Am. 2001; 15:97-122; Hicks L.A., Harrison L.H., Flannery B. et al. Incidence of pneumococcal disease due to non-pneumococcal conjugate vaccine (PCV7) serotypes in the United States during the era of widespread PCV7 vaccination, 1998-2004. J. Infect. Dis. 2007; 196:1346-1354; Протасова И.Н., Бахарева H.B., Перьянова O.B., Елистратова Т.А., Коваль М.В. Смена серотипов Streptococcus pneumoniae у детей, вакцинированных 7-валентной конъюгированной вакциной. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2014; 5(78):67-71].

Возможно также изменение микробного пейзажа и за счет других этиологически значимых видов возбудителей заболеваний респираторного тракта. Кроме того, такая вакцина неактивна в отношении бескапсульных штаммов и так же, как и неконъюгированные, не защищает от носительства. В связи с этим высокоприоритетным является создание безопасной эффективной имеющей приемлемую стоимость противопневмококковой вакцины на основе белоксодержащих фракций пневмококка с внутривидовой перекрестной протективной активностью.

Целью данного изобретения являются штаммы Streptococcus pneumoniae и способ получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью.

1) штамм S. pneumoniae серотипа 6В, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ

«Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 296, LD50 5×105 микробных клеток (п. 1).

2) штамм S. pneumoniae серотипа 10А, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 297, LD50≥109 микробных клеток (п. 2).

3) штамм S. pneumoniae серотипа 19F, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 298, LD50>109 микробных клеток (п. 3).

4) способ получения из штаммов п. 1, п. 2, п. 3 протективных белоксодержащих препаратов, обладающих внутривидовой противопневмококковой иммуногенной активностью (п. 4).

Поставленная цель достигается путем использования штаммов S. pneumoniae серотипов 6В п. 1, 10А п. 2, 19F п. 3, белоксодержащие антигены которых обладают высокой внутривидовой иммуногенной активностью. Белоксодержащие антигены из этих штаммов выделяют технологически простым способом (п. 4) путем микрофильтрации для отделения микробных клеток, инактивации микробной массы диметилкетоном с последующей водной экстракцией, ультрафильтрацией и лиофильным высушиванием.

П. 1. Штамм S. pneumoniae серотипа 6В выделен от больного в г. Москве в 2005 г. в ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 296.

Морфологические свойства: кокки располагаются парами и короткими цепочками, неподвижен, имеет выраженную капсулу, грамположительный. Жгутиков не имеет. Спор не образует. По Грамму окрашивается положительно. Растет на жидких и твердых питательных средах; на сывороточном и кровяном агаре; через 24 ч инкубации образует мелкие (0,3-0,5 мм) сероватые несливающиеся колонии. На жидких средах - диффузное помутнение.

Ферментативная активность: штамм расщепляет до кислоты без газа глюкозу, мальтозу, галактозу и др., не продуцирует оксидазу и каталазу, чувствителен к оптохину, желчи и желчно-кислым солям. Обладает гемолитической активностью.

Чувствительность к антибиотикам: чувствителен к цефуроксину, ципрофлоксацину, азитромицину, кларитромицину, амоксициллину, эритромицину, нефелину. Устойчив к гентамицину. Гомо- и гетерологичными фагами не лизируется.

Вирулентность: LD50 при внутрибрюшинном введении мышам составляет 5×105 микробных клеток.

Антигенные свойства: агглютинируется сывороткой капсульного серотипа 6 и факторной сывороткой 6с. При электрофорезе белковые антигены штамма образуют полосы с молекулярной массой 31, 35, 43 и 60 кДа (Рис. 1). Отличительной особенностью штамма S. pneumoniae серотипа 6В регистрационный номер в коллекции ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 296 является наличие антигенов с внутривидовой антигенной и протективной активностью (табл. 3 и 4), что позволяет считать его кандидатным вакцинным штаммом.

Хранится в лиофильно высушенном состоянии при температуре 3-5°С.

Размножают штамм на плотной (кровяной или сывороточный агар) и жидкой сердечно-мозговой среде при температуре 37°С с 5% СО2 при рН 7,6-7,8.

П. 2. Штамм S. pneumoniae серотипа 10А выделен от больного в г. Москве в 2006 г. в ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 297.

Морфологические свойства: кокки располагаются парами и короткими цепочками, неподвижен, имеет выраженную капсулу, грамположительный. Жгутиков не имеет. Спор не образует. По Грамму окрашивается положительно. Растет на жидких и твердых питательных средах; на сывороточном и кровяном агаре; через 24 ч инкубации образует мелкие (0,3-0,5 мм) сероватые несливающиеся колонии. На жидких средах - диффузное помутнение.

Ферментативная активность: штамм расщепляет до кислоты без газа глюкозу, мальтозу, галактозу и др., не продуцирует оксидазу и каталазу, чувствителен к оптохину, желчи и желчно-кислым солям. Обладает гемолитической активностью.

Чувствительность к антибиотикам: Чувствителен к цефуроксину, ципрофлоксацину, азитромицину, кларитромицину, амоксициллину, эритромицину, нефелину. Устойчив к гентамицину. Гомо- и гетерологичными фагами не лизируется.

Вирулентность: LD50 при внутрибрюшинном введении мышам составляет ≥109 микробных клеток.

Антигенные свойства: агглютинируется сывороткой капсульного серотипа 10 и факторной сывороткой 10с. При электрофорезе белковые антигены штамма образуют полосы с молекулярной массой 31, 35, 43 и 60 кДа (Рис. 1). Отличительной особенностью штамма S. pneumoniae серотипа 10А регистрационный номер в коллекции ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 297 является наличие антигенов с внутривидовой антигенной и

протективной активностью (табл. 3 и 4), что позволяет считать его кандидатным вакцинным штаммом.

Хранится в лиофильно высушенном состоянии при температуре 3-5°С.

Размножают штамм на плотной (кровяной или сывороточный агар) и жидкой сердечно-мозговой среде при температуре 37°С с 5% СО2 при рН 7,6-7,8.

П. 3. Штамм S. pneumoniae серотипа 19F выделен от больного в г. Москве в 2006 г. в ФГБУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 298.

Морфологические свойства: кокки располагаются парами и короткими цепочками, неподвижен, имеет выраженную капсулу, грамположительный. Жгутиков не имеет. Спор не образует. По Грамму окрашивается положительно. Растет на жидких и твердых питательных средах; на сывороточном и кровяном агаре; через 24 ч инкубации образует мелкие (0,3-0,5 мм) сероватые несливающиеся колонии. На жидких средах - диффузное помутнение.

Ферментативная активность: штамм расщепляет до кислоты без газа глюкозу, мальтозу, галактозу и др., не продуцирует оксидазу и каталазу, чувствителен к оптохину, желчи и желчно-кислым солям. Обладает гемолитической активностью.

Чувствительность к антибиотикам: Чувствителен к цефуроксину, ципрофлоксацину, азитромицину, кларитромицину, амоксициллину, эритромицину, нефелину. Устойчив к гентамицину. Гомо- и гетерологичными фагами не лизируется.

Вирулентность: LD50 при внутрибрюшинном введении мышам составляет >109 микробных клеток.

Антигенные свойства: Агглютинируется сывороткой капсульного серотипа 19 и факторной сывороткой 19b. При электрофорезе белковые антигены штамма образуют полосы с молекулярной массой 31, 35, 43 и 60 кДа (Рис. 1). Отличительной особенностью штамма серотипа 19F регистрационный номер 298 является наличие антигенов с внутривидовой антигенной и протективной активностью (табл. 3 и 4), что позволяет считать его кандидатным вакцинным штаммом.

Хранится в лиофильно высушенном состоянии при температуре 3-5°С.

Размножают штамм на плотной (кровяной или сывороточный агар) и жидкой сердечно-мозговой среде при температуре 37°С с 5% СО2 при рН 7,6-7,8.

Вирулентность исследованных штаммов S. pneumoniae представлена в таблице 2. Значения этого показателя в зависимости от штамма существенно отличаются от LD50 - 102-104 у наиболее вирулентных штаммов серотипа 3 до более 109 у большинства исследованных штаммов, в том числе являющихся объектом данного изобретения.

П. 4. Способ получения белоксодержащей фракции бактерий S. pneumoniae, обладающей внутривидовой протективной активностью, включает:

- раздельное культивирование штаммов S. pneumoniae серотипов 6В, 10A, 19F по пп. 1, 2, 3 соответственно;

- отделение микробных клеток от культуральной среды с помощью микрофильтрации через полисульфоновые мембраны УПМ-20, «Владипор», Россия;

- инактивация и высушивание микробной массы диметилкетоном;

- водная экстракция и получение декантата путем центрифугирования при 7000 об/мин в течение 40 мин;

- ультрафильтрация водного экстракта через фильтры Vivaflow (Германия) с порогом отсечения белков с молекулярной массой до 30 кДа и более 100 кДа до получения белоксодержащей фракции каждого штамма с молекулярной массой 30-100 кДа с последующим ее лиофильным высушиванием.

После лиофильного высушивания препараты, полученные из трех заявленных штаммов, содержат 48-53% белка и 6-8% углеводов (табл. 1). В препаратах, полученных из штаммов S. pneumoniae серотипов 6В, депонированого в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП») под регистрационным номером 296; 10А, депонированного в ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» под регистрационным номером 297, и 19F, депонированного в ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» под регистрационным номером 298, в электрофорезе выявляются практически одинаковые по молекулярной массе белковые компоненты: 60, 43, 35 и 31 кДа (рис. 1). Во взятом для сравнения высоковирулентном штамме S. pneumoniae серотипа 3 авторский номер 112 эти показатели отличаются: 55, 48, 35 и 31 кДа.

Преимущество изобретения заключается в получении эффективного белоксодержащего препарата с внутривидовой перекрестной протективной активностью в отношении S. pneumoniae, что обеспечивается использованием в конструкции вакцины Т-зависимых белоксодержащих антигенов S. pneumoniae и полисахаридных компонентов с адъювантной активностью. Технология получения белоксодержащих препаратов существенно упрощена за счет использования 3-х штаммов S. pneumoniae и технологически простого метода выделения антигенных компонентов.

Пример осуществления способа

Для приготовления белоксодержащей фракции используют штамм S. pneumoniae серотипов 6В ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 296, 10А ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 297, 19F ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 298.

Все этапы приготовления препаратов п. 4 производятся с каждым штаммом раздельно в одинаковых условиях. Лиофильно высушенные штаммы, например 6В ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 296, высевают из ампулы с культурой на пробирку с бульоном на сердечно-мозговом экстракте (состав среды: сердечно-мозговой экстракт - 3,5 г; пептический перевар животной ткани - 15 г; панкреатический гидролизат казеина - 10 г; декстроза - 2 г; хлорид натрия 5 г; двухзамещенный фосфат натрия 2,5 г - производство «Becton, Dickinson and Company Sparks», США), инкубируют в течение 4-6 ч при температуре 37°С, например в термостате "Binder" (Германия), пересевают в чашки Петри с агаром, содержащим 5% донорской крови, и инкубируют 18-20 ч при 37°С с 5% СО2 при рН 7,6-7,8; смывают выросшую культуру 0,9%-ным раствором натрия хлорида и стандартизуют по ОСО мутности 42-28-85-11 П (10МЕ) ФГБУ «НЦ ЭСМП. В реактор, например «АНКУМ-2М» (ИБП РАН г. Пущино) с рабочим объемом 10 л заливают 5 л сердечно-мозговой среды (190 г сухой среды растворяют в 5 л дистиллированной воды, кипятят 1 мин до полного растворения и стерилизуют автоклавированием 15 мин при 121°С, рН 7,4±0,2) и засевают выросшей посевной культурой из расчета 1×109 микробных клеток/мл среды. Культуру подращивают в реакторе при 37°С в течение 1,5-2 ч до удвоения количества клеток до 2×109 микробных клеток/мл. Затем в реактор добавляют 5 л сердечно-мозговой среды и осуществляют процесс культивирования при непрерывном перемешивании и подаче воздуха в течение 5-7 ч до завершения фазы экспоненциального роста. Микробную массу отделяют от среды культивирования с помощью микрофильтрации через полисульфоновые мембраны УПМ-20, «Владипор», Россия с диаметром пор 0,22 мкм. Микробные клетки смывают с мембраны обратным током 1 л стерильной дистиллированной воды. Количество полученной микробной массы составляет примерно 22000×109 микробных клеток. Микробные клетки инактивируют путем трехкратной обработки с интервалом 10-18 ч тройным объемом диметилкетона. Последнюю порцию диметилкетона сливают, клетки выкладывают на лоток, подсушивают при периодическом перемешивании и оставляют в холодильнике при 4°С на 24-48 ч. Полученную сухую инактивированную микробную массу подвергают трехкратной экстракции дистиллированной водой из расчета 80 мл воды на 1 г микробной массы. Экстракцию проводят в течение 40 мин при 7000 об/мин на центрифуге, например "Jouan" (Франция). Декантат подвергают ультрафильтрации, используя фильтрационную установку, например, "MasterFlex" (Германия) с фильтрами, например Vivaflow (Германия) с порогом отсечения белоксодержащих антигенов с молекулярной массой до 30 кДа и более 100 кДа. Полученную фракцию подвергают лиофильному высушиванию в сушильной машине, например, "BETA 16" (Германия) в течение 24 при контролируемом режиме высушивания. В сухом антигенном препарате определяют содержание белка методом Лоури и молекулярную массу белоксодержащих антигенов, которая должна находиться в пределах 30-100 кДа. Определение молекулярной массы проводят с помощью электрофореза, используя, например, систему электрофореза с иммуноблотом и документации в геле - Gel Doc XR (BioRad, США).

Аналогично поступают со штаммами S. pneumoniae серотипов 10А ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 297 и 19F ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 298.

В экспериментальных условиях на модели септической пневмококковой инфекции у мышей обоснована протективная внутривидовая активность препаратов, полученных указанным способом, из каждого заявленного штамма (табл. 3).

В этих опытах мышей линии BALB/c массой 14-16 г, 2-кратно иммунизированных препаратами, полученными из каждого из заявленных штаммов, внутрибрюшинно разовой дозой 100 мкг/мышь заражали только теми гетерологичными штаммами, у которых пятидесятипроцентная летальная доза (LD50) составляла менее 109 микробных клеток. Высоковирулентные штаммы для получения протективных белоксодержащих антигенов не предлагаются, но они использованы в опытах активной защиты мышей, иммунизрованных препаратами, приготовленными по предлагаемой технологии (табл. 3). Из данных таблицы 3 видно, что препараты, полученные из штаммов пневмококка серотипов 6В ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 296, 10А ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 297, 19F ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 298, защищали мышей от наиболее вирулентных штаммов серотипов 3, то есть в этих опытах была выявлена существенная перекрестная защита против наиболее вирулентных серотипов S. pneumoniae.

Антигенную активность препаратов, полученных из каждого отдельно взятого депонированного или авторского штамма, определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). На дно лунок планшета "Biomedicals", Россия вносили исследуемые препараты в концентрации 1 мкг/лунка и определяли их способность связывать антитела, содержащиеся в мышиных сыворотках. Сыворотки, полученные путем пятикаратной иммунизации мышей увеличивающимися дозами живых микробных клеток каждого штамма с интервалом 7-14 суток, начиная с дозы, не вызывающей гибели мышей (таблица 4). В качестве контрольного препарата, сорбированного на твердой фазе, использован синтетический гексасахарид, отражающий фрагмент цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с бычьим сывороточным

альбумином (БСА) [Сухова Е.В., Яшунский Д.В., Цветков Ю.Е., Курбатова Е.А., Нифантьева Н.Э. Синтез олигосахаридных фрагментов капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae тип 14 и их неогликоконъюгатов с бычьим сывороточным альбумином. Известия Академии наук. Серия химическая. 2014; 2:511-521]. Из этих данных видно, что капсульный полисахарид взаимодействует только с гомологичной сывороткой к штамму серотипа 14 авторский номер 125. Препараты из бескапсульного штамма авторский номер 36 и из наиболее вирулентных штаммов серотип 3 авторские номера 311 и 112 выявляли в исследованных сыворотках невысокий уровень антител. Препараты, полученные тем же методом, из серотипов 6В регистрационный номер 296, 10А регистрационный номер 297, 19F регистрационный номер 298, обладали перекрестной активностью и выявляли во всех исследованных сыворотках высокий уровень антител. Эти антитела были не к капсульному полисахариду, поскольку синтетический капсульный полисахарид серотипа 14 даже в гомологичной системе их не выявлял, а препараты из этого же серотипа, полученные по заявляемому методу, выявляли антитела, хотя и в меньшем титре, по сравнению с препаратами из штаммов серотипов 6В ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 296, 10А ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 297, 19F ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 298, детектирующие наиболее высокий уровень антител как в гомологичных, так и в гетерологичных сыворотках. Эти данные подтверждают наличие внутривидовой перекрестной антигенной активности у заявленных штаммов S. pneumoniae и способа получения из них иммуногенных фракций.

Результаты экспериментальных исследований подтверждают целесообразность использования депонированных 3-х штаммов, поскольку при исследовании протективной активности (табл. 3) препараты, полученные из них, защищали мышей от заражения двумя наиболее вирулентными штаммами. Препараты из штаммов серотипов 6В ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 296 и 10А ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 297 защищали также от серотипа 14 авторский номер 125. Внутривидовая перекрестная иммуногенная активность подтверждается также тем, что эти же препараты, сорбированные на твердой фазе в ИФА (табл. 4), выявляли высокий уровень антител в антимикробных сыворотках, полученных к ряду гетерологичных серотипов S. pneumoniae. Однако препарат из штамма серотипа 19F ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» 298 выявлял наиболее высокие титры антител как в сыворотке, полученной к гомологичному, так и к гетерологичным штаммам.

Эти эксперименты свидетельствуют о внутривидовой активности против различных серотипов S. pneumoniae каждого из препаратов, полученных по заявляемому способу.

Предлагаемый способ получения протективных белоксодержащих антигенов, обладающих внутривидовой иммуногенной активностью в отношении различных

серотипов S. pneumoniae, позволяет получить препарат, который может быть использован в качестве противопневмококковой вакцины широкого спектра действия или белка-носителя для пневмококковых вакцин, конструируемых на основе капсульных полисахаридов пневмококка. Использование такого препарата может расширить спектр протективной активности полисахаридной вакцины, что позволит уменьшить количество входящих в вакцину капсульных полисахаридов, а также наличие белка в препарате будет способствовать индукции Т-зависимого иммунного ответа и иммунологической памяти у привитых.

1. Штамм Streptococcus pneumoniae серотипа 6В, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 296 как кандидатный для получения белоксодержащей фракции, предназначенной для разработки пневмококковой вакцины.

2. Штамм Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 297 как кандидатный для получения белоксодержащей фракции, предназначенной для разработки пневмококковой вакцины.

3. Штамм Streptococcus pneumoniae серотипа 19F, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 298 как кандидатный для получения белоксодержащей фракции, предназначенной для разработки пневмококковой вакцины.

4. Способ получения белоксодержащей фракции бактерий Streptococcus pneumoniae, обладающей внутривидовой протективной активностью, отличающийся тем, что используют штаммы Streptococcus pneumoniae серотипов 6В, 10А, 19F по пп. 1, 2, 3 соответственно, культивирование каждого штамма проводят раздельно до окончания экспоненциальной фазы роста, микробные клетки отделяют с помощью микрофильтрации, инактивируют микробную массу диметилкетоном с последующей водной экстракцией, отделением декантата центрифугированием и ультрафильтрацией с порогом отсечения белка с молекулярной массой до 30 кДа и более 100 кДа до получения белоксодержащей фракции с молекулярной массой 30-100 кДа и лиофильным высушиванием.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для очистки почвы от загрязняющих веществ. Предложена композиция из 11 штаммов бактерий, способных метаболизировать ароматические нитросоединения и устойчивых к антибиотикам и тяжелым металлам.

Изобретение относится к микробиологии, фармакологии и медицине и может быть использовано для получения диагностического аллергена. Штамм Candida albicans var.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно технологии производства препаратов, предназначенных для очистки почв и воды от нефтезагрязнений. Препарат содержит твердый субстрат-носитель и иммобилизованную на его поверхности биомассу бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 в концентрации 1×109 клеток/см3.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Saccharomyces cerevisiae А-1, обладающий высокой продуктивностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-4066.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Kluyveromyces lactis А-2, обладающий высокой продуктивностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером Kluyveromyces lactis ВКПМ Y-4067.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Enterococcus thailandicus К25 XIV (I), обладающий высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Enterococcus hirae тур Р37 XV, обладающий высокой антагонистической способностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Enterococcus hirae МК 25 37(1) 10, обладающий высокой биологической активностью и высокой скоростью свертывания молока, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером Enterococcus hirae ВКПМ В-11835.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Enterococcus mundtii тур С37III, обладающий высокой антагонистической способностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Enterococcus hirae М25б № 23, обладающий высокой антагонистической способностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для очистки почвы от загрязняющих веществ. Предложена композиция из 11 штаммов бактерий, способных метаболизировать ароматические нитросоединения и устойчивых к антибиотикам и тяжелым металлам.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве кормов для животных, птиц и рыб. Смешанная культура микроорганизмов содержит бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 в соотношении 1:1:1 соответственно.

Изобретение относится к области микробиологии. Способ предусматривает накопление биомассы бледных трепонем в жидкой накопительной питательной среде.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно технологии производства препаратов, предназначенных для очистки почв и воды от нефтезагрязнений. Препарат содержит твердый субстрат-носитель и иммобилизованную на его поверхности биомассу бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 в концентрации 1×109 клеток/см3.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно технологии производства препаратов, предназначенных для очистки почв от нефтезагрязнений. Препарат содержит биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Enterococcus thailandicus К25 XIV (I), обладающий высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Enterococcus hirae тур Р37 XV, обладающий высокой антагонистической способностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Enterococcus hirae МК 25 37(1) 10, обладающий высокой биологической активностью и высокой скоростью свертывания молока, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером Enterococcus hirae ВКПМ В-11835.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Enterococcus mundtii тур С37III, обладающий высокой антагонистической способностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Enterococcus hirae М25б № 23, обладающий высокой антагонистической способностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.

Группа изобретений относится к способу профилактики или лечения рецидива острого отита среднего уха, возникающего в результате инфекции Streptococcus pneumoniae, у пациентов группы риска, включающему введение терапевтически эффективного количества композиции, по меньшей мере, однократно, пациенту.
Наверх