Лекарственное средство на основе индол-3-карбинола с повышенной эпигенетической активностью

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для производства лекарственных средств, необходимых в терапии заболеваний органов репродуктивной системы (патологии молочных желез, матки, эндометрия). Лекарственное средство, обладающее эпигенетической активностью, содержит индол-3-карбинол и вспомогательные вещества: лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, крахмал кукурузный модифицированный, магния стеарат или кальция стеарат, заключенные в капсулы, которые выполнены из гидроксипропилметилцеллюлозы, в следующем количестве в одной капсуле, г: индол-3-карбинол 0,10-0,20; лактоза 0,10-0,15; крахмал кукурузный модифицированный 0,05-0,15; целлюлоза микрокристаллическая 0,5-0,15; магния стеарат или кальция стеарат 0,001-0,004. Изобретение позволяет повысить эффективность высвобождения индол-3-карбинола из лекарственной формы и его превращения в дииндолилметан, который реализует присущую ему деметилирующую активность. 3 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для производства лекарственных средств, необходимых в терапии заболеваний органов репродуктивной системы (патологии молочных желез, матки, эндометрия).

Индол-3-карбинол (И-3-К) является уникальным химическим соединением, обладающим чрезвычайно широким спектром противоопухолевой активности. Удивительным образом это соединение в экспериментальных и клинических исследованиях продемонстрировало воздействие на самые различные механизмы канцерогенеза. В частности, одно из первых клинических исследований обнаружило удивительную способность И-3-К влиять на метаболизм эстрадиола и смещать биоконверсию последнего в сторону преимущественного синтеза 2-гидроксиэстрона, который обладает целым рядом важных физиологических функций и существенно снижать образование 16-гидроксиэстрона, который вызывает повышенную пролиферативную активность клеток-мишеней и может приводить их к малигнизации [V.L. Maruthanila, J. Poornima, S. Mirunalini. Attenuation of Carcinogenesis and the Mechanism Underlying by the Influence of Indole-3-carbinol and Its Metabolite 3,3-Diindolylmethane: A Therapeutic Marvel. Advances in Pharmacological Sciences, 2014, Article ID 832161, 7 pages http://dx.doi.org/10.1155/2014/832161].

В последствие было показано, что И-3-К вызывает избирательный апоптоз трансформированных клеток, что вносит значительный вклад в его противоопухолевую активность. Кроме этого, И-3-К ингибирует многие сигнальные каскады, которые активируются в процессе опухолевой трансформации клеток. Особенностью И-3-К, как физиологически активного вещества, является его биоконверсия в широкий спектр химических соединений. Каждое из этих соединений обладает самостоятельной активностью [H.L. Bradlo, М.А. Zeligs. Diindolylmethane (DIM) Spontaneously Forms from Indole-3-carbinol (I3C) During Cell Culture Experiments.in vivo, 201024: 387-392]. Причем характер этой конверсии может существенно отличаться у различных индивидуумов. Возможно, поэтому в процессе клинических исследований наблюдаются как быстрые и выраженные лечебные эффекты при приеме препаратов на основе И-3-К, так и их отсутствие. Основной лечебный эффект из всех известных производных И-3-К приписывается дииндолилметану (ДИМ) [A.Ahmad, W.A. Sakr, К.М. Wahidur Rahman. Mechanisms and Therapeutic Implications of Cell Death Induction by Indole Compounds. Cancers 2011, 5, 2955-2974]. Установлено, что именно ДИМ обладает высокой избирательной ингибирующей активностью по отношению к клеткам с нарушенным метаболизмом и находящимся в состоянии оксидативного стресса. Именно для ДИМ показана уникальная способность подавлять жизнедеятельность опухолевых стволовых клеток, которые определяют развитие злокачественных патологий. Наконец, для ДИМ установлена способность влиять на эпигенетические изменения в транформированных клетках, модулируя активность гистон деацетилаз и ДНК-метилтранфераз [Wong C.P., HsuA., Buchanan A., Palomera-Sanchez Z., Beaver L.M. et al. Effects of Sulforaphane and 3,39-Diindolylmethane on Genome-Wide Promoter Methylation in Normal Prostate Epithelial Cells and Prostate Cancer Cells. PLoS One. 2014; 9; Beaver L.M., Yu Tian-Wei, Sokolowski E.I., Williams D.E., Dashwood R.К., Ho E.3,3′-diindolylmethane, but not indole-3-carbinol, inhibits histonedeacetylase activity in prostate cancer cells. Toxicol Appl Pharmacol. 2012; 263(3): 345-351]. Через эти механизмы ДИМ способен инициировать генетическое перепрограммирование клеток, возвращая их в здоровое, с генетической точки зрения, состояние. Таким образом, можно предположить, что эффективность превращения И-3-К in vivo влияет на его терапевтическую активность.

Задачей настоящего изобретения явилась разработка лекарственных форм И-3-К, которые обеспечивали бы максимальную конверсию в ДИМ, и исследования терапевтической активности таких препаратов. Конверсия И-3-К в ДИМ происходит преимущественно в желудке под влиянием кислой среды. Поэтому скорость высвобождения И-3-К в полость желудка может играть принципиальную роль в конверсии И-3-К в ДИМ, а следовательно, на реализации биологической активности лекарственного средства. Таким образом, задачей данного изобретения явилась разработка лекарственного средства, обеспечивающего максимальную конверсию И-3-К в ДИМ, а также изучение эпигенетической активности разработанных лекарственных средств. В частности, восстановление активности генов, умолкающих в результате метилирования их промоторных участков. Значение эпигенетических модификаций генома оценено по-настоящему только в последние годы. Достоверно установлено, что существует несколько биохимических механизмов, с помощью которых осуществляется прижизненное перепрограммирование генетической программы клетки (см. Фиг. 1). Один из основных механизмов это метилирование регуляторных участков генов, которое приводит к блокаде их экспрессии. Этот механизм рассматривается сегодня, как одна из важнейших причин раннего канцерогенеза. Подобный же механизм может приводить к инактивации генов рецептивности эндометрия, что является причиной женского бесплодия. Сегодня роль эпигенетических модификаций установлена для самых разных заболеваний человека. Однако терапия, направленная на восстановление активности генов, пока только развивается. Поэтому разработка лекарственных средств, обладающих эпигенетической активностью является исключительно важной задачей. Поэтому задачей настоящего изобретения явилась разработка лекарственного средства на основе индол-3-карбинола, обладающего способностью деметилировать гены, чья экспрессия нарушена вследствие эпигенетических модификаций. Эффективность лекарственного средства исследовалась на генах рецептивности эндометрия.

Известно, что низкая рецептивность эндометрия является причиной подавляющего числа неудач при имплантации эмбриона, в том числе при проведении программ ЭКО, и одной из главных причин женского бесплодия.

Согласно данным современной молекулярной медицины, к числу ключевых регуляторов процессов рецептивности эндометрия, предопределяющих фертильность, принадлежат гены и кодируемые ими белки НОХ10 и НОХ11 [Hsieh-Li H.M., Witte D.P., Weinstein M., Branford W., Li H., Small K. et al. Hoxa 11 structure, extensive antisense transcription, and function in male and female fertility. Development. 1995; 121(5): 1373-85; Kwon H.E., Taylor H.S. The role of HOX genes in human implantation. In Annals of the New York Academy of Sciences. 2004; 1034: 1-18]. Гены обширного семейства HOX (Homeobox) кодируют факторы транскрипции, которые участвуют в регуляции имплантации в репродуктивном возрасте.

НОХА10 и HOXA11 экспрессируются в клетках эндометрия в различных сегментах матки, причем данный процесс является гормонозависимым и активируется под действием прогестерона и эстрогенов в секреторной фазе менструального цикла, достигая максимума в период "окна имплантации) [Taylor H.S. The role of НОХ genes in human implantation. Hum Reprod Update. 2000; 6(1): 75-9]. HOXA10 регулирует экспрессию маркеров рецептивности эндометрия: белка клеточной адгезии интегрина β3 [Daftary G.S., Troy P.J., Bagot C.N., Young S.L., H.S. Taylor. Direct regulation of beta 3-integrin subunit gene expression by HOXA10 in endometrial cells. Mol. Endocrinol. 2002; 16: 571-79], связывающего инсулиноподобный фактор белка IGFBP-1 [Kim J.J., Taylor H.S., Akbas G.E., Foucher I., Trembleau Α., Jaffe R.C. et al. Regulation of insulin-like growth factor binding protein-1 promoter activity by FKHR and HOXA10 in primate endometrial cells. Biol. Reprod. 2003; 68: 24-30] и ряда других [Bei L., Huang W., Wang H., Shah C., Horvath E., Eklund E. HoxA10 activates CDX4 transcription and Cdx4 activates HOXA10 transcription in myeloid cells. J. Biol. Chem. 2011; 286: 19047-64; Shah C.Α., Wang H., Bei L., Platanias L.C., Eklund E.A. HoxA10 regulates transcription of the gene encoding transforming growth factor beta2 (TGFbeta2) in myeloid cells. J. Biol. Chem. 2011; 286: 3161-76; Wang H., Lu Y., Huang W., Papoutsakis Ε.T., Fuhrken P., Eklund E.A. HoxA10 activates transcription of the gene encoding mitogen-activated protein kinase phosphatase 2 (Mkp2) in myeloid cells. J. Biol. Chem. 2007; 282: 16164-76], aHOXA11, в числе прочих, регулирует экспрессию маркера дедуциональной перестройки - гормонапролактина и интегрина α8 [Lynch V.J., Broyer К., Gellersen В., Wagner G.P. HoxA-11 and FOXO1A cooperate to regulate decidual prolactin expression: Towards inferring the core transcriptional regulators of decidual genes. PLoS One. 2009; 4; Valerius M.T., Patterson L.T., Feng Y., Potter S.S. Hoxa 11 is upstream of Integrin alpha8 expression in the developing kidney. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002; 99: 8090-95].

Показано, что у больных эндометриозом экспрессия генов НОХА10 и НОХ11 в эндометрии снижена по причине их аномального гиперметилирования в регуляторном (промоторном) участке. При этом снижается содержание и других клеточных компонентов и белков - медиаторов рецептивности эндометрия, регулируемых генами НОХ, таких как эндометриальные пиноподии, интегрин ανβ3, белок IGFBP-1 [Cakmak H., Taylor H.S. Molecular mechanisms of treatment resistance in endometriosis: the role of progesterone-hox gene interactions. Semin Reprod Med. 2010; 28(1): 69-74].

Известно, что снижение уровня содержания белка в ткани может быть вызвано как генетическими причинами (мутацией или полиморфизмом кодирующего его гена), так и эпигенетическими отклонениями, например метилированием промоторной области гена. Такое метилирование происходит по цитозиновому остатку под действием фермента ДНК-метилтрансферазы в строго определенных участках гена - так называемых динуклеотидных островках CpG, которые содержатся в промоторной области подавляющего большинства генов. Промоторное метилирование приводит к снижению экспрессии гена, вплоть до его полной инактивации ("эпигенетического молчания") и является одним из ключевых механизмов эпигенетической регуляции.

Следует отметить, что в последнее время, в целом, гинекологические заболевания, в том числе сопровождающиеся бесплодием, все чаще начинают рассматриваться как эпигенетические заболевания, при которых отмечается аномальный уровень метилирования генов, участвующих в их патогенезе. Так у больных эндометриозом, кроме генов рецептивности НОХА10 и НОХ11, в эндометрии наблюдалось аномальное метилирование генов эстрогеновых рецепторов β, прогестероновых рецепторов В (PR-B), гена белка адгезии кадгерина Е, а также генов ароматазы и стероидогенного фактора 1 (SF-1), контролирующих биосинтез эстрогена [Nasu К., Kawano Y., Tsukamoto Y., Takano M., Takai Ν., Li Η. et al. Aberrant DNA methylation status of endometriosis: epigenetics as the pathogenesis, biomarker and therapeutic target. J. Obstet. Gynaecol. Res. 2011; 37(7): 683-95; Wu Y., Haber son G., Basir Z., Strawn E., Yan P., Guo S.-W. Aberrant methylation at HOXA10 may be responsible for its aberrant expression in the endometrium of patients with endometriosis. Am. J. Obstet. Gynecol. 2005; 193(2): 371-80; Browne H., Taylor H. HOXA10 expression in ectopic endometrial tissue. Fertil. Steril. 2006; 85(5): 1386-90. Guo S.-W. Epigenetics of endometriosis. Mol. Hum. Reprod. 2009; 15(10): 587-607].

Было показано, что гены НОХА гиперметилированы и, как следствие, неактивны у 70-100% бесплодных женщин с эндометриозом и миомой, а также у 56% женщин с необъяснимым бесплодием [Cakma кН., Taylor H.S. Implantation failure: molecular mechanism sand clinical treatment. Hum Reprod Update. 2011; 17(2): 242-53; Matsuzaki S., Canis M., Darcha C., Pouly J.L., Mage G. HOXA-10 expression in the mid-secretory endometrium of infertile patients with either endometriosis, uterine fibromas or unexplained infertility. Hum Reprod. 2009; 24(12): 3180-7]. В то же время метилирование генов НОХА10 и HOXA11 в образцах ткани, взятых у здоровых доноров, отсутствовало. Эти данные позволили, во-первых, говорить об эпигенетической составляющей патогенеза данных заболеваний, а во-вторых, о ДНК-метилировании как о потенциальном диагностическом маркере состояния бесплодия, возникающего при указанных патологиях [Nasu К., Kawano Y., Tsukamoto Y., Takano M., Takai К., Li H. et al. Aberrant DNA methylation status of endometriosis: epigenetics as the pathogenesis, biomarker and therapeutic target. J. Obstet. Gynaecol. Res. 2011; 37(7): 683-95; Guo S.-W. Epigenetics of endometriosis. Mol. Hum. Reprod. 2009; 15(10): 587-607].

В настоящей работе было исследование статуса метилирования промоторных участков генов НОХА10 и НОХА11 в биоптатах эндометрия у женщин, страдающих бесплодием на фоне хронического эндометрита и исследована способность лекарственных средств на основе И-3-К вызывать деметилирование, что приводит к восстановлению экспрессии гена, а следовательно, к восстановлению репродуктивной функции.

Исследователями предпринимались попытки создания различных лекарственных форм индол-3-карбинола и дииндолилметана. Из уровня техники известен ряд решений, касающихся лекарственных форм И-3-К.

В частности, известно лекарственное средство для лечения масталгии и эндометриоза (US 6689387, опубл. 10.02.2004), представляющее собой микрочастицы И-3-К или 3,3′-дииндолилметана в крахмальной матрице, в том числе, в виде твердых лекарственных форм для орального введения. Данные формы содержат 30-70% крахмала, что, повышая растворимость активного вещества, не обеспечивает достаточной стабильности в процессе хранения.

Известно средство для лечения неопластических заболеваний на основе И-3-К и/или ДИМ (US 6399645, опубл. 2002). Данное средство может быть выполнено в виде капсулы или таблетки, содержащей в качестве вспомогательных веществ лактозу, крахмал, производные целлюлозы и подобное. Данный состав также не стабилен из-за содержания крахмала.

Известны также различные лекарственные формы средства для лечения мастопатии и эндометриоза на основе производных индола с повышенной степенью абсорбции, в том числе в виде таблеток, например, содержащих связующее, ПАВ и воду (US 2004/0156910). Таблетки могут быть покрыты оболочкой. Активное вещество присутствует в микрокристаллической форме. Разработанные лекарственные формы согласно данному источнику не обеспечивают улучшенную водорастворимость действующего вещества, представляют собой дисперсионные системы, в большей степени, имеющие гетерогенную структуру.

Хотя в известных патентах упоминается возможность получения таблеток с различными известными в области фармации добавками, в них не ставится и не предполагается задача создания такой формы, чтобы она позволяла разобщить терапевтические эффекты И-3-К и его метаболита.

Нами также предпринимались попытки создания лекарственных форм, обеспечивающих максимальное сужение спектра молекулярных внутриклеточных мишеней И-3-К и таким образом сделать действие данного препарата как можно более предсказуемым; то есть, разобщить терапевтические эффекты И-3-К и DIM. Наиболее близким к предложенному является антиэстрогенное и антипролиферативное средство для лечения и профилактики заболеваний женской репродуктивной системы, представляющее собой таблетку, покрытую оболочкой, содержащую индол-3-карбинол, а также вспомогательные вещества, при этом оно содержит в качестве вспомогательных веществ лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, бутилгидроксианизол, крахмал кукурузный модифицированный, магния стеарат или кальция стеарат, а в качестве оболочки кишечнорастворимое покрытие Акрилиз (RU 2315594 C1, опубл. 27.01.2008).

Задачей изобретения является создание лекарственного средства с повышенной эпигенетической активностью.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности высвобождения индол-3-карбинола из лекарственной формы и его превращения в дииндолилметан, который реализует присущую ему деметилирующую активность.

Технический результат достигается лекарственным средством, обладающим эпигенетической активностью, содержащим индол-3-карбинол и вспомогательные вещества лактозу, крахмал кукурузный модифицированный, микрокристаллическую целлюлозу, и магния стеарат или кальция стеарат, заключенные в капсулы, отличающееся тем, что капсулы выполнены из гидроксипропилметилцеллюлозы, в следующем количестве в одной капсуле, г:

индол-3-карбинол	0,10-0,20
лактоза	0,10-0,15
крахмал кукурузный модифицированный	0,05-0,15
целлюлоза микрокристаллическая	0,05-0,15
магния стеарат или кальция стеарат	0,001-0,004

Предложенное лекарственное средство на основе индол-3-карбинола обладает способностью вызывать деметилирование гена НОХ 10, ответственного за рецептивность эндометрия, обеспечивает эффективную конверсию фармакологически активного вещества в дииндолилметан и производится в виде целлюлозных капсул.

Изобретение иллюстрируется графическими материалами.

На фиг. 1 показаны три биохимических механизма эпигенетической регуляции - прижизненного перепрограммирования генетической программы клетки.

На фиг. 2 - график зависимости концентрации дииндолилметана в плазме женщин от времени после приема 200 мг различных лекарственных форм индол-3 - карбинола.

На фиг. 3 - результаты исследования биологической активности исследуемых лекарственных форм индол-3-карбинола по их способности вызывать деметилирование гена НОХ10.(Х) - нуклеотиды, содержащие метальную группу.

Предложенное лекарственное средство изготавливают следующим образом. Компоненты в расчетных количествах загружают в аппарат с мешалкой и перемешивают. Затем смесь направляют на аппарат для капсулирования.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1

Лекарственные формы индол-3-карбинола

1. Таблетки, содержащие 0,2 г индол-3-карбинола, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, минимизирующей образование дииндолилметана (по прототипу).

2. Желатиновые капсулы, содержащие 0,2 г индол-3-карбинола, имеющие в своем составе:

3. Целлюлозные капсулы, содержащие 0,2 г индол-3-карбинола, имеющие в своем составе (предложенное лекарственное средство):

4. Целлюлозные капсулы, содержащие 0,1 г индол-3-карбинола, имеющие в своем составе (предложенное лекарственное средство):

5. Целлюлозные капсулы, содержащие 0,15 г индол-3-карбинола, имеющие в своем составе (предложенное лекарственное средство):

Пример 2

Исследование концентрации дииндолилметана в плазме волонтеров, принимающих различные лекарственные формы индол-3-карбинола

Для исследования фармакокинетики лекарственных средств на основе индол-3-карбинола были отобраны 3 группы здоровых женщин в возрасте от 25 до 40 лет (Фиг. 2). Каждая группа принимала однократно перорально по одной дозе препаратов, содержащих 200 мг индол-3-карбинола. Каждые два часа у женщин отбирались пробы крови для определения содержания дииндолилметана. Определение проводилось по методике, описанной в работе «Comparative preclinical pharmacokinetics study of 3,3′-diindolylmethane formulations: is personalized treatment and targeted chemoprevention in the horizon?» [Paltsev M, Kiselev V, Muyzhnek E, Drukh V¹, Kuznetsov I, Pchelintseva О., EPMA J., 2013, 4:25. doi: 10.1186/1878-5085-4-25]. На Фиг. 2 представлены результаты этих исследований из которых следует, что максимальная конверсия И-3-К в ДИМ имеет место при приеме лекарственной формы на основе капсул из целлюлозы. Причину этого эффекта мы не можем объяснить в настоящее время, и он требует дальнейшего изучения. Однако было интересно узнать влияет ли этот параметр на способность лекарственных форм вызывать деметилирование генов. Мы попытались ответить на этот вопрос в рамках клинического исследования, проведенного на женщинах с утраченной репродуктивной функцией вследствие метилирования гена НОХ10, ответственного за рецептивность эндометрия.

Пример 3

Исследование биологической активности исследуемых лекарственных форм индол-3-карбинола по их способности вызывать деметилирование гена НОХ10

Биоптаты эутопического эндометрия были получены у пациенток в возрасте от 28 до 40 лет, страдающих бесплодием на фоне хронического эндометрита, в ходе диагностической контрольной гистероскопии и лечебно-диагностического выскабливания полости матки. В анамнезе у пациенток исключался рак эндометрия, поскольку, согласно данным литературы, при данной онкопатологии в опухоли отмечается аномальное гиперметилирование гена НОХ10 [Fambrini М., Bussani С., Sorbi F., Pier alii A., Cioni R. Methylation of the HOXA10 homeobox genepromoter is associated with endometrial cancer: Apilotstudy. J. Obstet. Gynaecol. 2013; 33: 519-20]. Полученные образцы ткани были трижды промыты буфером PBS (натрий-фосфатный буфер) и заморожены при температуре -20°С перед отправкой на исследование.

Выделение ДНК. Полученные образцы эндометрия измельчали хирургическим скальпелем и гомогенизировали в гомогенизаторе FastPrep^®-24 (MP Biomedicals, США) с добавлением матрикса D. Из полученных образцов выделяли ДНК с использованием и по протоколу набора ReliaPrep™ gDNA Tissue Miniprep System (Promega, США). Концентрацию ДНК определяли флуориметрически с использованием стандартного набора Qubitds DNA HS Assay Kit на флуориметре Qubit 2.0 (Life Technologies, США).

Бисульфитная конверсия. 150 нг полученной ДНК подвергали бисульфитной конверсии (переводу неметилированных остатков цитозина в тимин при сохранении метилированных остатков цитозина в неизмененном виде) с использованием набора Methyl Edge™ Bisulfite Conversion System (Promega, США). Концентрацию конвертированной ДНК определяли фотометрически в планшете µ-drop (BMGLabtech, Германия) с использованием мультидетектора CLARIO star (BMG Labtech, Германия).

Проведение ПЦР. 20 нг бисульфит-конвертированной ДНК отбирали для последующей ПЦР-амплификации с использованием полимеразной смеси GoTaq^® Hot Start Green Master Mix (Promega, США) и следующих праймеров:

Наличие и размер (длину) ПЦР-продуктов определяли посредством электрофореза в 2,5% агарозном геле с маркерами молекулярного веса 100 bp Molecular Ruler (Bio-Rad, США). Полученные ПЦР-продукты выделяли из геля с использованием набора Pure Link Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen, США).

Секвенирование. Секвенирование проводилось по стандартному протоколу с использованием прямых праймеров и набора реактивов ABI PRISM^® BigDye™ Terminator v. 3.1. Анализ продуктов реакции проводили на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США).

Статистический анализ. Статистический анализ результатов секвенирования проводили с использование программного обеспечения DNA Sequencing Analysis Software версии 5.1 (Applied Biosystems, США) и BiQ Analyzer (biq-analyzer.bioinf.mpi-inf.mpg.de). Уровень ДНК-метилирования оценивали качественно (наличие/отсутствие).

Для дальнейших исследований отбирали женщин с метилированным геном НОХ10. Женщин распределили на три группы, каждая из которых принимала одну из разработанных лекарственных форм. Курс приема препаратов длился три месяца, по 400 мг в сутки (по 2 капсулы 2 раза в день) По завершению курса, отбирались пробы эндометрия и по описанной методике исследовали наличие метальных групп в структуре гена НОХ10.

Результаты проведенного исследования приведены на Фиг 3. Как следует из полученных данных, максимальная деметилирующая активность наблюдалась в группе женщин, принимающих препарат индол-3-карбинола расфасованный в капсулы из гидроксипропилметилцеллюлозы. Таким образом, можно предположить, что высвобождение индол-3-карбинола его превращение в дииндолилметан из предложенной лекарственной формы на основе целлюлозных капсул происходит более эффективно, и образовавшийся дииндолилметан реализует присущую ему деметилирующую активность в клетках эндометрия.

Пример 4

Лечение цервикальных дисплазий

Рак шейки матки, ассоциированный с вирусами папилломы человека, остается одним из самых распространенных онкологических заболеваний женской репродуктивной системы. Эта патология развивается постепенно и проходит несколько стадий предраковых состояний: от цервикальной интраэпителиальной неоплазии 1 (CIN1) до CINIII с переходом в рак in situ и далее в инвазивный рак. Современные стандарты лечения этой патологии предусматривают хирургическое вмешательство, в частности эксцизию шейки матки, что в последствие отражается на репродуктивной функции женщины. В последние годы установлено, что прогрессия CIN1 в рак обусловлена метилированием гена WIF1. Этот ген кодирует синтез белка ингибитора Wnt-сигнальных каскадов, которые запускают канцерогенез клеток шейки матки при интеграции генома вируса папилломы человека [A.L. Delmas, B.M. Riggs, C.E. Pardo, L.M. Dyeretal. WIF1 is a frequent target for epigenetic silencing in squamous cell carcinoma of the Cervix. Carcinogenesis, 2011, 32:11, 1625-1633]. Показано, что при метилировании этого гена наступает блокада его экспрессии, в результате чего активируется Wnt-сигнальный каскад и наступает быстрая прогрессия цервикальных дисплазий в рак. Понимание этих механизмов открывает новые возможности в консервативном лечении дисплазий и профилактике рака шейки матки. Новый подход заключается в назначении лекарственных препаратов, способных вызвать деметилирование гена WIF1, что восстановит его экспрессию и затормозит процессы канцерогенеза. Для проверки данной гипотезы нами были отобраны десять женщин с диагнозом CINI-CINII у которых методом секвенирования были определены участки метилирования гена WIF1. Всем пациенткам была назначена терапия лекарственным средством на основе индол-3-карбинола в целлюлозных капсулах (препарат 3, пример 1) по 400 мг в день в течение 3 месяцев. Контрольная группа пациенток получала препарат на основе индол-3-карбинола в желатиновых капсулах по такой же схеме (препарат 2, пример 1). Лечение проводилось под контролем кольпоскопии, цитологии и при завершении курса проводился сиквенс гена WIF1 для определения участков метилирования. В группе женщин принимающих препарат 2 не было отмечено положительной динамики, а в 30% ухудшалась цитологическая картина, которая свидетельствовала о прогрессии заболевания. В связи, с чем им было проведена операция эксцизии шейки матки. В группе принимающей препарат 1 отмечена в 75% регрессия заболевания и, что подтверждалось кольпоскопическими исследования и положительной динамикой цитологической картины. Исследование зон метилирования гена WIF1 показало, что у пациенток с положительной динамикой наблюдалось полное (60%) и частичное деметилирование гена.

Следует отметить, что одна группа женщин получала препарат в капсулах, содержащих 100 мг индол-3-карбинола, а другая группа - в капсулах по 200 мг индол-3-карбинола. Однако суточная доза активного вещества в обоих случаях составила 400 мг индол-3-карбинола в день. Обе группы женщин показали выраженный клинический эффект от приема препарата. Существенных различий в группах не обнаружено.

Лекарственное средство, обладающее эпигенетической активностью, содержащее индол-3-карбинол и вспомогательные вещества лактозу, крахмал кукурузный модифицированный, микрокристаллическую целлюлозу, магния стеарат или кальция стеарат, заключенные в капсулы, отличающееся тем, что капсулы выполнены из гидроксипропилметилцеллюлозы, в следующем количестве в одной капсуле, г:

индол-3-карбинол	0,10-0,20
лактоза	0,10-0,15
крахмал кукурузный модифицированный	0,05-0,15
целлюлоза микрокристаллическая	0,05-0,15
магния стеарат или кальция стеарат	0,001-0,004