Способ экстракорпорального культивирования ооцитов коров


 


Владельцы патента RU 2602448:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных (RU)

Изобретение относится к области репродуктивной биотехнологии, а именно к способу экстракорпорального культивирования ооцитов коров. Способ включает оценку фазы роста ооцитов, выделенных стандартными методами из яичников коров после убоя, методом окрашивания бриллиантовым кристаллическим голубым, отделение не завершивших рост ооцитов и культивирование их в среде ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл. Культивирование проводят в течение 15 ч, затем ооциты перемещают в среду, дополнительно содержащую хорионический гонадотропин человека в количестве 10 м.ед/мл и культивируют еще 15 ч. Использование изобретения позволит повысить доли ооцитов, созревших в процессе экстракорпорального культивирования. 1 табл.

 

Изобретение относится к области репродуктивных биотехнологий, конкретно к способам культивирования животных клеток, и может быть использовано для получения зрелых яйцеклеток коров in vitro, компетентных к дальнейшему развитию, получению эмбрионов - интактных, клонированных, трансгенных, а также для выделения линий эмбриональных стволовых клеток.

Одной из задач в области клеточных репродуктивных технологий в животноводстве является создание эффективных систем для культивирования незрелых ооцитов, извлеченных из яичников животных - доноров после убоя. Разработаны методы культивирования незрелых ооцитов в питательных средах для завершения процесса созревания. Например, после забоя коров извлекают яичники, выделяют из них ооциты, по морфологическим критериям выделяют незрелые, культивируют в питательной среде до стадии дозревания и проводят оплодотворение [1].

Немаловажным аспектом в описанных процедурах является повышение точности определения степени зрелости ооцитов. В частности, было предложено использовать для этой цели краситель ВСВ (brilliant cresyl blue), который реагирует на внутриклеточную активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (G6PDH). Высокая активность фермента G6PDH в растущих ооцитах приводит к обесцвечиванию ВСВ, чего не наблюдается в ооцитах, завершивших фазу роста в организме животного [2]. Данный способ и был выбран в качестве прототипа.

Основным недостатком известных методик является небольшая относительная доля ооцитов, способных к дальнейшему развитию в эмбрионы.

Задачей предлагаемого изобретения была разработка способа экстракорпорального культивирования, обеспечивающего заметное увеличение количества ооцитов, созревших до состояния, пригодного для оплодотворения.

Решение поставленной задачи было найдено в виде способа, согласно которому фазу роста ооцитов, выделенных из коров после убоя, оценивают методом окрашивания бриллиантовым кристаллическим голубым (ВСВ), отделяют не завершившие рост ооциты, культивируют их в среде ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл в течение 15 ч, затем ооциты перемещают в другую среду, содержащую кроме выше упомянутых компонентов хорионический гонадотропин человека в концентрации 10 м.ед/мл, и культивируют еще 15 ч.

Были проведены следующие эксперименты. Из полученных на мясокомбинате яичников коров выделяли ооцит-кумулюсные комплексы путем аспирации содержимого фолликулов диаметром 3-6 мм. Затем морфологически оцененные ооциты в течение 90 минут подвергали воздействию раствора 26µМ ВСВ (В-5388, Sigma) в среде Дюльбекко и разделяли окрашенные ооциты (завершившие фазу роста) и без окраски (растущие).

Полученные описанным выше приемом ооциты, не завершившие фазу роста, разделили на две группы: контрольную и опытную. Ооциты контрольной группы культивировали согласно способу, описанному в прототипе [2], а именно, группами по 15-20 штук помещали в покрытые минеральным маслом капли объемом 200 мкл среды ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл. Опыт проводили в течение 24 ч при температуре 38.5°C в атмосфере с 5% углекислого газа при 90% влажности.

Ооциты опытной группы обрабатывали согласно заявляемому способу, а именно, сначала культивировали в указанной выше среде в течение 15 часов, затем переносили в среду, которая кроме указанных компонентов содержала хорионический гонадотропин человека в количестве 10 м.ед/мл, и культивировали в течение 15 ч при тех же условиях.

Для проверки возможности эмбрионального развития все ооциты оплодотворяли спермой быков и помещали в капли объемом 25 мкл синтетической среды эмбрионов (mSOF) +20 г/л буфера BSA. Культивирование эмбрионов проводили под минеральным маслом в атмосфере 5% углекислого газа, 5% кислорода и 90% азота. Для мониторинга развития эмбрионов на 5-й и 8-й день после оплодотворения оценивали, соответственно, выход морул и бластоцист.

Результаты описанных сравнительных испытаний приведены в таблице. Хорошо видно, что объект изобретения показывает значительное преимущество перед прототипом. Количество эмбрионов, разделившихся до 8-16 клеток в опытном варианте, превышает аналогичный показатель в контроле примерно на четверть, а доля зародышей, достигших стадии бластоцисты - более чем вдвое.

Технический результат изобретения заключается в существенном повышении доли ооцитов, созревших в процессе экстракорпорального культивирования и компетентных к эмбриональному развитию, и их способности к развитию до стадии бластоцисты после оплодотворения in vitro.

Источники информации

1. Патент РФ №2410063 от 04.06.2009.

2. В. Heleil., Т. Kuzmina, N. Novikova, Н. Torner and Н. Alm // Effect of prolactin on Developmental Competence of Bovine Oocytes Selected by Brilliant Cresyl Blue Staining / Journal of Reproduction and Infertility. - 2010, №1, p. 1-7.

Способ экстракорпорального культивирования ооцитов коров, согласно которому фазу роста ооцитов, выделенных стандартными методами из яичников коров после убоя, оценивают методом окрашивания бриллиантовым кристаллическим голубым (ВСВ), отделяют не завершившие рост ооциты и культивируют их в среде ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл, отличающийся тем, что упомянутое культивирование проводят в течение 15 ч, затем ооциты перемещают в среду, содержащую кроме выше упомянутых компонентов хорионический гонадотропин человека в количестве 10 м.ед/мл и культивируют еще 15 ч.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота. Среда для консервирования семени быка составлена с использованием следующих компонентов (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9, фруктоза 0,9, лимонная кислота 0,7, сахароза 2, глицерин 4,5-6,5, фосфолипиды сои 0,04-2,00, высокомолекулярное поверхностно-активное вещество 0,01-1, вода бидистиллированная остальное.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для определения функционального состояния яичников у самок сельскохозяйственных животных в условиях первой лактации.
Изобретение относится к птицеводству, в частности к среде для разбавления и длительного хранения спермы индюков. Среда характеризуется тем, что она содержит растворенные в дистиллированной воде глутамат натрия, глутаминовую кислоту, инозитол, калий фосфорнокислый двузамещенный, глюкозу и магния сульфат.

Изобретение относится к области искусственного осеменения животных и может применяться в сельскохозяйственном производстве. Способ забора криоконсервированного семени быков-производителей из сосуда Дьюара включает предварительное охлаждение корнцанга перед забором спермадоз в жидком азоте до температуры -196°C, при этом предварительному охлаждению подвергают только бранши корнцанга.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Предложенный станок для проведения искусственного осеменения телок и коров состоит из соединенных аркой боковых стоек с опорами, несущими перекрывающие створки.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу повышения воспроизводства косулей. Способ включает внутримышечное введение самкам стимулирующих овуляцию препаратов, при этом при воспроизводстве содержащихся в полувольных условиях косулей, отбирают самок с увеличенным числом приплода.
Изобретение относится к ветеринарии. Осуществляют одновременную ампутацию пениса и препуция.

Заявленное изобретение относится к ветеринарии, а именно к искусственному осеменению коров и телок. Вагиноскоп для искусственного осеменения коров и телок включает полипропиленовую трубку с защитным вкладышем, ручку, осветитель, в качестве которого используется фонарик с тремя светодиодами, и направляющую трубку из жести для фиксации осветителя и его прикрепления к стенке трубки вагиноскопа, при этом наружный конец полипропиленовой трубки имеет скос под углом 45-50 градусов и снабжен защитным вкладышем, прикрепленным к трубке.
Изобретение относится к области птицеводства, в частности к способам длительного хранения семени петухов в функциональном состоянии. Способ криоконсервации семени петухов характеризуется тем, что семя петухов разбавляют в 5 раз в среде, которая содержит 100 см3 дистиллированной воды, 6 г лактозы, 0,58 г лимонной кислоты, 1 г трис-оксиметил-аминометана, 10 см3 желтка куриного яйца, 5 см3 глицерина, при этом температура семени и среды 18-20º С.

Изобретение относится к устройству для введения и/или отбора жидкостей в яйцевод свиньи лапароскопическим путем и способу введения и/или отбора жидкостей с помощью указанного устройства.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к средам для искусственного осеменения сельскохозяйственных птиц. Среда для разбавления спермы сельскохозяйственной птицы включает 3 компонента, растворенных в дистиллированной воде.

Настоящее изобретение относится к аппарату и способу для обнаружения наступающего или наступившего состояния половой охоты у молочного животного в доильном зале.
Изобретение относится к мясному скотоводству. .

Изобретение относится к сельскому хозяйству, к животноводству, в частности, для выявления охоты коров на преддоильной площадке. .

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при массовых обработках животных. .

Изобретение относится к сельскохозяйственной биологии. .
Наверх