Способ дифференцировки живых сперматозоидов с помощью диагностической культуральной среды при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения

Авторы патента:

C12N5/076 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Владельцы патента RU 2603084:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Настоящее изобретение относится к области андрологии, репродуктологии и клинической эмбриологии. Способ дифференцировки живых сперматозоидов при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения предусматривает использование диагностической культуральной среды для дифференцировки живых сперматозоидов с увеличенной концентрацией пентоксифиллина 3,6 мМ/л и кофеином в концентрации 5 мМ/л. Существенным преимуществом использования совместно двух компонент (кофеина и пентоксифиллина) служит расширение клинических случаев, когда удается добиться кратковременной инициации колебательных движений головки/жгутика, что приводит к достижению оптимального времени при отборе живых сперматозоидов и выполнения оплодотворения методом ИКСИ. Применение разработанной культуральной среды позволяет клиническому эмбриологу проводить одновременно простую дифференцировку живых половых клеток и в этой же чашки Петри проводить оплодотворение методом ИКСИ. 2 пр.

Абсолютная астенозооспермия, то есть 100% неподвижных сперматозоидов в эякуляте, встречается с частотой 1 на 5000 случаев в когорте бесплодных пациентов [1]. Причинами полного отсутствия движений жгутика могут служить нарушения строения динеиновых ручек аксонемы жгутика, аномалии конфигурации микротрубочек, а также причины, связанные с эпидидимальным хранением сперматозоидов до эякуляции (посттестикулярная трансформация сперматозоидов) [2]. В случае отказа супружеской пары от использования донорской спермы при тяжелом мужском факторе бесплодия проводят оплодотворение неподвижными сперматозоидами. При выполнении оплодотворения методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) неподвижными сперматозоидами основная задача, стоящая перед клиническим эмбриологом, - дифференцирование живых неподвижных сперматозоидов (только такие пригодны для оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона) от мертвых (не пригодны для оплодотворения, происходит распад мужской ДНК, запущены необратимые процессы деградации всех внутриклеточных структур). Именно поэтому частота оплодотворения ооцитов в циклах ИКСИ при абсолютной астенозооспермии существенно ниже по сравнению с другими патологиями сперматозоидов [1]. Отсутствие движения как головки, так и жгутика также часто встречается при работе с образцами биоптата эпидидимиса/яичка и после криоразморозки спермы (особенно длительно хранящейся, более 5 лет).

Целью настоящего изобретения является разработка диагностической культуральной среды для дифференцировки живых сперматозоидов, пригодных для использования в рамках лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения.

Эта задача решается применением двухкомпонентной среды, позволяющей инициировать колебательные движения головки/жгутика сперматозоидов и использовать данные мужские половые клетки для оплодотворения методом ИКСИ в той же чашке Петри. В качестве составляющих разработанной культуральной среды использованы пентоксифиллин (Pentoxyphyllinum) в увеличенной концентрации 3,6 мМ/л и кофеин (Coffeine) в концентрации 5 мМ/л, добавленных в среду KSOM с буфером HEPES (21 мМ) и 5 мг/мл (0,5%) человеческого сывороточного альбумина HSA.

Наиболее применимые в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) стимуляторы подвижности сперматозоидов - ингибиторы фосфодиэстеразы (пентоксифиллин, кофеин, теофиллин). В отсутствии ингибиторов содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в мужской половой клетке остается неизменным и коррелирует только с гиперподвижностью и амплитудой латерального смещения головки сперматозоида. Накопление цАМФ, в свою очередь, стимулирует цАМФ-зависимые киназы, которые индуцируют фосфорилирование белков хвостика, что и инициирует непродолжительные биения [3]. Согласно литературным данным, исследователи эмпирически подбирают концентрации данных стимуляторов и проводят дифференцировку живых сперматозоидов с последующим оплодотворением методом ИКСИ [1-6]. В частности, на применение пентоксифиллина в конечной концентрации 3,5 мМ/л при оплодотворении методом ИКСИ получен патент №31979 А Украины, МПК 6 А61К 31/52 [7]. Однако при применении пентоксифиллина необходимо учитывать тот факт, что это неспецифический ингибитор фосфодиэстераз, именно поэтому использование только пентоксифиллина для инициации биений головки или жгутика сперматозоида не всегда дает необходимый результат: сперматозоиды в некоторых образцах эякулята/биоптата при наличии живых мужских половых клеток остаются неподвижными. Отличие разработанной диагностической культуральной среды с увеличенной концентрацией пентоксифиллина (3,6 мМ/л) и добавкой кофеина (5 мМ/л), добавленных в среду KSOM с буфером HEPES (21 мМ) и 5 мг/мл (0,5%) человеческого сывороточного альбумина HAS, позволяет инициировать движение и в таких сложных клинических случаях. Так как Руководство ВОЗ по анализу и обработке эякулята человека 5-го пересмотра [8] не рассматривает случаи тяжелого мужского бесплодия и не содержит указаний по работе с образцами при абсолютной неподвижности сперматозоидов, клинические эмбриологи вынуждены разрабатывать собственные протоколы.

При использовании разработанной культуральной среды для дифференцировки живых сперматозоидов протокол работы выбран следующий.

1. Нагреть диагностическую культуральную среду до комнатной температуры.

2. Приготовить стандартную чашку для выполнения ИКСИ, поместив каплю диагностической среды в центре.

3. Добавить эякулят в каплю с диагностической средой.

4. В течение не более 10 мин провести дифференцировку живых пригодных для оплодотворения сперматозоидов, перенеся их в каплю со стандартной средой для половых клеток.

5. Провести процедуру оплодотворения методом ИКСИ.

6. Далее культивирование эмбрионов осуществлять по стандартной методике.

Преимущества предлагаемой культуральной среды были подтверждены на 36 образцах сперматозоидов с тотальной неподвижностью (абсолютная астенозооспермия и образцы биопсии тестикулярной ткани). Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на применение среды для дифференцировки сперматозоидов. Подвижность была инициирована во всех образцах. Процент оплодотворения был 79,5%, что ниже по сравнению с циклами ИКСИ при использовании нативного эякулята (89%), частота дробления в группе составила 76,9% (против 92%). Качество эмбрионов и стадии дробления на день переноса эмбрионов в полость матки были сопоставимы. В исследуемой группе было получено 8 беременностей (22,2%), из которых 5 закончились выкидышем на раннем сроке (в том числе по причине хромосомной патологии у плода), 2 беременности в настоящий момент прогрессируют, рожден 1 здоровый ребенок.

Клинические примеры

Пример 1. Пациентка К., 28 лет, обратилась по поводу лечения бесплодия методами ЭКО/ИКСИ и переноса эмбрионов. Проведено полное клиническое обследование. В анамнезе беременностей не было. Гинекологический и эндокринологический статусы без особенностей. Муж, 34 лет, по результатам спермограммы выявлена тяжелая степень олигоастенотератозооспермии, первичное бесплодие. Супруге проведена стимуляция овуляции по модифицированному короткому протоколу с ант-ГнРГ, выполнена трансвагинальная пункция фолликулов, получено 10 ооцитов. У мужа в день оплодотворения обнаружена абсолютная неподвижность единичных сперматозоидов. Перед выполнением ИКСИ использовали разработанную среду для дифференцировки живых сперматозоидов. Оплодотворение произошло в 6 ооцитах, культивирование эмбрионов выполняли до стадии бластоцисты. В полость матки осуществлен перенос 2 эмбрионов. Наступила одноплодная беременность. На 40-й неделе выполнена плановая операция кесарево сечения, родился здоровый доношенный мальчик.

Пример 2. Пациентка С., 31 год, обратилась по поводу лечения бесплодия методами ЭКО/ИКСИ и переноса эмбрионов. В анамнезе беременностей не было, маточные трубы проходимы, гормональный статус в норме, практически здорова. Муж, 32 года, по результатам спермограммы астенотератозооспермия, некрозооспермия. Количество живых сперматозоидов 4%, первичное бесплодие. Супруге проведена стимуляция овуляции по модифицированному короткому протоколу с ант-ГнРГ, выполнена трансвагинальная пункция фолликулов, получено 8 ооцитов. У мужа в день оплодотворения в эякуляте подвижных сперматозоидов не найдено (живых сперматозоидов 1%). При добавлении к обработанной сперме только пентоксифиллина инициации биений жгутика не произошло. Использование разработанной культуральной среды с кофеином позволило отобрать живые сперматозоиды по небольшим колебательным движениям головки. Оплодотворение произошло в 4 ооцитах, культивирование эмбрионов выполняли до 5 суток. В полость матки произведен перенос 2 бластоцист хорошего качества. Беременность не наступила.

Таким образом, разработанная культуральная среда является эффективным методом дифференцировки неподвижных живых сперматозоидов от мертвых при абсолютной астенозооспермии, что позволяет повысить эффективность программ лечения бесплодия методом ИКСИ, не увеличивая время, затрачиваемое на процедуру оплодотворения, что является существенным преимуществом по сравнению с другими методиками.

Список литературы

1. Ortega С. et al. Absolute asthenozoospermia and ICSI: what are the options? // Human Reproduction, 2011, Vol. 17, No 5, pp. 684-692.

2. Holstein A.F., Schulze W., Davidoff M. Understanding spermatogenesis is a prerequisite for treatment // Repr. Biol. Endocrinol. - 2003. - V. 1 - P. 107-123.

3. Lewis S., Moohan J., Thompson W. Effect of pentoxifylline on human sperm motility in normozoospermic individuals using computer-assisted analysis // Fert. and Steril. - 1993. - 59. - 418-23.

4. Nassar A., Mahony M., Morshedi M. et al. Modulation of sperm tail protein tyrosine phosphorylation by pentoxifylline and its correlation with hyperactivated motility // Fert. and Steril. - 1999. - 71. - 919-23.

5. Elsraite O. et al. Effect of caffeine on human sperm mortility in vitro // 15^th world congress on in vitro fertilization, 2009.

6. Momozawa K, Fukuda Y. Caffeine in fertilization medium is not essential for bovine IVF by fully capacitated spermatozoa // Journal of reproduction anf development, vol. 49, No 6, 2003, p. 507-512.

7. Лучко НА., Грищенко В.И., Кучков И.Н., Калугин Ю.В. Способ повышения подвижности спермиев человека. Патент №31979А Украины, МПК 6 A61K 31/52. Опубл. в Б.И., 2000, №7-11, с. 168.

8. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека / под ред. Курило Л.Ф., перевод Макарова Н.П., 5-е изд. - М., 2012.

Способ дифференцировки живых сперматозоидов при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения, отличающийся тем, что используют диагностическую культуральную среду для дифференцировки живых сперматозоидов с увеличенной концентрацией пентоксифиллина 3,6 мМ/л и кофеином в концентрации 5 мМ/л.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено устройство и способ направления миграции клеток, а также способ изготовления данного устройства.

Способ активации цитотоксических лимфоцитов человека // 2603079

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения активированных цитотоксических лимфоцитов, и может быть использовано в медицине. Выделяют периферические мононуклеары из крови онкологических больных или доноров и культивируют их в бессывороточной среде ex-vivo с добавлением рекомбинантных человеческих IL-2 в концентрации от 125 нг/мл до 500 нг/мл и IL-15 в концентрации от 2,5 нг/мл до 5 нг/мл.

Кремниевый золь и клеточный комплекс, ткань и/или орган с волокнистой матрицей из поликремниевой кислоты // 2602620

Изобретение относится к биологически расщепляющимся и/или рассасывающимся силикагелевым материалам, применяемым в медицине для создания клеточного комплекса, ткани или органа с волокнистой матрицей из поликремниевой кислоты.

Пептиды neil3 и включающие их вакцины // 2600888

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) против белка NEIL3 в присутствии антигенпредставляющей клетки (АРС), несущей HLA-A*0201 и/или HLA-A*0206.

Способ повышения продуктивности эукариотических клеток в продуцировании рекомбинантного fviii // 2600886

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ повышения клеточно-специфичной продуктивности рекомбинантного фактора VIII (rFVIII), продуцируемого в суспензионной культуре клеток млекопитающих в процессе культивирования указанной суспензионной культуры клеток млекопитающих в культуральной среде.

Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток // 2599420

Изобретение относится к области эмбриологии. Способ получения популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток, которые представляют собой человеческие эмбриональные стволовые клетки линии Н9, H1, Н7 и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002, включает стадии: культивирования популяции указанных плюрипотентных стволовых клеток; дифференцирования популяции указанных плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы; дифференцирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в популяцию клеток первичной кишечной трубки; дифференцирования популяции клеток первичной кишечной трубки в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки и дифференцирования популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы путем культивирования популяции клеток задней части передней кишки в среде с добавлением ингибитора CYP26A без добавления ретиноевой кислоты.

Способ получения клеточного материала из плаценты человека // 2599418

Изобретение относится к медицине. Предложен способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из плаценты новорожденного (после родов на 38-40 неделе гестации).

Моноклональные антитела человека к белку программируемой смерти 1 (pd-1) и способы лечения рака с использованием анти-pd-1-антител самостоятельно или в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами // 2599417

Изобретение относится к биохимии. Описаны выделенные моноклональные антитела, которые специфически связываются с PD-1 с высокой аффинностью.

Конъюгаты и композиции для иммунотерапии и противоопухолевого лечения // 2597989

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано в медицине. Композицию, основанную на совместном применении ApoA, интерлейкина 15 и домена Sushi альфа цепи рецептора IL15, используют для стимулирования противоопухолевого иммунного ответа у субъекта.

Материал для культур клеток, полученный из растений // 2597978

Предложен материал для культивирования или доставки эукариотических клеток. Материал содержит происходящие из растений механически дезинтегрированные целлюлозные нановолокна и/или их производные в форме гидрогеля или мембраны во влажном состоянии.

Новый способ получения дифференцированных клеток // 2603094

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения зрелых мегакариоцитарных клеток. Способ включает принудительную экспрессию онкогена, выбранного из генов семейства MYC, и гена, выбранного из генов BMI1, Ring1a, Ring1b, Phc1, Phc2, Phc3, Cbx2, Cbx4, Cbx6, Cbx7 и Cbx8, в гемопоэтических клетках-предшественниках, CD34-положительных клетках, или мегакариоцитарных клетках-предшественниках без мульти-полиплоидизации, и культивирование и выращивание указанных клеток; и дифференцировку выращенных клеток в зрелые мегакариоцитарные клетки. Также описан способ получения препарата тромбоцитов, включающий: получение зрелых мегакариоцитарных клеток описанным выше способом; извлечение из культуры мегакариоцитарных клеток фракции культурального раствора, которая изобилует тромбоцитами, высвобожденными из мегакариоцитарных клеток; и удаление из указанной фракции иных компонентов клеток крови, отличных от тромбоцитов. Представлены препараты клеток для получения зрелых мегакариоцитарных клеток и тромбоцитов, содержащие мегакариоцитарные клетки-предшественники без мульти-полиплоидизации или зрелые мегакариоцитарные клетки, в которые введен онкоген, выбранный из генов семейства MYC, и ген, выбранный из генов BMI1, Ring1a, Ring1b, Phc1, Phc2, Phc3, Cbx2, Cbx4, Cbx6, Cbx7 и Cbx8. Описаны наборы для получения мегакариоцитарных клеток-предшественников на стадии премультинуклеации, для получения зрелых мегакариоцитарных клеток, для получения тромбоцитов. 9 н. и 2 з.п. ф-лы, 20 ил., 4 пр.

Вакцина против ehrlichia canis // 2603274

Изобретение касается вакцинной композиции. Охарактеризованная вакцинная композиция содержит эффективное иммунизирующее количество инактивированной Ehrlichia canis (Е. canis), а также неполярный растворитель, который включает липофильный адъювант. Е. canis инактивирована формалином. Неполярный растворитель представляет собой систему хлороформных растворителей. Изобретение может быть использовано против моноцитарного эрлихиоза собак. При ее введении в качестве первичной вакцины у пациента формируется защитный иммунный ответ, представляющий собой минимальный гуморальный ответ. 9 з.п. ф-лы, 5 ил., 18 табл., 2 пр.

Понижающая регуляция трансктипции sine/alu ретротранспозонов для индукции или восстановления способности к пролиферации и/или плюрипотентности стволовой клетки // 2603731

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ индукции, и/или восстановления, и/или поддержания фенотипа без признаков старения или его аспектов, в частности способности к пролиферации и/или плюрипотентности в клетке млекопитающего. Способ включает снижение уровня или активности транскриптов ретротранспозонов SINE/Alu в клетке в количестве, достаточном для индукции или восстановления способности к пролиферации и/или плюрипотентности указанной клетки млекопитающего. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 58 ил., 9 табл., 3 пр.

Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем // 2604802

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области гигиенической безопасности объектов пищевого назначения. Предложен способ определения безопасности пищевых ингредиентов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека. Способ включает три этапа: подготовку исследуемого объекта, подготовку тест-системы и определение безопасности объекта для тест-системы. Безопасность пищевых ингредиентов оценивают на основании определения жизнеспособности культуры клеток с использованием камеры Горяева и цитопатической активности изучаемых объектов. Изобретение обеспечивает повышение точности и достоверности результатов определения безопасности пищевых ингредиентов для человека. 4 табл., 2 пр.

Способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов с помощью клеточных тест-систем // 2604804

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека. Способ включает три этапа: подготовку исследуемого объекта, подготовку тест-системы и определение безопасности объекта для тест-системы. Токсичность и токсигенность пробиотических микроорганизмов оценивают на основании определения жизнеспособности культуры клеток с использованием камеры Горяева. Изобретение обеспечивает повышение точности и достоверности результатов определения безопасности пробиотических микроорганизмов для человека. 4 табл., 1 пр.

Способ определения биологической активности вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи при производстве ассоциированных препаратов (варианты) // 2606848

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Предложены способы определения биологической активности монокомпонентов в ассоциированных комбинированных ди- и тривакцинах, содержащих вакцинные штаммы вируса кори (Л-16), эпидемического паротита (Л-3) и/или краснухи (Орлов). Предложенные способы позволяют упростить технологию контроля вакцинных препаратов и снизить себестоимость производства вакцин. 3 н.п. ф-лы, 5 табл., 3 пр.

Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток // 2607380

Настоящее изобретение относится к способам дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток. В частности, в настоящем изобретении предложены способы характеризации клеток, дифференцировавших в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, на основании анализа уникальных маркеров клеточной поверхности. В настоящем изобретении также предложены способы обогащения или сортировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. В настоящем изобретении также предложены способы уменьшения количества клеток, которые могут загрязнять популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, сформированные способами, представляющими предмет настоящего изобретения, таким образом снижая частоту возникновения опухолей in vivo после трансплантации. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 13 ил., 7 табл., 7 пр.

Способ получения экзосом из крови // 2608509

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения экзосом из крови, в котором кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию с помощью центрифугирования при 600 g в течение 20 минут. Клеточную фракцию подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS при рН 7,4, инкубации в течение 15 минут с последующим центрифугированием в течение 25 минут при 600 g и сбором первого супернатанта. Затем проводят встряхивание с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 500 g и сбор второго супернатанта. Фильтрацию и ультрацентрифугирование выполняют одновременно с помощью ультрацентрифужных фильтровальных пробирок. Полученный суммарный пул экзосом крови включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови. Изобретение позволяет повысить выход целевого продукта. 1 табл., 5 пр.

Применение стромальных стволовых клеток жировой ткани для лечения свищей // 2608641

Изобретение относится к клеточной технологии. Описано применение полученных из жировой ткани стромальных стволовых клеток в производстве фармацевтической композиции для лечения свища у субъекта, где указанные полученные из жировой ткани стромальные стволовые клетки являются аллогенными по отношению к субъекту, которого предстоит лечить. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения свища. 27 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр.

Клеточная линия меланомы кожи человека mel ibr eemc, предназначенная для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы // 2608959

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, предназначенных для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы, и может быть использовано в медицине. Клеточную линию меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС получают из клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr. Полученная линия клеток хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157. Изобретение позволяет получить клеточную линию меланомы кожи человека, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и характеризуется экспрессией антигенов гистосовместимости I класса, дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44 и отсутствием антигенов гистосовместимости II класса. 1 табл.