Способ получения референс-панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для серологической диагностики маркеров вич-1

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано в технологии изготовления референс-панели сывороток, содержащих антигены и антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности тест-систем иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных и иммуноблотов. Способ получения референс-панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для серологической диагностики маркеров ВИЧ-1, включает отбор иммуноспецифических сывороток, содержащих антитела ко всем основным антигенам вируса и имеющих разную концентрацию этих антител, а также отбор нативных донорских сывороток с нулевым титром. Отбор сывороток для панелей производят по результатам их исследования методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на наличие инфекционного материала и титрования в подтверждающем анализе, тестируют вирусную нагрузку в реактивных сыворотках и в качестве иммуноспецифических сывороток выбирают только те сыворотки, которые в процессе титрования закономерно уменьшают величину оптической плотности (ОП) в ИФА и величину аналитического сигнала в ОТ ПЦР, которые затем аттестуют на количественное содержание в них РНК ВИЧ-1. В качестве донорских сывороток с нулевым титром выбирают только те, которые имеют отрицательный результат в ОТ-ПЦР и в ИФА - значение ОП<ОПкр для всех серологических маркеров. Отобранные реактивные сыворотки развитой стадии ВИЧ-1 инфекции разводят разводящим раствором (РР), не содержащим антитела к тестируемому вирусу, с получением разной концентрации антител ВИЧ-1. Для формирования референс-панели отбирают также 6 сывороток с нулевым титром для контроля специфичности тестов, 12 сывороток с различным титром р24 и 12 сывороток развитой стадии ВИЧ-1 инфекции с титром меньше 1:200, причем часть иммуноспецифических образцов содержат маркеры коинфекции ВИЧ с гепатитами В и С и туберкулеза при общем количестве сывороток в референс-панели не менее 30. Изобретение обеспечивает достоверную оценку качества молекулярных и серологических анализов на стадиях до и в начале сероконверсии в области низких значений оптической плотности, близких к ОПкр, и в присутствии серологических маркеров коинфекции (гепатитов С и В и туберкулеза). 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано в технологии приготовления референс-панели сывороток, содержащих антигены и антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности и сроков годности тест-систем иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных и иммуноблотов.

Основной причиной ложноположительных результатов ИФА является состав тестируемого образца сыворотки или плазмы. Наиболее частым компонентом сывороток ВИЧ инфицированных являются маркеры вирусных гепатитов В и С, а также туберкулеза. Следовательно, при формировании серологических референс-панелей следует учитывать растущее количество вариантов коинфекции ВИЧ с маркерами этих инфекций. Доля коинфекции ВИЧ и ВГС за последние годы выросла до 50% от количества ВИЧ инфицированных, ко-инфекция ВИЧ и ВГВ достигла 10-15%, а частота обнаружения маркеров туберкулеза у ВИЧ инфицированных в терминальной стадии составляет не менее 20% (Mathews G, Bhagani S. The epidemiology and natural history of HIV/HBV and HCV co-infections. J HIV Ther. 2003;8:77-84.; Iademarco MF, Castro KG. Epidemiology of tuberculosis. Semin Respir Infect. 2003; 18:225-240).

Как известно из литературы, структура и состав референс-панели должны соответствовать основным этапам течения вирусной инфекции и включать маркеры к основным субтипам вируса в данном регионе, а также учитывать уровни коинфекции с вирусными гепатитами и туберкулезом.

Первые маркеры ВИЧ-1 инфекции: молекулярные - РНК и провирусная ДНК ВИЧ, которые могут быть выявлены методом ПЦР на 7-8 день. Вирусная нагрузка достигает 10⁴-10⁶ копий РНК/мл. Это самая активная фаза для заражения.

Первый серологический маркер инфекции р24 появляется через 3 недели от момента инфицирования. Т-клеточный ответ практически снижает уровень р24 до нуля в течение 2-3-х недель.

Через 5-7 недель происходит сероконверсия и содержание вируса в крови начинает резко снижаться. Возникает ситуация, когда ВН и содержание р24 падают до нуля. Формируется В-клеточный ответ, появляются новые маркеры инфекции: иммуноглобулины против р24, gp41 и gp120.

Таким образом, в ранней стадии ВИЧ-инфекции можно опираться на анализы РНК ВИЧ и р24. Тест на р24 с 1995 г является обязательным для скрининга донорской крови. Специфичность теста высока (99%), но чувствительность не превышает 80%. Выявление р24 возможно только в краткий период - несколько дней - и затем р24 исчезает из кровотока под натиском иммунного ответа.

Весьма чувствительным в остром периоде остается ПЦР РНК на уровне 10⁴ копий. Более низкие уровни соответствуют окончанию острого периода. Недостатком метода служит контаминация пробы и ложноположительные результаты (ЛПР) в результате коинфекции, но при этом ВН не превышает 5000 коп/мл. Дополнением метода ВН является тест на ДНК ВИЧ, но он тоже фиксирует ЛПР.

Алгоритм выявления острой ВИЧ-инфекции. Диагноз острой ВИЧ-инфекции основан на обнаружении репликации вируса в отсутствие антител. Соответственно, алгоритм выявления острой инфекции включает параллельное определение РНК и антител к ВИЧ-1.

Многие лаборатории заинтересованы в использовании наиболее чувствительных тест-систем для выявления ВИЧ антител, для того чтобы исключать ложноотрицательные результаты (ЛОР). Хорошо известно, что ВИЧ антитела имеют низкую концентрацию и низкий аффинитет на первом этапе сероконверсии, так что их трудно диагностировать в течение первых 5-6 недель после ВИЧ инфекции, когда иммунный ответ только зарождается.

Образцы сывороток начала сероконверсии по некоторым признакам отличаются от образцов антител на стадии развитой ВИЧ инфекции.

- Ранние образцы могут содержать р24 антиген и IgM или IgA антитела в дополнение к IgG3 антителам; более поздние образцы часто содержат только IgG1 антитела.

- Некоторые ВИЧ антитела появляются ранее, чем другие: например репертуар в иммуноблотинге (ИМБ) указывает, что р24 появляется первым, за ним следуют антитела к gp120/160, и потом появляются остальные, последним обычно выявляют антитела к p31.

К сожалению, сыворотки некоторых людей, не инфицированных ВИЧ, при иммуноблоттинге в той или иной степени реагируют с одним или несколькими антигенами ВИЧ. Такая реакция бывает почти у 5% здоровых людей, не инфицированных ВИЧ; она нередко наблюдается у лиц с отрицательным результатом скринингового тестирования. Таким образом, многие сыворотки, давшие отрицательный результат при скрининговом тестировании методом ИФА, дадут сомнительный результат при иммуноблоттинге. В большинстве случаев при сомнительных результатах слабо окрашиваются полосы, соответствующие белкам полипротеина Gag (главным образом, р17, р24 и/или р55). Встречаются и другие наборы полос при ЛПР, но реже. Любой результат иммуноблоттинга, не удовлетворяющий критериям положительного или отрицательного результата, должен считаться сомнительным (Tebourski F., Slim A. and Elgaaied A. Disease Control criteria to resolve indeterminate human immunodeficiency virus type-1 Western blot results // Diagnostic Microbiology and Infectious Disease Vol. 48, 2004, P. 59-61]).

Из источников патентной информации известны способы получения контрольных сывороток, используемых в диагностических анализах (Заявка ЕПВ №0062227, МКИ G01 №33/96, опубл. 13.10.92 г.; заявка ЕПВ №0131826, МКИ G01 №33/96, опубл. 23.01.85 г.; заявка ФРГ №3324626, МКИ G01 №33/96, опубл. 17.01.85 г.; патент US 7179600, МПК C12N 15/09, опубл. 20.02.2007; заявка KR 2002997, опубл. 08.01.2002; межд. заявка WO 200200640, опубл. 10.04.2002). Однако такие сыворотки не могут быть использованы для глубокого контроля качества тест-систем и иммуноблотов (ИМБ), т.к. они не отражают все характеристики выборки сывороток, соответствующих возникновению и развитию вирусной инфекции. Именно с этой целью формируют панели сывороток.

Как самостоятельный тест, анализ р24 имеет невысокую чувствительность, но составляет важное дополнение в комбинации скриннинговых тестов ВИЧ-инфекции, главным образом, теста ELISA на антитела ВИЧ. Теоретически антигемения р24 может быть использована для выявления инфицированных лиц в период «window period» до начала сероконверсии, когда уровень р24 относительно высок.

Таким образом, использование комбинации антиген/антитело для скриннинга ВИЧ-инфекции оказывается высоко чувствительной и специфичной для детектирования ранней стадии ВИЧ.

Из источников научно-технической информации известны способы приготовления референс-панелей позитивных к ВИЧ или ВГС сывороток крови для оценки чувствительности диагностических иммуноферментных тест-систем (Lee Sh., Wood О., Taffs RE., Hu Ji., Machuca A., Vallejo A. and Hewlett In. Development and evaluation of HIV-1 subtype RNA panels for the standardization of HIV-1 NAT assays. Journal of Virological Methods, Volume 137, Issue 2, November 2006, Pages 287-29) [2, 13, 17]. Способы-аналоги включают приготовление набора иммунных сывороток, содержащих специфические антитела к основным белкам HIV-1 или ВГС и имеющих разную концентрацию этих антител. Полученная таким способом, например, стандартная панель ОСО 42-28-212-02П включает 16 сывороток крови носителей ВИЧ-1 (Стандартная панель анти-ВИЧ1 «СТАНДАРТ АТ(+)ВИЧ-1» (ОСО 42-28-212-02П) в сб.: Продукция ЗАО «МБС» для ИФА-диагностики. Информационный бюллетень ЗАО МБС, Новосибирск 2013, 39-47).

Недостатками таких способов-аналогов получения референс-панели сывороток являются следующие.

1. Образцы панели не аттестованы по величине вирусной нагрузки (ВН) и по наличию и концентрации р24.

2. Отсутствие в образцах панели р24 свидетельствует, что образцы сывороток получены от пациентов в resolved стадии ВИЧ инфекции и содержат анти-ВИЧ-1 IgG в высоких титрах. В панели ОСО 42-28-212-02П отсутствуют образцы ранней стадии ВИЧ-1 инфекции.

3. Панель не позволяет контролировать специфичность тест-систем, т.к. составлена из положительных сывороток.

Кроме того, в состав стандартной панели ОСО 42-28-212-02П входят сыворотки пациентов с высоким содержанием антител IgG1 и поэтому панель малопригодна для оценки достоверности результатов анализов, например, при выявлении низкотитражных ранних сывороток или при дискриминации ложноположительных сывороток, имеющих отличный репертуар антител.

В качестве прототипа выбран способ приготовления панели сывороток фирмой Boston Biomedica Inc., именуемой Anti-HIV Mixed Titer Performance Panel (Информационный бюллетень фирмы Boston Biomedica, Inc., Anti-HCV Low Titer Performance Panel. PHV 106. BBI Diagnostics. A Sera Care Company. 02.2006).

Способ включает:

- отбор иммунных сывороток, содержащих специфические антитела к основным антигенам тестируемого вируса и имеющих разную концентрацию этих антител;

- определение вирусной нагрузки ВИЧ;

- титрование антител ВИЧ-1 в донорской сыворотке;

- включение в состав панели донорских сывороток с нулевым титром.

К недостаткам прототипа следует отнести следующее.

1. Каждая панель BBI anti-HIV - 1 Mixed Titer Performance Panel PRB 204 включает 25 разведенных сывороток в жидком виде.

2. Не определены сроки забора сывороток относительно начала инфекции ВИЧ, т.е. не указаны образцы острого периода.

3. Только 2 образца панели представляют коинфицированные сыворотки с гепатитом В.

4. Сыворотки панели не стабилизированы.

5. Запрещено замораживание сывороток. По этой причине сыворотки панели должны храниться не ниже минус 20°С.

6. Характеристики сывороток панели служат только для информационных целей и фирма не гарантирует воспроизведение указанных характеристик при проведении анализов пользователями. Область их применения ограничена рамками решения исследовательских задач.

6. Стоимость панелей высока и колеблется от 1700 до 2000 долларов США.

При развитии ВИЧ-инфекции очень трудно выявить пациента в острый период из-за полного отсутствия каких-либо внешних признаков и болезненных ощущений. Большей частью инфицированные пациенты обращаются с жалобами, когда прошла сероконверсия и титры антител уже достаточно высоки (Koch W. Diagnostics and therapeutics in partnership. // IVD technology 2008, 14, 24-31). Панель такого состава не может быть использована для целей контроля качества диагностики ранней ВИЧ-инфекции, т.к. репертуар маркеров ранних сывороток отличается от репертуара сывороток хронической стадии инфекции (Богословская, Е.В. Изучение распространенности различных субтипов ВИЧ на территории РФ. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная Диагностика - 2010». - Москва, 2010. - Том 1. - С. 16-19).

Панель, изготовленная по способу-прототипу, малопригодна для оценки правильности результатов анализов, например, при дискриминации ложноположительных сывороток раннего периода, имеющих значения ОП, близкие или совпадающие с ОПкр (Cut off).

Кроме того, большое неудобство доставляет транспортировка и хранение панелей при температурах ниже минус 10°С, но не ниже минус 20°С (т.к. запрещено замораживание-оттаивание сывороток). При условиях перевозок, существующих в России и странах СНГ, такие панели быстро становятся непригодными.

Все это, несомненно, связано с тем, что сыворотки панели не стабилизированы. Практически нестабилизированные сыворотки не могут быть аттестованы, т.к. по правилам ВОЗ биологические референс-материалы должны иметь срок хранения более 2-х лет.

Подводя итоги изложенному выше, следует отметить, что производимые за границей панели сывороток не могут быть рекомендованы к использованию российским производителям тест-систем или работникам станций переливания крови (гематологических центров), т.к. зарубежные панели зачастую имеют неопределенный репертуар антител, очень чувствительны к температурным условиям транспортировки и хранения, и цены на них традиционно высоки.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого способа, который обеспечивал бы изготовление национальных референс-панелей сывороток маркеров ВИЧ-1 инфекции, позволяющих более достоверно оценивать качество молекулярных и серологических анализов (ПЦР и ИФА тест-систем и иммуноблотов) на стадиях до и в начале сероконверсии в области низких значений оптической плотности (ОП), близких к ОПкр, и в присутствии серологических маркеров коинфекции (гепатитов С и В и туберкулеза), т.е. способных повысить контроль чувствительности тест-систем и усилить контроль их специфичности на различных стадиях ВИЧ-1 инфекции.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения референс-панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для серологической диагностики маркеров ВИЧ-1, включающем отбор иммуноспецифических сывороток, содержащих антитела ко всем основным антигенам вируса и имеющих разную концентрацию этих антител, а также отбор нативных донорских сывороток с нулевым титром, согласно изобретению, отбор сывороток для панелей производят по результатам их исследования методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на наличие инфекционного материала и титрования в подтверждающем анализе (ИМБ, СПЕКТР), причем тестируют вирусную нагрузку (ВН) в реактивных сыворотках, и далее в качестве иммуноспецифических сывороток выбирают только те сыворотки, которые в процессе титрования закономерно (в соответствии с калибровочным графиком, построенным по закону Бугера-Ламберта - Бера: оптическая плотность раствора прямопропорциональна концентрации светопоглощающего вещества) уменьшают величину оптической плотности (ОП) в ИФА и величину аналитического сигнала в ОТ ПЦР, а в качестве донорских сывороток с нулевым титром - только те, которые имеют отрицательный результат в ОТ-ПЦР, а в ИФА - значение ОП<ОП кр для всех серологических маркеров, кроме того, отобранные реактивные сыворотки развитой стадии ВИЧ-1 инфекции разводят разводящим раствором (РР), не содержащим антитела к тестируемому вирусу, с получением разной концентрации антител ВИЧ-1.

В качестве иммуноспецифических сывороток отбирают сыворотки, содержащие антиген р24 и содержащие антитела ВИЧ с титром от 1:20 до 1:200, а в качестве нативных донорских сывороток с нулевым титром - сыворотки с ОП в ИФА в диапазоне от 0,02 о.е. до ОП кр.

Разведение иммуноспецифических сывороток производят в пуле донорских сывороток, причем во все сыворотки панели вводят стабилизатор, содержащий (мас. %): триптон или БСА (1,0-3,0), трегалозу (1,0-2,0) и бактериостатик (0,01-0,02).

Образцы иммуноспецифических сывороток дополнительно аттестуют на количественное содержание в них РНК ВИЧ-1.

Для формирования референс-панели отбирают 6 сывороток с нулевым титром для контроля специфичности тестов, 12 сывороток с различным титром р24 и 12 сывороток развитой стадии ВИЧ-1 инфекции с титром меньше 1:200, причем часть иммуноспецифических образцов содержат маркеры коинфекции ВИЧ с гепатитами В и С и туберкулеза при общем количестве сывороток в референс панели не менее 30.

Приготовленные сыворотки в стандартной панели высушивают до остаточной влажности менее 2,0 мас. % путем лиофилизации.

Описание способа получения референс-панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для серологической диагностики маркеров ВИЧ-1 (ПМ ВИЧ-1). Отбор сывороток для панелей производят по результатам исследования наличия р24 и положительного результата в ОТ-ПЦР на РНК ВИЧ-1 и в ИФА тестах. Причем в качестве иммуноспецифических сывороток выбирают только те, которые в процессе титрования закономерно (в соответствии с калибровочным графиком, построенным по закону Бугера-Ламберта-Бера: оптическая плотность раствора прямопропорциональна концентрации светопоглощающего вещества) снижают величину оптической плотности (ОП) в ИФА и значение аналитического сигнала в ОТ-ПЦР.

На следующем этапе тестируют биохимические параметры: общий белок и уровень аминотрансфераз, титруют в ИФА р24 антиген.

Окончательно для формирования национальной референс-панели отбирают 14 ранних сывороток с разным титром р24 и 10 сывороток с этапа развитой инфекции ВИЧ1. Большая часть положительных образцов сывороток ВИЧ-1 пациентов коинфекцированы ВГС, ВГВ или туберкулезом.

Для контроля специфичности ПЦР и ИФА наборов в состав панели вводят 6 сывороток здоровых доноров (Таблица 3).

Отобранные сыворотки-кандидаты стабилизируют и высушивают методом лиофилизации. Состав и структура национальной референс-панели позволяют сформировать из нее 3 контрольных панели для исследования качества диагностики ВИЧ-1 инфекции на отдельные маркеры.

1. Основным параметром образцов сывороток служит вирусная нагрузка (ВН), т.к. вирус присутствует практически на всех стадиях развития инфекции. Контрольную панель ВН в диапазоне 10²-10⁶ экв РНК/мл формируют для тестирования чувствительности ПЦР наборов. Панель может включать, например, образцы с различной концентрацией ВИЧ-1 и №27 для контроля специфичности.

2. Контрольная панель р24 антигена на основе референс-панели может быть сформирована в диапазоне от 100 ME до 1000 МЕ/мл. Панель включает образцы с различной концентрацией антигена р24 и образец №28 для контроля специфичности.

3. Контрольная панель анти-ВИЧ1 антител может быть сформирована в диапазоне титров от 1:500 до 1:5. Такая панель включает образцы с различной концентрацией антител и образцы №29-30 для контроля специфичности.

Важной проблемой при аттестации сывороток панели серологических маркеров ВИЧ инфекции является контроль чувствительности тест-систем для выявления р24 или антител к ВИЧ. В научной литературе и лечебной практике отсутствуют критерии однозначной идентификации антител к ВИЧ или диагноза ВИЧ инфекции. В этих случаях следует руководствоваться рекомендациями ВОЗ или CDC (Atlanta, US).

Согласно правилам ВОЗ и CDC препарат считается положительным на содержание антител к ВИЧ, если в иммуноблоте фиксируется не менее 2-х полос. ВОЗ критерий позитивности сывороток включает требование реактивности минимум 2-х полос gp41 & gp120, в то время как критерий CDC требует считать сыворотку позитивной, если в ней детектируются антитела, реактивные против 2-х из 3-х диагностических протеинов ВИЧ-1: р24, gp41 и gp120/160. Наконец, существует эмпирический критерий позитивности, который формирует условие, что сыворотка может быть признана положительной, если присутствуют одновременно 2 вирусных белка p31 и gp160 (Heffelfinger J.D.; Owen S.M.; Hendry R.M.; Lansky A. HIV Testing: The Cornerstone of HIV Prevention Efforts in the USA // Future Virol. 2011, 6, 1299-1317).

При этом сама процедура исследования предусматривает обязательное титрование сывороток от нативных значений оптической плотности (ОП) до ОПкр. И только в том случае, когда аналитический сигнал закономерно уменьшается с разведением, принимается, что регистрируемые антитела являются антителами именно к тестируемому вирусу, например ВИЧ-1, а сама сыворотка содержит инфекционный материал. Дополнительным подтверждением сомнительных результатов ИФА служат результаты ПЦР ВИЧ1. Таким образом, процедура отбора сывороток-кандидатов для референс панели включает три этапа, результаты которых независимы и позволяют надежно идентифицировать маркеры тестируемого вируса.

На 1-м этапе результаты определения РНК ОТ-ПЦР на ВИЧ-1 служат прямым критерием позитивности сыворотки. Позитивные образцы сыворотки должны содержать ВИЧ РНК и быть положительными в ИФА р24 и/или на антитела. Отрицательные образцы сывороток должны быть негативными в ОТ-ПЦР и иметь ОП<ОПкр в ИФА.

Кандидаты на ранние серологические маркеры ВИЧ-1 титруют с шагом 2, начиная с разведения 1:5 в двух тестах: "Бест - anti HIV" (ЗАО «Вектор Бест», Новосибирск) и "АГ/АТ ВИЧ" (ЗАО МБС, Новосибирск). Отбирают 14 сывороток - кандидатов при значениях коэффициента позитивности К+=ОП/ОПкр р24 от 1.5 до 8.0. Дополнительно отбирают сыворотки пациентов с развитой стадии ВИЧ, позитивных в ПЦР РНК ВИЧ-1, но не содержащих р24 антиген.

На 2-м этапе с помощью тестов «Бест анти-ВГС», «Инвитролоджик ВГВ АГ/АТ» и «АТ-Туб-Бест» отбирают образцы ВИЧ инфицированных с коинфекцией ВГВ, ВГС и туберкулеза, всего 10 образцов.

Одновременно исследуют сыворотки доноров для отбора образцов, не содержащих маркеры ВИЧ-1 и отрицательные в ПЦР-исследованиях на вирусы ВИЧ, ВГС, ВГВ и сифилиса.

Результаты исследований представлены в таблицах 1-3.

В Таблице 1 представлены примеры исследований 20 кандидатов в панель по иммунохимическим и биохимическим параметрам.

В Таблице 2 представлены результаты титрования кандидатов ранней стадии инфекции ВИЧ-1 на р24. 1-е разведение 1:5, и шаг титрования 2. Тест-система «КомбиБест ВИЧ-1,2 АГ/АТ (37°С, шейкер), ОПкр=0.205 о.е.

Далее референс-панель ВИЧ-1 формируют из отобранных на двух этапах сывороток кандидатов с различной концентрацией р24 и кандидатов с различными маркерами коинфекции ВИЧ с вирусными гепатитами и туберкулезом: 14 образцов - ранних маркеров, 4 образца развитого этапа, 6 образцов коинфекции В и С, 2 обр. - коинфекции туберкулеза, 6 отрицательных образцов, которые служат внутренним стандартом специфичности диагностического набора.

Образцы (№1-14) сывороток раннего периода включают в состав панели в нативной форме. Нормировку анти-ВИЧ антител в сыворотках развитого этапа инфекции (№15-24) осуществляют путем разведения аттестованных кандидатов до титров 1:10-1:200 в пуле донорских сывороток, не содержащих антитела к тестируемому вирусу, отрицательных в ОТ-ПЦР и имеющих нормальный уровень трансфераз.

Для сохранения неизменными значений специфических показателей сывороток референс-панели на длительный срок в последние добавляют стабилизатор на основе триптона (2,5-3 мас. %) трегалозы (1,0-1,5 мас. %), бактерицидов (0,01-0,02 мас. %) и затем высушивают до остаточной влажности не более 2,0 мас. % путем лиофилизации для длительного хранения.

Сравнение панели сывороток, приготовленной в соответствии с заявляемым способом, с панелью фирмы Boston Biomedica Inc. того же назначения, приготовленной по способу-прототипу (Информационный бюллетень фирмы Boston Biomedica, Inc., Anti-HCV Low Titer Performance Panel. PHV 106. BBI Diagnostics. A Sera Care Company. 02.2006), показывает, что отличная от прототипа совокупность существенных признаков обеспечивает новое раннее неизвестное свойство: возможность формирования национальной панели из аттестованных сывороток ВИЧ инфицированных и коинфицированных пациентов, что позволяет более надежно и правильно контролировать качество изготовляемых тест-систем и иммуноблотов, особенно в области значений ОП, близких к ОПкр. В качестве примеров использования панелей сывороток для контроля качества тест-систем приведены данные для референс панели ПМ анти-ВИЧ в скриннинговом и в подтверждающем форматах (Таблица 3).

Дополнительными параметрами ПМ ВИЧ-1 относительно панелей анти-ВИЧ (Catalog ZeptoMetrix Corporation (Franklin, MA 02038), 2003 и BBI Ltd.) являются титры p24 и наличие антител к ВГС и туберкулезу, наряду с р24 или антителами ВИЧ1.

На основе аттестованных свойств панели сывороток оценивают качество и сроки годности ПЦР систем и тест-систем анти-ВИЧ, используемых в практической медицине. При проведении контроля качества тест-систем, основанных на других принципах (иммуноблот, иммунофлуоресценция, агглютинация и др.), количество используемых сывороток референс панели и проведение испытаний регламентируются соответствующей НТД на тест-системы.

Пример выполнения заявляемого способа.

1. Поступление образцов плазмы. Сбор образцов крови предусматривает получение небольшого количества плазмы (2-7 мл), что позволит выполнить молекулярные исследования, ИФА и биохимические анализы и обеспечить производство. Забор крови производится одноразово после медицинского осмотра волонтеров. Для получения образца плазмы использованы специально предназначенные для этого безопасные одноразовые системы Vacutainer.

Забор крови проводится среди ВИЧ-инфицированных нелеченных пациентов, а также среди здоровых доноров, которые добровольно согласятся на проведение забора крови для изготовления стандартных препаратов.

После забора образцы плазмы передают в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» в условиях, исключающих разрушение нуклеиновых кислот или контаминацию образцов.

Образцы плазмы поступают на производство в вакутайнерах CPDA-1 емкостью 5-10 мл, герметично укупоренные, замороженные.

Каждая плазма, поступающая на производство для изготовления ПМ ВИЧ1, должна иметь паспорт с характеристиками - ИН (индивидуальный номер) донора, объем сыворотки, дату забора крови, предприятие-изготовитель, а также отвечать следующим требованиям: без признаков гемолиза и гиперлипидиемии, прозрачная, цвет - янтарный или светло-желтый, посторонние механические примеси, взвесь, осадок отсутствуют. Каждому вакутайнеру присваивают кодирующий номер.

Молекулярная диагностика. Для приготовления панели серомаркеров различных генотипов ВИЧ1 отбирают в процессе первичного скрининга (методом ИФА) 30 иммуноспецифических сывороток крови ВИЧ1 инфицированных лиц (ОП в диапазоне от 1,0 до 3,5 о.е.) и 10 донорских сывороток (ОП в диапазоне от 0,02 до 0,1 о.е.).

Отобранные после первичного скрининга кандидаты сиквенируют с помощью набора OneStep RT-PCR Kit (100) («QIAGEN», USA, Cat. No. 210212). Аликвоты сывороток крови для анализа методом ОТ-ПЦР хранили при минус 70°С в микропробирках по 1 мл. Выделение РНК ВИЧ проводили из 200 мкл сыворотки набором QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN, Cat # 57704) согласно инструкции производителя. Для амплификации фрагмента gag были выбраны праймеры, фланкирующие область гена р24, длиной 530 п. н. Для амплификации фрагмента env были выбраны праймеры, фланкирующие область гена gp120 длиной либо 1100 п. н., либо 410 п. н. (при невозможности получения большего фрагмента). Для амплификации фрагмента pro были выбраны праймеры, фланкирующие последовательность всего гена протеазы. При выборе праймеров пришлось ограничиться областями ВИЧ с достаточно высокой изменчивостью, поэтому был выбран формат амплификации - Nested ПЦР (или двухраундная ПЦР), которая позволяет решить проблему изменчивости и наработать достаточное количество ампликонов для последующего анализа нуклеотидной последовательности. На 2 м этапе стерильно отбирают по 300 мкл кандидатов в панель для тестирования по показателям вирусная нагрузка (ВН), титр р24 и титр анти-ВИЧ1 антител.

Инактивация сывороток. После отбора образцов - кандидатов на специфические анализы вакутайнеры с плазмой помещают в термостат при температуре 56°С для инактивации ВИЧ. Фиксируют время начала инактивации. Термодеградацию плазмы проводят 2-3 ч. После истечения этого времени гемакон достают из термостата, фиксируют время окончания инактивации.

Введение в сыворотки консерванта и стабилизатора. В каждый вакутайнер с плазмой добавляют 0,05% раствор мертиолята и гентамицина из расчета по 0,5 мл раствора смеси бактериостатиков на 10 мл сыворотки-кандидата.

Основные компоненты стабилизатора: триптон и тригалозу вводят в образцы плазмы в концентрированной форме в донорской сыворотке с концентрацией 10% триптона и 4% тригалозы. Целевая концентрация стабилизаторов составляет 2,5 мас. % триптона и 1 мас. % трегалозы в сыворотке с 0,01 мас. % бактериостатиков.

Приготовление пула донорских сывороток. Из нативных сывороток крови, не содержащих маркеры вирусных инфекций, готовят пул не менее чем от 10 здоровых доноров в количестве 1000 мл. Стабилизированный пул отрицательных сывороток используют в качестве матрикса - разводящего раствора (РР) для титрования положительных образцов ПМ ВИЧ. Доводят pH раствора до 6.8-7.2 при комнатной температуре с помощью 0.1 N NaOH или 0.1 N HCl. Вводят в раствор стабилизатор: 2% (w/v) трегалозы плюс 1% (w/v) БСА в 0,05 М ФСБ и бактерицид - 0,02% азида натрия.

Растворы разливают стерильно в емкости по 50 мл и хранят при 2-8°С в течение не более 1 месяца. В замороженном виде, при температуре минус 20°С, растворы можно хранить в течение 3-х лет.

2. Титрование серологических маркеров кандидатов. Титрование кандидатов ПМ на р24 и на анти-ВИЧ 1 антитела проводят с использованием разводящего раствора (РР) на одном планшете в трех повторах в тест - системах Инвитролоджик ВИЧ-1,2- АГ/АТ (ЗАО МБС, Новосибирск) и ВектоВИЧ-1 р24-антиген (ЗАО Вектор Бест, Новосибирск). Титры р24 некоторых ранних образцов панели представлены в таблице 2.

По результатам титрования антител ВИЧ-1 в кандидатах с этапа развитой инфекции с помощью статистической обработки строят усредненные кривые титрования для каждого кандидата в PP. По кривым титрования определяют коэффициенты разведения до определенного титра для каждого кандидата. Разведение для каждого номера от №15 до №24 в определенных пропорциях осуществляют в течение 15-20 мин в колбе объемом 50 мл добавлением РР, установленной на магнитной мешалке.

При этом получено 4 иммуноспецифических сывороток с титром в диапазоне от 1:10 до 1: 50 и 6 иммуноспецифических сывороток с титром в диапазоне от 1:50 до 1:200. Сыворотки панели стабилизированы и инактивированы прогреванием при +56°С в течение 120 мин, но с ними обращаются как с потенциально инфекционным материалом.

Сыворотки разливают по 300 мкл во флаконы R2 и лиофильно высушивают на установке "TG-50" (ФРГ). Режим лиофилизации подбирают по результатам предварительного физико-химического анализа фазовых превращений в разводящей донорской сыворотке со стабилизатором при замораживании. Лиофильно высушенные сыворотки панели имеют остаточное содержание воды около 1,0 мас. %. Флаконы с сыворотками укупоривают под вакуумом. Все сыворотки панели аттестуют до и после лиофилизации в тест-системах: "КомбиБест ВИЧ - 1,2 АГ/АТ" (ЗАО "ВекторБест"); "ВИЧ - 1,2 - АГ/АТ" (ЗАО "Эколаб"); "ИФА ВИЧ АГ/АТ" (ЗАО "Палитра") - проверяют, что в процессе лиофилизации специфическая активность сывороток не изменяется. (Таблица 3).

Стабильность сывороток панели в различных условиях хранения во флаконах определяют по результатам теста термодеградации, выполненного при температурах: -20, +4, +37°С и +50°С. По результатам теста установлено, что сыворотки панели способны сохранить неизменной специфическую активность в течение не менее 2,2 лет при хранении при температуре от +2°С до +6°С.

Экономическая эффективность применения предлагаемого способа изготовления образцов панели ранних серологических маркеров ВИЧ-1 и коинфекции гепатитов В и С и туберкулеза заключается в том, что указанные антитела используются как прогностические маркеры ВИЧ. Они циркулируют в крови инфицированных на ранней стадии и в хронике. Раннее обнаружение маркеров ВИЧ обусловлено высокой чувствительностью тест-систем к р24 и антителам разных субтипов. Сокращение сроков установления диагнозов для инфицированных пациентов и более ранняя медицинская помощь и контролируемое по количеству и маркеров коинфекции ВИЧ-1 лечение составляют социально значимую и экономическую эффективность, связанные с сокращением сроков лечения и сроков трудовой недееспособности людей.

Введение российской панели серологических маркеров ВИЧ-1 создаст юридическую основу для контроля качества диагностики ВИЧ инфекции и значительно уменьшит расходы средств контрольных организаций здравоохранения на приобретение дорогостоящих заграничных аналогов.

1. Способ получения референс-панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для серологической диагностики маркеров ВИЧ-1, включающий отбор иммуноспецифических сывороток, содержащих антитела ко всем основным антигенам вируса и имеющих разную концентрацию этих антител, а также отбор нативных донорских сывороток с нулевым титром, отличающийся тем, что отбор сывороток для панелей производят по результатам их исследования методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на наличие инфекционного материала и титрования в подтверждающем анализе (ИМБ, СПЕКТР), тестируют вирусную нагрузку (ВН) в реактивных сыворотках; в качестве иммуноспецифических сывороток выбирают только те сыворотки, которые в процессе титрования закономерно уменьшают величину оптической плотности (ОП) в ИФА и величину аналитического сигнала в ОТ ПЦР, которые затем аттестуют на количественное содержание в них РНК ВИЧ-1; в качестве донорских сывороток с нулевым титром выбирают только те, которые имеют отрицательный результат в ОТ-ПЦР и в ИФА - значение ОП<ОПкр для всех серологических маркеров, а отобранные реактивные сыворотки развитой стадии ВИЧ-1 инфекции разводят разводящим раствором (РР), не содержащим антитела к тестируемому вирусу, с получением разной концентрации антител ВИЧ-1, кроме того, для формирования референс-панели отбирают 6 сывороток с нулевым титром для контроля специфичности тестов, 12 сывороток с различным титром р24 и 12 сывороток развитой стадии ВИЧ-1 инфекции с титром меньше 1:200, причем часть иммуноспецифических образцов содержат маркеры коинфекции ВИЧ с гепатитами В и С и туберкулеза при общем количестве сывороток в референс-панели не менее 30.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве иммуноспецифических сывороток отбирают сыворотки, содержащие антиген р24 и содержащие антитела ВИЧ с титром от 1:20 до 1:200, а в качестве нативных донорских сывороток с нулевым титром - сыворотки с ОП в ИФА в диапазоне от 0,02 о.е. до ОПкр.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что разведение иммуноспецифических сывороток производят в пуле донорских сывороток, причем во все сыворотки панели вводят стабилизатор, содержащий (мас.%): триптон или БСА (1,0-3,0), трегалозу (1,0-2,0) и бактериостатик (0,01-0,02).

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что приготовленные сыворотки в стандартной панели высушивают до остаточной влажности менее 2,0 мас.% путем лиофилизации.