Днк конструкт для экспрессии

Изобретение относится к области биохимии, в частности к ДНК конструкту для экспрессии генов в эукариотических клетках, где конструкт представляет линейную с открытой цепью двухцепочечную ДНК, содержащую промоторную последовательность, кодирующую последовательность и сигнал терминации, где конструкт содержит по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид и где по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид расположен в последних 2-5 нуклеотидах 5′- и/или 3′-конца, а также к фармацевтической композиции его содержащей. Изобретение также относится к способу стабильной или транзиентной трансфекции человеческих, животных или эукариотических клеток, включающему инкубацию человеческих, животных или эукариотических клеток с вышеуказанным ДНК конструктом. Изобретение позволяет эффективно осуществлять стабильную или транзиентную трансфекцию человеческих, животных или эукариотических клеток. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к минималистичному конструкту для экспрессии гена, его переносу в клетки и применению для экспрессии генов в молекулярной медицине.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ

Часто для ДНК вакцинации, терапии опухолей и профилактике используют конструкты для экспрессии генов. Векторные конструкции для этих целей должны обеспечить успешную трансфекцию и максимальную безопасность для пациента. Так называемые конструкты замкнутой кольцевой двухцепочечной ДНК на основе плазмиды, которые физически или химически трансфектированы в клетки, являются относительно безопасными. Однако, в зависимости от типа интересующих клеток, эффективность трансфекции, как правило, не удовлетворительная. Следовательно, плазмиды не применимы для клинических протоколов. Дополнительно, как правило, они включают несколько прокариотических белков (например, гены, устойчивые к антибиотикам), которые контрансферируются в клетки. Прокариотические промоторы не являются абсолютно молчащими в эукариотических клетках, что в результате может привести к нежелательному воздействию на иммунитет. Также иммунная система хозяина может удалять трансфектированные клетки. Дополнительно, неметилированные CG мотивы в плазмидных векторах могут обладать иммуностимулирующим воздействием, принимая во внимание по меньшей мере некоторую иммунотоксичность в протоколах генной терапии.

Часто используют дефектные по репликации ретровирусные или аденовирусные векторы в виду их высокой трансфекционной эффективности по сравнению с плазмидами. Однако они подвержены существенному риску рекомбинации с вирусами дикого типа или активации онкогенеза. Дополнительно, необходимость использования высоко вирусных титров может вызвать воспаление.

Следовательно, существует потребность в разработке улучшенных конструктов для экспрессии генов по существу без побочных эффектов плазмидных и вирусных векторов. В ЕР 0941318 описывается маленький, линейный, ковалентно закрытый, гантелеобразный новый тип вектора для минималистичной, иммунологически определенной генной экспрессии (MIDGE). MIDGE представляет минимальную единицу переноса гена; он содержит только минимум необходимых последовательностей: кассету экспрессии, содержащую промотор, ген и последовательность, стабилизирующую РНК, фланкированную двумя короткими шпилечными олигонуклеотидными последовательностями. Дополнительно, конструкция MIDGE обеспечивает средства для эффективной транспортировки в интересующую клетку.

MIDGE молекулы представляют намного меньшие, чем традиционно используемые плазмидные или вирусные, векторы и, следовательно, легче переносятся в клетки и позволяют высокую скорость экспрессии. Они содержат короткие шпильки на обоих концах для защиты кассеты экспрессии от расщепления нуклеазами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Объект настоящего изобретения относится к конструктам ДНК, эффективным для экспрессии генов в эукариотических клетках, защищенным от расщепления нуклеазами.

Настоящее изобретение относится к ДНК конструкту для экспрессии генов, где конструкт представляет линейную с открытой цепью двухцепочечную ДНК, содержащую промоторную последовательность, кодирующую последовательность и сигнал терминации, где конструкт содержит по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид. Также настоящее изобретение относится к линейному частично двухцепочечному гантелеобразному ДНК конструкту, содержащему по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид.

Дополнительно настоящее изобретение относится к конструкту, где по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид расположен на 5′- и/или 3′-конце. Одноцепочечная петля может быть расположена на 5′- и/или на 3′-конце, также в комбинации по меньшей мере с одним L-ДНК нуклеотидом, который расположен в последних 2-5 нуклеотидах 5′-и/или 3′-конца.

Конструкт по настоящему изобретению может содержать частично или полностью двухцепопчечную ДНК. Дополнительно, конструкт может содержать по меньшей мере один L- или D-ДНК нуклеотид, модифицированный функциональной группой, выбранной из группы, содержащей карбоксильную группу, аминную, амидную, альдиминную, кетальную, ацетальную, сложного эфира, простого эфира, дисульфидную, тиоловую и альдегидные группы.

Нуклеотид может быть связан с соединением, выбранным из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, липидов, пузырьков, антител, синтетических молекул, полимеров, микрочастиц, частиц металлов, наночастиц или твердых фаз.

Конструкт по настоящему изобретению содержит промотор, который выбирают из группы, состоящей из промоторных последовательностей, которые работают в человеческих, животных или эукариотических клетках. Конструкт может кодировать белки, пептиды, антитела, гормоны, цитокины или биологически активные вещества, такие как ингибирующие, регулирующие или стимулирующие РНК или иммуномодуляторы.

Дополнительно объект настоящего изобретения относится к применению указанного выше ДНК-конструкта для стабильной или транзиентной трансфекции человеческих, животных или эукариотических клеток, наряду с генной терапией или ДНК вакцинацией. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «генная терапия» относится к in vivo или ex vivo, наряду с аутогенной или аллогенной терапией.

Дополнительный объект настоящего изобретения относится к применению указанного выше ДНК конструкта для профилактической или терапевтической вакцинации против инфекционных заболеваний или паразитов.

ДНК конструкты по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения рака или аутоиммунных заболеваний, необязательно совместно с применением не кодирующего иммуностимулирующего ДНК конструкта.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанный выше ДНК конструкт. Такая фармацевтическая композиция также может содержать химиотерапевтический агент. В качестве альтернативы, она может содержать дополнительный антиген бактериального, грибкового, паразитарного или вирусного происхождения.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к линейной с открытой цепью последовательности ДНК, полученной как ДНК конструкт. Указанная ДНК последовательность может представлять одноцепочечную или частично или полностью двухцепочечную. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин ДНК конструкт, ДНК молекула и конструкт для экспрессии являются синонимами и не ограничивают длину соответствующей ДНК последовательности. Мономерные единицы ДНК конструктов представляют нуклеотиды.

ДНК конструкт может быть получен синтетически или частично или полностью может быть биологического происхождения, где биологическое происхождение относится к генным способам получения последовательностей ДНК.

L-ДНК или нуклеотиды в L-конфигурации относятся к нуклеотидам, содержащим L-дезоксирибозу в качестве сахарного остатка вместо естественным образом присутствующей D-дезоксирибозы. L-дезоксирибоза представляет энантиомер (зеркальное отражение) D-дезоксирибозы. ДНК конструкты, частично или полностью состоящие из нуклеотидов в L-конфигурации, могут представлять частично или полностью одноцепочечные или двухцепочечные; однако нуклеотиды в L-конфигурации не могут гибридизоваться с нуклеотидами в D-конфигурации (Hauser et al., Nucleic Acid Res. 2006 34: 5101-11). L-ДНК является равно растворимой и селективной, как D-ДНК. При этом L-ДНК устойчива к расщеплению присутствующими естественным образом ферментами, в частности экзонуклеазами, таким образом, L-ДНК защищена от биологического разрушения (Urata et al., Nucleic Acids Res. 1992 20: 3325-32). Следовательно, L-ДНК имеет очень широкое применение.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «стебель» относится к двухцепочечной ДНК, образованной спариванием оснований в той же самой молекуле ДНК (которая затем частично самокомплементируется) или в других молекулах ДНК (которые частично или полностью комплементарны). Внутримолекулярное спаривание оснований означает спаривание оснований в тех же самых молекулах, а спаривание оснований между другими молекулами ДНК определяется как межмолекулярное спаривание оснований.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «петля» относится к неспаренной, одноцепочечной области внутри или на конце структуры стебля. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «шпилька» относится к отличающейся комбинации стебля и петли, которая имеет место, когда две самокомлементирующихся области одной и той же молекулы ДНК гибридизуются с образованием стебля с неспаренной петлей.

Гантелеобразная форма описывает линейный конструкт ДНК со шпильками на обоих концах, фланкирующих область стебля. Таким образом, «линейный конструкт ДНК» в контексте настоящего изобретения описывается как линейный с открытой цепью конструкт ДНК, содержащий одно- или двухцепочечную ДНК, или как линейный гантелеобразный конструкт ДНК, содержащий одноцепочечные петли на обоих концах двухцепочечной ДНК стебля.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «конец ДНК» обозначает 5′- или 3′-конец одноцепочечной ДНК и относится не только к терминальному нуклеотиду, но включает пять последних нуклеотидов соответствующего конца ДНК. Модификация конца ДНК относится по меньшей мере к одному из соответствующих нуклеотидов.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «твердая фаза», к которой нуклеотиды ковалентно или не ковалентно прикреплены, относится без ограничения к колонке, матрице, гранулам, стеклу, включая модифицированное или функционализированное стекло, кремний или материалы на основе кремния, включая силикон и модифицированный силикон, пластики (включая, полипропилен, полиэтилен и сополимеры стирола и другие материалы, акрилы, полибутилен, полиуретаны и тому подобное), нейлон или нитроцеллюлозу, смолы, полисахариды, углерод, а также неорганическое стекло и пластики. Таким образом, микротитрационные планшеты также входят в объем твердой фазы по настоящему изобретению.

Иммуномодуляция по настоящему изобретению относится к иммуностимуляции и иммуносупрессии. Иммуностимуляция предпочтительно означает, что клетки-эффекторы иммунной системы стимулированы для пролиферации, миграции, дифференцировки или проявления активности в любой другой форме. Пролиферация клеток, например, может быть индуцирована без костимулирующих сигналов при использовании иммуностимулирующих молекул ДНК, которые в норме требуют костимулирующего сигнала от хелперных Т-клеток.

С другой стороны, иммуносупрессию следует понимать как снижение активности или эффективности иммунной системы. Иммуносупрессия специально индуцирована для профилактики, например, отторжения трансплантированных органов, лечения реакции трансплантат против хозяина после трансплантации костного мозга или для лечения аутоиммунных заболеваний, например ревматоидных артритов или болезни Крона.

В этом контексте иммуностимуляция также может относиться к воздействию на природу или характер иммунной реакции, либо воздействию на иммунную реакцию, которая все еще развивается или созревает, либо к модуляции характера устойчивой иммунной реакции.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «вакцинация» относится к введению антигенного материала (вакцина) с получением иммунитета к заболеванию. Вакцины могут предотвратить или улучшить последствия инфицирования множеством патогенов, таких как вирусы, грибки, простейшие паразиты, бактерии, а также аллергические заболевания и астма, наряду с опухолями. Как правило, вакцины содержат один или более адъювант, например иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, используемые для стимуляции иммунного ответа. Общепринято, что вакцины являются самым эффективным и самым экономичным способом профилактики инфекций и других заболеваний.

Вводимый материал может, например, представлять живые, но ослабленные формы патогенов (такие как грибки, бактерии или вирусы), убитые или инактивированные формы этих патогенов, очищенный материал, такой как белки, нуклеиновые кислоты, кодирующие антигены, или клетки, такие как клетки опухоли или дендритные клетки. В частности, недавно была разработана ДНК вакцинация. ДНК вакцинация работает за счет вставки (и экспрессии, запуск распознавания иммунной системой) ДНК, кодирующей антигены, в клетки человека или животного. Некоторые клетки иммунной системы, которые распознают экспрессированные белки, атакуют эти белки и клетки, экспрессирующие их. Одним из преимуществ ДНК вакцин является простота их получения и хранения. Дополнительно, ДНК вакцины имеют множество преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами, включая способность индуцировать широкий ряд типов иммунных ответов.

Вакцинация может быть использована в качестве профилактики, позволяющей создать иммунитет против антигена у вакцинированного здорового индивидуума после воздействия антигена. В качестве альтернативы, терапевтическая вакцинация может вызвать усиленный ответ иммунной системы вакцинированного больного индивидуума, направляя иммунную систему индивидуума против антигенов. Обе, и профилактическая, и терапевтическая вакцинация, могут быть применены для людей и животных.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «генная терапия» относится к временной или постоянной генетической модификации (например, вставка, изменение или удаление генов) клеток и/или биологических тканей индивидуума для лечения заболеваний, таких как опухоли или аутоиммунные заболевания. Самая распространенная форма генной терапии включает вставку функциональных генов в неспецифическую геномную локализацию для замещения мутированного гена, но другие формы включают непосредственное корректирование мутации или модифицирование нормального гена, которое создает условия для транскрипции вирусов или даже перенос гена или фрагмента гена в клетку для его транскрипции.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «аутогенная генная терапия» относится к применению тканей или клеток самого индивидуума. Выделенные клетки или ткани модифицируют при использовании генной терапии и повторно вводят донору. В противоположность, «аллогенная генная терапия» относится к применению клеток для генной терапии от индивидуума, иного, чем индивидуум-акцептор. После генной модификации аллогенные клетки вводят акцептору.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «ех-vivo генная терапия» относится к терапии, при которой клетки от индивидуума, например гематопоэтические стволовые клетки или гематопоэтические клетки-предшественники, генетически модифицируют ex vivo и затем вводят лечимому индивидууму. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «in-vivo генная терапия» относится к терапии, при которой клетки от индивидуума, например гематопоэтические стволовые клетки или гематопоэтические клетки-предшественники, генетически модифицируют in vivo при использовании вирусных векторов или других конструктов экспрессии.

Генная терапия также может быть классифицирована как «генная терапия с использованием клеток зародышевой линии» и «генная терапия соматических клеток». В случае «генной терапии с использованием клеток зародышевой линии» зародышевые клетки, то есть сперма и яйцеклетки, генетически модифицируют. Генетические изменения, как правило, интегрированы в их геномы. Следовательно, изменения, вызванные терапией, будут наследственными и перейдут последующим поколениям. Этот подход используют для лечения генетических заболеваний и наследственных заболеваний. В случае «генной терапии соматических клеток» терапевтические гены переносят в соматические клетки индивидуума. Любые модификации и эффекты будут ограниченны только индивидуумом и не будут унаследованы потомками или последующими поколениями.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «рак» относится к раковым заболеваниям или опухолям, лечимым или предотвращаемым, которые выбраны из группы, состоящей без ограничения из рака молочной железы, меланомы, неоплазии кожи, лимфомы, лейкимии, опухоли желудочно-кишечного тракта, включая, карциномы толстой кишки, карциномы желудка, карциномы поджелудочной железы, колоректальный рак, рак тонкой кишки, карциномы яичников, карциному шейки матки, рак легких, рак простаты, почечно-клеточную карциному и/или метастазы в печени.

Аутоиммунные заболевания по настоящему изобретению включают ревматоидный артрит, болезнь Крона, системную красную волчанку (SLE), аутоиммунный тиреоидит, тиреоидит Хашимото, множественный склероз, диффузный токсический зоб, миастению гравис, целиакию и болезнь Аддисона.

Инфекционные заболевания по настоящему изобретению включают инфекции, вызванные бактериями, вирусами, грибками или эукариотическими паразитами, такие как ВИЧ, гепатит, грипп, лейшманиоз, бактериальная пневмония, туберкулез, коревая краснуха, коклюш, столбняк, менингит, сифилис, малярия и холера, наряду с болезнями, характерными для животных, такими как вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), вирус лейкоза кошачьих (FeLV), герпесвирусная инфекция крупного рогатого скота (BHV) и вирусная диарея крупного рогатого скота.

L-ДНК конструкт, содержащий дезоксирибонуклеиновую кислоту, содержащий минимальную единицу генной экспрессии, в результате приводит к получению конструкта для экспрессии, который не будет расщепляться нуклеазами. Данные экспериментов показали, что такие защищенные конструкты для генной экспрессии подходят для эффективного переноса генов в интересующую клетку.

Скорость генной экспрессии, которая может быть достигнута при использовании трансфекции конструктов по настоящему изобретению, выше, чем скорость, которая достигается при использовании ковалентно закрытых молекул, как описано в ЕР 0941318 (MIDGE вектор). MIDGE вектор показал более высокую эффективность транфекции, наряду с лучшей скоростью экспрессии, чем у сравнимых плазмидных векторов (Schakowski et al., in vivo, 21:17-24, 2007). За счет отсутствия одноцепочечных петель, как в ЕР 0941318, молекулы по настоящему изобретению дополнительно уменьшены в размере, что облегчает перенос генов. Благодаря L-ДНК модификации достигается стабильность. Действительно, применение ДНК-расщепляющих ферментов для удаления не модифицированной ДНК в процессе получения подчеркивает эту стабильность. Следует отметить, что также настоящее изобретение относится к L-ДНК, содержащей ДНК конструкт по меньшей мере с одной шпилькой, прикрепленной на одном из концов двухцепочечной ДНК.

ДНК конструкт по настоящему изобретению может быть использован для экспрессии искусственного кодирующего гена в интересующей клетке. В этом отношении ДНК вакцинация, терапия и профилактика опухолей требует конструктов для экспрессии, которые безопасны и эффективны для применения в клинических протоколах. Стандартные конструкты для экспрессии представляют, например, векторы на основе плазмид. Однако эти векторы имеют два недостатка. Первый, у них относительно низкая эффективность, и, второй, векторы на основе плазмид содержат несколько генов и генетические элементы, бесполезные для экспрессии заданного полипептида, и, следовательно, несут опасность непредсказуемых побочных иммунологических эффектов. При длительном и повторном применении вероятно, что заданный иммунный ответ замаскируется этими побочными эффектами из-за серьезных осложнений, которые могут возникнуть.

Другие конструкты для экспрессии по предшествующему уровню техники включают ретровирусные и аденовирусные векторы с дефектной репликацией. Хотя они очень эффективны для трансдукции даже неделящихся клеток широкого ряда клеток дикого типа, они вызывают риск рекомбинации с вирусами дикого типа и, следовательно, создаются новые патогенные вирусы, наряду с активацией онкогенеза. Дополнительно, велика вероятность того, что вирусные белки вызывают иммунологические побочные эффекты, по существу, с высокими титрами.

Минимальные единицы экспрессии конструктов для экспрессии по настоящему изобретению могут кодировать без ограничения MHC-I или МНС-II презентирующие пептиды, цитокины или компоненты регуляции клеточного цикла или регуляторные молекулы ДНК и антисмысловую РНК, рибозимы или мРНК, редактирующие молекулы. Дополнительно, ДНК конструкты по настоящему изобретению позволяют их адсорбцию или ковалентное или ионное связывание, например, с пептидами, белками, углеводами, липидами или гликопептидными лигандами, наряду с микрочастицами, которые позволяют переносить конструкты в клетки за счет баллистического переноса, в частности, в дерму, мышечные ткани, поджелудочную железу и печень.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Далее описание настоящей патентной заявки будет приведено со ссылкой на иллюстрирующие примеры и чертежи и неограничивающие варианты воплощения настоящего изобретения.

Фигура 1 - схематическая иллюстрация ДНК конструкта по настоящему изобретению.

Фигура 2 - электрофорез на агарозном геле ДНК конструктов после ферментативного расщепления.

Фигура 3 - эффективность трансфекции при использовании электропорации L-ДНК конструкта 2L-M.

Фигура 4 - эффективность липофекции при использовании электропорации L-ДНК конструкта 2L-M.

Фигура 5 - интенсивность флюоресценции конструктов для экспрессии, содержащих L- и D-ДНК.

Фигура 6 - сравнение эффективности трансфекции при использовании электропорации L-ДНК конструктов DL-M и LD-M и MIDGE вектора.

Фигура 7 - иммунизация мышей MIDGE или L-MIDGE, кодирующим малый белок поверхностного антигена гепатита В.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 приведена схематическая иллюстрация конструкта ДНК (2L-M) по настоящему изобретению. Как приведено в Таблице 1, терминальные олигонуклеотиды в L-конфигурации указаны серыми прямоугольниками на Фигуре 1 на концах двухцепочечного конструкта. Таким образом, цельный конструкт ДНК защищен от расщепления экзонуклеазами. Конструкт, приведенный на Фигуре 1, не имеет или ему не нужны шпилечные петли на одном или обоих концах для защиты от расщепления.

На Фигуре 2 приведен гель всех ДНК конструктов после расщепления Т7-Полимеразой из Т7 бактериофага. 6 µг каждого ДНК конструкта инкубировали с 10 единицами Т7-Полимеразы (общий реакционный объем: 20 µл). Через 0, 1, 2, 5, 30 и 1500 минут аликвоту 3 µл инкубируемой смеси удалили из образца и развели 5 µл формамида, содержащего краситель Sanger. Все аликвоты были помещены в 3% агарозный гель, через который в течение 100 минут пропускали ток 100 Вольт.

На дорожке 1 показан MIDGE вектор по ЕР 0941318. На дорожке 2 показаны не защищенные кассеты экспрессии, использованные для получения MIDGE вектора по ЕР 0941318. На дорожке 3 показан ДНК конструкт по настоящему изобретению, с обоих концов защищенный L-ДНК (далее указанный как «2L-M»). На дорожках 4 и 5 показаны альтернативные ДНК конструкты по настоящему изобретению с одним концом, защищенным L-ДНК, и другие, защищенные шпильками. ДНК конструкт на дорожке 4 содержит L-ДНК, защищающую 5′ конец промотора, и шпильку на 3′ конце, при этом конструкт на дорожке 5 защищен L-ДНК на 3′ конце промотора и шпилькой на 5′ конце, соответственно. Эти конструкты указаны как «DL-М» и «LD-М» (смотрите часть Примеров).

На Фигуре 3 приведена эффективность трансфекции при использовании электропорации 2L-M конструкта для экспрессии, содержащего L-ДНК по настоящему изобретению (2L-M), по сравнению с MIDGE по ЕР 0941318 (М), оба кодирующие eGFP. Результат эксперимента при использовании спермы лосося в качестве негативного контроля приведены с правой стороны. Левый черный столбец представляет количество живых клеток, серый столбец посередине представляет количество трансфектированных клеток, а белый правый столбец представляет количество мертвых клеток. Черная линия указывает общее количество клеток после электропорации.

Эффективность трансфекции нового 2L-M конструкта для экспрессии, содержащего L-ДНК, на около одну треть выше, чем при использовании гантелеобразного конструкта MIDGE. Как указано выше, MIDGE вектор показал более высокую эффективность трансфекции по сравнению с плазмидными векторами (Schakowski et al., in vivo, 21:17-24,2007).

Результаты не только демонстрируют, что конструкт для экспрессии по настоящему изобретению подходит для генной экспрессии, но также неожиданно показали, что конструкт неожиданно обладает более высокой эффективностью по сравнению с другими конструктами для экспрессии. Указанный выше конструкт для экспрессии, очевидно, достаточно стабилен для того, чтобы вызвать значительную экспрессию гена, и, с другой стороны, проникновение или перенос конструкта в клетки, по-видимому, работает достаточно хорошо как при использовании электропорации, так и при использовании липофекции.

Для проверки результатов, приведенных на Фигуре 3, относящихся к электропорции, эквимолярные количества MIDGE по ЕР 0941318 и 2L-M ДНК конструкты, содержащие L-ДНК, переносили в клетки при использовании липофекции (Фигура 4). В качестве негативного контроля использовали сперму лосося. Каждый белый столбец показывает количество живых клеток, серый столбец показывает количество трансфектированных клеток, а черный столбец представляет количество мертвых клеток.

Использование 1,5 µг ДНК для липофекции в результате приводит к более высокому числу трансфектированных клеток для 2L-M конструкта, содержащего L-ДНК по настоящему изобретению. Хотя число трансфектированных клеток при использовании 0,5 µг ДНК ниже при использовании L-ДНК конструкта, интенсивность флюоресценции выше у L-ДНК конструктов.

На Фигуре 5 показано отношение между количеством (масса) ДНК, используемым для трансфекции, и средней интенсивностью флюоресценции, индуцированной в отдельных клетках. Сплошная линия представляет 2L-M конструкт по настоящему изобретению, а пунктирная линия представляет результаты, полученные при использовании MIDGE по ЕР 0941318.

Для достижения равной интенсивности света требуется применить на около 30% более ДНК (массы) гантелеобразного ДНК конструкта по сравнению с 2L-M конструктом. Следовательно, эффективность ДНК конструкта по настоящему изобретению оказалась неожиданно выше, чем при использовании гантелеобразного конструкта.

На Фигуре 6 приведено сравнение флюоресценции, полученной у клеток СНО-К1, которые были модифицированы eGFP при использовании электропорации при использовании MIDGE вектора и LD-M конструктов, и DL-M, наряду со спермой лосося в качестве контроля. Неожиданно при использовании всех концентраций, конструкты DL-M и LD-M оба вызвали более высокий флюоресцентный сигнал от клеток по сравнению с MIDGE вектором. Следовательно, конструкты L-ДНК, содержащие один L-ДНК-модифицированный конец и одну D-ДНК шпильку, неожиданно показали повышенную эффективность трансфекции по сравнению с MIDGE вектором. Очевидно, что эти конструкты достаточно хорошо принимаются клетками и позволяют стабильную и эффективную экспрессию, с получением в результате векторов с улучшенными показателями.

Для тестирования эффективности указанных выше конструктов для экспрессии на животной модели использовали ДНК последовательность, кодирующую малый белок поверхностного антигена гепатита В (HBsAg). Линейное представление показало значительное различие между группами мышей, иммунизированных MIDGE и L-MIDGE (в случае IgG2a, р=0,033), приведено на Фигуре 7. Использование L-MIDGE в качестве конструкта для экспрессии в результате привело к более высоким концентрациям IgG антитела по сравнению с MIDGE.

Настоящее изобретение относится к линейному конструкту для генной экспрессии, защищенному от расщепления нуклеазами и подходящему для эффективной экспрессии генов после трансфекции в клетки. Было продемонстрированно, что генные продукты, полученные в результате трансфекции конструктов для экспрессии по настоящему изобретению, индуцируют специфические антитела. Следовательно, доказано, что конструкты для экспрессии по настоящему изобретению подходят для эффективной генной экспрессии в эукариотические клетки.

ПРИМЕРЫ

Получение ДНК конструктов

Получение ДНК конструктов по настоящему изобретению аналогично таковому в ЕР 0941318. Однако шпилечные олигонуклеотиды заменены так называемыми «L-адаптерами", как приведено в Таблице 1. Оба адаптера состояли из отдельных химерных ДНК молекул SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 2 (L-адаптер 1) или SEQ ID No. 3 и SEQ ID No. 4 (L-адаптер 2), соответственно (Таблица 1). Адаптеры получили гибридизацией эквимолярных концентраций одноцепочечных молекул ДНК по Таблице 1 при 0,28 мг/мл в течение 40 минут при постепенном снижении температуры с 90°C до 25°C в 40 мМ Tris-HCl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ DTT, 0,5 мМ АТР (рН 7,8 при 25°C). После лигирования обоих адаптеров с кассетами экспрессии аналогично синтезу в ЕР 0941318 с последующим удалением линейной D-ДНК при использовании Т7 полимеразы и конечной очисткой продукта при использовании ВЭЖХ. Этот конструкт указан как «2L-М».

В качестве альтернативы, один из L-адаптеров заменен соответствующей шпилькой, как в MIDGE векторе по ЕР 0941318. В результате получены ДНК конструкты с L-ДНК защитой на одной стороне промотора и шпилькой на другой стороне. Эти конструкты указаны как «DL-M» (L-адаптер 1 и шпилька) и «LD-M» (L-адаптер 2 и шпилька), соответственно.

Таблица 1: ДНК молекулы, использованные для получения ДНК конструктов. Все нуклеотиды находятся в D-конфигурации за исключением нуклеотидов
SEQ ID	Название	Последовательность (5′-3′)	Нуклеотиды в L-конфигурации
SEQ ID No. 1	CKm364	AGGGGTCCAGTTTTTT	14, 15
SEQ ID No. 2	CKm365	AAAAACTGGAC	1,2
SEQ ID No. 3	CKm362	TTTTTCTAAGCTT	1,2
SEQ ID No. 4	CKm363	GGGAAAGCTTAGAAAAAT	16, 17
	L-адаптер 1	SEQ ID No. 1/SEQ ID No. 2	Смотрите выше
	L-адаптер 2	SEQ ID No. 3/SEQ ID No. 4	Смотрите выше

Трансфекции

Для трансфекции конструктов ДНК в клетки использовали различные способы трансфекции, например липофекцию или электропорацию. Липотрансфекцию проводили следующим образом: 6·10⁴ СНО-К1 клеток высевали на 3,8 см² матрицу тканевой культуры и трансфектировали через 24 часа с указанными количествами eGFP-экспрессирующей ДНК смешиванием 1:4 с Fugene HD (Roche) и подвергали обработке согласно инструкциям и рекомендациям производителя. Через один день после трансфекции клетки собирали при использовании трипсинизации и провели анализ на флюоресценцию при использовании проточной цитометрии (10000 подсчитанных событий).

Электропорация

Электропорацию провели следующим образом: 2·10⁶ СНО-К1 клеток ресуспендировали в 500 µл ростовой среды, смешанной с указанным количеством eGFP-экспрессирующей ДНК плюс 11 µг спермы лосося, и генерировали импульсы 270 вольт при 1650 µФ. Затем клетки высеяли на 9,5 см² матрицу тканевой культуры и культивировали. Через один день после трансфекции клетки собирали при использовании трипсинизации и провели анализ на флюоресценцию при использовании проточной цитометрии (10000 подсчитанных событий).

Иммунизация мыши

HBsAg кодирующую последовательность поместили под контроль сильного вирусного промотора PCMV. L-MIDGE векторы, кодирующие HBsAg, получили при использовании ODNs CKm362-365 (сравнение Таблица 1), MIDGE векторы, кодирующие HBsAg, получили согласно ЕР 0941318. Мышей Balb/c (6 животных в группе) иммунизировали внутрикожно 10 µг/25 µл L-MIDGE-HBsAg векторов (8,14 пкмоль) или 10 цг/25 µл MIDGE-HBsAg векторов (8179 пкмоль) дважды с 3 недельным интервалом. Через две недели после второй иммунизации получили сыворотку и провели анализ при использовании ELISA на IgGl и IgG2a специфические антитела к HBsAg при использовании пластин, покрытых HBsAg (Dade Behring; Enzygnost Anti-HBs II; cat. no. OQNE17 or OQNE11), IgGl и IgG2a крысиные антимышиные антитела (BD; каталожный номер 559626 и 553391) в качестве вторичных антител, мышиный анти-HBsAg IgG2a (Affinity BioReagents, каталожный номер MAI-19264) в качестве стандарта и мышиный анти-HBsAg IgGl (Affinity BioReagents, каталожный номер MAI-19263) в качестве стандарта.

1. ДНК конструкт для экспрессии генов в эукариотических клетках, где конструкт представляет линейную с открытой цепью двухцепочечную ДНК, содержащую промоторную последовательность, кодирующую последовательность и сигнал терминации, где конструкт содержит по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид и где по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид расположен в последних 2-5 нуклеотидах 5′- и/или 3′-конца.

2. Конструкт по п. 1, где по меньшей мере один конец ДНК конструкта содержит одноцепочечную петлю.

3. Конструкт по любому из пп. 1 или 2, где указанный конструкт частично или полностью двухцепочечный.

4. Конструкт по любому из пп. 1 или 2, где по меньшей мере один L- или D-ДНК нуклеотид модифицирован функциональной группой, выбранной из группы, содержащей карбоксильную группу, аминную, амидную, альдиминную, кетальную, ацетальную, сложного эфира, простого эфира, дисульфидную, тиоловую и альдегидные группы.

5. Конструкт по п. 4, где модифицированный нуклеотид связан с соединением, выбранным из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, липидов, антител, синтетических молекул, полимеров, микрочастиц, частиц металлов, наночастиц или твердых фаз.

6. Конструкт по любому из пп. 1 или 2, где промотор выбирают из группы, состоящей из промоторных последовательностей, которые работают в человеческих, животных или эукариотических клетках.

7. Конструкт по любому из пп. 1 или 2, где указанный конструкт выполнен с возможностью кодировать белки, пептиды, антитела, гормоны, цитокины или другие биологически активные вещества.

8. Конструкт по п. 7, где биологически активные вещества представляют иммуномодуляторы.

9. Фармацевтическая композиция для стабильной или транзиентной трансфекции человеческих, животных или эукариотических клеток, содержащая ДНК конструкт по любому из пп. 1-8.

10. Способ стабильной или транзиентной трансфекции человеческих, животных или эукариотических клеток, включающий инкубацию человеческих, животных или эукариотических клеток с ДНК конструктом по одному из пп. 1-8.