Вакцинный штамм вируса гриппа а/17/боливия/2013/6585 (h1n1) pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Охарактеризованный вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных. Реассортант депонирован в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского под №2809. Изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей. 5 табл.

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09.

В апреле 2009 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила о появлении в циркуляции среди людей нового вируса гриппа A(H1N1)pdm. Новый вирус А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm имеет генетическое родство по определенным генам с вирусами, вызывающими грипп свиней, птиц и человека, и никогда ранее не циркулировал среди людей. Вирус с легкостью передавался от человека к человеку и был более контагиозен, чем сезонные штаммы. ВОЗ рекомендовал использовать этот вирус как прототип для подготовки пандемической противогриппозной вакцины [World Health Organization. Characteristics of the emergent influenza A(H1N1) viruses and recommendations for vaccine development, http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/vaccinerecommendations/en/index.html].

Однако гемагглютинин вируса гриппа А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm, выделенного в 2009 году, не стабилен. Штаммы, циркулирующие в последнее время, более стабильны, что связано с мутацией Glu-47-Lys в ножке гемагглютинина (НА2). Эта единичная аминокислотная замена влияет также на инфекционность современных А/Калифорния/07/2009-подобных вирусов [Cotter CR, Jin Н, Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stability and infectivity. PLoS Pathol. 2014. Vol. 10 (1). P.e1003831; Yang H, Chang JC, Guo Z et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88 (9). P. 4828-4838].

В связи с вышесказанным, в качестве А/Калифорния/07/2009-подобного вируса был выбран штамм А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, НА и NA которого антигенно и генетически сходны с другими пандемически-подобными вирусами, циркулирующими в настоящее время, а его гемагглютинин (НА2) содержит стабилизирующую мутацию Glu-47-Lys, отсутствующую у А/Калифорния/07/2009 эталонного вируса [Cotter CR, Jin Н, Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stabilityand infectivity. PLoS Pathol. 2014. Vol. 10 (1). P.e1003831; Yang H, Chang JC, Guo Z et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88 (9). P. 4828-4838].

В результате появления в циркуляции нового высокостабильного эпидемического штамма вируса гриппа, А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, известный вакцинный штамм А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) - прототип [Ларионова Н.В., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей Патент РФ №2413765 от 16.09.09. опубл. БИ 2011, №7] - утратил свою актуальность.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно-актуального А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm-подобного вакцинного штамма живой гриппозной вакцины для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, обладающего стабильностью гемагглютинина и высокой репродуктивной активностью.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопросы вирусологии. 1977. №4. С. 387-395].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л.,1968. С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно-актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации. На основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) был создан вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 - прототип.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts, ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к реассортантному вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 и родительского штамма А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09 с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, полностью совпадали (табл. 1). Кроме того, перекрестная постановка РТГА вирусов А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm и А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09 с соответствующими гипериммунными крысиными сыворотками подтвердила близкое антигенное родство этих вирусов (табл. 1);

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма нейраминидаза (NA) проверен методом микс-ПЦР, а также полногеномным секвенированием и идентичен вирусу А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали микс-ПЦР анализ ДНК копий генов [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С. 29-36], основанный на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или «дикого» вируса.

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), принадлежат пандемическому родительскому вирусу А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, РА, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09. Таким образом, полное секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 показало генетическую стабильность аттенуирующих мутаций.

В гемагтлютинине вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 присутствует стабилизирующая аминокислота - лизин - в позиции 47 субъединицы НА2, которая по данным Yang et al. [Yang H., Chang J.C., Guo Z. et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88 (9). P.4828-4838.] и Cotter et al. [Cotter C.R., Jin H., Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stabilityand infectivity. PLoS Pathol 2014. Vol. 10 (1). Pe1003831] приводит к повышению стабильности и инфекционности Калифорния-подобных вирусов (Glu-47-Lys).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 проводили путем его параллельного титрования в развивающихся куриных эмбрионах при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила менее 1,7 log10 ЭИД50/МЛ, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 8,0 log10 ЭИД50/МЛ, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Все результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Генетическая стабильность кодирующих мутаций. Генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах. Полногеномное секвенирование показало, что нуклеотидная последовательность вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 до и после его пятикратного пассирования, осталась неизменной, в том числе в генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА), ответственных за аттенуирующий фенотип (табл. 3).

Фенотипические характеристики пассажного варианта также не претерпели никаких изменений (табл. 4).

Все вышесказанное подтверждает высокую генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09.

Безвредность для морских свинок. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 проводили на морских свинках обоего пола в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». - М.: 2010. 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708н от 23.08.20010. http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html]. Морским свинкам вводили однократно 5 мл вакцинного вируса подкожно в дозе 7.0 lg ЭИД50/0.2 мл. Животным контрольной группы вводили подкожно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его подкожном введении (табл. 5).

Данные физиологического исследования показали, что подкожное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

Заключение

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 депонирован 01.04.2015 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2809 и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8.7 log10 ЭИД50/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:32.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Штамм вируса гриппа А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09, депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского под №2809, используемый для получения живой гриппозной интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса ящура А №2166/Краснодарский/2013 (производственный, контрольный КРС).
Изобретение касается способа получения бактериофага. Представленный способ включает засев суспензии бактериальных клеток в титре 108-1012 КОЕ/мл на плотную питательную среду с толщиной слоя от 3 мм до 25 мм и культивирование при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 5 мм до 50 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса ящура А №2155/Забайкальский/2013 (производственный).

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит активное вещество и целевые добавки.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины, содержащей активное вещество и целевые добавки. В качестве активного вещества вакцина содержит смесь из авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, А №2187/Кути/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и О №2123/Южная Осетия/2011, полученных в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, представляющих собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура.

Изобретение относится к биотехнологии и касается набора олигонуклеотидов-праймеров для получения первичной структуры F гена вирусов болезни Ньюкасла класса I. Представленный набор состоит из трех пар олигонуклеотидов, имеющих следующую структуру (5′→3′): Представленные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют ограничивать манипуляции одноступенчатой процедурой проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан рекомбинантный аттенуированный штамм вируса осповакцины с нарушенными генами вирулентности ΔA56RΔB8RΔJ2RΔC3LΔN1L (1421ABJCN) на основе клонированного вируса осповакцины штамм ЛИВП.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицине. Диагностический штамм вируса гриппа RN9/13-human A(H6N9) получен путем скрещивания апатогенного вируса гриппа птиц А/серебристая чайка/Сарма/51 с/06(H6N1) с холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/Ануи/2013/61(H7N9) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2).
Изобретение относится к области защиты растений. Предложен способ повышения эффективности бакуловирусных препаратов.

Настоящее изобретение относится к области бактериофаговой терапии для лечения и регулирования бактериальных инфекций. Представленная группа изобретений касается выделенного бактериофага, обладающего активностью против Pseudomonas aeruginosa, белков, кодируемых геномом такого бактериофага, фармацевтической композиции, содержащей такие белки, применяющейся для изготовления лекарственного средства для лечения инфекции, обусловленной Pseudomonas aeruginosa, способа диагностики бактериальной инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, и способа уменьшения или ингибирования колонизации или роста Pseudomonas aeruginosa на твердой поверхности.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и направлена на получение гриппозной вакцины в жидком виде. Живая вакцина в жидком виде для профилактики гриппа включает штаммы вирусов гриппа типа H1N1 H3N2, В и стабилизатор.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для индукции перекрестной защиты от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма гриппа.

Изобретение относится к медицине, а именно к вакцинопрофилактике. Предложена композиция вакцины, содержащая один или более антигенов, и адъювант, содержащий олеиновую кислоту и моноолеин для применения в интраназальной вакцинации пациента.

Группа изобретений относится к ветеринарии и может быть использована для защиты собаки от заболевания, вызванного вторичным патогеном, представляющим собой Streptococcus equi.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа получения средства, предназначенного для лечения гриппа, включающего заражение куриных эмбрионов вирусом гриппа, инкубацию эмбрионов, охлаждение эмбрионов, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), обработку ВАЖ с целью дезагрегации и последующей инактивации, микрофильтрацию ВАЖ, ультрафильтрацию ВАЖ и очистку вирусного концентрата.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены вакцинная композиция для вакцинации против инфекции гриппа и набор для вакцинации против инфекции гриппа, содержащий вакцинную композицию.

Изобретение относится к области медицины и касается противогриппозной вакцины широкого спектра действия против птичьего гриппа А человека. Охарактеризованная вакцина содержит эктодомен белка М2, молекулярный адъювант и буферный раствор, взятые в эффективных количествах.

Изобретение раскрывает применение вакцинной композиции, содержащей по меньшей мере один профилактически активный агент против гриппа и по меньшей мере один адъювант, являющийся соединением PBS-96 следующей формулы (III) или соединением PBS-14 следующей формулы (IV) для изготовления лекарственного средства, предназначенного для предотвращения или лечения гриппа.

Представленная группа изобретений касается вирусоподобной частицы и способов ее использования и получения. Предложенная вирусоподобная частица, по существу, не содержащая нуклеиновую кислоту вируса, сформирована из слитого белка, включающего белок оболочки растительного вируса и белок-мишень.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения в растении или в его части химерных вирусоподобных частиц (VLP).

Изобретение относится к вирусологии. Предложен вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 - реассортант, полученный методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм В/60/Пхукет/2013/26 характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных. Штамм В/60/Пхукет/2013/26 содержит гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса В/Пхукет/3073/2013 и остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации В/СССР/60/69. Штамм В/60/Пхукет/2013/26 может быть использован в медицине для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей в составе живой гриппозной интраназальной вакцины. 4 табл.
Наверх