Способ измерения клеточно-опосредованной иммунологической реактивности
Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для измерения активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта. Для этого проводят контактирование образца цельной крови, представляющего собой источник лимфоцитов, с одним или более агентами, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета. Измерение присутствия или повышения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где присутствие или уровень иммунной эффекторной молекулы показывает уровень клеточно-опосредованной реактивности у субъекта. Группа изобретений относится также к применению агентов, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета, в производстве диагностического анализа клеточно-опосредованной иммунологической реактивности, а также к способу, позволяющему пользователю определить статус клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у субъекта. Использование данной группы изобретений позволяет выявлять иммунные дисфункции путем использования системы цельной крови и объединения стимуляторов, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитете, обеспечивая синергетический эффект. 3 н. и 29 з.п. ф-лы, 7 пр., 7 ил.,7 табл.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение, в общем, относится к области иммунологических диагностических тестов. Более конкретно, настоящее изобретение предусматривает способ измерения клеточно-опосредованной иммунологической реактивности. Настоящее изобретение также позволяет определить иммуносупрессивные эффекты заболеваний, терапевтических агентов и загрязнителей окружающей среды. Анализ по настоящему изобретению также может быть включен в медицинскую систему для обеспечения системы диагностических отчетов и облегчения процесса ухода при клиническом лечении.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Библиографические данные публикаций, на которые ссылается автор в данном описании, указаны в алфавитном порядке в конце описания.
Ссылка на любой уровень техники в данном описании не является и не должна рассматриваться как его подтверждение или какая-либо форма его предположения, которые составляют часть этого общих знаний в любой стране.
Иммунологические методы диагностики составляют важный инструмент для выявления различных заболеваний. Это особенно важно с учетом специфичности компонентов иммунной системы. Несмотря на специфичность, иммунологические методы диагностики не всегда достаточно чувствительны для того, чтобы обнаружить низкие уровни активности систем приобретенного и/или врожденного иммунитета, например, в ответ на незначительные инфекции или при наличии низкого уровня постоянной инфекции, либо у субъектов, имеющих иммунодефицит или любую форму иммуносупрессии. Существует необходимость в разработке диагностических тестов с повышенной чувствительностью по отношению к клеточно-опосредованной иммунологической реактивности благодаря возможностям приобретенного и врожденного иммунитета. Это особенно относится к субъектам, имеющим или проявляющим признаки заболевания, и средствам, которые вызывают или которые связаны с иммуносупрессией.
Одна из форм иммунологического диагностического теста включает стимуляцию Т-клеток антигенами или митогенами в выделенной культуре клеток или целой культуре крови с последующим детектированием эффекторных молекул, таких как цитокины, которые продуцируются активированными Т-клетками (также называемыми как эффекторные Т-клетки). Эффекторные молекулы, как правило, детектируются с помощью таких методов, как иммуноферментный, мультиплексный анализ, ELISpot и проточная цитометрия. Такие тест-системы полезны для выявления Т-клеточных ответов, специфичных к конкретным заболеваниям.
Возможность оценить клеточно-опосредованный иммунный ответ у субъекта особенно важна при контроле иммунодефицита и иммуносупрессии. Иммунодефицит характеризуется снижением способности вызывать эффективный иммунный ответ. Такой неполный иммунный ответ или его отсутствие могут возникнуть в результате первичного или приобретенного (вторичного) иммунодефицита.
Первичные иммунодефицита (PID) являются генетически унаследованными и характеризуются дефицитом различных компонентов системы приобретенного или врожденного иммунитета (Hu и Gatti, Curr Opin Allergy din Immunol. 8(6):540-546, 2008). Тем не менее большинство типов иммунодефицита являются приобретенными (вторичными) и могут быть вызваны патогенными агентами, как это происходит при ВИЧ-инфекции; лекарственными средствами, как при иммуносупрессивной терапии после трансплантации органов; патологическими состояниями, которые могут иметь место при раке (например, лейкемии, лимфоме), или могут быть вызваны загрязнителями окружающей среды.
Молекулярная основа иммунодефицита разнообразна, однако клеточный иммунитет играет ключевую роль в опосредовании многих наблюдаемых клинических проявлений. В настоящее время синдромы иммунодефицита диагностируются и регулируются ad hoc в зависимости от возбудителя.
Например, основной отличительной чертой ВИЧ-инфекции является прогрессирующая потеря CD4+ Т-клеток и нарушение общей иммунной функции, включая нарушение антиген-специфичного иммунного ответа на патогены, такие как цитомегаловирус (CMV) и вирус гепатита В (ВГВ) [Douek et al., Annu. Rev. Med. 60:471-84, 2009 и Chang et al., J. Virol. 83:7649-58, 2009]. Таким образом, подсчет CD4+ Т-лимфоцитов и вирусной нагрузки остаются ключевыми косвенными маркерами ВИЧ-инфекции и были в значительной степени подтверждены как прогнозирующие иммунные дисфункции с прогрессирующей инфекцией, а также иммунную дисфункцию при восстановлении иммунитета после профилактики (Hengel и Kovacs, J. Infect. Dis. 188(12):1791-3, 2003). Тем не менее существует много случаев, в которых клинические симптомы не коррелируют с уровнем иммунной функции, как предсказывается по таким косвенным маркерам, особенно при условно-патогенных инфекциях, которые развиваются при наличии нормального количества CD4+ Т-клеток и низкой вирусной нагрузки (Solomon et al., J. Infect. Dis. 757:1915-23, 2003).
Кроме того, контроль состояния больных с клеточным иммунодефицитом, которые подверглись трансплантации солидных органов (СОТ) и получают лекарственные препараты для подавления иммунной системы (иммунодепрессанты) для предотвращения отторжения, также осуществляется в специальном порядке. Как правило, уровни препарата иммунодепрессанта для пациента контролируются по регулярным анализам крови и заболеваемости после прививок, при нозокомиальной или внебольничной инфекции (Schrem et al., Dtsch Arztebl Int. 106(9):148-156, 2009).
В настоящее время основной проблемой, связанной со многими маркерами, используемыми для мониторинга и определения связанных с иммунодефицитом заболеваний, является отсутствие клеточного иммунитета. Были разработаны многочисленные тесты функции Т-клеток, при которых измеряются лимфопролиферативные ответы на митогены, такие как фитогемагглютинин (РНА), митоген лаконоса и конканавалин А (СоnА). Однако они обеспечивают только измерение функциональной способности Т-клеток; субпопуляции клеток, участвующих в клеточном иммунитете. Важно, что становится все более очевидным то, что врожденные иммунные механизмы в значительной степени способствуют защите хозяина, либо действуя напрямую или за счет увеличения специфичных Т-клеток (Cooper et al., Hematology:314-30, 2003). Таким образом, функциональные реакции клеток врожденной (естественные киллеры [NK-клетки]) и приобретенной (Т-клетки) иммунной системы совместно образуют более полный анализ клеточного иммунитета.
Возможность оценить клеточный иммунитет имеет клиническое значение. Например, более 33 миллионов взрослых и детей являются инфицированными ВИЧ (Доклад о глобальной эпидемии СПИДа, ЮНЭЙДС, 2008 г., ISBN 9789291737116), и в настоящее время ежегодно во всем мире проводится около 100000 трансплантаций солидных органов (Matesanz et al. Transplant Proc. 41(6):2297-301, 2009).
Дисрегуляция врожденного иммунитета проявляется при ВИЧ-инфекции в IFN-γ анализе цельной крови, описанном для мониторинга иммунной реакции на TLR-7/8 агонистические соединения (соединение имидазохинолина, R848) [Nowroozalizadeh et al., Cytokine 46:325-31, 2009]. Кроме того, описано диагностическое устройство, которое оценивает функциональный Т-клеточный ответ (Cylex ImmuKnow (зарегистрированная торговая марка), US 2003/0199006 A1) и измеряет продукцию АТФ в РНА-стимулированных CD4+ клетках (Kowalski et al., J Immunotoxicol. 4(3):225-32, 2007). В частности, анализ Cylex продемонстрировал клиническую пригодность в условиях СОТ, при различных неблагоприятных явлениях, например, при инфекции, при этом отторжение можно регулировать в достаточной мере.
Существует необходимость в разработке анализа, который позволяет оценить комбинированное функциональное состояние клеточно-опосредованной иммунологической реактивности врожденного и приобретенного иммунитета у субъекта и определить состояние болезни и агенты, вызывающие иммуносупрессию.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает способ оценки состояния и возможностей клеточно-опосредованного иммунитета у субъекта. Способ, предусмотренный в настоящем документе, частично основан на совместной стимуляции приобретенного и врожденного иммунного ответа. Это обеспечивает прогнозирование возможностей клеточного иммунитета, в том числе степень иммуносупрессии у данного субъекта. В одном воплощении изобретения клетки цельной крови или ее фракции контактируют с одним или несколькими агентами, которые стимулируют как приобретенный, так и врожденный иммунный ответ в лимфоцитах. Уровень клеточно-опосредованной иммунной реактивности определяется путем измерения наличия и уровня эффекторных молекул, продуцированных иммунными клетками. В конкретном воплощении цельная кровь или ее фракция содержит Т-лимфоциты и NK-клетки. Один или несколько агентов стимулируют или усиливают приобретенный иммунный ответ через Т-клетки и врожденный иммунитет через NK-клетки. Таким образом, анализ измеряет комбинированный адаптивный и врожденный клеточный иммунный потенциал.
Комбинированный иммунный ответ обеспечивает большую степень клеточно-опосредованной иммунной реактивности по сравнению с иммунологической реактивностью приобретенного или врожденного иммунитета, измеряемой сингулярно. Кроме того, анализ может быть проведен с использованием небольших объемов крови, таких как от 1 мкл до 1000 мкл, и, следовательно, анализ может проводиться на пробах из пальца и капилляров. Большой объем анализа, например, от 1,5 мл до 200 мл, в том числе 5 мл, 10 мл и 20 мл объемы, также рассматриваются в настоящем документе.
Возможность оценить сочетание приобретенного и врожденного иммунитета является важным, например, для выявления условий заболеваний и лечебно-экологических факторов, которые вызывают подавление иммунитета, что может привести к повышенному риску повторных инфекций.
Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения предусматривает способ измерения активности клеточного иммунного ответа у субъекта, где способ включает контактирование образца лимфоцитов от субъекта с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение уровня продукции иммунной эффекторной молекулы иммунными клетками, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточной иммунологической реактивности у субъекта.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу измерения активности клеточного иммунного ответа у субъекта, где способ включает контактирование образца лимфоцитов от субъекта с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение повышения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточной иммунологической реактивности у субъекта, где уровень иммунологической реактивности свидетельствует о наличии или отсутствии, либо уровне или стадии болезни или состояния, выбранного из списка, включающего заражение патогенным агентом, аутоиммунные заболевания, рак, воспалительные состояния, воздействия токсического агента, воздействие терапевтического агента и иммунодефицит.
Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает тест-систему для обнаружения присутствия, отсутствия, уровня или стадии заболевания или состояния, у субъекта, где способ включает контактирование образца лимфоцитов от субъекта с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение увеличения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где уровень иммунной эффекторной молекулы свидетельствует о болезни или состоянии.
Также еще один аспект настоящего изобретения предполагает способ мониторинга ответа на терапию заболевания или состояния у субъекта, где способ включает контактирование образца лимфоцитов от субъектов с агентом, используемым при терапии, и измерение наличия или повышение уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток в присутствии одного или нескольких молекул, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на эффективность терапии.
Настоящее изобретение также предусматривает способ определения того, вызывает ли агент подавление иммунитета у субъекта, где способ включает контактирование пробы лимфоцитов от субъекта после воздействия агента с одним или несколькими потенцирующими средствами, которые стимулируют приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение наличия и уровня эффекторной молекулы из лимфоцитов, где уровень эффекторной молекулы определяет уровень иммуносупрессии, индуцированной агентом.
В одном воплощении изобретения кровь стимулируют агонистами TLR и агонистами TLR совместно.
Согласно этому аспекту, агент может быть лекарственным препаратом или токсичным веществом из окружающей среды.
Способ по настоящему изобретению может быть также обозначен как "анализ". Здесь анализ может быть пригоден, в частности, для оценки общей иммунологической реактивности у субъекта или для обнаружения иммунологической реактивности к конкретным условиям заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, целиакия, рак, заражение организма патогенными организмами или агентами, воздействие токсического агента или лекарственного средства и состояния иммунодефицита или иммуносупрессии, в том числе индуцированные заболевания. Проба лимфоцитов может быть просто получена из цельной крови, однако настоящее изобретение предполагает использование любого источника лимфоцитов, включая фракционированные пробы, содержащие лимфоциты, а также пробы, прошедшие выделение и/или истощение. Способы с использованием микро-образцов крови, в том числе взятых от контактных уколов и из капилляров, также являются частью настоящего изобретения. Пробы содержат по меньшей мере Т-клетки (Т-лимфоциты) и NK клетки (NK-лимфоциты). Указание "иммунные клетки " включает в себя Т-клетки.
Дополнительно к реакционной смеси добавляют простые сахара, в частности декстрозу или глюкозу. Указание "кровь" включает в себя цельную кровь без разбавления, а также кровь, используемую при анализе в объеме от 10% до 100% от общего объема исследуемого образца (т.е. реакционной смеси), в том числе от примерно 50% до примерно 100% и от 80% до примерно 100%. Исследуемые объемы могут составлять от 1 мкл до более 1000 мкл, в том числе от 1,5 мл до 200 мл, такие как 5 мл до 20 мл.
Для усиления приобретенного и врожденного иммунитета может быть использован один тип агентов, либо могут быть использованы совместно два или более типов агентов. Например, может быть использована совместная стимуляция агонистами TCR и агонистами TLR. Лимфоциты также могут быть обработаны определенным антигеном для измерения комбинированных антиген-индуцированного ответа приобретенного и врожденного иммунитета у субъекта.
Субъекты могут быть представлены человеком или животным, не относящимся к человеку. Таким образом, настоящее изобретение имеет медицинское применение для человека, а также применение в ветеринарии и животноводстве. Человек является собой особенно важным субъектом в практике настоящего изобретения.
В другом варианте настоящее изобретение предусматривает способ определения, вызывает ли заболевание подавление иммунитета у субъекта, где способ включает контактирование пробы лимфоцитов от субъекта, имеющего то или иное заболевание, с одним или несколькими веществами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение наличия и уровня иммунной эффекторной молекулы из лимфоцитов, где уровень иммунной эффекторной молекулы свидетельствует о степени иммуносупрессии, вызванной или связанной с заболеванием.
Наборы и кожные тесты также формируют часть настоящего изобретения.
В одном воплощении настоящего изобретения образец цельной крови отобран в пробирки для сбора крови, которые содержат агенты, либо в которые добавляются агенты для инкубации. Как правило, кровь поддерживается в присутствии гепарина. Гепарин может находиться в пробирке при добавлении крови или может быть добавлен после. Использование пробирок для сбора крови совместимо со стандартными автоматизированными лабораторными системами и пригодно для анализа в крупномасштабных системах и системах произвольной выборки. Пробирки для сбора крови также минимизируют расходы при обработке и уменьшают лабораторное воздействие на цельную кровь и плазму и, следовательно, уменьшают риск заражения лабораторного персонала патогенными агентами, такими как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса гепатита В (HBV) и вирус гепатита С (ВГС). Кроме того, использование пробирок для сбора крови для проведения инкубации делает анализ более чувствительным, чем используемый ранее 24-луночный культуральный планшет.
Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает улучшенный клеточно-опосредованный иммунный анализ, включающий в одном из вариантов использования пробирки для сбора крови, дополнительно простые сахара, такие как декстроза, и стадию инкубации с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет. Стадия инкубации, как правило, длится от примерно 5 до примерно 50 часов, в частности 24 часа. Дополнительно может быть добавлен антиген.
Иммунные эффекторные молекулы, как правило, представляют собой цитокины, такие как, но не ограничиваясь этим, IFN-γ, интерлейкин (например, IL-2, ИЛ-4, IL-6, IL-10, IL-12 или IL-13), трансформирующий фактор роста бета (TGFp), либо гранулоцитарный или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (G-CSF и GM-CSF, соответственно). Другие эффекторные молекулы приведены в Таблице 6. Наличие или уровень иммунной эффекторной молекулы может быть определено по самой молекуле или степени экспрессии соответствующего гена.
Анализ по настоящему изобретению может быть также использован при индивидуальном медицинском подходе в контроле терапии и/или как часть медицинской системы. Такая система может быть основанной на веб- или иной технологии. Бизнес-метод, таким образом, также обеспечен, при котором кровь собирается в переносные пробирки, которые затем анализируются на клеточно-опосредованную иммунологическую реактивность в определенном месте, и результаты отправляются в виде электронного отчета через соответствующие архитектуры провайдеру клинического обеспечения.
Кроме того, возможность использования анализа для малых объемов крови пригодна для педиатрических целей, а также для анализа пожилых и немощных людей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Некоторые рисунки содержат цветные изображения или элементы. Цветные фотографии доступны по просьбе у патентообладателя или в соответствующем патентном ведомстве. При их получении в Патентном ведомстве может быть взята плата.
Фигуры 1А-С представляют графические изображения отдельных стимуляторов IFN-γ ответов в культурах цельной крови. Показаны результаты группы нормальных здоровых доноров при использовании TCR стимуляторов митогена (А) и анти-СD3 антитела (В) или R848 TLR стимулятора (С).
Фигуры 2А-С представляют графические изображения синергизма анти-СD3 антитела (TCR-агониста) с различными TLR агонистами. (A) TLR-2; Pam3CSK4 и Липоманнан, (В) TLR-4, ЛПС (липополисахарид) и (С) TLR-7/8; соединение R 848 (имидазохинолин). Номера наверху графика указывают кратное увеличение IFN-γ ответа культуры, стимулированной совместно TLR/анти-СD3 антителом, по сравнению с культурой, стимулированной только анти-СD3 антителом.
Фигура 3 представляет графическое изображение использования γTCR/TLR совместной стимуляции для установления предельного (порогового) IFN-γ ответа у нормальных здоровых индивидуумов. Показан относительный диапазон для здоровой популяции, обеспечивая возможность наблюдения снижения IFN-γ ответа у индивидуума с иммунодефицитом. Таким образом, может быть предположена мера иммуносупрессии вследствие медикаментозного лечения или заболевания, если ответ падает ниже порогового (предельного) значения для здоровой популяции.
Фигура 4 представляет графическое изображение, показывающее обнаружение многочисленных аналитов в плазме человека из обработанной (TCR+TLR агонистами) и необработанной (NIL) цельной крови. Цельная человеческая кровь обрабатывалась путем стимулирования комбинацией анти-СD3 антитела (TCR агониста) и TLR-7/8 агониста, R848 (имидазохинолина). Несколько хемокинов, цитокинов и внеклеточных сигнальных молекул были найдены только в плазме цельной крови, стимулированной одновременно TCR и TLR агонистом (синие столбцы, TCR+TLR). Некоторые другие молекулы показывают более высокие уровни в сравнении с необработанной цельной кровью (красные столбцы, NIL).
Фигура 5 представляет собой графическое изображение синергизма, наблюдаемого между двойным симулянтом (TCR+TLR) IFN-γ ответов в культурах цельной крови по сравнению со стимуляцией цельной крови только TCR агонистом или только TLR агонистом в ВИЧ-инфицированной и нормальной здоровой группах. Исследованные популяции включают в себя (i) нелеченных ВИЧ-инфицированных (представителей Южной Африки) и (ii) нормальных здоровых доноров (представителей Австралии). Средние значения по популяции указаны в Таблице 7.
Фигура 6 представляет собой графическое изображение корреляции, наблюдаемой между уровнем IFN-γ ответа и количеством CD4+ Т-клеток, которое наблюдалось при стимуляции комбинированным агонистом (TCR+TLR) цельной крови ВИЧ-инфицированной группы.
Фигура 7 представляет собой графическое изображение, показывающее стимуляцию цельной крови комбинацией TCR и TLR агонистов, которая позволяет определить ингибирующие концентрации иммунодепрессантов для данного донора.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном описании, если контекст не требует иного, слово "включать" и его вариации, такие как "содержит" или "содержащий", должны пониматься как подразумевающие включение указанного элемента или целого, либо группы элементов или целых, но не исключение любого другого элемента или целого, либо группы элементов или целых.
Как используется в настоящем описании, особые формы единственного числа включают в себя формы множественного числа, если из контекста явно не следует иного. Так, например, указание "Т-клетка" включает в себя одну Т-клетку, а также две или более Т-клетки, указание "агент" включает один агент, а также два или более агентов; указание "изобретение" включает в себя один или несколько аспектов изобретения и т.д. Термины "Т-клетки" и "Т-лимфоциты" используются здесь взаимозаменяемо. "Иммунные клетки" включают в себя Т-клетки и клетки врожденной иммунной системы, такие как NK-клетки.
Указание "агент", "реагент", "молекула" и "соединение" включает в себя отдельные средства и комбинации двух или более таких средств. "Комбинация" также включает в себя несколько частей, таких как две части композиции, где агенты предоставлены отдельно и используются или применяются отдельно, либо смешиваются вместе до применения. Например, многосоставная кассета для анализа может иметь два или несколько агентов, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, которые содержаться раздельно. В одном варианте два агента представляют собой агонист TCR и агонист TLR. Таким образом, этот аспект настоящего изобретения включает в себя агенты в сухой и свободной форме или иммобилизованные на стене камеры или на твердом носителе в кассете для анализа. "Комбинация" также включает в себя слитые или химерные молекулы, содержащие стимулятор приобретенного иммунитета и стимулятор врожденного иммунитета. Стимулятор приобретенного иммунитета может модулировать приобретенный иммунитет через Т-клеточный рецептор -зависимые или -независимые средства. Примером агониста TCR является анти-CDS антитело. Агонисты TLR включает TLR-7/8 агонисты, такие как R848 (имидазохинолин).
Настоящее изобретение частично основано на увеличении продукции эффекторных молекул из лимфоцитов, подверженных потенцированию приобретенным и врожденным иммунитетом. Это позволяет проводить более чувствительный анализ для оценки клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у субъекта. Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает анализ для выявления, оценки или других видов мониторинга клеточно-опосредованного ответа у субъекта путем измерения присутствие или уровня эффекторных молекул из Т-клеток, стимулированных потенциатором приобретенного и врожденного иммунитет. Лимфоциты контактируют с агентом, который усиливает приобретенный и врожденный иммунитет. Как правило, участвуют по меньшей мере два агента: по меньшей мере один потенцирует приобретенный иммунитет (через Т-клетки) и по меньшей мере один усиливает врожденный иммунитет (например, через NK-клетки). В качестве альтернативы используются химерные молекулы, включающие стимулятор приобретенного иммунитета и стимулятор врожденного иммунитета. Стимулятор приобретенного иммунитета может действовать через Т-клеточный рецептор -зависимые или -независимые средства. Настоящее изобретение обеспечивает, таким образом, средства для определения реакции клеточного иммунитета у субъекта и, в свою очередь, предоставляет средства для определения того, вызывает ли или связано ли заболевание или агент с иммуносупрессией. Способ обеспечивает также диагностику инфекционных болезней, патологических состояний, определения уровня иммунологической активности и оценки приобретенной и врожденной иммунной клеточной реактивности к эндогенным или экзогенным агентам, а также оценки воздействия токсичных агентов, таких как бериллий или другие токсичные вещества.
Таким образом, один аспект настоящего изобретения предусматривает способ измерения активности клеточного иммунного ответа у субъекта, включающий контактирование с пробой лимфоцитов субъекта с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение уровня продукции иммунной эффекторной молекулы иммунными клетками, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у субъекта.
Другой аспект настоящего изобретения предусматривает способ измерения активности клеточного иммунного ответа у субъекта, включающий контактирование пробы лимфоцитов субъекта с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение увеличения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточной реактивности у субъекта, где уровень реактивности свидетельствует о наличии или отсутствии, либо степени или стадии болезни или состояния, выбранного из списка, включающего заражение патогенным агентом, аутоиммунные заболевания, рак, воспалительное состояние и воздействие токсического агента.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает способ измерения активности клеточного иммунного ответа у субъекта, включающий контактирование пробы лимфоцитов субъекта с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение повышения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточной реактивности и свидетельствует о наличии или отсутствии, либо степени или стадии заболевания или состояния, выбранного из списка, включающего заражение патогенным агентом, аутоиммунные заболевания, рак, воспалительное состояние и воздействие токсического агента.
Другой аспект настоящего изобретения предусматривает способ анализа для обнаружения присутствия, отсутствия, уровня или стадии заболевания или состояния у субъекта, где способ включает контактирование пробы лимфоцитов субъекта с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение увеличения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где уровень иммунной эффекторной молекулы свидетельствует о болезни или заболевании.
Настоящее изобретение также предусматривает способ определения того, вызывает ли агент подавление иммунитета у субъекта, где способ включает контактирование пробы лимфоцитов от субъекта после воздействия агента с одним или несколькими усилителями, которые стимулируют приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение наличия и уровня эффекторных молекул из лимфоцитов, где уровень эффекторных молекул определяет уровень иммуносупрессии, индуцированной агентом.
Согласно этому аспекту, агент может представлять собой лекарственное средство или токсичное вещество из окружающей среды.
В одном воплощении изобретения образцы крови совместно стимулируют агонистом TCR (например, анти-CD3 антителом) и агонистом TLR (например, TLR-7/8 агонистом, имидазохинолином [R848]).
Таким образом, настоящее изобретение предусматривает способ измерения активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта, включающий контактирование пробы лимфоцитов от субъекта с агонистом TCR и агонистом TLR для усиления приобретенного и врожденного иммунитета и измерение уровня иммунной эффекторной молекулой, продуцированной иммунными клетками, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у субъекта.
Другой аспект настоящего изобретения предусматривается способ измерения активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта, включающий контактирование пробы лимфоцитов от субъекта с агонистом TCR и агонистом TLR, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение увеличения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточно-опосредованной реактивности у субъекта, где уровень реактивности свидетельствует о наличии или отсутствии, либо степени или стадии заболевания или состояния, выбранного из списка, включающего заражение патогенным агентом, аутоиммунное заболевание, рак, воспалительное состояние и воздействие токсичного агента.
Также предусмотрено применение агониста TCR и агониста TLR, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, в производстве диагностической тест-системы клеточно-опосредованной иммунологической реактивности методом инкубации лимфоцитов с одной или более молекулой, которая усиливает системы приобретенного и врожденного иммунитета, и определения присутствия или повышения уровня эффекторной молекулы.
В другом воплощении настоящее изобретение предусматривает способ определения того, вызывает ли состояние болезни подавление иммунитета у субъекта, где способ включает контактирование пробы лимфоцитов от субъекта, имеющего то или иное заболевание, с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и определение наличия и уровня иммунной эффекторной молекулы из лимфоцитов, где уровень иммунной эффекторной молекулы свидетельствует о степени иммуносупрессии, вызванной или связанной с заболеванием.
Также предусмотрено применение одного или нескольких агентов, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет в производстве диагностической тест-системы клеточно-опосредованной иммунной реактивности методом инкубации лимфоцитов с одной или более молекулой, которая усиливает системы приобретенного и врожденного иммунитета, и определения наличия или повышение уровня эффекторной молекулы.
Такое применение включает в себя использование для обнаружения и контроля присутствия, отсутствия, уровня или стадии заболевания или состояния, такого как инфекция патогенным агентом, аутоиммунное заболевание, рак, воспалительное заболевание и/или воздействие лекарственным препаратом или токсичным агентом, таким как бериллий или другим токсичным веществом из окружающей среды. Измерение "иммунной эффекторной молекулы" включает в себя измерение одного или нескольких различных типов молекул.
Указание на усиление приобретенного и врожденного иммунитета включает в себя стимулирование Т-клеточный рецептор -зависимого и/или -независимого иммунитета и Toll-подобный рецептор (TLR) -зависимого иммунитета, такого как опосредованный NK-клетками. Термин "клетки иммунной системы" включает "Т-клетки". Также может быть добавлен дополнительный агент для модуляции активности регуляторных Т-клеток (T-reg клеток). Последнее включает в себя ингибирование супрессорной функции T-reg клеток. Агенты, которые модулируют Т-reg клетки, используемые здесь, включают CD25 лиганд; смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды к генетическому материалу, кодирующему JAK1 или TYK2; нейтрализующие антитела, CpG-содержащий олигонуклеотид; олигонуклеотид, действующий в качестве TLR-модулирующего агента, а также другие TLR-модулирующие агенты.
В частном воплощении T-reg клетки являются супрессорными клетками иммунного ответа, активность которых ингибирована.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу измерения активности клеточного иммунного ответа у субъекта, включающему контактирование пробы регуляторных Т-клеток от субъекта с агентом, выбранным из (i) ингибитора супрессорных регуляторных Т-клеток и (ii) активатора иммунных усиливающих клеток или их части, и дальнейшее контактирование Т-клеток с одним или несколькими агентами, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и измерение увеличения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточно-опосредованной реактивности у субъекта.
Примеры ингибиторов или модуляторов T-reg функции включают CD25 лиганды, такие как, но не ограничиваясь этим, поликлональные или моноклональные антитела к CD25 или их антигенсвязывающие фрагменты, гуманизированные или деиммунизированные поликлональные или моноклональные антитела к CD25, либо рекомбинантные или синтетические формы поликлональных или моноклональных антител. Другие примеры агентов включают смысловые или антисмысловые нуклеиновые молекул, направленные на мРНК или ДНК (т.е. генетический материал), кодирующий Янус-тирозинкиназу 1 (JAK1) или тирозинкиназу 2 (TYK2) или небольшие молекулы ингибиторов JAK1 или TYK2 белков. Указание "малые молекулы" включает иммуноглобулиновые новые антигенные рецепторы (IgNARs), как описанные в Международной заявке на патент WO 2005/118629. Дополнительные примеры подходящих агентов включают такие стимулирующие агенты как CpG молекулы, которые действуют через Toll-подобные рецепторы (TLR) и/или другие механизмы. Таким образом, CpG-содержащие олигонуклеотиды и олигонуклеотид, действующий в качестве TLR-модулирующего агента, также являются частью настоящего изобретения.
Для модуляции T-reg клеток может быть использован как один тип агента, так и агенты двух или более типов. Например, анализ может быть проведен с лигандом CD25 и JAK1/TYK2 смысловым или антисмысловым олигонуклеотидом; лигандом CD25 и TLR-модулирующим агентом; JAK1/TYK2 смысловым или антисмысловым олигонуклеотидом и TLR-модулирующим агентом, или лигандом CD25, JAK1/TYK2 смысловым или антисмысловым олигонуклеотидом и TLR-модулирующим агентом. Альтернативно, используется только один тип агента. В другом альтернативном варианте используются CpG-содержащий олигонуклеотид и TLR-модулирующий агент.
В соответствии с различными аспектами настоящего изобретения лимфоциты/клетки иммунной системы могут также подвергаться воздействию антигена для измерения антиген-индуцированной реактивности приобретенного и врожденного иммунитета.
Указание "субъект" включает человека или виды, отличные от человека, в том числе приматов, домашний скот (в том числе, овцы, коровы, свиньи, лошади, ослы, козы), лабораторных подопытных животных (в том числе, мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки), домашних животных (в том числе, собаки, кошки), различных птиц (в том числе, домашние птицы, вольерные птицы), пресмыкающихся и земноводных. Таким образом, настоящее изобретение может найти применение для человека в медицине, также как и в животноводстве и ветеринарии, а также применение для диких животных, в том числе в отрасли бегов лошадей, собак и верблюдов. Например, анализ по настоящему изобретению может обычно осуществляться на лошадях до и/или после сильного напряжения (например, скачки) для выявления симптомов легочного кровоизлияния, вызванного физической нагрузкой (EIPH). Все лошади проявляют ту или иную форму EIPH в той или иной степени во время тренировки. Однако субклинические формы EIPH может быть трудно обнаружить.
Указание человека включает отдельные популяции людей, таких как дети, пожилые и немощные люди, а также, в частности, группы людей или популяции отдельной расовой принадлежности.
В другом воплощении субъект представляет собой человека, а анализ клеточно-опосредованного иммунного ответа используется для скрининга реактивности к патогенным микроорганизмам, вирусам и паразитам, потенциальные для развития или мониторинга аутоиммунных условий, целиакии, мониторинга ответа у субъекта к онкологическим проявлениям и для определения наличия любого типа иммунодефицита или иммуносупрессии. Последнее может быть вызвано, например, определенными медикаментами, в том числе различными химиотерапевтическими агентами. Кроме того, оно может быть вызвано воздействием токсичных веществ из окружающей среды и загрязнителей.
Иммунные эффекторные молекулы могут быть любыми из многочисленных молекул, которые вырабатываются в ответ на активацию клеток или стимуляцию антигеном. Несмотря на то, интерферон (IFN), такой как IFN-γ, является предпочтительной иммунной эффекторной молекулой, могут быть использованы другие молекулы, включая ряд цитокинов, таких как интерлейкин (IL), например, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 или IL-13, фактор некроза опухоли альфа (TNF-a), трансформирующий фактор роста бета (TGF-R), колониестимулирующий фактор (CSF), такой как гранулоцитарный (G)-CSF или гранулоцитарномакрофаговый (GM)-CSF, среди прочего комплемент или компоненты пути комплемента. Другие эффекторные молекулы, которые могут быть использованы, перечислены в Таблице 6.
Примеры агонистов Т-клеточных рецепторов включают РНА, стафилококковый энтеротоксин В (SEB), CpG олигонуклеотиды, антитела к комплексу Т-клеточного рецептора и анти-СD3 антитела. Примеры стимуляторов Т-клеточный рецептор -независимого приобретенного иммунитета включают РМА и ConA. TLR агонисты включают Pam3CSK4 (TL R-2 лиганд), Липоманнан (TLR-2 лиганд), поли(1:С)- (TLR-3 лиганд), липополисахарид (TLR-4 лиганд), имидазохинолин соединение, такое как R848 (TLR-7/8 лиганд) и CpG олигодезоксинуклеотиды (TLR-9 лиганд). С точки зрения выбора TLR агонистов, в порядке убывания, агонисты выбираются из агонистов для TLR-7/8>TLR-4>TLR-3>TLR-2.
"CpG молекула" означает олигонуклеотид, содержащий CpG последовательность или мотив. Настоящее изобретение распространяется на любой модулятор функции Toll-подобных рецепторов (TLR) или иной аспекта иммунной системы.
Настоящее изобретение также относится к способу измерения активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта, включающего контактирование пробы лимфоцитов от субъекта с агонистами TLR и стимулятором приобретенного иммунитета и измерение уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточно-опосредованной реактивности у субъекта.
Анализ по настоящему изобретению позволяет обнаруживать наличие или отсутствие, либо степень или стадию заболевания или состояния у субъекта, такого как инфекция патогенным агентом, аутоиммунное заболевание, рак, воздействие воспалительного агента, воздействие лекарственного средства, воздействие токсичных агентов, таких как бериллий или другие токсичные вещества или загрязнители, а также иммунодефицит или иммуносупрессия, в том числе индуцированная заболеванием или болезнью.
Агент или агенты для приобретенного и врожденного иммунитета могут быть в свободной форме в реакционном сосуде или могут быть иммобилизованными на твердой подложке, такой как гранулы или боковая поверхность либо дно реакционного сосуда. Агент или агенты могут также быть представлены в высушенном состоянии, а затем могут быть восстановлены до или во время использования. Аналогично, если антиген входит, антиген может быть в свободной форме или может быть иммобилизованным в реакционном сосуде, в том числе на самом сосуде либо гранулах или на другой твердой подложке.
В одном из вариантов проба, полученная от субъекта, как правило, хранится в пробирке для сбора крови. Пробирки для сбора крови включают пробирки для взятия крови и других им подобные сосуды. Наиболее удобно, если проба представлена цельной кровью, а пробирки для сбора крови гепаринизированы. Альтернативно, гепарин добавляется в пробирку после сбора крови. Несмотря на то, что цельная кровь детально рассмотрена и представляет наиболее удобный образец, настоящее изобретение предполагает и другие виды проб, содержащих клетки иммунной системы, таких как лимфатическая жидкость, мозговая жидкость, тканевая жидкость и жидкости дыхательной системы, в том числе носовая и легочная жидкости, а также пробы, претерпевшие истощение клеток. Указание "кровь" включает цельную кровь, неразведенную, в частности, тканевой культурой, средой, реагентами, наполнителями и т.д. В одном варианте воплощения термин "кровь" включает анализируемый образец (т.е. реакционную смесь), содержащий по меньшей мере 10% по объему цельной крови. Термин "по меньшей мере 10% по объему" включает объемы крови 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и 100% по объему от общего числа анализируемого объема реакционной смеси. Могут быть добавлены дополнительные агенты, такие как культуральная среда, ферменты, наполнители, антиген и т.п., не отходя от понятия образца, содержащего "цельную кровь".
Также могут быть использованы небольшие объемы крови, такие как от 1 мкл до 1000 мкл. Примеры включают 5 мкл, 10 мкл, 20 мкл, 50 мкл, 100 мкл и 500 мкл, а также доли между указанными. Таким образом, объемы образца включают от 1 мкл до 200 мл, в том числе 1 мл, 5 мл, 10 мл и 20 мл.
Применение пробирки для сбора крови совместимо со стандартными автоматизированными лабораторными системами и пригодно для анализа в крупномасштабных системах и системах произвольной выборки. Пробирки для сбора крови также минимизируют расходы на обработку и уменьшают лабораторное воздействие на цельную кровь и плазму и, следовательно, уменьшают риск контактирования лабораторного персонала с патогенным агентом, таким как ВИЧ или вирус гепатита В (HBV) и вирус гепатита С (HCV).
Комбинирование стадии инкубации с пробирками для сбора крови особенно эффективно и повышает чувствительность анализа, так как обеспечивает дополнительное средство инкубации клеток в присутствии простых Сахаров, таких как декстроза или глюкоза.
Клетки клеточно-опосредованной иммунной системы теряют способность обеспечивать иммунный ответ в цельной крови после длительного периода, следующего за отбором крови от субъекта, а иммунные ответы без вмешательства часто сильно уменьшены или отсутствуют после 24 часов с момента сбора крови. Сокращение работы и потребности в специализированных пластиковых изделиях позволяет стимулировать клеточно-опосредованной иммунитет антигенами для выполнения в месте ухода, в таких местах как врачебный кабинет, клиника, амбулаторные учреждения, а также ветеринарные клиники или фермы. После того как антигенная стимуляция завершена, потребности в свежих и активных клетках больше нет. IFN-y и другие цитокины и иммунные эффекторные молекулы являются стабильными в плазме крови и, таким образом, образец может быть сохранен или транспортирован без особых условий или временных требований.
Стадия инкубации может длиться от 1 до 50 часов, например от 1 до 40 часов или от 8 до 24 часов или периода времени, в том числе между 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 часов. Период в 24 часа особенно удобен.
Возможность измерения клеточно-опосредованного иммунитета имеет важное значение для оценки способности субъекта реагировать на заражение патогенным агентом, таким как микроорганизмы или вирусы, либо паразиты; вызывать аутоиммунный ответ, такой как при аутоиммунном диабете или для защиты от рака или других онкологических заболеваний, либо для выявления воспалительного состояния или для выявления воздействия или чувствительности у субъекта к токсическому агенту, такому как бериллий. Анализ, описанный здесь, также позволяет обнаруживать заболевание, приводящее к иммуносупрессии или иммуносупрессии, вызванной медицинскими препаратами. Таким образом, указание "измерение клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта" включает иммунную диагностику инфекционных и аутоиммунных заболеваний, маркер иммунологической компетенции, а также маркер воспалительных заболеваний, рака и токсических агентов. Важно отметить, что определяются комбинированные реакции приобретенной и врожденной иммунных систем. Кроме того, возможность использования малых объемов крови позволяет легко проводить анализы, например, у детей, пожилых и немощных людей.
В одном воплощении заболевания, приводящие к иммуносупрессии, включают хронические инфекции и рак. Медикаменты, которые могут привести к иммуносупрессии, включают те, которые используются для лечения ревматоидного артрита, рака и воспалительных заболеваний кишечника.
Патогенные или инфицирующие агенты включают бактерий, паразитов и вирусов. Примеры бактерий включают грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, таких как виды Mycobacterium, виды Staphylococcus, виды Streptococcus, Escherichia coli, виды Salmonella, виды Clostridium, виды Shigella, виды Proteus, виды Bacillus, виды Hemophilus, виды Borrelia среди прочего. Mycobacterium tuberculosis является особенно пригодным целевым агентом, так же как и условия появления инфекции Mycobacterium tuberculosis, например, туберкулеза (ТБ). Примеры вирусов включают вирус гепатита (вирус гепатита В и вирус гепатита С), вирус герпеса и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), а также вызванные ими заболевания. Паразиты включают различные виды Plasmodium, стригущий лишай, паразиты печени и т.п. Другие патогенные агенты включают эукариотические клетки, такие как дрожжи и грибы.
Аутоиммунные заболевания, предусмотренных здесь для детекции, включают inter alia очаговую алопецию, анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, рассеянный склероз, аутоиммунные заболевания надпочечников, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатии, целиакия спру-дерматит, синдром хронической усталости (СХУ), хроническую воспалительную демиелинизацию, хронические воспалительные полиневропатии, синдром Чарга - Стросса, рубцовый пемфигоид, синдром Тибьержа-Вейсенбаха, болезнь холодовой агглютинации, болезнь Крона, герпетиформный дерматит, дискоидную волчанку, различные криоглобулинемии, фибромиалгию, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический легочный фиброз, идиопатическую пурпурную тромбоцитопению (ITP), IgA нефропатию, инсулинозависимый сахарный диабет (тип I), красный плоский лишай, красную волчанку, болезнь Меньера, различные заболевания соединительной ткани, рассеянный склероз, миастению, миокардит, обыкновенную пузырчатку, злокачественную анемию, узелковый полиартериит, полихондрит, полигранулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, основную агаммаглобулинемию, первичный билиарный цирроз печени, псориаз, синдром Рейно, синдром Рейтера, ревматизм, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, системную красную волчанку, артериит Такаясу, височный артериит/болезнь Хортона, язвенный колит, увеит, васкулит и витилиго.
Как правило, важно оценить потенциальную или реальную клеточно-опосредованную реактивность у субъектов, подверженных таким инфекциям. Способ по настоящему изобретению может быть также использован для определения наличия или отсутствия этих условий, а также уровня или стадии заболевания.
Другие заболевания, которые могут привести к иммуносупрессии, включают воспалительные заболевания.
Примеры воспалительных заболеваний, предусмотренные настоящим изобретением, включают, но не ограничиваясь этим, болезни и расстройства, которые приводят к покраснению, отеку, боли и чувству жара в определенных областях, что предназначено для защиты тканей, пораженных из-за травмы или болезни. Воспалительные заболевания, которые можно лечить с помощью способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь этим, акне, ангину, артрит, аспирационную пневмонию, эмпиему, гастроэнтерит, воспаление, кишечный грипп, NEC/некротический энтероколит, воспаление тазовых органов, фарингит, PID, плеврит, заболевания горла, покраснение, боль в горле, расстройство желудка и инфекции мочевыводящих путей, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулонейропатию. Что касается применения не для человека, то настоящее изобретение распространяется на выявление EIPH у лошадей и различных заболеваний у животных, таких как лицевая опухоль у Тасманского Дьявола.
Лечение рака также каким-то образом зависит от клеточного иммунитета и сам рак или лекарственные препараты, применяемые для лечения рака, могут привести к иммуносупрессии. Типы рака, предусмотренные в настоящем документе, включают: группу заболеваний и расстройств, которые характеризуются неконтролируемым ростом клеток (например, образование опухолей) без дифференциации этих клеток в различные специализированные клетки. Такие заболевания и расстройства включают ABL1 протоонкоген, рак, связанный со СПИДом, невриномы слухового нерва, острый лимфобластный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, рак аденоцистомы, рак надпочечников, идиопатическую миелоидную метаплазию, алопецию, альвеолярную мягкую саркому, рак анального канала, ангиосаркому, апластическую анемию, астроцитому, атаксию-телеангиэктазию, базально-клеточную карциному (кожи), рак мочевого пузыря, рак костей, рак кишечника, глиому ствола головного мозга, опухоль головного мозга и ЦНС, рак молочной железы, опухоль ЦНС, карциноидные опухоли, рак шейки матки, опухоль мозга у детей, рак у детей, лейкемию у детей, саркому мягких тканей у детей, хондросаркому, хориокарциному, хронический лимфолейкоз, хронический миелолейкоз, колоректальный рак, кожную Т-клеточную лимфому, дерматофибросаркому с протуберанцем, десмопластическая опухоль малых округлых клеток, рак протоков, эндокринный рак, рак эндометрия, эпендимому, рак пищевода, саркома Юинга, рак экстра-печеночных желчных протоков, рак глаз, меланома глаза, ретинобластому, рак маточных труб, анемию Фанкони, фибросаркому, рак желчного пузыря, рак желудка, рак двенадцатиперстной кишки, желудочно-карциноидную опухоль, рак мочеполовой системы, опухоль зародышевых клеток, гестационные трофобластическо-сосудистые заболевания, глиому, гинекологические виды рака, гемобластические злокачественные образования, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, наследственный рак молочной железы, гистиоцитоз, болезнь Ходжкина, вирус папилломы человека, пузырный занос, гиперкальциемию, рак гортаноглотки, внутриглазную меланому, рак островковых клеток, саркому Капоши, рак почки, гистиоцитоз к леток Лангерганса, рак гортани, лейомиосаркому, лейкозы, синдром Ли-Фраумени, рак губы, липосаркому, рак печени, рак легких, лимфедему, лимфомы лимфому Ходжкина, лимфому не-Ходжкина, рак груди у мужчин, злокачественную палочковидную опухоль почки, медуллобластому, меланому, клеточный рак Меркеля, мезотелиому, метастатический рак, рак ротовой полости, множественную эндокринную неоплазию, грибовидный микоз, миелодиспластический синдром, миелому, миелопролиферативные расстройства, назальный рак, рак носоглотки, нефробластому, нейробластому, нейрофиброматоз, синдром хромосомных поломок Ниймеген, не-меланомный рак кожи, немелкоклеточный рак легких (НМРЛ), рак глаза, рак пищевода, рак ротовой полости, рак ротоглотки, остеосаркома, рак стомы яичников, рак поджелудочной железы, околоносовой рак, рак паращитовидных желез, рак околоушной железы, рака полового члена, периферическую нейроэктодермальную опухоль, рак гипофиза, истинную полицитемиию, рак простаты, редкие виды рака и связанные с ними расстройства, рак клеток почек, ретинобластому, рабдомиосаркому, синдром Ротмунда-Томсона, рак слюнных желез, саркому, шванному, синдром Сезари, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого (МРЛ), мелкоклеточный рак кишечника, саркомы мягких тканей, опухоли спинного мозга, плоскоклеточный рак (кожи), рак желудка, синовиальную саркому, рак яичек, рак вилочковой железы, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак (мочевого пузыря), переходно-клеточный рак (почек, почечной лоханки, мочеточников), трофобластической рак, уретральный рак, рак мочевого системы, уроплакинс, саркому матки, рак матки, рак влагалища, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема и опухоль Вильмса.
Как указано выше, иммунной клетки, такие как лимфоциты, могут также подвергаться воздействию антигена для оценки антиген-индуцированного приобретенного и врожденного иммунитета.
Детекция иммунных эффекторных молекул может быть проведена для белка или нуклеиновой кислоты. Таким образом, указание "наличие или уровень" иммунной эффекторной молекулы включает прямые и косвенные данные. Например, высокие уровни мРНК цитокинов представляют собой косвенные данные, свидетельствующие о повышении уровня цитокинов.
Лиганды для иммунных эффекторов особенно пригодны для обнаружения и/или количественной оценки этих молекул. Антитела к иммунным эффекторам особенно полезны. Методы анализов, предусмотренных в настоящем документе, известны в данной области и включают, например, радиоиммунологический анализ, сэндвич-анализ, ELISA и ELISpot. Указание "антитела" включает фрагменты антител, адаптированные для млекопитающих антитела (например, гуманизированные), деиммунизированные антитела, рекомбинантные или синтетические антитела, а также гибридные и одноцепочечные антитела. Для кожных тестов у людей здесь предусмотрены гуманизированные или деиммунизированные антитела для обнаружения эффекторных молекул.
Как поликлональные, так и моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации иммунными эффекторными молекулами или их антигенными фрагментами, используемые для иммуноанализа. Способы получения обоих типов сыворотки хорошо известны в данной области. Поликлональные сыворотки менее предпочтительны, но их относительно легко получить путем инъекций подходящим лабораторным животным эффективного количества иммунных эффекторов или их антигенной части, сбором сыворотки от животного и выделением специфических сывороток любым из известных методов иммуноадсорбирования. Хотя антитела, получаемые этим методом, подходят практически для любого типа иммуноанализа, они, как правило, менее предпочтительны из-за возможной неоднородности продукта.
Использование моноклональных антител в иммуноанализе особенно полезно из-за возможности их получения в больших количествах и однородности продукта. Подготовка гибридомных клеточных линий для продукции моноклональных антител, полученных путем слияния иммортализованной клеточной линии и лимфоцитов, сенсибилизированных в отношении иммуногенного препарата, может быть осуществлена с помощью методов, которые хорошо известных специалистам в данной области.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения предусматривает способ выявления иммунных эффекторных молекул в образце, содержащем лимфоциты от субъекта, где способ включает контактирование образца или аликвоты образца с антителом, специфичным для иммунной эффекторной молекулы или ее антигенных фрагментов, в течение некоторого времени и в условиях, достаточных для формирования комплексов антитело-эффектор, а затем выявление комплексов, где иммунные эффекторные молекулы образуются после инкубации лимфоцитов с одним или несколькими агентами, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета.
"Образец" включает цельную кровь или ее часть, содержащую лимфоциты. Такой способ включает микро-массивы, макро-массивы и нано-массивы на плоских или сферических твердых подложках. Используется как микро-, так и макро- массив. "Образец" также включает образцы небольших объемов от 1 мкл до 1000 мкл, в том числе 5 мкл, 10 мкл, 20 мкл, 50 мкл и 100 мкл.
Различные варианты методов иммуноанализа раскрыты в Патентах США №№. 4,016,043, 4,424,279 и 4,018,653.
Ниже приведено описание одного варианта анализа. Немеченые антитела иммобилизованы на твердой подложке, а образец, исследуемый на иммунные эффекторные молекулы (например, цитокины), контактирует со связанными молекулами. После периода инкубации в течение времени, достаточного для образования комплексов антитело - иммунная эффекторная молекула, добавляется вторичное антитело, специфичное к эффекторной молекуле, меченное репортерной молекулой, способной производить детектируемый сигнал, и смесь инкубируется в течение времени, достаточного для формирования другого комплекса антитело-эффектор-меченое антитело. Любой непрореагировавший материал вымывается, а наличие эффекторных молекул определяется путем наблюдения сигнала, производимого репортерной молекулой. Результаты могут быть как качественными, путем простого наблюдения видимого сигнала, или могут быть количественными, путем сравнения с контрольным образцом, содержащим известное количество антигена. Такой обобщенный метод хорошо известен специалистам в данной области также как и его различные вариации.
В этих анализах первичное антитело, специфичное к данному иммунному эффектору, либо ковалентно или пассивно связано с твердой поверхностью. Твердая поверхность, как правило, представлена стеклом или полимером, наиболее часто используются полимеры целлюлозы, полиакриламида, нейлона, полистирола, поливинилхлорида или полипропилена. Твердые носители могут быть в виде трубок, гранул, сфер, дисков микропланшетов или любой другой поверхностью, пригодной для проведения иммуноферментного анализа. Процессы прикрепления хорошо известны в данной области и, как правило, заключаются в ковалентном связывании или физической адсорбции, полимер-антитело промывают при подготовке исследуемого образца. Аликвота исследуемого образца добавляется к твердой фазе комплекса и инкубируется в течение достаточного периода времени (например, 2-120 минут или для удобства на ночь) и при определенных условиях (например, примерно от 20°С до 40°С) для связывания любой субъединицы антитела. После инкубационного периода твердую фазу с субъединицами антитела промывают и сушат, а затем инкубируют с вторичным антителом, специфичным к части эффекторной молекулы. Вторичное антитело связано с репортерной молекулой, которая используется как индикатор связывания вторичного антитела с эффекторной молекулой.
Существует множество вариаций этого метода. Одним наиболее полезным вариантом такого метода является одновременный анализ, где все или большинство компонентов смешивают практически одновременно. Кроме того, связывание антител с цитокинами может быть определено путем связывания меченых антител, направленных на указанное первичное антитело.
Под "репортерной молекулой", используемой в данном описании, имеется в виду молекула, которая по своей химической природе обеспечивает аналитически идентифицируемый сигнал, который позволяет обнаружить антиген-связанное антитело. Детекция может быть качественной или количественной. Наиболее часто используемыми репортерными молекулами для этого типа анализа являются ферменты, флуорофоры или радионуклид-содержащие молекулы (например, радиоактивные изотопы) и хемилюминесцентные молекулы. Примеры подходящих флуорофоров приведены в Таблице 1. В случае иммуноферментного анализа, фермент конъюгирован с вторичным антителом, как правило, с помощью глутаральдегида или периодата. Однако, как может быть без труда признано, существуют широкий спектр различных методов конъюгирования, которые являются доступными для специалиста в данной области. Обычно используются ферменты, включая пероксидазу хрена, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу и щелочную фосфатазу, среди прочего. Субстраты для использования с определенными ферментами, как правило, выбираются для получения, после гидролиза соответствующим ферментом, детектируемого изменения цвета. Примеры подходящих ферментов включают щелочную фосфатазу и пероксидазу. Можно также использовать флуорогенные субстраты, которые дают флуоресцирующий продукт, в отличие от хромогенного, как указанные выше. Во всех случаях фермент-меченные антитела добавляются к первым комплексам антитело-антиген для связывания с ними, а затем избыток реагента вымывается. Раствор, содержащий соответствующие субстраты, затем добавляется к комплексу антитело-антиген-антитело. Субстрат вступает в реакцию с ферментом, связанным с вторым антителом, предоставляя качественный визуальный сигнал, который может быть в дальнейшем оценен количественно, как правило, спектрофотометрически, для оценки количества антигена, который присутствовал в образце. Опять же настоящее изобретение распространяется на по существу одновременный анализ.
С другой стороны, флуоресцентные соединения, такие как флуоресцеин и родамин, могут быть химически связаны с антителами, не изменяя их связывающей способности. При активации светом определенной длины волны флуорохром меченых антител поглощает энергию света, вызывая состояние возбуждения в молекуле, и затем испускает свет характерного цвета, который может быть определен визуально с помощью светового микроскопа. Флуоресцентно-меченые антитела могут связываться с первым комплексом антитело-антиген. После вымывания оставшихся несвязанных реагентов третичный комплекс затем облучают светом соответствующей длины волны, наблюдаемая флуоресценция указывает на наличие интересующего антигена. Иммунофлуоресценция и ферментные методы иммуноанализа очень хорошо зарекомендовали себя в уровне техники и особенно предпочтительны для настоящего способа. Тем не менее, также могут быть использованы другие репортерные молекулы, такие как радиоизотопы, хемилюминесцентные или биолюминесцентные молекулы.
Существует целый ряд других систем детекции, которые могут быть использованы, включая коллоидное золото, и все такие системы детекции охвачены настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также предусматривает генетические анализы, такие как основанные на ПЦР-анализе для обнаружения РНК продуктов экспрессии генетической последовательности, кодирующей иммунный эффектор.
В одном из вариантов воплощения ПЦР проводится с использованием пары праймеров, из которых один или оба, как правило, мечены одной и той же или разными репортерными молекулами, способными производить различимый сигнал. Использование флуорофоров особенно полезно в практике настоящего изобретения. Примеры подходящих флуорофоров могут быть выбраны из списка, приведенного в Таблице 1. Другие метки включают люминесцирующие и фосфоресцирующие, а также инфракрасные красители. Такие красители или флуорофоры также могут быть использованы в качестве репортерных молекул для антител.
| Таблица 1 | ||
| Список подходящих флуорофоров | ||
| Зонд | Ех1 (нм) | Em2 (нм) |
| Химически активные и конъюгированные зонды | ||
| Гидроксикумарин | 325 | 386 |
| Аминокумарин | 350 | 455 |
| Метоксикумарин | 360 | 410 |
| Каскадный голубой | 375; 400 | 423 |
| Lucifer Yellow | 425 | 528 |
| Нитробензоксадиазол | 466 | 539 |
| R-фикоэритрин (РЕ) | 480; 565 | 578 |
| РЕ-Су5 конъюгаты | 480; 565; 650 | 670 |
| РЕ-Су7 конъюгаты | 480; 565; 743 | 767 |
| АРС-Су7 конъюгаты | 650; 755 | 767 |
| Red 613 | 480; 565 | 613 |
| Флуоресцеин | 495 | 519 |
| FluorX | 494 | 520 |
| BODIPY-FL | 503 | 512 |
| TRITC | 547 | 574 |
| Х-Родамин | 570 | 576 |
| Лиссаминовый родамин В | 570 | 590 |
| Зонд | Ех1 (нм) | Em2 (нм) |
| PerCP | 490 | 675 |
| Texas Red | 589 | 615 |
| Аллофикоцианин (АРС) | 650 | 660 |
| TruRed | 490, 675 | 695 |
| AlexaFluor350 | 346 | 445 |
| Alexa Fluor 430 | 430 | 545 |
| Alexa Fluor 488 | 494 | 517 |
| Alexa Fluor 532 | 530 | 555 |
| Alexa Fluor 546 | 556 | 573 |
| Alexa Fluor 555 | 556 | 573 |
| Alexa Fluor 568 | 578 | 603 |
| Alexa Fluor 594 | 590 | 617 |
| Alexa Fluor 633 | 621 | 639 |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 688 |
| Alexa Fluor 660 | 663 | 690 |
| Alexa Fluor 680 | 679 | 702 |
| Alexa Fluor 700 | 696 | 719 |
| Alexa Fluor 750 | 752 | 779 |
| Cy2 | 489 | 506 |
| Cy3 | (512); 550 | 570; (615) |
| Cy3,5 | 581 | 596;(640) |
| Cy5 | (625); 650 | 670 |
| Cy5,5 | 675 | 694 |
| Cy7 | 743 | 767 |
| Зонды нуклеиновых кислот | ||
| Hoeschst 33342 | 343 | 483 |
| DAPI | 345 | 455 |
| Hoechst 33258 | 345 | 478 |
| SYTOX Blue | 431 | 480 |
| Хромомицин A3 | 445 | 575 |
| Митрамицин | 445 | 575 |
| YOYO-1 | 491 | 509 |
| SYTOX Зеленый | 504 | 523 |
| SYTOX Оранжевый | 547 | 570 |
| Этидия бромид | 493 | 620 |
| 7-AAD | 546 | 647 |
| Акридиновый оранжевый | 503 | 530/640 |
| TOTO-1, TO-PRO-1 | 509 | 533 |
| Тиазоловый оранжевый | 510 | 530 |
| Пропидиум иодид (PI) | 536 | 617 |
| ТОТО-3, TO-PRO-3 | 642 | 661 |
| LDS751 | 543; 590 | 712; 607 |
| Флуоресцентные белки | ||
| Y66F | 360 | 508 |
| Y66H | 360 | 442 |
| EBFP | 380 | 440 |
| Wild-type | 396, 475 | 50, 503 |
| GFPuv | 385 | 508 |
| Зонд | Ех1 (нм) | Em2 (нм) |
| ECFP | 434 | 477 |
| Y66W | 436 | 485 |
| S65A | 471 | 504 |
| S65C | 479 | 507 |
| S65L | 484 | 510 |
| S65T | 488 | 511 |
| EGFP | 489 | 508 |
| EYFP | 514 | 527 |
| DsRed | 558 | 583 |
| Другие зонды | ||
| Монохлоробиман | 380 | 461 |
| Кальцеин | 496 | 517 |
| 1 Ех: длина волны пика возбуждения (нм) | ||
| 2 Em: длина волны пика эмиссии (нм) |
Настоящее изобретение предусматривает любой подходящий способ анализа флуоресценции. В связи с этим настоящее изобретение предусматривает способы, включающие, но не ограничиваясь этим, флуоресцентную спектроскопию с временным разрешением в 2 фотона и 3 фотона, как, например, описанные Lakowicz et al., Biophys. J. 72/567, 1997, флуоресцентную микроскопию в реальном времени, как, например, раскрытая Eriksson et al., Biophys. J. 2:64, 1993, и передачу энергии посредством флуоресцентного резонанса, как, например, раскрытая Youvan et al., Biotechnology et elia 3:1-18, 1997.
Люминесценция и фосфоресценция может быть обеспечена подходящими люминесцентными или фосфоресцирующими метками, соответственно, которые известны из уровня техники. Любой оптический способ для идентификации метки может быть использован в соответствии с настоящим изобретением.
Инфракрасное излучение может вызываться подходящим инфракрасным красителем. Примеры инфракрасных красителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь этим, описанные в Lewis et al., Dyes Pigm. 42(2):197, 1999, Tawa et al., Mater. Res. Soc. Symp. Proc.488 [Electrical, Optical and Magnetic Properties of Organic Solid-State Materials IV], 885-890, Daneshvar et al., J. Immunol. Methods 226(1-2): 119-128, 1999, Rapaport et al., Appl. Phys. Lett. 74(3):329-331, 1999 and Durig et al., J. Raman Spectrosc. 24(5)-281-285, 1993. Может быть использован любой подходящий метод инфракрасной спектроскопии для выявления инфракрасного красителя. Например, для ИК-спектроскопии может быть использовано преобразование Фурье, как, например, описано Rahman et al., J. Org. Chem. 63: 6196, 1998.
Соответственно, электромагнитное рассеяние может возникнуть в результате дифракции, отражения, преломления и поляризации излучения электромагнитных волн, включая свет и рентгеновские лучи. Такое рассеяние может быть использовано для количественного определения уровня мРНК или уровня белка.
Проточная цитометрия особенно пригодна при анализе эмиссии флуорофора.
Как известно из уровня техники, проточная цитометрия является высокопроизводительным методом, который обеспечивает быстрый анализ физических и химических свойств частиц (например, меченых РНК, ДНК и белков), которые проходят в потоке жидкости через один или несколько лазерных лучей. Поскольку каждая частица попадает под лазерный луч, рассеянный и дневной свет, излучаемый каждым элементом или частицей, детектируется и записывается с помощью любого подходящего алгоритма слежения, например, описанного ниже.
Современный проточный цитометр в состоянии выполнить эти задачи до 100000 клеток/частиц с-1. Благодаря использованию оптического набора фильтров и дихроичных зеркал, могут быть выделены и одновременно обнаружены различные длины волн дневного света. Кроме того, может быть использовано несколько лазеров с различными длинами волн возбуждения. Таким образом, могут быть использованы различные флуорофоры для выявления и изучения, например, различных иммунных эффекторов в образце или иммунных эффекторов из нескольких субъектов.
Подходящие проточные цитометры, которые могут быть использованы в способах по настоящему изобретению, включают те, которые измеряют от 5 до 9 оптических параметров (см. Таблицу 2) с помощью одного возбуждающего лазера, обычно ионами аргона с воздушным охлаждением лазера, работающего при 15 мВт со спектральной линией 488 нм. Более усовершенствованные проточные цитометры способны использовать несколько возбуждающих лазеров, таких как гелий-неоновый лазер (633 нм) или HeCd лазер (325 нм) в дополнение к аргоновый лазеру (488 или 514нм).
| Таблица 2 | |||
| Примерные оптические параметры, которые измеряются с помощью проточной цитометрии | |||
| Параметр | Аббревиатура | Детекционный угол падающего луча лазера | Длина волны (нм) |
| Прямой рассеянный свет | FS | 2-5° | 488* |
| Боковой рассеянный свет | SS | 90° | 488* |
| "Зеленная" флуоресценция | FL1 | 90° | 510-540† |
| "Желтая" флуоресценция | FL2 | 90° | 560-580† |
| "Красная" флуоресценция | FL3 | 90° | >650# |
| * с использование возбуждающего лазера 488 нм | |||
| † ширина полосы пропускания полосно-пропускающего фильтра | |||
| # длинноволновый фильтр. |
Например, Biggs et al., Cytometry 36:36-45, 1999 сконструировали 11-параметрический проточный цитометр с использованием трех возбуждающих лазеров и продемонстрировали использование девяти различных флуорофоров в дополнение к измерениям прямого и бокового рассеяния для целей иммунофенотипирования (т.е. классификации) частиц. Выбор параметров может быть адекватно использован в зависимости от коэффициентов экстинкции, квантовых выходов и количества спектральных наложений между флуорофорами (Malemed et al., "Flow cytometry and sorting", 2nd Ed., New York, Wiley-Liss, 1990). Следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным проточным цитометром или определенным набором параметров. В этой связи, изобретение также предусматривает использование вместо обычного проточного цитометра микропроточного цитометра, как, например, описанный Fu et al., Nature Biotechnology 77:1109-1111, 1999.
Анализ по настоящему изобретению может быть автоматизированным или полуавтоматизированным для высокопроизводительного скрининга или для скрининга числа иммунных эффекторов от одного субъекта. В случае автоматизации анализ легко контролируется компьютерной программой.
Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает веб- и не-веб-системы, где данные о клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у субъекта предоставляются клиент-серверу или другой архитектурной платформе с центральным процессором, который анализирует и сравнивает с контролем и дополнительно считывает другую информацию, такую как возраст пациента, пол, вес и другие заболевания, а затем предоставляет отчет, например, о факторе риска тяжести заболевания или прогрессирования заболевания или состояния, либо показателе вероятности развития заболевания. Таким образом, также обеспечен бизнес-метод, где кровь собирается в переносные пробирки, которые затем анализируются на клеточно-опосредованную иммунологическую реактивность в определенном месте, а результаты отправляются в виде электронного отчета через клиент-сервер или другие архитектурные платформы провайдера клинического обеспечения.
Таким образом, основанное на знаниях программное обеспечение и аппаратные средства также составляют часть настоящего изобретения. Это облегчает клиническое обеспечение выявления того, вызвано ли или связано ли с иммуносупрессией заболевание, в том числе инфекции, рак или воспаление, а также воздействие лекарственного препарата или токсических веществ.
В частности, анализы по настоящему изобретению могут быть использованы в существующих или вновь разработанных основанных на знаниях архитектурах или платформах, связанных с оценкой патологии. Например, результаты анализов передаются через коммуникационную сеть (например, Интернет) или по телефонной связи к системе обработки, где алгоритм хранится и используется для генерации последующего предсказания значения вероятности, которая транслируется в индекс клеточно-опосредованной иммунологической реактивности или иммуносупрессии, который затем передается конечному пользователю в виде диагностического и прогнозирующего отчета. Такой отчет может также послужить основой для ведения клинического ухода и персонализированной медицины.
Таким образом, анализ может быть представлен в виде набора или компьютеризованной системы, которая содержит реагенты, необходимые для определения концентрации иммунных эффекторных молекул после воздействия на лимфоциты одного или нескольких агентов, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунитет, и компьютерное оборудование и/или программное обеспечение для облегчения определения и передачи отчетов врачу.
Например, настоящее изобретение предусматривает способ, который позволяет пользователю определить состояние клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у субъекта, где способ включает:
(a) получение данных в виде уровней или концентраций иммунных эффекторных молекул, которые относительно контроля обеспечивают корреляцию состояния клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у пользователя через сеть связи, иммунная эффекторная молекула измеряется после воздействия на лимфоциты одного или нескольких агентов, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунный ответ;
(b) обработку данных субъекта с помощью одномерного или многомерного анализа, получая значение иммунологической реактивности;
(c) определение статуса субъекта в соответствии с результатами значения иммунологической реактивности по сравнению с заданными значениями, и
(d) передачу индикатора статуса субъекта пользователю через сеть связи.
Указание "одномерный" или "многомерный" анализ включает алгоритм, который осуществляется с помощью одномерной или многомерной функции.
Для удобства способ обычно дополнительно включает:
(a) предоставление определения пользователем данных, используя удаленную конечную станцию; и
(b) передачу данных от конечной станции к базовой через сеть связи.
Базовая станция может включать первую и вторую системы обработки, а способ может включать:
(a) передачу данных к первой системе обработки;
(b) передачу данных ко второй системе обработки; и
(c) вызов первой системы обработки с помощью функции одномерного или многомерного анализа, получая значение клеточно-опосредованной иммунологической реактивности.
Способ также может включать:
(а) передачу результатов функции одномерного или многомерного анализа к первой системе обработки; и
(b) вызов первой системы обработки для определения состояния субъекта.
В этом случае, способ также включает по меньшей мере:
(a) передачу данных между сетью связи и первой системой обработки через первый брандмауэр; и
(b) передачу данных между первой и второй системами обработки через второй брандмауэр.
Вторая система обработки может быть соединена с базой данных, адаптированной для хранения предопределенных данных и/или функции одномерного и/или многомерного анализа, где способ включает:
(a) запрос у базы данных на получение по меньшей мере выбранных предопределенных данных или доступа к функции одномерного или многомерного анализа в базе данных; и
(b) сравнение выбранных предопределенных данных с данными субъекта или получение предопределенного индекса вероятности уровня клеточно-опосредованной иммунологической реактивности или иммуносупрессии.
Вторая система обработки может быть соединенная с базой данных, где способ включает хранение данных в базе данных.
Способ может также включать предоставление пользователю данных для определения, используя безопасный массив, где безопасный массив элементов способен определять уровень иммунной эффекторной молекулы, и предоставления ряда признаков, каждый из которых расположен в соответствующей(-их) позиции(-ях) в соответствующем коде. В этом случае способ обычно включает вызов базовой станции для:
(a) определения кода от данных;
(b) определения схемы, показывающей позицию каждого признака в массиве; и
(c) определения параметрических значений в соответствии с определенной схемой и данными.
Способ может также включать вызов базовой станции для:
(a) определения стоимости информации, где стоимость информации указывает оплату пользователем; и
(b) выполнение сравнения в соответствии с определенной стоимостью информации.
Настоящее изобретение также обеспечивает базовую станцию для определения состояния субъекта в соответствии с клеточно-опосредованной иммунологической реактивностью или иммуносупрессией, где базовая станция включает:
(a) способ хранения;
(b) систему обработки, где система обработки адаптирована для:
(c) получения данных субъекта от пользователя через сеть связи, где данные включают уровни иммунной эффекторной молекулы, где уровень эффекторной молекулы представлен относительно контроля, обеспечивая корреляцию с состоянием клеточно-опосредованной иммунологической реактивности, где иммунная эффекторная молекула определена после обработки лимфоцитов одним или более агентами, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунного ответа;
(d) выполнения алгоритмической функции, включая сравнение данных с предопределенными данными;
(e) определения статуса субъекта в соответствии с результатами алгоритмической функции, включающей указанное сравнение; и
(с) вывода показателя статуса субъекта пользователю через сеть связи.
Система обработки может быть адаптирована для получения данных от удаленной конечной станции, адаптированной для получения данных.
Система обработки может включать:
(a) первую систему обработки, адаптированную для:
(i) получения данных; и
(ii) определения статуса субъекта в соответствии с результатами функции одномерного или многомерного анализа, включающей сравнение данных; и
(b) вторую систему обработки, адаптированную для:
(i) получения данных от системы обработки;
(ii) выполнения функции одномерного или многомерного анализа, включающей указанное сравнение; и
(iii) передачи результатов первой системы обработки.
Базовая станция обычно включает:
(a) первый брандмауэр для связи первой системой обработки с сетью связи; и
(b) второй брандмауэр для связи первой и второй систем обработки.
Система обработки может быть соединена с базой данных, где система обработки адаптирована для хранения данных в базе данных.
В соответствии с этим вариантом воплощения уровень иммунной эффекторной молекулы может быть показан отдельно или в комбинации с другими биомаркерами или индикаторами заболевания. "Измененный" уровень означает увеличение или повышение, либо снижение или уменьшение концентрации иммунной эффекторной молекулы.
Определение концентрации или уровня иммунной эффекторной молекулы позволяет создание диагностического правила, основанного на концентрации по сравнению с контролем. Альтернативно, диагностическое правило основано на применении статистического алгоритма и алгоритма машинного обучения. Такой алгоритм использует соотношение между эффекторной молекулой и статусом заболевания, наблюдаемого в обучающих данных (с известным заболеванием или статусом клеточно-опосредованной иммунологической реактивности) для вывода соотношений, которые затем используются для прогнозирования состояния пациентов с неизвестным статусом. Может быть использован алгоритм, который обеспечивает показатель вероятности того, что субъект имеет определенный уровень клеточно-опосредованной иммунологической реактивности и/или заболевание. Алгоритм осуществляет функцию одномерного или многомерного анализа.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает диагностическое правило, основанное на применении статистических алгоритмов и алгоритмов машинного обучения. Такой алгоритм использует взаимосвязь между иммунной эффекторной молекулой и уровнем клеточно-опосредованной иммунологической реактивности или иммуносупрессии, наблюдаемой в обучающих данных (с известным иммунным статусом) для вывода соотношений, которые затем используются для прогнозирования состояния пациентов с неизвестным иммунным статусом. Практикующие специалисты в данной области анализа данных признают, что в обучении данных могут быть использованы различные формы выводящих связей, существенно не влияя на сущность данного изобретения.
Настоящее изобретение также предусматривает использование базы знаний обучающих данных, содержащих уровни иммунной эффекторной молекулы от субъекта с известным уровнем клеточно-опосредованной иммунологической реактивности для создания алгоритма, который на входе второй базы знаний, содержащей данные уровней той же иммунной эффекторной молекулы от субъекта с неизвестным уровнем иммунологической реактивности, предоставляет индекс вероятности, который предсказывает особенности клеточно-опосредованной иммунологической реактивности.
Термин "обучающие данные" включает знание уровней иммунной эффекторной молекулы по отношению к контролю, где иммунная эффекторная молекула определяется после воздействия на лимфоциты одного или более агентов, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета. "Контроль" включает в себя сравнение уровня иммунной эффекторной молекулы у субъекта с "нормальной" иммунологической реактивностью или может быть статистически определенным уровнем, основанным на обучении.
Таким образом, термин "обучающие данные" включают уровни иммунной эффекторной молекулы.
Уровни или концентрации иммунной эффекторной молекулы обеспечивают ввод исследуемых данных, указанный здесь как "вторая база знаний". Вторая база знаний либо считается относительной контролю, либо подается в алгоритм "первой базы знаний", которая содержат информацию об уровне иммунного эффектора у субъекта с известным иммунологическим статусом. Вторая база знаний получена от субъекта с неизвестным состоянием клеточно-опосредованной иммунологической реактивности. На выходе алгоритма или сравнения с контролем предоставляется вероятность или фактор риска, упомянутый в настоящем документе как "индекс вероятности", субъекта, имеющего определенный уровень иммунологической реактивности или иммуносупрессии.
Данные уровней иммунной эффекторной молекулы представляют собой входные данные. Входные данные, содержащие значения уровней иммунного эффектора, представлены относительно контроля или используются в алгоритме, который представляет значение вероятности риска того, что субъект имеет, например, иммуносупрессивное состояние. Режим обработки можно контролировать для выявления наличия любой иммуносупрессии. Уровень иммуносупрессии может показать возможность увеличения риска получения вторичной инфекции у субъекта или рецидива (например, при лечении рака или лечения патогенных инфекций).
Как описано выше, способы диагностики иммунологической реактивности или иммуносупрессии, путем определения того, в какой мере субъект может проявлять иммунную реакцию приобретенной и врожденной иммунной системы, с помощью уровня иммунной эффекторной молекулы обеспечивает вторую базу данных знаний в алгоритме, получаемом от первой базы знаний или уровня той же эффекторной молекулы у пациентов с известным иммунньм статусом. Также предусмотрены методы обнаружения иммунологической реактивности, включающие определение наличия и/или скорости появления иммунной эффекторной молекулы после стимуляции системы приобретенного и врожденного иммунитета в выборке испытуемых. Под "скоростью" понимают изменение концентрации эффекторной молекулы в образце субъекта с течением времени.
Как отмечалось выше, термин "образец", используемый здесь, означает любой образец, содержащий эффекторную молекулу при стимуляции процессов приобретенного и врожденного иммунитета, включая, но не ограничиваясь этим, биологические жидкости (в том числе, цельную кровь, плазму, сыворотку, асцит), тканевые экстракты, свежесобранные клетки и лизаты клеток, которые были инкубированы в клеточных культурах.
Способ по настоящему изобретению может быть использован для диагностики и определения стадии заболевания. Настоящее изобретение также может быть применено для мониторинга прогрессирования состояния и мониторинга того, эффективно ли конкретное лечение или нет. В частности, этот способ может быть использован для мониторинга иммуносупрессии после операции, лечения рака или т.п., либо воздействия лекарственных препаратов или токсичных веществ.
В одном варианте воплощения настоящее изобретение предполагает способ мониторинга иммуносупрессии у субъекта, включающий:
(a) обеспечение пробы от субъекта;
(b) определение уровня иммунной эффекторной молекулы после стимуляции процессов приобретенного и врожденного иммунитета;
где уровень иммунного эффектора относительно контроля обеспечивает корреляцию статуса клеточно-опосредованной иммунологической реактивности и уровней субъекта для алгоритма, обеспечивая индекс вероятности того, что субъект имеет тот или иной уровень иммуносупресии; и
(c) дальнейшее повторение этапов (а) и (b) и сравнение результата этапа (b) с результатом этапа (с), где разница индексов вероятности является индикатором развития состояние у субъекта.
Указание "алгоритм" или "алгоритмическая функция", как указано выше, включает выполнение функций одномерного или многомерного анализ. Ряд различных архитектур и платформ может быть реализован в дополнение к описанным выше. Следует иметь в виду, что может быть использована любая форма архитектуры, пригодная для осуществления настоящего изобретения. Тем не менее одним из наиболее пригодных является использование распределенных архитектур, В частности, в соответствующих географических точках может быть предусмотрен ряд конечных станций. Указанное может увеличить производительность системы за счет снижения расходов пропускной способности и потребностей, а также за счет того, что в случае если одна базовая станция перегружена или неисправна, ее работу могут взять на себя другие конечные станции. Это также позволяет распределение нагрузки и т.п., обеспечивая доступ к системе в любое время
В этом случае, необходимо обеспечить, чтобы базовая станция содержала ту же информацию и сигнатуры, что и различные используемые конечные станции.
Следует также отметить, что в одном примере конечные станции могут быть представлены портативными устройствами, такими как КПК, мобильные телефоны и т.п., которые могут передавать данные субъекта к базовой станции через сеть связи, такой как Интернет, и получать отчеты.
В приведенных выше аспектах изобретения термин "данные" означает уровень или концентрацию иммунного эффектора после усиления процессов приобретенного и врожденного иммунитета. "Сеть связи" включает в себя Интернет, а также мобильную телефонную сеть и фиксированную телефонную линию. При использовании сервера, как правило, она представлена клиент-сервером или, более конкретно, простым протоколом доступа к объектам (SOAP).
Один из аспектов настоящего изобретения включает эксперименты, которые демонстрируют клеточно-опосредованную иммунологическую реактивность у субъекта путем измерения реактивности отдельно для стимуляторов врожденного и приобретенного иммунитета. В одном варианте воплощения один или более образцов, таких как образцы периферической крови, фракции, обогащенные белыми клетками крови, или бронхоальвеолярного лаважа, могут быть получены от субъекта, имеющего или предположительно имеющего то или иного заболевание (например, аутоиммунные заболевания, инфекции патогенными агентами или воздействие бериллия), а иммунологическая реактивность измеряется путем определения эффекторных молекул из эффекторных Т-клеток (например, CD4+ Т-клеток). Анализ проводится в присутствии одного или нескольких агентов, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунные ответы.
Иммуносвязывающие методы включают методы обнаружения или количественного анализа реактивного компонента в образце, где методы основаны на выявлении и количественном определении любых иммунных комплексов, образующихся в процессе связывания. Таким образом, можно получить образец, предположительно содержащий цитокины после процесса совместной стимуляции приобретенного и врожденного иммунитета и контактирования образца с антителами, а затем обнаружения или количественного анализа иммунных комплексов, образованных в определенных условиях.
Контактирование выбранной биологической пробы с антителами в условиях, эффективных и достаточных для формирования иммунных комплексов (первичных иммунных комплексов), как правило, осуществляется добавлением композиции к образцу и инкубацией смеси в течение времени, достаточного для образования иммунных комплексов, т.е. связывания антител с присутствующими антигенами. По истечении этого времени композиции образец-антитело, такие как срезы ткани, планшеты ELISA, ELISpot, дот-блот или Вестерн-блот, как правило, промываются для того, чтобы удалить неспецифически связанные антитела, что позволяет сохранить только специфически связанные антитела в виде первичных иммунных комплексов для детекции.
В конкретном варианте воплощения настоящее изобретение предусматривает способ обнаружения присутствия, отсутствия, уровня или стадии заболевания или состояния субъекта, включающий контактирование цельной крови, которая содержит по меньшей мере 10% от общего объема реакционной смеси с одним или несколькими агентами, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета, и измерение наличия или повышение уровня иммунной эффекторной молекулы из Т-клеток, где наличие или уровень иммунной эффекторной молекулы свидетельствует о заболевании или состояние.
В другом варианте воплощения настоящее изобретение относится к наборам для использования в способах, описанных выше. В одном из вариантов предполагается набор для иммунодетекции. В другом варианте предполагается набор для анализа образцов от субъекта, имеющего или предположительно развивающего заболевание, индуцированное металлом либо химически-индуцированное. В более конкретном варианте воплощения предполагается набор для анализа образца от субъекта, имеющего или предположительно развивающего заболевание. В более конкретном варианте предложен набор для оценки клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у субъекта до или после заболевания, которое развивалось до или после того, как субъект получал лекарственный препарат или обрабатывался токсическим веществом или загрязнителем. Если также используется антиген, то набор также может содержать этот антиген.
Реагенты набора для иммунодетекции могут быть представлены в любой форме, в том числе имеющие детектируемые метки, которые связаны или соединены с данным антителом или антигеном, и детектируемые метки, которые связаны или присоединены к вторичному связывающему лиганду. В качестве примера вторичные лиганды могут быть представлены вторичными антителами, которые имеют сродство к первым антителам или антигенам, и вторичными антителами, которые имеют сродство к антителам человека.
Другие подходящие реагенты для иммунодетекции, использующиеся в представленных наборах, включают двухкомпонентные реагенты, которые включают вторичные антитела, имеющие сродство к первичным антителам или антигенам, наряду с третичным антителом, которое имеет сродство для вторичного антитела, где третичные антитела связаны с детектируемыми метками.
Наборы могут дополнительно содержать соответствующие аликвоты композиции антигена или эффекторной молекулы, меченных или немеченных, которые могут быть использованы для получения стандартной кривой в детекционном анализе.
Наборы могут содержать антитела, конъюгированные с метками либо в полностью конъюгированной форме, в форме интермедиатов, или в виде отдельных долей, которые смешиваются пользователем набора. Компоненты набора могут быть представлены либо в водной среде, либо в лиофилизированной форме.
Контейнер любого набора, как правило, включает по меньшей мере один флакон, пробирку, колбу, бутыль, шприц или другие варианты контейнера, в котором могут быть размещены тестируемые агенты, антитела или антигены, и, желательно, в виде подходящих аликвот. В случае необходимости вторичного или третичного связывающего лиганда или дополнительных компонентов, набор также, как правило, содержит второй, третий или других дополнительные контейнеры, в которых могут быть размещены лиганд или другие компоненты. Наборы по настоящему изобретению также обычно включают средства для хранения антител, антигена и любые другие реагентов в закрытом виде для коммерческой продажи. Такие контейнеры могут включать контейнеры для инъекции или пластиковые контейнеры выдувного формования, в котором сохраняются необходимые флаконы.
Настоящее изобретение также предусматривает улучшение анализа для выявления клеточно-опосредованного иммунного ответа или его уровня у субъекта, где анализ включает инкубацию пробы лимфоцитов от субъекта и выявление наличия или повышение эффекторных молекул, где усовершенствование заключается в дальнейшей инкубации лимфоцитов с одним или несколькими агентами, которые усиливают системы врожденного и приобретенного иммунитета.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения субъекта, имеющего патогенную инфекцию, аутоиммунное расстройство или рак, либо предрасположенность к развитию такого состояния или расстройства, включающий контактирование пробы лимфоцитов от субъекта с одним или более агентов, которые усиливают приобретенную и врожденную иммунные системы, и измерение наличия или повышения уровня иммунной эффекторной молекулы из Т-клеток, где наличие или уровень иммунной эффекторной молекулы указывает на уровень клеточно-опосредованной реактивности у субъекта, который указывает на наличие, отсутствие, уровня или степени состояния или расстройства, и последующее лечение состояния или расстройства.
Настоящее изобретение дополнительно описано следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕР 1
Разработка анализа
Гепаринизированные образцы крови были собраны в пробирки Li-Hep Vacuette [зарегистрированная торговая марка] (Greiner Bio-one, Германия).
Аликвоты образцов крови инкубировали с различными концентрациями агонистов Т-клеточных рецепторов: фитогемагглютинином (Cellistis Limited, Австралия), антителом против CD3ε человека (IgGI мыши, клон UCHT1; eBioscience, Сан-Диего) и антителом к комплексу Т-клеточного рецептора комплекса и агонистами Toll-подобных рецепторов: TLR-2 лигандом Липоманнан (InvivoGen, Сан-Диего), TLR-2 лигандом Pam3CSK4 (InvivoGen, Сан-Диего), Поли(1:С) TLR-3 лигандом (InvivoGen, Сан-Диего), лигандом липополисахарида TLR-4 (Sigma, Австралия), соединением имидазоквинолина - TLR-7/8 лигандом, R848 (InvivoGen, Сан-Диего) и TLR-9 лигандом CpG олигодезоксинуклеотидом (Hycult Biotechnology, Нидерланды) или физиологическим раствором в качестве контроля для ряда пробирок с различным количеством собранной крови, рекомендованным производителями теста QuantiFERON для человека [зарегистрированная торговая марка] (Cellestis Limited, Австралия). Т-клеточный рецептор-независимые стимуляторы включают форболмиристатацетат (РМА), конканавалин А (СоnА) и митоген лаконоса. Аликвоты могут быть небольших объемов, таких как от 1 мкл до 1000 мкл, или больших объемов, таких как от 1,5 мл до 200 мл.
В некоторых экспериментах к крови перед началом инкубации добавляли глюкозу в различных концентрациях. В других экспериментах к крови добавляли комбинацию двух или больше стимуляторов, состоящую по меньшей мере из одного TCR стимулятора и одного TLR стимулятора.
Простимулированные образцы крови инкубировали в течение от 1 до 48 часов при 37°С, после чего с осевших клеток крови собиралась плазма. Количество IFN-γ, присутствующее в каждом образце плазмы, затем было измерено с помощью QuantiFERON-TB [зарегистрированная торговая марка] ELISA (Cellestis Limited, Австралия) в соответствии с инструкциями производителя. Альтернативно образец IFN-γ оценивался количественно с помощью более чувствительного QuantiFERON-TB Gold [зарегистрированная торговая марка] ELISA (Cellestis Limited, Австралия) в соответствии с инструкциями производителя.
Значения оптической плотности ELISA для IFN-γ стандартов каждого планшета ELISA были использованы для построения стандартной кривой, из которой значения количества IFN-γ, присутствующего в каждом из тестируемых образцов плазмы, были преобразованы в значения МЕ/мл.
ПРИМЕР 2
Комбинации Т-клеточный рецептор (ТСК)-зависимых агонистов и агонистов Toll-подобных рецепторов (TLR)
Возможные комбинации TCR и TLR агонистов, используемых в анализе, описанном в Примере 1, показаны в Таблице 3.
| Таблица 3 | ||||||
| Комбинации TCR и TLR агонистов, используемых в анализе | ||||||
| TCR агонист | TLR агонист | |||||
| Pam 3CSK4 TLR-2 | Липоманнан (TLR-2) | Поли (I:С)-(TLR-3) | Липополисахарид (TLR-4) | Имидазохинолин (R848) (TLR-7/8) | CpG олигонуклеотид (TLR-9) | |
| PHA (фито-гемагглютинин) | v | v | v | v | v | v |
| анти-СD3ε антитело | v | v | v | v | v | v |
| Стафилококковый энтеротоксин В (SEB) | v | v | v | v | v | v |
| Антитела к комплексу Т-клеточного рецептора | v | v | v | v | v | v |
ПРИМЕР 3
Комбинации Т-клеточный рецептор (ТСР)-независимых агонистов и агонистов Toll-подобных рецепторов (TLR)
Возможные комбинации TCR-независимых агонистов и TLR агонистов, используемых в анализе, описанном в Примере 1, показаны в Таблице 4.
| Таблица 4 | ||||||
| Комбинации агонистов TCR и TLR, используемых в анализе | ||||||
| TCR-независимые агонисты | TLR агонист | |||||
| Pam 3CSK4 TLR-2 | Липоманнан (TLR-2) | Поли (1:С)- (TLR-3) | Липополисахарид (TLR-4) | Имидазохинолин (R848) (TLR-7/8) | CpG олигонуклеотид (TLR-9) | |
| СоnА1 | v | v | v | v | v | v |
| РМА2 | v | v | v | v | v | v |
| Митоген лаконоса | v | v | v | v | v | v |
| 1 конканавалин А | ||||||
| 2 форболмиристатацетат. |
ПРИМЕР 4
Оценка анализа
Анализ включает в себя совместную стимуляцию Т-клеточных рецепторов (TCR) и Toll-подобных рецепторов (TLR) для оценки комбинированного функционального врожденного и адаптивного иммунитета у индивидуума. Стимуляция цельной крови in vitro одним TCR или TLR стимулятором в отдельности приводит к непостоянному ответу среди здоровых доноров: от чрезвычайно высоких уровней IFN-γ до недетектируемых уровней у некоторых здоровых индивидуумов (рис.1). В целях создания контрольного спектра здоровых индивидуумов и наблюдения снижения иммунной функции из-за иммунодефицита, было оценено взаимодействие при сочетании врожденного и приобретенного иммунного ответа (рис.2). Двойная стимуляция усиливает вызванные ответы у нормальной здоровой популяции, позволяя определить пороговый уровень (рис.3). Значения для нормальной здоровой популяции позволяет также наблюдать снижение IFN-γ ответа у индивидуумов, страдающих иммунодефицитом. Таким образом, возможна оценка иммуносупрессии как следствия медикаментозного лечения или заболевания, в случае если иммунный ответ падает ниже порогового значения (отсечки) в сравнении со значениями для здоровой популяции.
ПРИМЕР 5
Использование агониста Т-клеточного рецептора
Этот пример представляет способ оценки сочетания врожденного и приобретенного иммунитета in vitro, используя агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR) (соединение имидазохинолина, R848, которое специфично для NK-клеток) и агонистов Т-клеточного рецептора (TCR) для совместной стимуляции иммунных клеток. Такая in vitro диагностика предназначена для использования цельной крови, мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) и очищенной клеточной популяции клеток с фидерными слоями. Однако также могут быть включены другие агонисты TLR, специфичные для разных типов клеток иммунной системы.
Технология QFN in-tube (Cellestis) представляет собой метод измерения клеточно-опосредованного иммунитета (КОИ) после стимуляции цельной крови комбинацией стимуляторов, которые специфично активируют различные клетки иммунной системы. Стимулирование осуществляется в закрытом сосуде, который инкубируется в течение 24 часов при 37°С без увлажнения. Плазма собирается с цельной крови, и IFN-γ детектируется с помощью одноэтапного ELISA, обеспечивая измерение функции целевой клетки. В частности, анализ оценивает функциональный статус иммунной системы индивидуумов, определяя совместный врожденный (NK-клетки) и адаптивный (Т-клетки) иммунный ответ. Такой анализ используется для контроля общего иммунного статуса индивидуума для in vitro диагностических и прогностических приложений.
Устройство измеряет общий выход IFN-γ, произведенной в ответ на комбинацию двух стимуляторов одновременно. Результирующее "значение" относится к общему функциональному состоянию иммунной системы индивида в данный момент времени. Это учитывает продольное и широтное сравнение иммунного статуса.
Данные показывают, что следующий порядок TLR-7/8>TLR-4>TLR-3>TLR-2 представляет снижение эффективности класса TLR агонистов, которые оказывают синергический ответ при использовании в комбинации с анти-СD3 антителом (TCR агонистом) с целью разработки диагностического теста для клинических целей. Вследствие этого, в этом примере используются TLR-7/8 агонисты, такие как соединение имидазохинолина (R848), для того, чтобы получить максимальный синергетический ответ. Тем не менее различные приложения могут потребовать использование субмаксимальной синергии или, долее того, использование двух или более комбинаций TLR классы с агонистом TCR, таких как анти-CD3 антитело или митоген (фитогемагглютинин; РНА). Показано, что в диагностическом тесте, митоген оказывает свои функции через TCR, расположенный на Т-клетках. Об этом свидетельствует способность анти-СD3 антитела к отмене ответа на митоген, когда используются комбинация обоих стимуляторов.
ПРИМЕР 6
Определение иммуносупрессии у субъектов, вызванной медикаментами
Анализ проводится на субъектах, подверженных воздействию медикаментов, таких как химиотерапевтические препараты или препараты, применяемые для лечения ревматоидного артрита, рака и воспалительных заболеваний кишечника. Для субъектов, у которых была выявлена иммуносупрессия, обеспечено медицинское наблюдение во избежание повторных инфекций. Например, могут быть предоставлены антибиотики или иммуностимуляторы.
ПРИМЕР 7
Стимуляция цельной крови агонистом TCR и агонистом TLR
Цельная кровь обрабатывалась комбинацией анти-СD3 антитела (агониста TCR) и TLR-7/8 агониста, R848 (имидазохинолин). Наблюдаемые уровни монокина, индуцированные гамма-интерфероном (MIG, CXCL9), и IFN-γ представлены в Таблице 5. Значения приведены с соответствующим рассчитанным контрольным значением (NIL). Данные показывают, что MIG и IFN-γ соответствуют индикаторам стимуляции.
| Таблица 5 | ||
| Субъект | MIG (CXCL9) пг/мл | IFN-γ пг/мл |
| 1 | >2000 | 34280 |
| 2 | 1567 | 20040 |
| 3 | 1494 | 20000 |
| 4 | >2000 | 31680 |
| 5 | >2000 | 35320 |
| 6 | >2000 | 73760 |
| 7 | 1744 | 25400 |
| 8 | >2000 | 24840 |
Цельную кровь также стимулировали без комбинации анти-СD3 антитела (агониста TCR) и TLR-7/8 агониста, R848 (имидазохинолин). Полученная плазма используется для характеристики известных цитокинов, хемокинов и внеклеточных сигнальных молекул. Обнаруженные целевые агенты могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими эффекторами в качестве репортерных молекул. Это особенно важно для мультиплексирования. Обнаруженные целевые агенты приведены в Таблице 6.
| Таблица 6 | |
| Целевой агент | |
| Компонент комплемента 5а (С5а) | |
| Gro α (CXCL1) | |
| sICAM-1 (CD54) | |
| ifn-γ (Type II IFN) | |
| IL-1 α (IL-1F1) | |
| IL-1 β (IL-1F2) | |
| IL-1ra (IL-1F3) | |
| IL-6 | |
| IL-8 (CXCL8) | |
| IL-10 | |
| IL-16 (LCF) | |
| IL-17 | |
| IP-10 (CXCL 10) | |
| I-TAC (CXCL11) | |
| MCP-1 (CCL2) | |
| MIF (GIF) | |
| MIP-1α (CCL3) | |
| MIP-1β (CCL4) | |
| Серпин Е1(РАI-1) | |
| RANTES (CCL5) | |
| TNF-α (TNFSF2) | |
| MIG (CXCL9) |
| Таблица 7 | ||||||
| HIV+ve необработанные (TCR) | HIV+ve необработанные (TLR) | HIV+ve необработанные (TCR+TLR) | Нормальные здоровые (TCR) | Нормальные здоровые (TLR) | Нормальные здоровые (TCR+TLR) | |
| Число значений | 24 | 24 | 24 | 50 | 49 | 50 |
| Минимум | 0,935 | 0 | 2,65 | 0,67 | 7,78 | 34,17 |
| 25% процентиля | 26,63 | 1,601 | 54,35 | 7,068 | 24,74 | 232,1 |
| Среднее | 77,45 | 6,675 | 91,28 | 21,76 | 52,43 | 554 |
| 75% процентиля | 108,6 | 22,41 | 291,5 | 42,39 | 87,33 | 882,5 |
| Максимум | 331 | 122 | 1349 | 154,4 | 439,1 | 1989 |
Результирующий профиль цитокинов, хемокинов и внеклеточных сигнальных молекул представлен графически на рис.4. Несколько цитокинов, хемокинов и внеклеточных сигнальных молекул были найдены только в плазме цельной крови, стимулированной TCR и TLR агонистом одновременно (синие столбцы, TCR+TLR).
Некоторые другие молекулы имели более высокие значения, относительно необработанной цельной крови (красные столбцы, NIL).
Синергизм, наблюдаемый между двойной стимуляцией TCR и TLR агонистами на IFN-γ ответы от цельной культуры крови по сравнению со стимуляцией цельной крови либо только TCR агонистом, либо только TLR агонистом, показан на рис.5.
Исследуемая популяция была представлена ВИЧ-инфицированной группой и группой нормальных здоровых людей. Исследование популяции включают в себя (i) нелеченных ВИЧ-инфицированных (представители Южной Африки) и (ii) нормальных здоровых доноров (представители Австралии). Средние значения по популяции приведены в Таблице 7.
Корреляция между уровнем IFN-γ ответа и количеством CD4+ Т-лимфоцитов после совместной TCR+TLR стимуляции показана на рис.6. Здесь обрабатывалась цельная кровь ВИЧ-инфицированной группы.
Стимуляция цельной крови комбинацией TCR и TLR агонистов также позволяет определить ингибирующую концентрацию иммунодепрессанта для данного донора (рис.7).
Специалистам в данной области будет понятно, что изобретение, описанное здесь, допускает варианты и модификации, помимо тех, которые конкретно описаны здесь, и что многие другие агенты могут осуществлять Т-клеточный рецептор зависимое и -независимое потенцирование и Toll-подобный рецептор - потенцирование или комбинация обоих. Следует понимать, что изобретение включает в себя все эти вещества. Изобретение также включает в себя все этапы, особенности композиции и соединений, упомянутых или указанным в этом подробном описании, индивидуально или совместно, а также любые комбинации двух или более указанных шагов или функций.
БИБЛИОГРАФИЯ
Biggs et al., Cytometry 36:36-45, 1999.
Chang et al., J. Virol. 55:7649-58, 2009.
Cooper et al., Hematology:314-30, 2003.
Daneshvar et al., J. Immunol. Methods 226(1-2):119-128, 1999.
Douek et al., Annu. Rev. Med. 60:471-84, 2009.
Durig et al., J. Roman Spectrosc. 24(5):281-285, 1993.
Eriksson et al., Biophys. J. 2:64, 1993.
Fu et al., Nature Biotechnology 17:1109-1111, 1999.
Hengel and Kovacs.J. Infect. Dis. 188(12):1791-3, 2003.
Hu and Gatti, Curr Opin Allergy Clin Immunol. 8(6):540-546, 2008.
Kowalski et al., J Immunotoxicol. 4(3):225-32, 2007.
Lakowicz et al., Biophys. J. 72:567, 1997.
Lewis etal, Dyes Pigm. 42(2):197, 1999.
Malemed et al., "Flow cytometry and sorting", 2nd Ed., New York, Wiley-Liss, 1990.
Matesanz et al. Transplant Proc. 41(6):2297-301, 2009.
Nowroozalizadeh et al., Cytokine 46:325-31, 2009.
Rahmanetal, J. Org. Chem. 65/6196, 1998.
Rapaport et al., Appl. Phys. Lett. 74(3):329-331, 1999.
Schrem et al., Dtsch Arztebl Int. 706(9):148-156, 2009.
Solomon et al., J. Infect. Dis. 757:1915-23, 2003.
Tawa et al., Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 488 [Electrical, Optical and Magnetic Properties of
Organic Solid-State Materials IV], 885-890 Youvan et al., Biotechnology et elia 3:1-18, 1997.
1. Способ измерения активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта, где способ включает контактирование образца цельной крови, представляющего собой источник лимфоцитов, от субъекта с одним или более агентами, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета, и измерение присутствия или повышения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где присутствие или уровень иммунной эффекторной молекулы показывает уровень клеточно-опосредованной реактивности у субъекта.
2. Способ по п. 1, где субъект представляет собой человека.
3. Способ по п. 1, где образец представляет собой неразбавленную цельную кровь.
4. Способ по п. 3, где образец представляет собой цельную кровь, которая составляет от примерно 10% до 100% объема анализируемого образца.
5. Способ по п. 4, где цельная кровь составляет от примерно 50% до 100% объема анализируемого образца.
6. Способ по п. 5, где цельная кровь составляет от примерно 80% до 100% объема анализируемого образца.
7. Способ по п. 1, где образец представлен небольшим объемом крови от 1 мкл до 1000 мкл.
8. Способ по п. 1, где источник лимфоцитов дополнительно инкубирован с антигеном.
9. Способ по п. 3, где цельная кровь собрана в пробирки, содержащие гепарин.
10. Способ по п. 1, где агент, который усиливает приобретенный иммунный ответ, представляет собой агонист Т-клеточного рецептора.
11. Способ по п. 10, где агент выбран из CpG олигонуклеотида, антител к комплексу Т-клеточного рецептора, фитогемагглютинина и анти-CD3 антитела.
12. Способ по п. 1, где агент, который усиливает систему врожденного иммунитета, представляет собой агонист Toll-подобного рецептора (TLR).
13. Способ по п. 12, где агонист TLR стимулирует через TLR-7/8, TLR-4, TLR-3 или TLR-2.
14. Способ по п. 13, где агонист выбран из TLR лиганда, липоманнана, поли(I:С)- и имидазохинолина, R848.
15. Способ по п. 1, где агент, который усиливает систему приобретенного иммунитета, представляет собой Т-клеточный рецептор-независимый стимулятор, такой как форболмиристатацетат (РМА), конканавалин А (ConA) и митоген лаконоса.
16. Способ по п. 15, где агент выбран из конканавалина А, митогена лаконоса и форболмиристатацетата (РМА).
17. Способ по п. 1, где иммунная эффекторная молекула представляет собой цитокин.
18. Способ по п. 17, где цитокин представляет собой IFN-γ.
19. Способ по п. 1, где иммунные эффекторы детектируются антителами, специфичными к ним.
20. Способ по п. 19, где иммунные эффекторы детектируются с помощью ELISA.
21. Способ по п. 20, где иммунные эффекторы детектируются с помощью ELISpot.
22. Способ по п. 1, где субъект инфицирован патогенным агентом, выбранным из видов Mycobacterium, видов Staphylococcus, видов Streptococcus, видов Borrelia, Escherichia coli, видов Salmonella, видов Clostridium, видов Shigella, видов Proteus, видов Bacillus, вируса герпеса, вируса гепатита В или С и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), либо заболевания, вызванного ими.
23. Способ по п. 22, где заболевание представляет собой инфекцию Mycobacterium tuberculosis или туберкулез (ТВ).
24. Способ по п. 22, где заболевание представляет собой инфекцию вирусом гепатита или ВИЧ.
25. Способ по п. 22, где субъект имеет заболевание, выбранное из очаговой алопеции, анкилозирующиего спондилоартрита, антифосфолипидного синдрома, аутоиммунной болезни Аддисона, рассеянного склероза, аутоиммунных заболеваний надпочечников, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного оофорита и орхита, болезни Бехчета, буллезного пемфигоида, кардиомиопатии, целиакии спру-дерматита, синдрома хронической усталости (СХУ), хронической воспалительной демиелинизации, хронической воспалительной полиневропатии, синдрома Чарга-Стросса, рубцевого пемфигоида, синдрома Тибьержа-Вейсенбаха, болезни холодовой агглютинации, болезни Крона, герпетиформного дерматита, дискоидной волчанки, существенной смешанной криоглобулинемии, фибромиалгии, гломерулонефрита, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, тиреоидита Хашимото, идиопатического легочного фиброза, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), IgA нефропатии, инсулинозависимого сахарного диабета (тип I), красного плоского лишая, волчанки, болезни Меньера, смешанного заболевания соединительной ткани, миастении gravis, миокардита, обыкновенной пузырчатки, злокачественной анемии, узелкового полиартериита, полихондрита, полигранулярных синдромов, ревматической полимиалгии, полимиозита и дерматомиозита, первичной агаммаглобулинемии, первичного билиарного цирроза печени, псориаза, синдрома Рейно, синдрома Рейтера, ревматизма, ревматоидного артрита, саркоидоза, склеродермии, синдрома Шегрена, синдрома мышечной скованности, системной красной волчанки, артериита Такаясу, темпорального артериита/гигантоклеточного артериита, язвенного колита, увеита, васкулита, витилиго и воспалительного заболевания кишечника.
26. Способ по п. 25, где заболевание представляет собой целиакию.
27. Способ по п. 25, где заболевание представляет собой аутоиммунный диабет.
28. Способ по п. 1, где субъект имеет рак, выбранный из ABL1 протоонкогена, рака, связанного со СПИДом, невриномы слухового нерва, острого лимфобластного лейкоза, острого миелобластного лейкоза, аденокистозной карциномы, рака надпочечников, агногенной миелоидной метаплазии, алопеции, альвеолярной саркомы мягких тканей, рака анального канала, ангиосаркомы, апластической анемии, астроцитомы, атаксии-телеангиэктазии, базально-клеточной карциномы кожи, рака мочевого пузыря, рака костей, рака кишечника, глиомы ствола головного мозга, опухоли головного мозга и ЦНС, рака молочной железы, опухоли ЦНС, карциноидных опухолей, рака шейки матки, опухоли мозга у детей, рака у детей, лейкемии у детей, саркомы мягких тканей у детей, хондросаркомы, хориокарциномы, хронического лимфолейкоза, хронического миелолейкоза, колоректального рака, кожной Т-клеточной лимфомы, выбухающей дерматофибросаркомы, десмопластической опухоли малых округлых клеток, протоковой карциномы, эндокринного рака, рака эндометрия, эпендимомы, рака пищевода, саркомы Юинга, рака экстрапеченочных желчных протоков, рака глаз, меланомы глаза, ретинобластомы, рака маточных труб, анемии Фанкони, фибросаркомы, рака желчного пузыря, рака желудка, рака ЖКТ, ЖКТ-карциноидной опухоли, рака мочеполовой системы, опухоли зародышевых клеток, гестационной трофобластической болезни, глиомы, гинекологических типов рака, гемобластических злокачественных образований, волосатоклеточного лейкоза, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярного рака, наследственного рака молочной железы, гистиоцитоза, болезни Ходжкина, вируса папилломы человека, пузырного заноса, гиперкальциемии, рака гортаноглотки, внутриглазной меланомы, рака островковых клеток, саркомы Капоши, рака почки, гистиоцитоза клеток Лангерганса, рака гортани, лейомиосаркомы, лейкозов, синдрома Ли-Фраумени, рака губы, липосаркомы, рака печени, рака легких, лимфедемы, лимфомы, лимфомы Ходжкина, лимфомы не-Ходжкина, рака груди у мужчин, злокачественной палочковидную опухоли почки, медуллобластомы, меланомы, клеточного рака Меркеля, мезотелиомы, метастатического рака, рака рта, множественной эндокринной неоплазии, грибовидного микоза, миелодиспластического синдрома, миеломы, миелопролиферативных расстройств, назального рака, рака носоглотки, нефробластомы, нейробластомы, нейрофиброматоза, синдрома Ниймеген, не-меланомного рака кожи, немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), рака глаза, рака пищевода, рака ротовой полости, рака ротоглотки, остеосаркомы, рака стомы яичников, рака поджелудочной железы, околоносового рака, рака паращитовидных желез, рака околоушной железы, рака полового члена, периферической нейроэктодермальной опухоли, рака гипофиза, истинной полицитемии, рака простаты, редких видов рака и связанных с ними расстройств, почечно-клеточной карциномы, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, синдрома Ротмунда-Томсона, рака слюнных желез, саркомы, шванномы, синдрома Сезари, рака кожи, мелкоклеточного рака легкого (МРЛ), рака тонкого кишечника, саркомы мягких тканей, опухоли спинного мозга, плоскоклеточного рака кожи, рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичек, рака вилочковой железы, рака щитовидной железы, переходно-клеточного рака мочевого пузыря, переходно-клеточного рака почечной лоханки и мочеточников, трофобластического рака, уретрального рака, рака мочевого системы, уроплакинса, саркомы матки, рака матки, рака влагалища, рака вульвы, макроглобулинемии Вальденстрема и опухоли Вильмса.
29. Способ по п. 1, где субъект имеет иммуносупрессию.
30. Применение одного или более агентов, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета, в производстве диагностического анализа клеточно-опосредованной иммунологической реактивности способом инкубирования стимуляторов врожденного и приобретенного иммунитета с образцом цельной крови, представляющим собой источник Т-клеток и NK-клеток, и детектирования присутствия или увеличения эффекторных молекул.
31. Применение по п. 30, где используются два агента, представляющие собой TCR агонист и TLR агонист.
32. Способ, позволяющий пользователю определить статус клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у субъекта с помощью способа по п. 1, где способ включает:
(a) получение данных в форме уровней или концентраций иммунной эффекторной молекулы, которые относительно контрольных значений обеспечивают корреляцию со статусом клеточно-опосредованной иммунологической реактивности, от пользователя через сеть связи, где иммунная эффекторная молекула измеряется после воздействия на образец цельной крови, содержащий лимфоциты, одного или более агентов, которые усиливают приобретенный и врожденный иммунные ответы;
(b) обработку данных субъекта с помощью одномерного или многомерного анализа для получения значения иммунологической реактивности;
(c) определение статуса субъекта в соответствии с результатами значения иммунологической реактивности в сравнении с предопределенными значениями; и
(d) передачу показаний статуса субъекта пользователю через сеть связи.
