Композиция для профилактики или лечения глазных болезней, содержащая s-аллил-l-цистеин в качестве активного ингредиента, и фармацевтический препарат, содержащий ее

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для профилактики или лечения возрастной макулярной дистрофии. Для профилактики или лечения возрастной макулярной дистрофии, включая влажную возрастную макулярную дистрофию и сухую возрастную макулярную дистрофию, в качестве лекарственного средства применяют S-аллил-L-цистеин, его фармацевтически приемлемую соль или его сольват или гидрат. Использование изобретения позволяет повысить эффективность профилактики или лечения возрастной макулярной дистрофии. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область

Настоящее изобретение относится к композиции для профилактики или лечения глазных болезней. Конкретнее, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей S-аллил-L-цистеин в качестве активного ингредиента, полезного для профилактики или лечения глазных болезней.

Описание предшествующего уровня техники

Макула или желтое пятно - это нервная ткань, расположенная рядом с центром сетчатки глаза человека и строго ответственная за зрение глаза, так как она является центром поля зрения, куда попадают изображения, и это то место, где концентрируется большинство зрительных клеток. Макулярная дистрофия (MD), вызванная различными факторами, является заболеванием, которое приводит к нарушению зрения. Макулярная дистрофия является одной из трех главных причин необратимой слепоты, наряду с глаукомой и диабетической ретинопатией.

Макулярная дистрофия встречается в основном в сухой и влажной формах. Сухая макулярная дистрофия является основной причиной слепоты и нарушения зрения у пожилых людей. Сухая форма макулярной дистрофии ведет к атрофии слоя пигментного эпителия сетчатки под сетчаткой, которая является причиной потери зрения за счет потери фоторецепторов (палочек и колбочек) в центральной части глаза. При влажной макулярной дистрофии, которая относится к значительно меньшему количеству диагностированных случаев, чем случаи сухой формы, за макулой может образовываться патологический рост кровеносных сосудов; эти сосуды могут давать утечку крови и жидкости в макулу и повреждать клетки фоторецепторов. Вызванная сосудами, кровотечением, жидкостью и образованием рубцов влажная форма макулярной дистрофии может быстро прогрессировать и со временем приводить к сильному повреждению центрального зрения.

Известно, что возрастная макулярная дистрофия (AMD) проявляет на своих ранних стадиях связанное с возрастом избыточное накопление пигмента в клетках пигментного эпителия сетчатки (RPE), несмотря на то что ее этиология еще неизвестна. Представителем среди пигментных отложений в клетках RPE является N-ретинилиден-N-ретинил-этаноламин (A2E), который синтезируется путем соединения полностью-транс-ретиналя с этаноламином. A2E накапливается в RPE клетках глаза и в результате фотовозбуждения генерирует синглетный кислород, что приводит к связанной с окислением потере двойной связи соединения, вызывая повреждение RPE клеток.

В настоящее время трудно ожидать полной терапии для возрастной макулярной дистрофии в основном по причине того, что точный механизм макулярной дистрофии до сих пор неизвестен. Таким образом, является важным должным образом предотвращать или минимизировать потерю зрения, вызванную прогрессированием макулярной дистрофии. Недавние открытия применяли витамины-антиоксиданты и цинк (Zn) для лечения возрастной макулярной дистрофии по причине их способности предотвращать развитие макулярной дистрофии. При влажной форме возрастной макулярной дистрофии раннее лечение лазером может изменить образование новых кровеносных сосудов, предотвращая, таким образом, обострение болезни. Однако такие терапии не гарантируют при этом удовлетворительные результаты. В настоящее время профилактика является наиболее важной в лечении возрастной макулярной дистрофии.

Известно, что накопление в клетках пигментного эпителия сетчатки липофусцина, что является названием, данным содержащим липиды мелко гранулированным желто-коричневым пигментным гранулам, тесно коррелирует с установлением атрофической макулярной дистрофии, что признано для значительной части случаев диагностированной возрастной макулярной дистрофии, как продемонстрировано многими исследованиями.

В соответствии с повседневными изменениями в жизни, клетки пигментного эпителия сетчатки переваривают оптические диски фоторецепторов клеток палочек в дневное время, и оптические диски фоторецепторов клеток колбочек ночью, с сопутствующим образованием липофусцина в качестве остатка лизосомного переваривания. Кроме того, клетки пигментного эпителия сетчатки фагоцитируют прилегающие клетки пигментного эпителия сетчатки и фоторецепторы с нарушенным функционированием, что способствует загрузке накоплений липофусцина. Липофусцин состоит в основном из неразрушаемых бис-ретиноидных аддуктов и образуется посредством следующего биосинтетического пути: 1) фоторецепторные клетки, которые поглощают свет в сетчатке, продуцируют альдегид витамина А (полностью-транс-ретиналь) из 11-цис-ретиналя путем фотоизомеризации; 2) полностью-транс-ретиналь транспортируется из фоторецепторов в пигментный эпителий сетчатки, где он путем серий реакций конденсации превращается в флуорофор липофусцина. Флуорофор липофусцина опосредует светозависимую реакцию перекисного окисления липидов, которая может повреждать клетки сетчатки, приводя к потере зрения и даже к слепоте. Флуорофор липофусцина образуется в основном в постмитотических клетках (например, в клетках миокарда, нейронах, клетках эпителия сетчатки и т.д.), где происходит активный метаболизм. Примеры флуорофора липофусцина, выделенного на сегодняшний день, включают A2E и его изомер с двойной связью Iso-A2E, и коньюгат полностью-транс-ретинального димера (atRAL димер).

Все эти соединения образуются путем фосфатного гидролиза фосфатидилпиридиния бис-ретиноида (A2PE), который образуется посредством конденсации полностью-транс-ретиналя и фосфатидилэтаноламина, оба выделенных из зрительного цикла. Одна молекула полностью-транс-ретиналя реагирует с фосфатидилэтаноламином (PE) с образованием основания Шиффа N-ретинилиден-фосфатидилэтаноламина (NRPE), который, как обнаружено, является субстратом для АТФ-связывающего кассетного транспортера ABCA4, специфичного к фоторецепторам. NRPE из нормального зрительного цикла связывается с другой молекулой полностью-транс-ретиналя с образованием A2PE, чему способствуют определенные условия окружающей среды, интенсивность света или окислительный стресс (Sparrow et al., Vision Res, 2003. 43(28): 2983-90).

Согласно ряду исследований, накопление A2E увеличивается с возрастом, и соединения под действием интенсивного света претерпевают опосредованное кислородом синглетное фотоокисление. Также было обнаружено, что продукт фотоокисления A2E является основным фактором возрастной макулярной дистрофии, причиной которой является воспаление, как было проверено путем иммунной комплементации.

Рынок лекарственных средств для макулярной дистрофии делится в основном на лекарственные средства и функциональные оздоровительные пищевые продукты. В Южной Корее Ранибизумаб (Луцентис) является единственным одобренным лекарственным средством и находится на рынке в качестве терапевтического средства для влажной макулярной дистрофии. Однако в настоящее время не существует одобренного терапевтического средства для лечения сухой макулярной дистрофии. Ранибизумаб является гуманизированным моноклональным антителом, которое распознает и блокирует фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) А при неоваскулярной возрастной макулярной дистрофии так, что упавшее зрение вследствие макулярной дистрофии может быть восстановлено или не деградирует дальше. Судя по клиническим испытаниям, однако, Genentech обеспокоен тем, что Ранибизумаб может повышать риск возникновения инсульта. Кроме того, Ранибизумаб дорог и продается в качестве внутриглазной инъекции, что является затруднительным для применения.

Возвращаясь к области функционально оздоровительных пищевых продуктов, лишь лютеин является одобренным в качестве индивидуального типа. Лютеин, который накапливается в клетчатке, служит фотопротектором для желтого пятна от дистрофии путем поддерживания уровней макулярного пигмента. Однако некоторые исследования показали, что долговременное использование добавки, содержащей каротеноид, такой как лютеин, повышает риск возникновения рака легкого, в особенности у курильщиков. В связи с этим пациентам, которые курят табак, может быть опасно потреблять продукты, связанные с лютеином.

Кроме того, натуральные продукты, в большом количестве найденные в ягодах, известные как имеющие терапевтический эффект на макулярную дистрофию, хотя и не одобренные KFDA как функциональные вещества, включают зеаксантин, макулярный пигмент типа лютеина и антоцианины. Однако исследования действия этих соединений на макулярную дистрофию недостаточны. В последние годы увеличилось появление макулярной дистрофии в среднем возрасте так же, как и у пожилых людей, в то время как терапевтические средства для макулярной дистрофии скудны. Поэтому существует крайняя необходимость в развитии лекарственных средств и функциональных оздоровительных пищевых продуктов, которые являются полезными для профилактики макулярной дистрофии.

Подобным образом чеснок, принадлежащий к роду Allium, привлек пристальное внимание как натуральное вещество, так как известно, что он обладает антибактериальной, противогрибковой, антиоксидантной и противораковой активностью (Ankri et al., Microbes Infect. 1(2), pp125-129, 1999). Также было показано, что чеснок эффективно предотвращает тромбоз, воспаление и окислительный стресс (Sener et al., Mol. Nutr. Food. Res., 51(11), pp1345-1352, 2007). Чеснок содержит множество ингредиентов, включая не содержащие серу вещества и сероорганические соединения, среди которых есть стероидные сапонины, такие как эрубозид-В, который проявляет противогрибковое и противораковое действия (Matsura H et al., ChemPharm Bull (Tokyo), 36; 3659-3663, 1988), гликозидные фракции, которые действуют по снижению уровня холестерола (Slowing et al., J Nutr., 131, pp994S-9S, 2001), и бета-хлорогенин, который ингибирует агрегацию тромбоцитов (Rahman K et al., J Nutr. 2006).

Сообщается, что как природный компонент зрелого чеснока, S-аллил-L-цистеин проявляет ряд фармацевтических действий, включающих подавляющее действие на атеросклероз благодаря его антиоксидантной активности и ингибирующего действия на некоторые линии раковых клеток (Proceeding of the American Association for Cancer Research, 30, p181, 1989).

S-аллил-L-цистеин значительно восстанавливает поврежденные гепатоциты, как было испытано на крысиных моделях поражения печени, индуцированного четыреххлористым углеродом (CHOI, Soo Yeon, 2009, Effects of S-allyl Cystein on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats). Также, S-аллил-L-цистеин предохраняет желудок от Helicobacter pylori (Bang, Sung Hye, 2010, Protective effect of S-allyl-L-Cystein (SAC) on Helicobacter Pylori-infected mice).

В публикации нерассмотренной Корейской патентной заявки № 10-2011-0032641 (озаглавленной “Composition for preventing or treating gastrointestinal disorders comprising s-allyl-l-cystein as an active ingredient”) раскрыто, что S-аллил-L-цистеин может подавлять инфекцию Helicobacter и защищать желудок от повреждения, вызванного Helicobacter.

Эта заявка может ссылаться на ряд публикаций по автору, цитированию и/или номеру патента, включая без ограничений статьи, презентации и патенты. Полные раскрытия каждой из любых таких ссылок в этой заявке включены, таким образом, посредством ссылки на данную заявку. В то же время нигде в этих статьях и патентных документах не упомянуто профилактическое и лечебное действие S-аллил-L-цистеина на возрастную макулярную дистрофию.

В настоящее время было бы трудно с точки зрения медицины ожидать законченного лечения возрастной макулярной дистрофии, и вследствие этого наиболее важным является ее профилактика. Как раскрыто, интенсивное и тщательное исследование, проведенное авторами настоящего изобретения, привело к обнаружению, что S-аллил-L-цистеин является эффективным профилактическим и лечебным по отношению к возрастной макулярной дистрофии.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ

В одном из вариантов осуществления изобретения предложенным является фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глазных болезней, индуцированных фотоокислением, включающая в качестве активного ингредиента S-аллил-L-цистеин, его производное или его фармацевтически приемлемую соль. Фармацевтическая композиция может ингибировать накопление A2E в клетках пигментного эпителия сетчатки и подавлять фотоокисление A2E, устраняя, таким образом, этиологию глазных болезней.

В другом варианте осуществления изобретения предложенным является лекарственный препарат, полученный из этой композиции для профилактики или лечения глазных болезней.

Как раскрыто, аспект настоящего изобретения предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения глазной болезни, композицию, включающую в качестве активного ингредиента S-аллил-L-цистеин, его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват, или гидрат, и проявляющую ингибирующую активность по отношению к фотоокислению.

Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глазной болезни включает в качестве активного ингредиента S-аллил-L-цистеин, его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват, или гидрат, и может ингибировать окисление N-ретинилиден-N-ретинил-этаноламина (A2E) в клетках пигментного эпителия сетчатки.

Глазными болезнями могут быть возрастная макулярная дистрофия или дегенеративные поражения сетчатки.

Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глазной болезни может содержать S-аллил-L-цистеин в количестве от 5 до 99,9% по массе.

В композиции для профилактики или лечения глазной болезни S-аллил-L-цистеин может быть получен путем выделения и очистки из растения рода Allium, путем синтеза или путем ферментации.

Композиция для профилактики или лечения глазной болезни может дополнительно включать противовоспалительное средство или антиоксидант.

В композиции для профилактики или лечения глазной болезни противовоспалительное средство может быть выбрано из группы, состоящей из ибупрофена, кетопрофена, флурбипрофена, фенопрофена, напроксена, пироксикама, теноксикама, изоксикама, мелоксикама, индометацина, ацеклофенака, диклофенака и их комбинации, и антиоксидант может быть выбран из группы, состоящей из витамина А, витамина С, витамина Е, каротиноида, цинка, меди, железа, марганца, лютеина, зеаксантина, селена, глутатиона (GSH), ликопина и их комбинации.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения рассматривается лекарственный препарат, содержащий композицию для профилактики или лечения глазной болезни, лекарственный препарат выбран из группы, состоящей из лекарственной формы для перорального введения, введения через слизистую оболочку, инъекции, ингалятора и наружного применения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1 является графиком, демонстрирующим ингибиторную активность S-аллил-цистеина по отношению к фотоокислению.

ФИГ. 2 является графиком, демонстрирующим ингибиторную активность S-аллил-цистеина по отношению к фотоокислению A2E в линии клеток пигментного эпителия сетчатки человека (APRE-19).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В соответствии с аспектом такового настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения глазной болезни, композиции, включающей в качестве активного ингредиента S-аллил-L-цистеин, его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват, или гидрат и проявляющей ингибирующую активность по отношению к фотоокислению.

Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глазной болезни включает в качестве активного ингредиента S-аллил-L-цистеин, его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват, или гидрат и может ингибировать окисление N-ретинилиден-N-ретинил-этаноламина (A2E) в клетках пигментного эпителия сетчатки.

В качестве натурального составляющего зрелого чеснока S-аллил-L-цистеин, как известно, проявляет ряд фармацевтических действий, в том числе подавляющее действие на атеросклероз, благодаря своей антиоксидантной активности, и ингибирующее действие на некоторые линии раковых клеток (Proceeding of the American Association for Cancer Research, 30, p181, 1989).

Как было упомянуто выше, композиция для профилактики или лечения глазной болезни может включать в качестве активного ингредиента фармацевтически приемлемую соль S-аллил-L-цистеина, эффективно предотвращающую и лечащую макулярную дистрофию. Это может быть кислотно-аддитивная соль или соль четвертичного аммония. Примеры кислотно-аддитивной соли включают, но не ограничены ими, неорганические кислые соли, такие как гидрохлорид, гидробромид, сульфат, фосфат и т.д., и органические кислые соли, такие как оксалат, малеат, фумарат, лактат, малеат, сукцинат, тартрат, бензоат, метансульфонат и т.д. Примеры солей четвертичного аммония могут включать, но не ограничены ими, низшие алкилгалогениды, такие как йодистый метил, бромистый метил, йодистый этил, бромистый этил и т.д.; низшие алкилсульфонаты, такие как метилметансульфонат, этилметансульфонат и т.д.; и низшие алкилакрилсульфонаты, такие как метил-п-толуолсульфонат.

Кроме того, поскольку S-аллил-L-цистеин или его фармацевтически приемлемая соль могут быть в форме сольватов или гидратов, композиция настоящего изобретения может использовать сольват или гидрат S-аллил-L-цистеина или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента.

Как используется в настоящем описании, термин «фармацевтически приемлемое производное» относится к соединению, которое получено путем замещения атома или атомной группы на часть исходного соединения, без нарушения основной структуры, как, например, производное метила или производное хлорида. Ряд производных, синтезированных из основной структуры, могут приводить к более высокой фармацевтической эффективности, чем эффективность исходного соединения.

Производное S-аллил-L-цистеина может быть легко получено с использованием способа, известного в данной области техники (например, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Chemistry, 5th ed., 1:172-178 и 949-982 (1995)).

Глазная болезнь может быть возрастной макулярной дистрофией или дегенеративным поражением сетчатки.

Макулярная дистрофия (MD) является заболеванием, которое приводит к потере зрения в центре зрительной области из-за поражения макулы. Примеры макулярной дистрофии включают сухую макулярную дистрофию, влажную макулярную дистрофию, возрастную макулярную дистрофию, миопическую макулярную дистрофию и идиопатическую макулярную дистрофию, в одном из вариантов осуществления изобретения возрастную макулярную дистрофию. В частности, композиция в одном из вариантов осуществления изобретения включает значительную ингибирующую активность по отношению к фотоокислению при возрастной макулярной дистрофии. В одном из вариантов осуществления изобретения было обнаружено, что S-аллил-L-цистеин защищает клетки дозозависимым образом от клеточной гибели, вызванной синим светом, как испытано при появляющемся накоплении A2E в клетках пигментного эпителия сетчатки линии (ARPE-19).

В одном из вариантов осуществления изобретения композиция для профилактики или лечения глазных болезней может включать S-аллил-L-цистеин в количестве от 5 до 99,9% по массе и в другом варианте осуществления изобретения в количестве от 5 до 60% по массе. Еще в одном варианте осуществления изобретения композиция S-аллил-L-цистеина не только защищает ARPE-19 дозозависимым способом, чтобы таким образом эффективно предотвращать или лечить глазные болезни, но также не вызывает побочные эффекты.

В одном из вариантов осуществления изобретения композиция для профилактики или лечения глазной болезни может также включать противовоспалительное средство или антиоксидант.

В одном из вариантов композиции для профилактики или лечения глазной болезни противовоспалительное средство может быть выбрано из группы, состоящей из ибупрофена, кетопрофена, флурбипрофена, фенопрофена, напроксена, пироксикама, теноксикама, изоксикама, мелоксикама, индометацина, ацеклофенака, диклофенака и их комбинации, и антиоксидант может быть выбран из группы, состоящей из витамина А, витамина С, витамина Е, каротиноида, цинка, меди, железа, марганца, лютеина, зеаксантина, селена, глутатиона (GSH), ликопина и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления изобретения S-аллил-L-цистеин может быть получен путем выделения и очистки из растения рода Allium, путем синтеза или путем ферментации. Например, S-аллил-L-цистеин может быть получен из растения рода Allium, такого как, например, чеснок, виноградный лук, лук, лук-шалот и т.д., с использованием способа, раскрытого в EP 0429080A1. Или же S-аллил-L-цистеин может быть синтезирован или получен с использованием метода, известного в данной области техники, как например ферментации. Помимо прямого получения S-аллил-L-цистеин может быть коммерчески доступным.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения композиция для профилактики или лечения глазной болезни может быть составлена в виде лекарственной формы, выбранной из группы, состоящей из лекарственной формы для перорального применения, применения через слизистую оболочку, инъекции, ингалятора и наружного применения.

В дополнение к одному или более активным ингредиентам, в одном из вариантов осуществления изобретения композиция настоящего изобретения может также включать один или более инертных фармацевтически приемлемых носителей. В настоящем изобретении может быть использован любой носитель, который обычно применяют в фармацевтических препаратах. Примеры носителя могут включать без ограничения лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, алгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Кроме того, еще в одном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция настоящего изобретения может дополнительно включать лубрикант, смачивающее средство, подсластитель, ароматизатор, эмульгатор, суспендирующее средство и консервант. Для подробного описания подходящих фармацевтически приемлемых носителей и препаратов может быть сделана ссылка на Remington's Pharmaceutical Sciences (19^th Ed., 1995).

Лекарственные препараты могут быть введены млекопитающим, таким как крысы, мыши, домашний скот, люди и т.д., через оральный или неоральный пути, например перорально, ректально или внутривенно, внутримышечно, подкожно, интратекально или внутрицереброваскулярно. В одном из вариантов осуществления изобретения может быть использовано неоральное введение или внутрикожное введение. Еще в одном варианте осуществления изобретения может быть использовано местное применение путем покрытия.

Подходящая доза лекарственного препарата может варьировать в зависимости от ряда факторов, включая лекарственные формы, вес пациента, возраст, половую принадлежность и состояние здоровья, режим питания, время применения, способ применения, скорость выделения и тяжесть реакции пациента. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть введена взрослому в дозе 0,1-100 мг/кг от одного до нескольких раз в день в виде пероральной лекарственной формы и введена взрослому в дозе от 1,0 до 3,0 мл от одного до пяти раз в день в течение одного месяца или дольше в виде средства для наружного применения. Однако дозировка не ограничивается.

В одном из вариантов осуществления изобретения в способе, который может осуществить средний специалист в данной области техники, фармацевтическая композиция может быть составлена вместе с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом в стандартной лекарственной форме или упакована в упаковках лекарственных средств для многократного приема. В этом отношении препарат может иметь любую лекарственную форму, если она подходит для фармацевтических препаратов, включая пероральные формы, такие как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы, и аэрозоли; для наружных применений, такие как мази, кремы и т.д.; суппозитории и стерильные инъекции. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция может также включать диспергирующие вещества или стабилизаторы.

В одном из вариантов осуществления изобретения активный ингредиент композиции S-аллил-L-цистеин, который является и ингибитором накопления A2E в клетках пигментного эпителия сетчатки, и супрессором окисления A2E, может проявлять превосходные профилактические и терапевтические эффекты на глазные болезни, включая возрастную макулярную дистрофию и дегенеративную болезнь сетчатки.

Кроме того, в одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть получена в качестве лекарственных препаратов, эффективных для профилактики или лечения глазных болезней.

Здесь и далее настоящее изобретение будет пояснено в деталях путем примеров, так что средний специалист в данной области техники может осуществить настоящее изобретение. Однако подробные описания вариантов осуществления данного изобретения не претендуют быть исчерпывающими или ограничивать изобретение точной формой, раскрытой ниже. В то время как конкретные варианты осуществления изобретения и примеры для него описаны ниже с иллюстративными целями, различные эквивалентные модификации являются возможными в объеме данного изобретения, как признано специалистами в соответствующей области техники.

Необходимо отметить, что символ «%», как используется на всем протяжении описания для представления концентрации определенного вещества, предназначен означать масса/масса (масс./масс.) % для (твердое вещество)/(твердое вещество), масса/объем (масс./об.) % для (твердое вещество)/жидкость и объем/объем (об./об.) % для жидкость/жидкость, если не оговорено другое.

ПРИМЕР ПОЛУЧЕНИЯ: Культура клеток

Линия пигментных клеток сетчатки, использованная в экспериментах и исследованиях настоящего изобретения, произошла из линии клеток пигментного эпителия сетчатки (ARPE-19: ATCC no CRL-2302), купленной у ATCC (American Type Culture Collection, Manassas VA), и поддерживалась пассажами, как описано в документе (Sparrow, J.R. et al., A2E alipofuscin fluorophore, in human retinal pigmented epithelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999, 40(12), 2988-95).

Кратко, линию пигментных клеток сетчатки культивировали в условиях при 37ºС под 5% СО₂ в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Gibco, USA), дополненной антибиотиками (Gibco, USA), включая 100 ед./мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и амфотерицина В, и 10% фетальной бычьей сывороткой (Hyclone, USA). Клеткам давали прикрепиться на дно культурального планшета и культивировали с пассажем путем обработки смесью 1:4 трипсин:10% фетальная бычья сыворотка (Gibco, USA) - среда с добавками при слиянии.

Для использования в эксперименте, клетки высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 5×10⁴ клеток/лунку.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1: Подавляющая активность S-аллил-цистеина по отношению к фотоокислению

Исследование S-аллил-цистеина на подавляющую активность по отношению к окислению A2E, индуцированному синим светом

S-аллил-цистеин изучали на способность подавлять окисление A2E, индуцированное синим светом. Сначала, 100 мкМ A2E разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) до 20 мкМ, и 200 мкл разведенного вещества помещали в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем отрицательный контроль, положительный контроль (лютеин 20 мкМ) или заранее определенную концентрацию S-аллил-цистеина (1, 10, 100 мкМ) добавляли к разведенному веществу и перемешивали пипетированием.

Светодиодная лампа, испускающая синий свет в среднем диапазоне длины волны в 430 нм, действовала над микропланшетами для индукции фотоокисления до тех пор, пока поглощение A2E не было снижено вдвое. Поглощение измеряли путем ELISA до и после индукции фотоокисления. Для получения концентраций A2E измерения были наложены на стандартную A2E кривую, и разницу в концентрациях до и после экспонирования под синим светом использовали для получения концентрации окисленного A2E. Из этих данных рассчитывали ингибирующую активность образца по отношению к фотоокислению A2E по следующей математической формуле 1. В формуле 1, “абс.” означает поглощение.

Математическая формула 1

$$PI(\%)=\frac{A-B}{A}\times 100$$

А = абс. A2E - абс. A2E + синий свет

В = {(абс.A2E + образец) - абс. образца} - {(абс. A2E + образец + синий свет) - (абс. образца - абс. образца + синий свет)}

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПРИМЕР 2: Исследование ингибирующей активности по отношению к фотоокислению A2E в линии пигментных клеток эпителия сетчатки человека (APRE-19)

Цитопротективная активность S-аллил-цистеина по отношению к индуцированному синим светом апоптозу линии пигментных клеток эпителия сетчатки человека (ARPE-19), накопивших A2E

Линию пигментных клеток сетчатки человека (ARPE-19) высевали с плотностью 5×10⁴ клеток/лунка в 96-луночные планшеты и инкубировали с 20 мкМ A2E в течение 7 дней для накопления A2E. Затем, до воздействия синего света, клетки обрабатывали, как описано выше, отрицательным контролем, положительным контролем (лютеин: 20 мкМ) или S-аллил-цистеином предварительно определенной концентрации (1, 10, 100 мкМ).

После этого клеточную выживаемость измеряли с использованием анализа с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (MTT). MTT анализ является стандартным колориметрическим анализом для оценки жизнеспособности клеток, обычно в лаборатории. Как правило, жизнеспособные клетки считают с использованием гемоцитометра или путем измерения оптической плотности; однако этот метод требует слишком много времени и труда для большого количества клеток и склонен выдавать неточные результаты. В качестве альтернативы MTT анализ построен так, что желтый субстрат тетразолия MTT восстанавливается метаболически активными клетками, частично посредством действия митохондриальных ферментов дегидрогеназ, до пурпурного формазана, который может быть солюбилизирован и измерен спектрофотометрическими методами. Этот анализ может быстро и точно анализировать пролиферативное поведение большого количества клеток. Пурпурный солюбилизированный раствор в диметилсульфоксиде (ДМСО) показывает максимум оптической плотности при 540 нм. Измерения поглощения при этой длине волны проявляют линейную корреляцию с подсчетом живых клеток. Большее количество живых клеток продуцирует большее количество кристаллов формазана, регистрируя большее поглощение.

Согласно MTT анализу (Sigma-Aldrich Inc., St.Louis, MO, USA) DMEM, содержащую 0,5 мг/мл MTT, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 2 часов в инкубаторе в условиях темноты. После завершения реакции клетки в каждой лунке полностью растворяли в 2 мл ДМСО (Sigma-Aldrich Inc.). Поглощение при 540 нм измеряли на микропланшеточном ридере для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), и жизнеспособность клеток выражали в процентах (%) от поглощения нормального контроля, который не накапливал A2E и не был обработан образцами.

Ингибиторная активность S-аллил-цистеина по отношению к окислению A2E, индуцированному синим светом

Для того чтобы оценить ингибиторную активность S-аллил-цистеина по отношению к фотоокислению A2E, концентрации окисленного A2E измеряли после воздействия синего облучения, как описано в экспериментальном примере 1 и результаты изображены на ФИГ. 1.

Как можно видеть на ФИГ. 1, концентрация окисленного A2E уменьшалась на 20, 32 и 41% при 1, 10 и 100 мкМ S-аллил-цистеина соответственно, по сравнению с необработанными клетками. Положительный контроль показал значительную защитную активность соединения настоящего изобретения по сравнению с группой, обработанной лютеином. Взятые в совокупности данные показали, что S-аллил-L-цистеин ингибирует фотоокисление A2E дозозависимым образом.

Цитопротективная активность S-аллил-цистеина по отношению к индуцированному синим светом апоптозу ARPE-19, накопивших A2E

Для оценки цитопротективной активности S-аллил-цистеина по отношению к апоптозу, индуцированному синим светом, был проведен MTT анализ для измерения жизнеспособности клеток, как описано в экспериментальном примере 2, и результаты изображены на ФИГ. 2.

Как явствует из ФИГ. 2, существует значительная разница в жизнеспособности клеток между отрицательным контролем, экспонированным под синим светом после накопления A2E, и положительным контролем.

Жизнеспособность клеток увеличивалась по сравнению с отрицательным контролем на 63, 134 и 167%, когда клетки были обработаны 1, 10 и 100 мкМ S-аллил-L-цистеина соответственно, демонстрируя, что S-аллил-цистеин защищает клетки пигментного эпителия сетчатки человека дозозависимым образом.

Несмотря на то что раскрытые варианты осуществления настоящего изобретения были описаны с иллюстративными целями, специалисты в данной области техники поймут, что различные модификации, дополнения и замены являются возможными, без выхода из объема и сущности настоящего изобретения, которое представлено в прилагаемой формуле изобретения.

1. Применение S-аллил-L-цистеина, его фармацевтически приемлемой соли или его сольвата или гидрата в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения возрастной макулярной дистрофии, включая влажную возрастную макулярную дистрофию и сухую возрастную макулярную дистрофию.

2. Применение по п. 1, где S-аллил-L-цистеин получают путем выделения и очистки из растения рода Allium путем синтеза или ферментации.

3. Применение по п. 1, где лекарственное средство дополнительно содержит противовоспалительное средство или антиоксидант.

4. Применение по п. 3, где противовоспалительное средство выбрано из группы, состоящей из ибупрофена, кетопрофена, флурбипрофена, фенопрофена, напроксена, пироксикама, теноксикама, изоксикама, мелоксикама, индометацина, ацеклофенака и диклофенака и их комбинации; и антиоксидант выбран из группы, состоящей из витамина А, витамина С, витамина Е, каротиноида, цинка, меди, железа, марганца, лютеина, зеаксантина, селена, глутатиона (GSH) и ликопина и их комбинации.

5. Применение по п. 1, где лекарственное средство представлено в форме, которая выбрана из группы, состоящей из лекарственной формы для перорального введения, введения через слизистую, инъекции, ингалятора и формы для наружного применения.