Способ получения культуры изолированных корней silene linicola к1601 - продуцента экдистероидов



Способ получения культуры изолированных корней silene linicola к1601 - продуцента экдистероидов
Способ получения культуры изолированных корней silene linicola к1601 - продуцента экдистероидов
Способ получения культуры изолированных корней silene linicola к1601 - продуцента экдистероидов
Способ получения культуры изолированных корней silene linicola к1601 - продуцента экдистероидов

 


Владельцы патента RU 2605912:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ, НИ ТГУ) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности. Способ предусматривает бактериальную трансформацию экспланта корня ювенильного растения Silene linicola агробактериальным штаммом R-1601 A. Rhizogenes. Трансформированные корни от экспланта отделяют и культивируют. Изолированные корни культивируют первые два пассажа на среде Гамборга с добавлением 250 мг/л цефотаксима, последующие пассажи выращивают на среде Гамборга с добавлением 500 мг/л гидролизата казеина. Изобретение позволяет обеспечить постоянный высокий темп роста изолированных корней Silene linicola К1601 на безгормональных питательных средах при высоком уровне биосинтеза видоспецифичных экдистероидов. 3 ил., 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности.

Интенсивные исследования по получению вторичных метаболитов из лекарственного растительного сырья и поиску растений, продуцирующих эти вещества, проводятся вследствие широкого спектра их биологической активности, в частности анаболический, адаптогенный, иммуномодулирующий эффекты экдистероидов [1, 2].

Семейство Caryophyllaceae является одним из самых богатых экдистероидсодержащих в мировой флоре и характеризуется разнообразным составом экдистероидов, наличием множества обнаруженных пока только в них новых соединений, высоким содержанием мажорных компонентов экдистероидной суммы. В настоящее время экдистероиды обнаружены более чем в 150 видах рода Silene L., 12 - в Lychnis L. и ряд видов в других родах [1, 3]. Альтернативой известным подходам получения сырья и экстрактов лекарственных растений является культура клеток, тканей и органов растений.

Известны штаммы культивируемых клеток и изолированных корней экдистероидсодержащих растений - Ajuga reptans L. [4, 5], Ajuga turkestanica () [6], Serratula tinctoria L. [7], Serratula coronata L. [8]. Однако в литературе нет данных по получению культуры изолированных корней представителей сем. Caryophyllaceae как источников получения экдистероидов.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения культуры клеток экдистероидсодержащих видов рода Silene [9], в соответствие с которым показана возможность получения стабильно растущей культуры каллусов представителей рода Silene из различных типов эксплантов. Для этого различные типы эксплантов культивируют на среде Мурасиге и Скуга (MS) с добавлением гормонов (регуляторов роста) - бензиламинопурина 1 мкМ, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 5 мкМ и гидролизата казеина 1 г/л. При данном способе культивирования индексы роста каллусов Silene linicola корневого происхождения составили по сырой биомассе - 4,1±0,6, по сухой - 4,0±1,3.

Недостатками данного способа являются медленный прирост биомассы, необходимость использования дорогостоящих регуляторов роста для стабильного роста культуры in vitro, незначительный уровень содержания экдистероидов в конечном продукте.

Задачей изобретения является получение генетически и биохимически стабильной культуры изолированных корней Silene linicola, характеризующейся постоянным высоким темпом роста на безгормональных питательных средах и высоким уровнем биосинтеза экдистероидов, свойственных данному виду растения.

Поставленная задача решается созданием новой культуры изолированных корней Silene linicola, обозначенной Silene linicola К1601, и оптимизацией условий их культивирования. Способ получения культуры-продуцента экдистероидов включает культивирование экспланта корня ювенильного растения с добавлением регуляторов роста, отделение трансформированных корней от экспланта и их последующее выращивание на питательной среде. Отличие от прототипа заключается в том, что осуществляют агробактериальный перенос генов Agrobacterium rhizogene, плазмида pRi, штамм R-1601, в корни Silene linicola (синдром hairy root). После трансформации бактериальную среду элиминируют, а стерильные изолированные корни Silene linicola К1601 культивируют на жидкой безгормональной питательной среде Гамборга, причем первые два пассажа культивируют с добавлением к питательной среде 250 мг/л цефотаксима, а все последующие пассажи культивируют с добавлением к питательной среде 500 мг/л гидролизата казеина.

Опытным путем показана возможность создания культуры изолированных корней Silene linicola и биосинтеза в ней экдистероидов, а созданная культура Silene linicola К1601 является альтернативным источником экдистероидов. Усиленному синтезу экдистероидов способствует оптимально подобранный состав питательной среды.

На фиг. 1 показана фотография культуры изолированных корней Silene linicola К1601.

На фиг. 2 приведена ВЭЖХ этанольного экстракта Silene linicola К1601

На фиг. 3 приведены УФ-спектры экдистероидов Silene linicola К1601.

Культура Silene linicola К1601 получена от вида Silene linicola C.C.Gmelin (сем. Caryophyllaceae), семена которого получены из ботанического сада г. Геттингена (Германия) и интродуцированы в Сибирском ботаническом саду Томского государственного университета. Происхождение культуры Silene linicola К1601 - агробактериальный перенос генов pRi Agrobacterium rhizogenes, штамм R-1601, в корни ювенильных растений Silene linicola. Характеристика получаемой культуры - тонкие интенсивно ветвящиеся корни, индекс роста по сырой биомассе 14,7+0,5, по сухой биомассе 13,5+0,4.

Способ по изобретению осуществляют следующим образом.

На первом этапе проводится бактериальная трансформация эксплантов корня растения Silene linicola. Для получения асептической культуры семена Silene linicola стерилизовали в 20 % растворе «Domestos» с последующим трехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой и помещали на 0,6 % агар для проращивания. Условия культивирования семян: фотопериод свет/темнота 16/8, Т=22±2 °С.

Трансформацию проводили по следующей схеме: стерильные проростки делили на лист, гипокотиль, корень, накалывали иголкой инсулинового шприца и инокулировали в течение 24 часов в жидкой питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей суспензию агробактерий A. rhizogenes, штамм R-1601, суточного возраста. После экспозиции инокуляты промывали стерильной средой Мурасиге и Скуга с уменьшенным вдвое содержанием макро- и микроэлементов (½ MS). Для проявления трансформации помещали на агаризованную среду с добавлением 500 мг/л цефотаксима. Через 3 недели, после появления розетки корней, их отделяли, пересаживали на ту же питательную среду с цефотаксимом (500 мг/л), затем кончики корней двукратно пересаживали на агаризованную питательную среду ½ MS с 250 мг/л антибиотика для элиминирования бактерий. В дальнейшем использовали жидкую питательную среду Гамборга. Состав среды Гамборга оптимально сбалансирован по макро-, микросолям и витаминам для биосинтеза экдистероидов в Silene linicola К1601. Например, в среде Гамборга в 1,5-10 раз меньше содержание макросолей, микросолей и сахарозы, чем в MS. Концентрации же витаминов в среде Гамборга в 2-10 раз больше, в чем в MS.

Пример 1. Изолированные корни переносили на жидкую питательную среду Гамборга с добавление 250 мг/л цефотаксима и культивировали 2 пассажа (период между пассажами - 30 дней) для достижения полной асептичности культуры. После этого культуру изолированных корней переносили на среду Гамборга с добавлением 500 мг/л гидролизата казеина, период между последующими пассажами составлял 45 дней. Для пересадки брали примерно 200 мг сырой биомассы корней и помещали в конические колбы на 250 мл в 100 мл среды. pH доводили до 5,8 до автоклавирования. Условия культивирования: темнота, температура 24±2°С, орбитальный шейкер 90 об./мин. Консервация - на агаризованной питательной среде Гамборга при температуре +17 °С при слабом освещении. Результат положительный (фиг. 1 - 3).

Пример 2. Аналогичен примеру 1, но первый и второй пассажи на жидкую среду Гамборга проводили без добавления цефотаксима в дозировке 250 мг/л. Результат отрицательный. При отсутствии антибиотика в первых пассажах на жидких средах наблюдали появление бактериальной инфекции с частотой 75 %.

Пример 3. Аналогично примеру 1, но культивирование изолированных корней проводили в жидкой питательной среде Гамборга без добавления гиролизата казеина. Результат отрицательный. На данной питательной среде показатели роста сырой и сухой биомассы резко снижались. Результаты представлены в таблице 1.

Таким образом, в результате испытаний способа по изобретению (пример 1) показано, что культура изолированных корней Silene linicola К1601 растет стабильно, образует массу тонких плотно переплетенных корней (фиг. 1). Культура поддерживается с помощью пересадок на свежие питательные среды каждые 45 дней. Согласно данным ВЭЖХ анализа, в процессе культивирования в заявленных условиях происходит активный синтез множества экдистероидов (см. табл. 2). Профиль ВЭЖХ этанольного экстракта изолированных корней Silene linicola К1601 имеет большое сходство с профилем соответствующего экстракта интактных растений по времени удерживания детектируемых веществ (фиг. 2), что подтверждается и характерными УФ-спектрами поглощения (фиг. 3). В экстрактах идентифицированы характерные экдистероиды для видов рода Silene: 20-гидроксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, полиподин В. Содержание 20-гидроксиэкдизона в образцах Silene linicola К1601 составляет 0,18 %. Идентификация других экдистероидов требует дополнительных исследований.

Технический результат - обеспечение постоянного высокого темпа роста изолированных корней Silene linicola К1601 на безгормональных питательных средах при высоком уровне биосинтеза видоспецифичных экдистероидов.

Источники информации

1. Зибарева Л.Н. Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaceae. Автореф. дисс. док. хим. наук, Новосибирск, 2003. 247 с.

2. Володина С.О. Экдистероидсодержащие растения: ресурсы и биотехнологическое использование. Дисс. канд. биолог. наук, Сыктывкар, 2006. 166 с.

3. Distribution of phytoecdysteroids in the Caryophyllaceae / L. Zibareva, V. Volodin, Z. Saatov, T. Savchenko, P. Whiting, R. Lafont, L. Dinan // Phytochemistry. - 2004. - V. 64. - №. 2 - P. 499 - 517.

4. Филлипова В.Н., Володина С.О., Смоленская И.Н., Зоринянц С.Э., Ануфриев Э.Н., Носов А.М., Володин В.В. (2007). Штамм культивированных клеток растений Ajuga reptans. Патент РФ №2296154 от 27.03.2007.

5. Matsumoto T., Tanaka N. Production of ecdysteroid by hairy root cultures of Ajuga reptans var autropurpurea // Agric. Biol. Chem. - 1991- V. 55. - P. 1019-1025.

6. Cheng D.M., Yousef G.G., Grace M.H., Rogers R.B., Gorelick-Feldman J., Raskin I., Lila M.A. In vitro production of metabolism-enchancing phytoecdysteroids from Ajuga turkestanica // Plant Cell Tiss. Organ. Cult. - 2008. - V. 93. - P. 73-83.

7. Delbeque J., Beydon P., Chapuis L. In vitro incorporation of radio labelled cholesterol and mevalonic acid into ecdysteron by hairy root cultures of a plant Serratula tinctoria. // Eur J Entomol. - 1995. - 92:301-307.

8. Филлипова В.Н., Володина С.О., Смоленская И.Н., Зоринянц С.Э., Ковлер Л.А., Ануфриев Э.Н., Носов А.М., Володин В.В. Штамм культивируемых клеток растений Serratula coronata L. Патент РФ №2296155 от 27.03.2007.

9. Эрст А.А., Зибарева Л.Н. Особенности каллусообразования экдистероидсодержащих видов рода Silene L. (Caryophyllaceae Juss.) в культуре in vitro // Сибирский экологический журнал. - 2013. - № 4. - С. 603-608.

Способ получения культуры

изолированных корней Silene linicola

Таблица 1. Сравнительная оценка прироста сырой и сухой биомассы изолированных корней Silene linicola К1601 при различном составе питательной среды

Таблица 2. Идентификация экдистероидов в этанольных экстрактах Silene linicola К1601

Примечание: НИДЭ - неидентифицированный экдистероид.

Способ получения культуры изолированных корней Silene linicola К1601 - продуцента экдистероидов, включающий бактериальную трансформацию экспланта корня ювенильного растения Silene linicola, отделение трансформированных корней от экспланта и их последующее культивирование, отличающийся тем, что бактериальную трансформацию осуществляют агробактериальным штаммом R-1601 A. rhizogenes, а культивирование изолированных корней Silene linicola К1601 осуществляют на жидкой безгормональной питательной среде Гамборга, причем первые два пассажа культивируют с добавлением к питательной среде 250 мг/л цефотаксима, а все последующие пассажи культивируют с добавлением к питательной среде 500 мг/л гидролизата казеина.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Осуществляют однократное опрыскивание водным раствором органоминерального удобрения надземной части вегетирующих растений овса в стадии кущения.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к растениеводству. Изобретение представляет собой способ снижения заболеваемости подсолнечника, включающий использование природных источников сырья, обработку посевов за вегетацию дважды, где семена перед посевом обволакивают отработанной тамбуканской грязью в количестве 150-200 кг/га в смеси с биопрепаратом Альбит в дозе 60-80 мл/га, а в фазу образования корзинок эту смесь растворяют в воде 200-250 л/га и обрабатывают посевы.

Изобретения относятся к области сельского хозяйства, в частности к технологии возделывания риса. Способ включает применение сениканта для ускорения созревания в виде раствора сульфата марганца, Mn 400 г/га д.в., в фазе молочно-восковой спелости зерна.

Изобретение относится к регуляторам роста и развития растений. Средство для стимулирования образования хлорофилла в процессе развития высших растений включает водный раствор пероксида водорода в концентрации 5·10-5-1·10-3 М (1,7·10-3-3,4·10-2 г/л).
Изобретение может быть использовано в химической промышленности. Способ получения стабильного хлорамина в непрерывном потоке при комнатной температуре, в котором концентрированный источник хлора объединяют с концентрированным источником амина при их мольном соотношении, составляющем 1:0,755-1:6, с реакционной средой и перемешивают для получения стабильного хлорамина с pH 7-10,5.
Изобретение может быть использовано в целлюлозно-бумажной промышленности для ингибирования и контроля роста микроорганизмов в технических и оборотных водах. Для осуществления способа в обрабатываемую воду вводят предварительно приготовленную смесь бромхлордиметилгидантоина и гипохлорита натрия с концентрацией бромхлордиметилгидантоина от 0,1 до 7,5 г/л и их соотношением в пересчете на активный хлор от 1:15 до 15:1.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к дезинфицирующим системам для медицинских устройств. Для этого используют раствор пероксида водорода для дезинфекции контактных линз.
Изобретение относится к синергетической противомикробной композиции, включающей флуметсулам или диклозулам и пиритион цинка, где массовое соотношение флуметсулама и пиритиона цинка составляет от 8:1 до 1:7, а массовое соотношение диклозулама и пиритиона цинка составляет от 15:1 до 1:2.
Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к растениеводству. В способе выращивают рассаду томата с поливом водой.
Изобретение относится к способам стимулирования роста растений. Осуществляют обработку посадочного материала путем замачивания семян перед посевом в течение 24 часов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению трансгенных растений лесных древесных пород в качестве биологических моделей при прогнозировании круговоротов азота и углерода в лесных экосистемах.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Меристемные растения опрыскивают 0,1% раствором ПАБК, куда вводят 0,1% биопрепарата Фитолавина при температуре 20-25°С, а при повторном опрыскивании в фазе 3-4 листьев в раствор дополнительно добавляют 0,2-0,3% гумата калия.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая), включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах, где через 7-10 дней после культивирования в стандартных условиях побеги помещают в условия с температурой 4-8°С и уровнем освещенности 500-1000 люкс на срок до 8 (лимонник китайский, береза повислая) или до 12 месяцев (рододендрон, сирень).
Изобретение относится к области декоративного садоводства. Изобретение представляет собой способ размножения растений фритиллярий методом in vitro, включающий стерилизацию эксплантов, разделение их на части, посадку на питательную среду Данстена и Шорта, отделение микролуковиц от эксплантов, их укоренение и адаптацию, отличающийся тем, что после разделения эксплантов их помещают на питательную среду Данстена и Шорта, содержащую 6 г/л агара с добавлением - 5 мкМ 6-бензиламинопурина и 2 мкМ α-нафтилуксусной кислоты, после культивирования на данной среде микролуковицы размножают на безгормональной среде Данстена и Шорта в течение 4 недель при освещении 3 клк 16 ч свет/ 8 ч темнота при температуре 24°C, укореняют и адаптируют в контейнерах со сфагновым мхом, в темноте, при температуре 7°C, в течение 2 месяцев.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования лимона in vitro, заключающийся в том, что стерильные пазушные почки предварительно культивируют до появления микропобегов на питательной среде МС с добавлением БАП 0,1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, агар 0,7%, затем вычленяют из них меристемы размером 0,4-0,6 мм с 2-3 примордиями и прививают их на подвой, выращенный in vitro на среде WPM, дополненной БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 0,7%, микропривитые растения культивируют на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ получения моноклональной линии растительных клеток от гетерологичной популяции растительных клеток, включающий следующие стадии.

Изобретение относится к области биохимии. Предложена система контроля фотосинтетического и дыхательного СО2-газообмена в культуре in vitro.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов лапчатки белой (Potentilla alba L.) в условиях гидропоники, включающий использование черенков материнских растений, размножение и выращивание, где в качестве эксплантов используются черенки материнских растений, которые высаживают на питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 0,5 мкМ БАП для введения в культуру ткани, через 20-30 суток развившиеся побеги пересаживают для микроразмножения на питательную среду Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 0,5 мкМ БАП+0,25 мкМ ИМК+0,05 мкМ ГК, укореняют побеги на агаризированной среде Мурасиге-Скуга, дополненной 1 мкМ НУК, затем растения-регенеранты вынимают из культуральных сосудов, отмывают корни в дистиллированной воде от агара, закрепляют в кассетах и помещают в гидропонную установку на 90 суток для адаптации и выращивания растительного лекарственного сырья на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1/4 состава макросолей, 1/4 состава микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого, при температуре 24-26°C, режим освещения: 16 часов день, 8 часов ночь.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности картофелеводства. В способе выращивают мини-клубни оздоровленного картофеля в защищенном грунте, полученные от пробирочных растений.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесному хозяйстве. Изобретение представляет собой способ подготовки микропобегов in vitro ясеня, осины, ивы для последующего укоренения в условиях ex vitro, включающий перенос растений после стадии мультипликации на питательную среду WPM для элонгации, с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л и никотиновой кислоты 0,5 мг/л, где в среду для элонгации добавляют глутамин в концентрации 0,5 или 1,0 ммоль/л, при этом культивирование растений осуществляется при повышенной освещенности - от 5 до 8 тыс.
Наверх