Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения



Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения
Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения

 

C40B40/10 -
C40B40/10 -
C40B40/08 -
C40B40/08 -
C07K1/107 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2606016:

РЕДВУД БАЙОСАЙНС, ИНК. (US)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению меченого альдегидом антитела для конъюгации с интересующим лекарственным средством, и может быть использовано в медицине. Полученное антитело может быть модифицировано формилглицин-образующим ферментом с образованием модифицированного 2-формилглицином (FGly) антитела, которое может быть ковалентно и сайт-специфично конъюгировано с целевым фрагментом. Изобретение позволяет получить конъюгат, способный к направленной доставке в антиген экспрессирующие ткани организма. 10 н. и 50 з.п. ф-лы, 33 ил., 3 пр.

 

Перекрестная ссылка на связанные заявки

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США, серийный номер 61/433,042, поданной 14 января 2011 г., которая включена в данную заявку в полном объеме путем ссылки.

Уровень техники

Антитела находят применение в различных диагностических и терапевтических сферах. Антитела могут также применяться для доставки лекарственных средств. Однако конъюгацию лекарственного средства с антителом может быть сложно контролировать, и она может давать гетерогенную смесь конъюгатов, отличающихся по количеству присоединенных молекул лекарственного средства. Это может усложнить контроль количества, которое вводят больному.

Литература

Патентная публикация США №2010/0210543; WO 2010/096394; Патентная публикация США №2008/0187956; WO 2009/120611.

Краткое описание изобретения

В данном описании предлагаются меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина (Ig), которые могут быть модифицированы формилглицин-образующим ферментом с получением модифицированного формилглицином (FGly) полипептида Ig. FGly-модифицированный полипептид Ig может быть ковалентно и сайт-специфически связан с целевой группой, чтобы обеспечить конъюгат Ig. Описание также включает способы получения таких меченых альдегидом полипептидов Ig, FGly-модифицированных полипептидов Ig и конъюгатов Ig, а также способы их применения.

Краткое описание фигур

На фиг.1А изображена карта сайта, показывающая возможные сайты модификации для создания меченого альдегидом полипептида Ig. Верхняя последовательность является последовательностью аминокислот консервативной области легкой цепи полипептида IgG1 (SEQ ID NO:1) и показывает возможные сайты модификации в легкой цепи Ig; нижняя последовательность является последовательностью аминокислот консервативной области тяжелой цепи полипептида Ig (SEQ ID NO:228; GenBank номер доступа AAG00909) и показывает возможные сайты модификации в тяжелой цепи Ig. Нумерация тяжелой и легкой цепей основана на полноразмерных тяжелых и легких цепях.

На фиг.1Б показано выравнивание константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина для IgG1 (SEQ ID NO:2), IgG2 (SEQ ID NO:4), IgG3 (SEQ ID NO:3), IgG4 (SEQ ID NO:5) и IgA (SEQ ID NO:6), при этом показаны сайты модификации, в которых альдегидные метки могут быть введены в тяжелую цепь иммуноглобулина. Нумерация тяжелой и легкой цепей основана на полноразмерных тяжелых и легких цепях.

На фиг.1В изображено выравнивание константных областей легкой цепи (SEQ ID NO:1 и 7-10) иммуноглобулина, при этом показаны сайты модификации, в которых альдегидные метки могут быть введены в легкую цепь иммуноглобулина.

На фиг.2 представлена схема экспрессии меченых альдегидом антител и их последующей химической конъюгации.

На фиг.3 изображены доступные для растворителя участки петли в константных областях легкой цепи (верхняя последовательность (SEQ ID NO:11)) и тяжелой цепи (нижняя последовательность (SEQ ID NO:12)) анти-CD19, с мотивом LCTPSR сульфатазы в константной области тяжелой цепи. Сигнальный пептид показан строчными буквами; вариабельная область подчеркнута; доступные для растворителя участки петли в константных областях показаны полужирным и подчеркнутым шрифтом. Последовательность LCTPSR показана полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием.

На фиг.4 изображены результаты белкового блоттинг-анализа меченых альдегидом анти-CD19 и меченых альдегидом анти-CD22 антител. На левой панели предложено схематическое изображение антитела и показаны примеры относительных положений сайтов модификации альдегидной меткой в участке СН1 тяжелой цепи Ig ("CH1 (А)", "CH1 (В)", "CH1 (С)"), участке СН2 тяжелой цепи Ig ("СН2 (А)", "СН2 (В)", "СН2 (С)"), участке СН2/3 ("СН2/СН3") и C-концевом участке ("C-конец").

На фиг.5 показаны результаты анализа методом вестерн-блоттинга: а) меченого альдегидом анти-CD22 антитела, химически конъюгированного с аминоокси-FLAG (панель А); и б) результаты анализа методом вестерн-блоттинга меченых альдегидом анти-CD19 антител и меченых альдегидом анти-CD22 антител, химически конъюгированных с аминоокси-FLAG.

На фиг.6А и 6Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.6А; (SEQ ID NO:13)), кодирующая тяжелую цепь CD22-специфичного антитела IgG1, и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.6Б; (SEQ ID NO:14)). Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.7А и 7Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.7А; (SEQ ID NO:15)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 иммуноглобулина (Ig) ("CH1 (A) LCTPSR"), и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.7Б; (SEQ ID NO:16)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в СН1 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.8А и 8Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.8А; (SEQ ID NO:18)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 иммуноглобулина (Ig) ("CH1 (В) LCTPSR"), и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.8Б; (SEQ ID NO:19)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в CH1 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.9А и 9Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.9А; (SEQ ID NO:20)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 иммуноглобулина (Ig) ("CH1 (С) LCTPSR"), и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.9Б; (SEQ ID NO:21)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в СН1 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.10А и 10Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.10А; (SEQ ID NO:22)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 Ig ("CH1 (С) LATPSR"), и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.10Б; (SEQ ID NO:23)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) в СН1 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.11А и 11В изображена нуклеотидная последовательность (фиг.11А; (SEQ ID NO:25)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 Ig ("СН2 (А) LCTPSR"), и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.11Б; (SEQ ID NO:26)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в СН2 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.12А и 12Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.12A; (SEQ ID NO:27)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 Ig ("СН2 (В) LCTPSR"), и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.12Б; (SEQ ID NO:28)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в СН2 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.13А и 13Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.13А; (SEQ ID NO:29)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 Ig ("СН2 (С) LCTPSR"), и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.13Б; (SEQ ID NO:30)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в СН2 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.14А и 14Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.14A; (SEQ ID NO:31)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 Ig ("СН2 (С)"), и кодируемые последовательности аминокислот (фиг.14Б; (SEQ ID NO:32)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) в СН2 подчеркнута.

На фиг.15А и 15Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.15A; (SEQ ID NO:33)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 Ig ("СН2/СН3 LCTPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.15Б; (SEQ ID NO:34)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в СН2/СН3 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.16А и 16Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.16А; (SEQ ID NO:35)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 Ig ("СН2/CH3 LATPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.16Б; (SEQ ID NO:36)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) в СН2/СН3 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.17А и 17Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.17А; (SEQ ID NO:37)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 Ig ("C-концевая LCTPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.17Б; (SEQ ID NO:38)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) на C-концевом участке подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.18А и 18Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.18A; (SEQ ID NO:39)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD22 Ig ("C-концевая LATPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.18Б; (SEQ ID NO:40)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) на C-концевом участке подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.19А и 19Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.19А; (SEQ ID NO:41)), кодирующая человеческую легкую цепь каппа CD22-специфичного Ig, и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.19Б; (SEQ ID NO:42)). Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.20А и 20Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.20А; (SEQ ID NO:43)), кодирующая меченую альдегидом легкую цепь каппа анти-CD22 Ig, и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.20Б; (SEQ ID NO:44)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.21А и 21Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.21A; (SEQ ID NO:45)), кодирующая меченую альдегидом легкую цепь каппа анти-CD22 Ig, и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.21Б; (SEQ ID NO:46)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.22А и 22Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.22А; (SEQ ID NO:47)), кодирующая тяжелую цепь CD19-специфичного антитела IgG1, и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.22Б; (SEQ ID NO:48)). Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.23А и 23Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.23А; (SEQ ID NO:49)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD19 Ig ("CH1 (С) LCTPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.23Б; (SEQ ID NO:50)) (CH1 (С)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в участке СН1 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.24А и 24Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.24А; (SEQ ID NO:51)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD19 Ig ("CH1 (С) LATPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.24Б; (SEQ ID NO:52)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) в участке СН1 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.25А и 25Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.25А; (SEQ ID NO:53)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD19 Ig ("СН2 (В) LCTPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.25Б; (SEQ ID NO:54)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в участке СН2 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.26А и 26Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.26А; (SEQ ID NO:55)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD19 Ig ("СН2 (В) LATPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.26Б; (SEQ ID NO:56)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) в участке СН2 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.27А и 27Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.27A; (SEQ ID NO:57)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD19 Ig ("СН2/СН3 LCTPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.27Б; (SEQ ID NO:58)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) в участке СН2/СН3 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.28А и 28Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.28А; (SEQ ID NO:59)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD19 Ig ("СН2/СН3 LATPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.28Б; (SEQ ID NO:60)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) в участке СН2/СН3 подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.29А и 29Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.29А; (SEQ ID NO:61)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD19 Ig ("C-концевой LCTPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.29Б; (SEQ ID NO:62)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) на C-концевом участке подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.30А и 30Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.30А; (SEQ ID NO:63)), кодирующая меченую альдегидом тяжелую цепь анти-CD19 Ig ("C-концевой LATPSR"), и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.30Б; (SEQ ID NO:64)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) на C-концевом участке подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.31А и 31Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.31A; (SEQ ID NO:65)), кодирующая человеческую легкую цепь каппа CD19-специфичного Ig, и кодируемая последовательность аминокислот (фиг.31Б; (SEQ ID NO:66)). Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.32А и 32Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.32А; (SEQ ID NO:67)), кодирующая меченую альдегидом легкую цепь каппа анти-CD19 Ig, и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.32Б; (SEQ ID NO:68)). Последовательность мотива LCTPSR сульфатазы (SEQ ID NO:17) подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

На фиг.33А и 33Б изображена нуклеотидная последовательность (фиг.33А; (SEQ ID NO:69)), кодирующая меченую альдегидом легкую цепь каппа анти-CD19 Ig, и кодируемые аминокислотные последовательности (фиг.33Б; (SEQ ID NO:70)). Последовательность мотива LATPSR сульфатазы (SEQ ID NO:24) подчеркнута. Конец сигнальной последовательности обозначен "/". Конец вариабельной области и начало константной области обозначены "//".

Определения

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в данном описании равнозначно для обозначения полимерной формы аминокислот любой длины. Если конкретно не указано иное, "полипептид", "пептид" и "белок" могут содержать кодируемые и не-кодируемые генетически аминокислоты, химически или биохимически модифицированные или дериватизированные аминокислоты, и полипептиды, содержащие модифицированный пептидный остов. Термин включает слитые белки, в том числе, не ограничиваясь ими, белки слитые с гетерологичной последовательностью аминокислот, слитые с гетерологичными и гомологичными лидерными последовательностями, белки, которые содержат как минимум один N-концевой остаток метионина (например, чтобы облегчить выработку в рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине); иммунологически меченые белки; и т.п.

В данном описании когда речь идет об иммуноглобулинах "природная последовательность аминокислот" или "родительская последовательность аминокислот" используются равнозначно для обозначения последовательности аминокислот иммуноглобулина до модификации с введением гетерологичной альдегидной метки.

Термин "антитело" используется в самом широком смысле и включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела и полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела, химерные антитела, фрагменты антител (например, Fab фрагменты), и т.п. Антитело способно связываться с целевым антигеном (Janeway, С, Travers, P., Walport, М., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Целевой антиген может содержать один или более сайтов связывания, также называемых эпитопами, которые распознаются определяющими комплементарность участками (CDR), образованными одной или несколькими вариабельными областями антитела.

"Полипептид иммуноглобулина" в данном описании обозначает полипептид, содержащий как минимум константную область легкой цепи полипептида или как минимум константную область тяжелой цепи полипептида.

Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина полипептида иммуноглобулина состоит из каркасного участка (FR), прерывающегося тремя гипервариабельными участками, которые также называют "участками определяющими комплементарность" или "CDR". Определена протяженность каркасного участка и CDR (см. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Каркасный участок антитела, который представляет собой объединенные каркасные участки составляющих легких и тяжелых цепей, служит для позиционирования и выравнивания CDR. CDR прежде всего ответственны за связывание с эпитопом антигена.

Термин "природное антитело" обозначает антитело, в котором тяжелые и легкие цепи антитела продуцированы и спарены иммунной системой многоклеточного организма. Селезенка, лимфатические узлы, костный мозг и сыворотка - это примеры тканей, которые продуцируют природные антитела. Например, антитела, выработанные антитело-продуцирующим клетками, выделенными из организма первого животного, иммунизированного антигеном, - это природные антитела.

В данном описании, нумерация остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина и в легкой цепи иммуноглобулина такая же, как в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), которая явно включена в данное описание путем ссылки.

"Родительский полипептид Ig" - это полипептид, содержащий последовательность аминокислот, в которой отсутствует меченая альдегидом константная область, как описано в данном описании. Родительский полипептид может содержать константную область природной последовательности, или может содержать константную область с ранее существовавшими модификациями последовательности аминокислот (например, вставки, делеции и/или замены).

В контексте полипептида Ig, термин "константная область", который хорошо известен в данной области техники, обозначает C-концевой участок тяжелой цепи Ig, или легкой цепи Ig. Константная область тяжелой цепи Ig содержит домены CH1, СН2 и СН3 (и домены СН4, при этом цепь - это тяжелая цепь μ или ε). В природной тяжелой цепи Ig домены CH1, СН2, СН3 (и, если присутствует, СН4) начинаются сразу после (С-конца) вариабельной области (VH) тяжелой цепи, и длина каждого из них составляет от приблизительно 100 аминокислот до приблизительно 130 аминокислот. В природной легкой цепи Ig, константная область начинается сразу после (C-конца) вариабельной области (VL) легкой цепи, и ее длина составляет от приблизительно 100 аминокислот до 120 аминокислот.

В некоторых вариантах, "функциональный участок Fc" обладает "эффекторной функцией" природной последовательности участка Fc. Примеры "эффекторных функций" включают связывание с C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; супрессию рецепторов на поверхности клетки (например, рецептор В-клеток; BCR), и т.п. Такие эффекторные функции в общем требуют участка Fc для объединения со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела) и могут быть оценены с применением различных анализов, хорошо известных в данной области.

"Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность" и "ADCC" обозначают опосредованную клетками реакцию, в ходе которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcR (например, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и далее вызывают лизис клетки-мишени. Основные клетки для опосредования ADCC, клетки NK, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII.

Термины "рецептор Fc" или "FcR" используются для описания рецептора, который связывается с участком Fc антитела. FcR рассмотрены в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457 92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25 34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330 41 (1995).

Термин "гуманизированное антитело" или "гуманизированный иммуноглобулин" обозначает нечеловеческое (например, мышиное или кроличье) антитело, содержащее одну или более аминокислот (например, в каркасном участке, константной области или CDR), которые заменены соответствующим образом расположенной аминокислотой человеческого антитела. В целом, гуманизированные антитела вызывают сниженную иммунную реакцию в организме хозяина-человека, по сравнению с негуманизированной версией такого же антитела. Антитела могут быть гуманизированы с использованием разнообразных методов, известных из уровня техники, включая, например, пересадку CDR (ЕР 239,400; РСТ публикация WO 91/09967; патенты США №№5,225,539; 5,530,101; и 5,585,089), рекомбинацию поверхностных остатков или перестройку поверхности (ЕР 592,106; ЕР 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)) и перемешивание цепей (патент США №5,565,332). В некоторых вариантах, замены каркаса идентифицируют моделированием взаимодействий CDR и остатков каркаса, чтобы идентифицировать остатки каркаса, важные для связывания с антигеном, и сравнением последовательностей, чтобы идентифицировать необычные остатки каркаса в конкретных положениях (см., например, патент США №5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Дополнительные способы гуманизации антител, предусмотренные для применения в настоящем изобретении, описаны в патентах США №№5,750,078; 5,502,167; 5,705,154; 5,770,403; 5,698,417; 5,693,493; 5,558,864; 4,935,496; и 4,816,567, а также РСТ публикациях WO 98/45331 и WO 98/45332. В конкретных вариантах, антитело субъектов-кроликов может быть гуманизировано согласно способам, сформулированным в US20040086979 и US20050033031. Соответственно, антитела, описанные выше, могут быть гуманизированы с использованием способов, которые хорошо известны в данной области.

Термин "химерные антитела" обозначает антитела, гены легких и тяжелых цепей которых сконструированы, обычно методами генной инженерии, из генов вариабельных и константных областей антител, принадлежащих различным видам. Например, вариабельные сегменты генов моноклонального антитела мыши могут быть присоединены к человеческим константным сегментам, таким как гамма 1 и гамма 3. Пример терапевтического химерного антитела - это гибридный белок, состоящий из вариабельного или антигенсвязывающего домена антитела мыши и константного или эффекторного домена человеческого антитела, хотя могут быть использованы домены других видов млекопитающих.

Под "альдегидной меткой" или "альд-меткой" подразумевается последовательность аминокислот, которая содержит происходящую от мотива сульфатазы последовательность аминокислот, которую можно модифицировать, или которая модифицирована формилглицин-образующим ферментом (FGE) таким образом, чтобы она содержала остаток 2-формилглицина (здесь и в дальнейшем "FGly"). Остаток FGly, образуемый FGE, в литературе часто носит название "формилглицина". Иначе говоря, термин "альдегидная метка" используется в данном описании для обозначения последовательности аминокислот, содержащей "не модифицированный" мотив сульфатазы (т.е. мотив сульфатазы, в котором остатки цистеина или серина не модифицированы FGE с образованием FGly, но способны быть модифицированными), а также последовательности аминокислот, содержащей "модифицированный" мотив сульфатазы (т.е. мотив сульфатазы, в котором остаток цистеина или серина модифицирован FGE с образованием FGly).

"Модификация" в контексте воздействия формилглицин-образующего фермента (FGE) на мотив сульфатазы обозначает биохимическую модификацию остатка цистеина или серина в мотиве сульфатазы до остатка формилглицина (FGly) (например, Cys до FGly или Ser до FGly).

"Генетически кодируемый" в отношении последовательности аминокислот полипептида, пептида или белка означает, что последовательность аминокислот состоит из остатков аминокислот, которые могут быть продуцированы транскрипцией и трансляцией нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность аминокислот, при этом транскрипция и/или трансляция может происходить в клетке или в бесклеточной системе транскрипции/трансляции in vitro.

Термин "контрольная последовательность" обозначает последовательности ДНК, которые способствуют экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретной системе экспрессии, например клетке млекопитающего, бактериальной клетке, бесклеточной системе синтеза, и т.п. Контрольные последовательности, подходящие для прокариотических систем, включают, например, промотор, необязательную последовательность оператора, и сайт связывания с рибосомой. В эукариотических клеточных системах могут использоваться промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота "функционально связана", когда она расположена в функциональном отношении с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК пре-последовательности или лидера секреции функционально связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется, как белок-предшественник, который участвует в секреции полипептидов; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания с рибосомой функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, чтобы способствовать инициации трансляции. В общем, "функционально связанный" означает, что связываемые последовательности ДНК являются смежными, и, в случае лидера секреции, являются смежными и находятся в пределах рамки считывания. Связь обеспечивается лигированием или посредством реакций амплификации. Синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры могут применяться для связи последовательностей в соответствии с обычной практикой.

Термин "кассета экспрессии" в данном описании обозначает сегмент нуклеиновой кислоты, обычно ДНК, который может быть вставлен в нуклеиновую кислоту (например, путем использования рестрикционных сайтов, совместимых с лигированием в целевую конструкцию или гомологичной рекомбинацией в целевую конструкцию или в геном клетки-хозяина). В целом, сегмент нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид, который кодирует целевой полипептид (например, белок меченого альдегидом Ig), и кассета и рестрикционные сайты сконструированы таким образом, чтобы способствовать вставке кассеты в соответствующую рамку считывания для транскрипции и трансляции. Кассеты экспрессии могут также содержать элементы, которые способствуют экспрессии полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид в клетке-хозяине. Такие элементы могут включать, не ограничиваясь ими, промотор, минимальный промотор, энхансер, элемент ответа, терминаторную последовательность, последовательность полиаденилирования, и т.п.

В данном описании термин "выделенный" используется для описания целевого соединения, которое находится в окружении, отличном от того, в котором соединение встречается в природе. Подразумевается, что "выделенный" включает соединения, которые находятся в образцах, в существенной мере обогащенных целевым соединением и/или в которых целевое соединение частично или в существенной мере очищено.

В данном описании термин "в существенной мере очищенный" обозначает соединение, которое извлечено из его природного окружения и как минимум на 60% свободно, как минимум на 75% свободно, как минимум на 80% свободно, как минимум на 85% свободно, как минимум на 90% свободно, как минимум на 95% свободно, как минимум на 98% свободно, или более чем на 98% свободно от других компонентов, с которыми оно связано в природе.

Термин "физиологические условия" предназначен для включения условий, совместимых с живыми клетками, например преимущественно водные условия с температурой, значением рН, содержанием соли, и т.п., которые совместимы с живыми клетками.

Под "реакционно-способным партнером" подразумевается молекула или молекулярная группа, которая специфично реагирует с другим реакционно-способным партнером, с образованием продукта реакции. Примеры реакционно-способных партнеров включают цистеин или серин мотива сульфатазы и FGE, которые реагируют с образованием продукта реакции в форме модифицированной альдегидной метки, содержащего в мотиве FGly вместо цистеина или серина. Другие примеры реакционно-способных партнеров включают альдегид формилглицинового остатка (FGly) модифицированной альдегидной метки и "реакционно-способный партнер, способный реагировать с альдегидом", который содержит способную реагировать с альдегидом группу и целевую группу, и который реагирует с образованием продукта реакции в форме меченого модифицированным альдегидом полипептида, содержащего целевую группу, конъюгированную с модифицированным полипептидом через модифицированный остаток FGly.

"N-Конец" обозначает концевой аминокислотный остаток полипептида, содержащий свободную аминогруппу, при этом аминогруппа в не-N-концевых остатках аминокислот в норме образует часть ковалентного остова полипептида.

"С-Конец" обозначает концевой аминокислотный остаток полипептида, содержащий свободную карбоксигруппу, при этом карбоксигруппа в не-С-концевых остатках аминокислот в норме образует часть ковалентного остов полипептида.

"Внутренний сайт" в связи с полипептидом или аминокислотной последовательностью полипептида обозначает участок полипептида, который не расположен на N-конце или С-конце.

Перед тем, как настоящее изобретение будет описано далее, следует понимать, что данное изобретение не ограничивается описанными конкретными вариантами, поскольку они, конечно, могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном описании, применяется только с целью описания конкретных вариантов, и не предназначена для целей ограничения, поскольку контекст настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Если предлагается интервал значений, следует понимать, что, если контекст явно не диктует иное, каждое промежуточное значение, до десятого знака нижнего предела, между верхним и нижним пределом данного интервала, и любое другое заявленное и промежуточное значение в указанном интервале, находятся в пределах изобретения. Верхние и нижние пределы таких меньших интервалов могут независимо входить в еще меньшие интервалы, и также находятся в пределах изобретения, включая какой-либо конкретно исключенный предел в указанном интервале. Если заявленный интервал включает один или оба предела, интервалы, исключающие один или оба из включенных таким образом пределов, также включены в изобретение.

Следует понимать, что некоторые признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов, также могут быть предложены в комбинации в едином варианте. С другой стороны, различные признаки изобретения, которые, для краткости, описаны в контексте единого варианта, также могут быть предложены отдельно или в любой подходящей подкомбинации. Все комбинации вариантов, имеющих отношение к изобретению, конкретно охватываются настоящим изобретением и раскрыты в данном описании точно так же, как если бы каждая и всякая комбинация была раскрыта отдельно и явно, до такой степени, что такие комбинации охватывают предмет изобретения, т.е. например, соединения, которые являются устойчивыми соединениями (т.е. соединения, которые могут быть получены, выделены, охарактеризованы и проверены на биологическую активность). Кроме того, все подкомбинации различных вариантов и их элементов (например, элементы химических групп, перечисленных в вариантах, описывающих такие переменные) также конкретно охватываются настоящим изобретением и раскрыты в данном описании точно так же, как если бы каждая и всякая такая подкомбинация была раскрыта отдельно и явно в данном описании.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое же значение, какое обычно им придает средний специалист в данной области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном описании, могут также использоваться в практике или проверке настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны в данном изобретении. Все публикации, упомянутые в данном описании, включены в данное описание путем ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми цитируются публикации.

Следует отметить, что в данном описании и прилагаемой формуле изобретения слова, употребляемые в единственном числе, также включают и множественное число, если только контекст явно не диктует иное. Поэтому, например, "меченый альдегидом полипептид Ig" включает множественное число таких полипептидов, и "конъюгированный с лекарственным средством полипептид Ig" включает ссылку на один или более конъюгированных с лекарственным средством полипептидов Ig и их эквиваленты, известные квалифицированным специалистам в данной области, и т.д. Кроме того, отмечается, что пункты формулы могут быть сформулированы таким образом, чтобы исключить любой необязательный элемент. Таким образом, данное утверждение предназначено служить предшествующей основой для использования такой исключающей терминологии как "исключительно", "только" и подобной, в связи с заявлением элементов пункта формулы, или использования "отрицательного" ограничения.

Подразумевается, что некоторые признаки изобретения, которые, для ясности, описаны в контексте отдельных вариантов, также могут быть предложены в комбинации в едином варианте. С другой стороны, различные признаки изобретения, которые, для краткости, описаны в контексте единого варианта, также могут быть предложены отдельно или в любой подходящей подкомбинации.

Публикации, обсуждаемые в данном описании, приведены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничего в данном описании не должно быть интерпретировано как допущение того, что настоящее изобретение не имеет право предшествовать такой публикации благодаря более ранней дате создания настоящего изобретения. В дальнейшем, приведенные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.

Подробное описание изобретения

В данном описании предлагаются. меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина (Ig), которые могут быть модифицированы под действием формилглицин-образующего фермента (FGE), с образованием модифицированного формилглицином (FGly) полипептида Ig. FGly-модифицированный полипептид Ig может быть ковалентно и сайт-специфично связан с целевой группой посредством реакции со способным к реакции с альдегидом реакционно-способным партнером, с образованием конъюгата Ig. Описание также включает способы получения таких меченых альдегидом полипептидов Ig, FGly-модифицированных полипептидов Ig и конъюгатов Ig, а также способы их применения.

Меченые альдегидом полипептиды Ig также могут здесь и в дальнейшем обозначаться как "меченые альд полипептиды Ig", "меченые альд тяжелые цепи Ig " или "меченые альд легкие цепи Ig". Такие меченые альд полипептиды Ig могут быть сайт-специфично модифицированы ковалентно присоединенной целевой молекулой, такой как лекарственное средство (например, пептидное лекарственное средство, низкомолекулярное лекарственное средство, и т.п.), растворимый в воде полимер, обнаруживаемая метка, синтетический пептид, и т.п.

В композициях и способах согласно настоящему описанию используют природный, генетически кодируемый мотив сульфатазы применяемый в качестве метки, в данном описании обозначенного как "альдегидная метка" или "альд метка", чтобы направить сайт-специфическую модификацию полипептида Ig. Сульфатазный мотив альдегидной метки, который основан на мотиве, найденном в активных сайтах сульфатаз, содержит остаток серина или цистеина, который способен к модификации (окислению) с образованием остатка 2-формилглицина (FGly) под действием формилглицин-образующего фермента (FGE), in vivo (например, во время трансляции содержащего метку альд белка в клетке) или in vitro (например, путем обеспечения контакта содержащего метку альд белка с FGE в бесклеточной системе). Альдегидная группа полученного остатка FGly может использоваться в качестве "химической ручки", чтобы способствовать сайт-специфической химической модификации полипептида Ig, и таким образом, сайт-специфическому присоединению целевой группы. Например, пептид, модифицированный таким образом чтобы содержать α-нуклеофилсодержащую группу (например, аминоокси или гидразидную группу) может реагировать с FGly-содержащим полипептидом Ig, с образованием конъюгата, в котором полипептид Ig и пептид связан гидразоновым или оксимным мостиком, соответственно, или посредством альтернативных альдегид-специфических химических реакций, таких как восстановительное аминирование. Реакционно-способность альдегида, таким образом, обеспечивает возможность биортогональной и хемоселективной модификации полипептида Ig и обеспечивает сайт-специфические средства для химической модификации, которая, в свою очередь, может использоваться, чтобы обеспечить сайт-специфическое присоединение целевой группы к конечному конъюгату.

Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина

В настоящем описании предлагаются выделенные меченые альдегидом полипептиды Ig, в том числе меченые альдегидом тяжелые цепи Ig и меченые альдегидом легкие цепи Ig, при этом меченые альдегидом полипептиды Ig, в которых альдегидная метка расположена в пределах или вблизи доступного для растворителя участка петли константной области Ig, при том, что альдегидная метка не расположена на C-конце полипептида Ig.

В целом, альдегидная метка может быть основана на любой последовательности аминокислот, происходящей от мотива сульфатазы (также носит название "сульфатазного домена"), которая способна к модификации формилглицин-образующим ферментом (FGE) таким образом, чтобы содержать формилглицин (FGly). Такие сульфатазные мотивы также могут здесь и в дальнейшем носить название сайта FGE-модификации. Действие FGE направлено специфическим для последовательности образом, в том смысле, что FGE действует на сульфатазный мотив, расположенный в пределах полипептида иммуноглобулина.

В настоящем описании также предлагается библиотека меченых альдегидом полипептидов Ig, которая включает множество (популяцию) членов, при том, что каждый член-полипептид Ig содержит альдегидную метку в ином положении(ях).

В настоящем описании также предлагается меченое альдегидом антитело, которое может содержать: 1) меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig; и меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig; 2) меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig; и константную область легкой цепи Ig, которая не содержит альдегида; или 3) константную область тяжелой цепи Ig, которая не содержит альдегида; и меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig. Целевое меченое альдегидом антитело также содержит домены VH и/или VL и может связываться с антигеном.

Примеры альдегидных меток

Длина минимального мотива сульфатазы в альдегидной метке составляет обычно 5 или 6 остатков аминокислот, обычно не более 6 остатков аминокислот. Длина мотивов сульфатазы, предложенных в полипептиде Ig, составляет как минимум 5 или 6 остатков аминокислот, и может составлять, например, от 5 до 16, 6-16, 5-15, 6-15, 5-14, 6-14, 5-13, 6-13, 5-12, 6-12, 5-11, 6-11, 5-10, 6-10, 5-9, 6-9, 5-8 или 6-8 остатков аминокислот, таким образом, чтобы определить длину мотива сульфатазы менее чем 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 или 7 остатков аминокислот.

В целом, обычно желательно минимизировать степень модификации природной последовательности аминокислот целевого полипептида Ig, чтобы минимизировать количество остатков аминокислот, которые вставлены, удалены, заменены (замещены) или добавлены (например, на N- или С-конце). Минимизация степени модификации последовательности аминокислот целевого полипептида Ig обычно желательна, чтобы минимизировать влияние, которое такие модификации могут оказывать на функции и/или структуру Ig. Поэтому, представляющие особый интерес альдегидные метки включают такие, которые требуют модификации (вставка, добавление, делеция, замена/замещение) менее чем 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 остатков аминокислот в последовательности аминокислот целевого полипептида. Если последовательность аминокислот, природная для полипептида Ig, содержит один или более остатков желательного мотива сульфатазы, общее количество модификаций остатков может быть уменьшено, например, модификацией спецификации сайта остатков аминокислот, обрамляющих природные остатки аминокислот, чтобы обеспечить последовательность мотива сульфатазы.

Следует отметить, что хотя особый интерес представляют такие альдегидные метки, которые содержат хотя бы минимальный мотив сульфатазы (также обозначается как "консенсусный мотив сульфатазы"), также предусматривается, что более длинные альдегидные метки как предусматриваются, так и включены в настоящее описание и могут найти применение в композициях и способах по изобретению. Альдегидные метки могут, таким образом, содержать минимальный мотив сульфатазы длиной 5 или 6 остатков, или могут быть длиннее и содержать минимальный мотив сульфатазы, который может содержать на N- и/или С-концах мотива дополнительные остатки аминокислот. Альдегидные метки, например, длиной 5 или 6 остатков аминокислот, включены, также как и более длинные последовательности аминокислот - более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более остатков аминокислот.

В конкретных вариантах, используемый мотив сульфатазы может быть описан формулой:

причем:

Z1 представляет собой цистеин или серин (который также может быть представлен (C/S));

Z2 представляет собой остаток пролина или аланина (который также может быть представлен как (Р/А));

Z3 представляет собой основную аминокислоту (например, аргинин (R), и может представлять собой лизин (K) или гистидин (Н), обычно лизин), или алифатическую аминокислоту (аланин (А), глицин (G), лейцин (L), валин (V), изолейцин (I) или пролин (Р), обычно A, G, L, V или I;

X1 присутствует или отсутствует и, если присутствует, может представлять собой любую аминокислоту, однако обычно алифатическую аминокислоту, серосодержащую аминокислоту или полярную, незаряженную аминокислоту (т.е. кроме ароматической аминокислоты или заряженной аминокислоты), обычно L, М, V, S или Т, чаще L, М, S или V, с условием, что когда мотив сульфатазы расположен на N-конце целевого полипептида, X1 присутствует; и

Х2 и Х3 независимо могут представлять собой любую аминокислоту, однако обычно алифатическую аминокислоту, полярную, незаряженную аминокислоту или серосодержащую аминокислоту (т.е. кроме ароматической аминокислоты или заряженной аминокислоты), обычно S, Т, А, V, G или С, чаще S, Т, А, V или G.

Таким образом, в настоящем описании предлагаются выделенные меченые альдегидом полипептиды Ig, в том числе меченые альдегидом тяжелые цепи Ig и меченые альдегидом легкие цепи Ig, при том, что меченые альдегидом полипептиды Ig включают последовательность аминокислот константной области Ig, модифицированную таким образом, чтобы обеспечить последовательность как минимум 5 аминокислот формулы X1Z1X2Z2X3Z3, причем:

Z1 - это цистеин или серин;

Z2 - это остаток пролина или аланина;

Z3 представляет собой алифатическую аминокислоту или основную аминокислоту;

X1 присутствует или отсутствует и, если присутствует, то представляет собой любую аминокислоту, при условии, что, если гетерологичный мотив сульфатазы расположен на N-конце полипептида, X1 присутствует;

каждый из Х2 и Х3 независимо представляет собой любую аминокислоту,

при этом последовательность расположена в пределах или вблизи доступного для растворителя участка петли константной области Ig, и последовательность не расположена на C-конце тяжелой цепи Ig.

Следует отметить, что после действия FGE на мотив сульфатазы, Z1 окисляется с образованием остатка формилглицина (FGly). К тому же, как после FGE-опосредованной модификации, так и после реакции с реакционно-способным партнером, содержащим целевую группу, положение FGly в Z1 приведенной выше формулы ковалентно связано с целевой группой (например, обнаруживаемой меткой, растворимым в воде полимером, полипептидом, лекарственным средством, и т.д.).

Если альдегидная метка присутствует в любом положении, кроме N-конца целевого полипептида, X1 в формуле выше может быть предложен как остаток аминокислоты природной последовательности аминокислот целевого полипептида. Таким образом, в некоторых вариантах, и при наличии в любом положении, кроме N-конца целевого полипептида, мотивы сульфатазы представлены формулой:

причем X1 и Х2 независимо могут представлять собой любую аминокислоту, однако обычно алифатическую аминокислоту, полярную, незаряженную аминокислоту или серосодержащую аминокислоту (т.е. кроме ароматической аминокислоты или заряженной аминокислоты), обычно S, Т, А, V или С, чаще S, Т, А или V; и Z3 представляет собой основную аминокислоту (например, аргинин (R), и может представлять собой лизин (K) или гистидин (Н), обычно лизин), или алифатическую аминокислоту (аланин (А), глицин (G), лейцин (L), валин (V), изолейцин (I) или пролин (Р), обычно A, G, L, V или I.

Как отмечалось выше, мотив сульфатазы может содержать дополнительные остатки в одном или обоих из N- и С-концов последовательности, например, таким образом, что альдегидная метка содержит как мотив сульфатазы, так и "вспомогательный мотив". В одном из вариантов, мотив сульфатазы содержит вспомогательный мотив на С-конце (т.е. после остатка аргинина в формуле выше) 1, 2, 3, 4, 5, 6, или все 7 смежных остатков последовательности аминокислот AALLTGR (SEQ ID NO:92), SQLLTGR (SEQ ID NO:93), AAFMTGR (SEQ ID NO:94), AAFLTGR (SEQ ID NO:95), SAFLTGR (SEQ ID NO:96), ASILTGK (SEQ ID NO:97), VSFLTGR (SEQ ID NO:98), ASLLTGL (SEQ ID NO:99), ASILITG (SEQ ID NO:100), VSFLTGR (SEQ ID NO:101), SABVITGR (SEQ ID NO:102), SATVTGR (SEQ ID NO:103), TNLWRG (SEQ ID NO:104), TNLWRGQ (SEQ ID NO:105), TNLCAAS (SEQ ID NO:106), VSLWTGK (SEQ ID NO:107), SMLLTG (SEQ ID NO:108), SMLLTGN (SEQ ID NO:109), SMLLTGT (SEQ ID NO:110), ASFMAGQ (SEQ ID NO:111), или ASLLTGL (SEQ ID NO:112) (см., например, Dierks et al. (1999) EMBO J 18(8):2084-2091), или GSLFTGR (SEQ ID NO:113). Однако такие дополнительные C-концевые остатки аминокислот не требуются для FGE-опосредованной модификации мотива сульфатазы альдегидной метки, и поэтому являются только необязательными и могут быть специфично исключены из альдегидных меток, описанных в данном описании. В некоторых вариантах альдегидная метка не содержит последовательности аминокислот CGPSR(M/A)S (SEQ ID NO:114) или CGPSR(M/A) (SEQ ID NO:115), которая может присутствовать как природная последовательность аминокислот в фосфонатмоноэфирных гидролазах.

Мотив сульфатазы альдегидной метки, в общем, выбирают таким образом, чтобы он был способен к модификации выбранным FGE, например, FGE, присутствующим в клетке-хозяине, в которой экспрессируется меченый альдегидом полипептид, или FGE, который должен контактировать с меченым альдегидом полипептидом в неклеточном способе in vitro.

Выбор альдегидных меток и FGE, которые обеспечивают подходящих реакционно-способных партнеров, чтобы обеспечить образование FGly в альдегидной метке целевого полипептида Ig, могут быть легко доступны, как это очевидно из сведений в данной области. В целом, мотивы сульфатазы, восприимчивые к модификации эукариотическим FGE, содержат цистеин и пролин (т.е. цистеин и пролин в положениях Z1 и Z2, соответственно, в Формуле I выше (например, X1CX2PX3Z3); CX1PX2Z3 в Формуле II выше) и модифицированы "SUMF1-типом" FGE (Cosma et al. Cell 2003, 113, (4), 445-56; Dierks et al. Cell 2003, 113, (4), 435-44). Мотивы сульфатазы, восприимчивые к модификации прокариотическим FGE, содержат цистеин или серин, а также пролин в мотиве сульфатазы (т.е. цистеин или серин в Z1, и пролин в Z2, соответственно, в Формуле I выше (например, X1(C/S)X2PX3Z3); (C/S)X1PX2Z3 в Формуле II выше)) модифицирован "SUMF1-типом" FGE, или "AtsB-типом" FGE, соответственно (Szameit et al. J Biol Chem 1999, 274, (22), 15375-81). Другие мотивы сульфатазы, чувствительные к модификации прокариотическим FGE, содержат цистеин или серин и/или пролин или аланин в мотиве сульфатазы (т.е. цистеин или серин в Z1, и пролин или аланин в Z2, соответственно, в Формуле I или II выше (например, X1CX2PX3R; X1SX2PX2R; X1CX2AX3R; X1SX2AX3R; CX1PX2R; SX1PX2R; CX1AX2R; SX1AX2R, X1CX2PX3Z3; X1SX2PX2Z3; X1CX2AX3Z3; X1SX2AX3Z3; CX1PX2Z3; SX1PX2Z3; CX1AX2Z3; SX1AX2Z3), и чувствительны к модификации, например могут быть модифицированы FGE Firmicutes (например, Clostridium perfringens) (см. Berteau et al. J. Biol. Chem. 2006; 281:22464-22470) или FGE Mycobacterium tuberculosis.

Таким образом, например, если FGE представляет собой FGE эукариот (например, FGE млекопитающих, в том числе FGE человека), мотив сульфатазы обычно представлен формулой:

X1CX2PX3Z3

при этом

X1 может присутствовать или отсутствовать и, если присутствует, может представлять собой любую аминокислоту, однако обычно алифатическую аминокислоту, серосодержащую аминокислоту или полярную, незаряженную аминокислоту (т.е. кроме ароматической аминокислоты или заряженной аминокислоты), обычно L, М, S или V, при условии, что, если мотив сульфатазы расположен на N-конце целевого полипептида, то X1 присутствует;

Х2 и Х3 независимо могут представлять собой любую аминокислоту, однако обычно алифатическую аминокислоту, серосодержащую аминокислоту или полярную, незаряженную аминокислоту (т.е. кроме ароматической аминокислоты или заряженной аминокислоты), обычно S, Т, А, V, G или С, чаще S, Т, А, V или G; и

Z3 представляет собой основную аминокислоту (например, аргинин (R), и может представлять собой лизин (K) или гистидин (Н), обычно лизин), или алифатическую аминокислоту (аланин (А), глицин (G), лейцин (L), валин (V), изолейцин (I) или пролин (Р), обычно A, G, L, V или I.

Конкретные примеры мотивов сульфатазы включают LCTPSR (SEQ ID NO:17), MCTPSR (SEQ ID NO:116), VCTPSR (SEQ ID NO:117), LCSPSR (SEQ ID NO:118), LCAPSR (SEQ ID NO:119), LCVPSR (SEQ ID NO:120), LCGPSR (SEQ ID NO:121), ICTPAR (SEQ ID NO:122), LCTPSK (SEQ ID NO:123), MCTPSK (SEQ ID NO:124), VCTPSK (SEQ ID NO:125), LCSPSK (SEQ ID NO:126), LCAPSK (SEQ ID NO:127), LCVPSK (SEQ ID NO:128), LCGPSK (SEQ ID NO:129), LCTPSA (SEQ ID NO:130), ICTPAA (SEQ ID NO:131), MCTPSA (SEQ ID NO:132), VCTPSA (SEQ ID NO:133), LCSPSA (SEQ ID NO:134), LCAPSA (SEQ ID NO:135), LCVPSA (SEQ ID NO:136) и LCGPSA (SEQ ID NO:137). Другие конкретные мотивы сульфатазы будут очевидными из описания данного изобретения.

Формилглицин-модифицированные полипептиды Ig

Как описано подробнее ниже, модифицированный меченый альдегидом полипептид Ig реагирует с реакционно-способным партнером, содержащим целевую группу, для обеспечения конъюгации целевой группы с остатком FGly модифицированного меченого альдегидом полипептида Ig и образования модифицированного полипептида. Модифицированные полипептиды Ig, содержащие модифицированную альдегидную метку, в общем, описываются как содержащие модифицированный мотив сульфатазы формулы:

при этом

FGly' - остаток формилглицина, содержащий ковалентно присоединенную группу;

Z2 представляет собой пролин или остаток аланина (который также может быть представлен как (Р/А)); Z3 представляет собой основную аминокислоту (например, аргинин (R), и может представлять собой лизин (K) или гистидин (Н), обычно лизин), или алифатическую аминокислоту (аланин (А), глицин (G), лейцин (L), валин (V), изолейцин (I) или пролин (Р), обычно A, G, L, V или I;

X1 может присутствовать или отсутствовать и, если присутствует, может представлять собой любую аминокислоту, однако обычно алифатическую аминокислоту, серосодержащую аминокислоту или полярную, незаряженную аминокислоту (т.е. кроме ароматической аминокислоты или заряженной аминокислоты), обычно L, М, V, S или Т, чаще L, М или V, с условием, что когда мотив сульфатазы расположен на N-конце целевого полипептида, X1 присутствует; и

Х2 и Х3 независимо могут представлять собой любую аминокислоту, однако обычно алифатическую аминокислоту, серосодержащую аминокислоту или полярную, незаряженную аминокислоту (т.е. кроме ароматической аминокислоты или заряженной аминокислоты), обычно S, Т, А, V, G или С, чаще S, Т, А, V или G.

Таким образом, в настоящем описании предлагается полипептид Ig, модифицированный таким образом, чтобы включить формилглициновую группу, при этом полипептид Ig содержит FGly-модифицированный мотив сульфатазы формулы:

X1(FGly)X2Z2X3Z3

причем:

X1 присутствует или отсутствует и, если присутствует, является любой аминокислотой, с условием, что когда мотив сульфатазы расположен на N-конце полипептида, то X1 присутствует;

каждый из Х2 и Х3 независимо представляет собой любую аминокислоту; и

Z3 является основной аминокислотой; и

при том, что FGly-модифицированный полипептид Ig представляет группу FGly на доступной для растворителя поверхности, когда он находится в свернутом состоянии.

В настоящем описании также предлагается библиотека FGly-модифицированных полипептидов Ig, причем библиотека включает множество (популяцию) членов, при том, что каждый член-FGly-модифицированный полипептид Ig содержит FGly-модифицированную альдегидную метку, и при этом каждый член-FGly-модифицированный полипептид Ig содержит альдегидную метку в ином положении(ях). На фиг.2 приведен пример схемы создания библиотеки FGly-модифицированных полипептидов Ig, в которой каждый член-полипептид Ig содержит альдегидную метку в ином положении. На фиг.2 показано прикрепление лекарственного средства к FGly-модифицированным полипептидам.

В настоящем описании предлагается FGly-модифицированное антитело, при этом FGly-модифицированное антитело может содержать: 1) FGly-модифицированную константную область тяжелой цепи Ig; и FGly-модифицированную константную область легкой цепи Ig; 2) FGly-модифицированную константную область тяжелой цепи Ig и константную область легкой цепи Ig, которая не модифицирована FGly; или 3) константную область тяжелой цепи Ig, которая не модифицирована FGly, и FGly-модифицированную константную область легкой цепи Ig. Целевое FGly-модифицированное антитело также содержит домены VH и/или VL и может связываться с антигеном.

Конкретные примеры модифицированных мотивов сульфатазы включают L(FGly)TPSR (SEQ ID NO:138), M(FGly)TPSR (SEQ ID NO:139), V(FGly)TPSR (SEQ ID NO:140), L(FGly)SPSR (SEQ ID NO:141), L(FGly)APSR (SEQ ID NO:142), L(FGly)VPSR (SEQ ID NO:143) и L(FGly)GPSR (SEQ ID NO:144), I(FGly)TPAR (SEQ ID NO:145), L(FGly)TPSK (SEQ ID NO:146), M(FGly)TPSK (SEQ ID NO:147), V(FGly)TPSK (SEQ ID NO:148), L(FGly)SPSK (SEQ ID NO:149), L(FGly)APSK (SEQ ID NO:150), L(FGly)VPSK (SEQ ID NO:151), L(FGly)GPSK (SEQ ID NO:152), L(FGly)TPSA (SEQ ID NO:152), M(FGly)TPSA (SEQ ID NO:153), V(FGly)TPSA (SEQ ID NO:154), L(FGly)SPSA (SEQ ID NO:155), L(FGly)APSA (SEQ ID NO:156), L(FGly)VPSA (SEQ ID NO:157) и L(FGly)GPSA (SEQ ID NO:158).

Как описано более подробно ниже, целевая группа может представлять собой любую из множества групп, таких как растворимый в воде полимер, обнаруживаемая метка, лекарственное средство или группа для иммобилизации полипептида Ig в мембране или на поверхности. Как очевидно из приведенного выше обсуждения меченых альдегидом полипептидов Ig, модифицированный мотив сульфатазы модифицированного полипептида может быть расположен в любом желательном положении полипептида. Таким образом, в настоящем описании предлагается, например, модифицированный полипептид, содержащий модифицированный мотив сульфатазы, расположенный в положении посттрансляционной модификации родительского полипептида (т.е. если целевой полипептид модифицирован таким образом, чтобы обеспечить альдегидную метку в положении посттрансляционной модификации, продуцированный позже модифицированный полипептид будет содержать группу в положении, соответствующем данному положению посттрансляционной модификации в родительском полипептиде). Например, модифицированный полипептид может быть продуцирован таким образом, чтобы содержать ковалентно связанный, растворимый в воде полимер в положении, соответствующем сайту, на котором гликозилирование обычно происходило бы в целевом родительском полипептиде. Таким образом, например, может быть продуцирован ПЭГилированный полипептид, содержащий группу ПЭГ, имеющую такое же или приблизительно такое же расположение, какое остатки сахаров занимали бы в родительском полипептиде природного происхождения. Также, если целевой родительский полипептид сконструирован таким образом, чтобы содержать одно или более неприродных положений посттрансляционной модификации, модифицированный полипептид может содержать ковалентно присоединенные растворимые в воде полимеры в одном или более положений модифицированного полипептида, соответствующих таким неприродным положениям посттрансляционной модификации в родительском полипептиде.

Модификация целевого полипептида Ig для введения альдегидной метки

Модификация целевого полипептида Ig для введения одной или более альдегидных меток может быть достигнута с использованием рекомбинантных молекулярных методов генной инженерии, чтобы получить нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой меченый альдегидом полипептид Ig. Такие способы хорошо известны в данной области, и включают способы клонирования, способы сайт-специфической мутации, и т.п. (см., например, Sambrook et al. в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); "Current Protocols in Molecular Biology" (ред., Ausubel et al.; Greene Publishing Associates, Inc. и John Wiley & Sons, Inc. 1990 с дополнениями).

Тяжелые и легкие цепи целевого иммуноглобулина

Как обсуждалось выше, в настоящем описании предлагаются меченые альдегидом полипептиды Ig, FGly-модифицированные меченые альдегидом полипептиды Ig и конъюгаты Ig. Полипептиды Ig, используемые для создания меченого альдегидом полипептида Ig, FGly-модифицированного меченого альдегидом полипептида Ig или конъюгатов Ig по настоящему описанию, включают как минимум константную область Ig, например константную область тяжелой цепи Ig (например, как минимум домен СН1; как минимум домен СН1 и СН2; домен CH1, СН2 и СН3; или домен CH1, СН2, СН3 и СН4) или константную область легкой цепи Ig. Такие полипептиды Ig здесь и в дальнейшем называют "целевыми полипептидами Ig".

Целевой полипептид Ig может содержать последовательность аминокислот, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную непрерывному тяжу от приблизительно 300 аминокислот до приблизительно 330 аминокислот аминокислотной последовательности тяжелой цепи константной области, изображенного на фиг.1Б. Например, целевой полипептид Ig может содержать последовательность аминокислот, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичную непрерывному тяжу, приведенному в SEQ ID NO:2, длиной от приблизительно 300 аминокислот до приблизительно 330 аминокислот.

Целевой полипептид Ig может содержать последовательность аминокислот, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичную последовательности аминокислот непрерывного тяжа длиной от приблизительно 200 аминокислот до приблизительно 233 аминокислот, или от приблизительно 200 аминокислот до приблизительно 236 аминокислот, аминокислотной последовательности константной области легкой цепи, изображенной на фиг.1В. Например, целевой полипептид Ig может содержать последовательность аминокислот, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичную последовательности аминокислот непрерывного тяжа длиной от приблизительно 200 аминокислот до приблизительно 236 аминокислот аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1.

Как отмечалось выше, целевой полипептид Ig, в общем, содержит как минимум константную область тяжелой цепи Ig или константную область легкой цепи Ig, и может дополнительно содержать вариабельную область Ig (например, область VL и/или область VH). Константные области тяжелой цепи Ig включают константные области любого изотипа тяжелой цепи Ig, неприродные константные области тяжелой цепи Ig (в том числе консенсусные константные области тяжелой цепи Ig). Константный участок Ig может быть модифицирован таким образом, чтобы содержать альдегидную метку, при том, что в альдегидной метке присутствует или вблизи нее расположен доступный для растворителя участок петли константной области Ig.

Константная область Ig может быть модифицирована вставкой и/или заменой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот, или более чем 16 аминокислот, чтобы обеспечить аминокислотную последовательность мотива сульфатазы, как изложено выше.

В некоторых случаях, меченый альдегидом полипептид Ig по настоящему описанию содержит меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig (например, как минимум домен СН1; как минимум домен СН1 и СН2; домен CH1, СН2 и СН3; или домен CH1, СН2, СН3 и СН4). Меченая альдегидом константная область тяжелой цепи Ig может содержать последовательности константной области тяжелой цепи изотипа IgA, IgM, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или любого его аллотипического варианта, например последовательности константной области тяжелой цепи человека или последовательности константной области тяжелой цепи мыши, гибридную константную область тяжелой цепи, синтетическую константную область тяжелой цепи, или консенсусную последовательность константной области тяжелой цепи, и т.п., модифицированные таким образом, чтобы содержать как минимум один мотив сульфатазы, который может быть модифицирован FGE с образованием FGly-модифицированного полипептида Ig. Аллотипические варианты тяжелых цепей Ig известны в данной области. См., например, Jefferis and Lefranc (2009) MAbs 1:4.

В некоторых случаях, меченый альдегидом полипептид Ig по настоящему описанию содержит меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig. Меченая альдегидом константная область легкой цепи Ig может содержать последовательности константной области легкой цепи каппа, легкой цепи лямбда, например константные области легкой цепи каппа или лямбда человека, гибридную константную область легкой цепи, синтетическую константную область легкой цепи, или консенсусную последовательность константной области легкой цепи, и т.п., модифицированные таким образом, чтобы содержать как минимум один мотив сульфатазы, который может быть модифицирован FGE с образованием FGly-модифицированного полипептида Ig. Примеры константных областей включают человеческие области гамма 1 и гамма 3. За исключением мотива сульфатазы, модифицированная константная область может содержать последовательность аминокислот дикого типа, или она может содержать последовательность аминокислот, которая как минимум на 70% идентична (например, как минимум на 80%, как минимум на 90% или как минимум на 95% идентична) последовательности аминокислот дикого типа.

Как отмечается выше, выделенный меченый альдегидом полипептид Ig по настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот константной области Ig, модифицированную таким образом, чтобы обеспечить последовательность мотива сульфатазы длиной как минимум 5 аминокислот описанной выше формулы, причем последовательность расположена в пределах или вблизи доступного для растворителя участка петли константной области Ig полипептида. В некоторых вариантах мотив сульфатазы расположен в положении, отличающемся или комплементарном по отношению к С-концу тяжелой цепи полипептида Ig.

Доступная для растворителя петля антитела может быть идентифицирована с помощью молекулярного моделирования или сравнения с известной структурой антитела. Относительная доступность остатков аминокислот может также быть вычислена с применением способа DSSP (Dictionary of Secondary Structure in Proteins; Kabsch and Sander 1983 Biopolymers 22:2577-637), и доступный для растворителя поверхностный участок аминокислот может быть вычислен на основании 3-мерной модели антитела, с использованием известных в данной области алгоритмов (например, Connolly, J. Appl. Cryst. 16, 548 (1983) и Lee and Richards, J. Mol. Biol. 55, 379 (1971), оба из которых включены в данном описание путем ссылки).

Как отмечается выше, выделенный меченый альдегидом полипептид Ig может содержать константную область тяжелой цепи, модифицированную таким образом, чтобы содержать мотив сульфатазы, как изложено выше, при этом мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи поверхностно-доступного участка петли константной области тяжелой цепи полипептида Ig. Иллюстративные примеры поверхностно-доступных участков петли константной области тяжелой цепи представлены на фиг.1А и 1Б.

В некоторых случаях, целевой иммуноглобулин модифицирован таким образом, чтобы включить мотив сульфатазы, как изложено выше, причем мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи участка константной области тяжелой цепи IgG1. соответствующего одному или более из: 1) аминокислот 122-127; 2) аминокислот 137-143; 3) аминокислот 155-158; 4) аминокислот 163-170; 5) аминокислот 163-183; 6) аминокислот 179-183; 7) аминокислот 190-192; 8) аминокислот 200-202; 9) аминокислот 199-202; 10) аминокислот 208-212; 11) аминокислот 220-241; 12) аминокислот 247-251; 13) аминокислот 257-261; 14) аминокислот 269-277; 15) аминокислот 271-277; 16) аминокислот 284-285; 17) аминокислот 284-292; 18) аминокислот 289-291; 19) аминокислот 299-303; 20) аминокислот 309-313; 21) аминокислот 320-322; 22) аминокислот 329-335; 23) аминокислот 341-349; 24) аминокислот 342-348; 25) аминокислот 356-365; 26) аминокислот 377-381; 27) аминокислот 388-394; 28) аминокислот 398-407; 29) аминокислот 433-451; и 30) аминокислот 446-451; причем нумерация аминокислот основана на нумерации аминокислот человеческого IgG1, как изображено на фиг.1Б.

Примеры поверхностно-доступных участков петли тяжелой цепи IgG1 включают: 1) ASTKGP (SEQ ID NO:71); 2) KSTSGGT (SEQ ID NO:72); 3) PEPV (SEQ ID NO:73); 4) NSGALTSG (SEQ ID NO:202); 5) NSGALTSGVHTFPAVLQSSGL (SEQ ID NO:74); 6) QSSGL (SEQ ID NO:227); 7) VTV; 8) QTY; 9) TQTY (SEQ ID NO:75); 10) HKPSN (SEQ ID NO:76); 11) EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:77); 12) FPPKP (SEQ ID NO:78); 13) ISRTP (SEQ ID NO:79); 14) DVSHEDPEV (SEQ ID NO:80); 15) SHEDPEV (SEQ ID NO:223; 16) DG; 17) DGVEVHNAK (SEQ ID NO:81); 18) HNA; 19) QYNST (SEQ ID NO:82); 20) VLTVL (SEQ ID NO:83); 21) GKE; 22) NKALPAP (SEQ ID NO:84); 23) SKAKGQPRE (SEQ ID NO:85); 24) KAKGQPR (SEQ ID NO:206); 25) PPSRKELTKN (SEQ ID NO:86); 26) YPSDI (SEQ ID NO:87); 27) NGQPENN (SEQ ID NO:88); 28) TPPVLDSDGS (SEQ ID NO:89); 29) HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:90); и 30) SLSPGK (SEQ ID NO:175), как показано на фиг.1А и 1Б.

В некоторых случаях, целевой иммуноглобулин модифицирован таким образом, чтобы содержать мотив сульфатазы, как изложено выше, при том, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи участка константной области тяжелой цепи IgG2, соответствующего одному или более из: 1) аминокислот 1-6; 2) аминокислот 13-24; 3) аминокислот 33-37; 4) аминокислот 43-54; 5) аминокислот 58-63; 6) аминокислот 69-71; 7) аминокислот 78-80; 8) 87-89; 9) аминокислот 95-96; 10) 114-118; 11) 122-126; 12) 134-136; 13) 144-152; 14) 159-167; 15) 175-176; 16) 184-188; 17) 195-197; 18) 204-210; 19) 216-224; 20) 231-233; 21) 237-241; 22) 252-256; 23) 263-269; 24) 273-282; 25) аминокислот 299-302; причем нумерация аминокислот основана на нумерации последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:4 (IgG2 человека; также показанный на фиг.1Б).

Примеры поверхностно-доступных участков петли тяжелой цепи IgG2 включают: 1) ASTKGP (SEQ ID NO:71); 2) PCSRSTSESTAA (SEQ ID NO:91); 3) FPEPV (SEQ ID NO:168); 4) SGALTSGVHTFP (SEQ ID NO:159); 5) QSSGLY (SEQ ID NO:160); 6) VTV; 7) TQT; 8) HKP; 9) DK; 10) VAGPS (SEQ ID NO:161); 11) FPPKP (SEQ ID NO:78); 12) RTP; 13) DVSHEDPEV (SEQ ID NO:80); 14) DGVEVHNAK (SEQ ID NO:81); 15) FN; 16) VLTW (SEQ ID NO:162); 17) GKE; 18) NKGLPAP (SEQ ID NO:163); 19) SKTKGQPRE (SEQ ID NO:164); 20) PPS; 21) MTKNQ (SEQ ID NO:165); 22) YPSDI (SEQ ID NO:87); 23) NGQPENN (SEQ ID NO:88); 24) TPPMLDSDGS (SEQ ID NO:166); 25) GNVF (SEQ ID NO:182); и 26) HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:90), как показано на фиг.1Б.

В некоторых случаях, целевой иммуноглобулин модифицирован таким образом, чтобы содержать мотив сульфатазы, как изложено выше, при том, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи участка константной области тяжелой цепи IgG3, соответствующего одному или более из: 1) аминокислот 1-6; 2) аминокислот 13-22; 3) аминокислот 33-37; 4) аминокислот 43-61; 5) аминокислоты 71; 6) аминокислот 78-80; 7) 87-91; 8) аминокислот 97-106; 9) 111-115; 10) 147-167; 11) 173-177; 16) 185-187; 13) 195-203; 14) 210-218; 15) 226-227; 16) 238-239; 17) 246-248; 18) 255-261; 19) 267-275; 20) 282-291; 21) аминокислот 303-307; 22) аминокислот 313-320; 23) аминокислот 324-333; 24) аминокислот 350-352; 25) аминокислот 359-365; и 26) аминокислот 372-377; причем нумерация аминокислот основана на нумерации последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:3 (IgG3 человека; также показанный на фиг.1Б).

Примеры поверхностно-доступных участков петли тяжелой цепи IgG3 включают: 1) ASTKGP (SEQ ID NO:71); 2) PCSRSTSGGT (SEQ ID NO:167); 3) FPEPV (SEQ ID NO:168); 4) SGALTSGVHTFPAVLQSSG (SEQ ID NO:169); 5) V; 6) TQT; 7) HKPSN (SEQ ID NO:76); 8) RVELKTPLGD (SEQ ID NO:170); 9) CPRCPKP (SEQ ID NO:171); 10) PKSCDTPPPCPRCPAPELLGG (SEQ ID NO:229); 11) FPPKP (SEQ ID NO:78); 12) RTP; 13) DVSHEDPEV (SEQ ID NO:80); 14) DGVEVHNAK (SEQ ID NO:81); 15) YN; 16) VL; 17) GKE; 18) NKALPAP (SEQ ID NO:84); 19) SKTKGQPRE (SEQ ID NO:164); 20) PPSREEMTKN (SEQ ID NO:172); 21) YPSDI (SEQ ID NO:87); 22) SSGQPENN (SEQ ID NO:173); 23) TPPMLDSDGS (SEQ ID NO:166); 24) GNI; 25) HEALHNR (SEQ ID NO:174); и 26) SLSPGK (SEQ ID NO:175), как показано на фиг.1Б.

В некоторых случаях, целевой иммуноглобулин модифицирован таким образом, чтобы содержать мотив сульфатазы, как изложено выше, при том, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи участка константной области тяжелой цепи IgG4, соответствующего одному или более из: 1) аминокислот 1-5; 2) аминокислот 12-23; 3) аминокислот 32-36; 4) аминокислот 42-53; 5) аминокислот 57-62; 6) аминокислот 68-70; 7) аминокислот 77-79; 8) аминокислот 86-88; 9) аминокислот 94-95; 10) аминокислот 101-102; 11) аминокислот 108-118; 12) аминокислот 122-126; 13) аминокислот 134-136; 14) аминокислот 144-152; 15) аминокислот 159-167; 16) аминокислот 175-176; 17) аминокислот 185-186; 18) аминокислот 196-198; 19) аминокислот 205-211; 20) аминокислот 217-226; 21) аминокислот 232-241; 22) аминокислот 253-257; 23) аминокислот 264-265; 24) 269-270; 25) аминокислот 274-283; 26) аминокислот 300-303; 27) аминокислот 399-417; причем нумерация аминокислот основана на нумерации последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:5 (IgG4 человека; также приведенный на фиг.1Б).

Примеры поверхностно-доступных участков петли тяжелой цепи IgG4 включают 1) STKGP (SEQ ID NO:176); 2) PCSRSTSESTAA (SEQ ID NO:91); 3) FPEPV (SEQ ID NO:168); 4) SGALTSGVHTFP (SEQ ID NO:159); 5) QSSGLY (SEQ ID NO:160); 6) VTV; 7) ТКТ; 8) НКР; 9) DK; 10) YG; 11) CPAPEFLGGPS (SEQ ID NO:177); 12) FPPKP (SEQ ID NO:78); 13) RTP; 14) DVSQEDPEV (SEQ ID NO:178); 15) DGVEVHNAK (SEQ ID NO:81); 16) FN; 17) VL; 18) GKE; 19) NKGLPSS (SEQ ID NO:179); 20) SKAKGQPREP (SEQ ID NO:180); 21) PPSQEEMTKN (SEQ ID NO:181); 22) YPSDI (SEQ ID NO:87); 23) NG; 24) NN; 25) TPPVLDSDGS (SEQ ID NO:89); 26) GNVF (SEQ ID NO:182); и 27) HEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:183), как показано на фиг.1Б.

В некоторых случаях, целевой иммуноглобулин модифицирован таким образом, чтобы содержать мотив сульфатазы, как изложено выше, при том, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи участка константной области тяжелой цепи IgA, соответствующего одному или более из: 1) аминокислот 1-13; 2) аминокислот 17-21; 3) аминокислот 28-32; 4) аминокислот 44-54; 5) аминокислот 60-66; 6) аминокислот 73-76; 7) аминокислот 80-82; 8) аминокислот 90-91; 9) аминокислот 123-125; 10) аминокислот 130-133; 11) аминокислот 138-142; 12) аминокислот 151-158; 13) аминокислот 165-174; 14) аминокислот 181-184; 15) аминокислот 192-195; 16) аминокислоты 199; 17) аминокислот 209-210; 18) аминокислот 222-245; 19) аминокислот 252-256; 20) аминокислот 266-276; 21) аминокислот 293-294; 22) аминокислот 301-304; 23) аминокислот 317-320; 24) аминокислот 329-353; причем нумерация аминокислот основана на нумерации последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:6 (IgA человека; также изображенный на фиг.1Б).

Примеры поверхностно-доступных участков петли тяжелой цепи IgA включают: 1) ASPTSPKVFPLSL (SEQ ID NO:184); 2) QPDGN (SEQ ID NO:185); 3) VQGFFPQEPL (SEQ ID NO:186); 4) SGQGVTARNFP (SEQ ID NO:187); 5) SGDLYTT (SEQ ID NO:188); 6) PATQ (SEQ ID NO:189); 7) GKS; 8) YT; 9) CHP; 10) HRPA (SEQ ID NO:190); 11) LLGSE (SEQ ID NO:191); 12) GLRDASGV (SEQ ID NO:192); 13) SSGKSAVQGP (SEQ ID NO:193); 14) GCYS (SEQ ID NO:194); 15) CAEP (SEQ ID NO:195); 16) РЕ; 17) SGNTFRPEVHLLPPPSEELALNEL (SEQ ID NO:196); 18) ARGFS (SEQ ID NO:197); 19) QGSQELPREKY (SEQ ID NO:198); 20) AV; 21) AAED (SEQ ID NO:199); 22) HEAL (SEQ ID NO:200); и 23) IDRLAGKPTHVNVSWMAEVDGTCY (SEQ ID NO:201), как показано на фиг.1Б.

Мотив сульфатазы может находиться в пределах или быть расположен вблизи одной или нескольких указанных аминокислотных последовательностей таких сайтов модификации тяжелой цепи Ig. Например, полипептид тяжелой цепи Ig может быть модифицирован в одной или нескольких из этих последовательностей аминокислот, чтобы обеспечить мотив сульфатазы, смежный и N-концевой и/или смежный и С-концевой относительно указанных сайтов модификации. Альтернативно или дополнительно, полипептид тяжелой цепи Ig может быть модифицирован в одной или нескольких из указанных последовательностей аминокислот, чтобы обеспечить вставку мотива сульфатазы между любыми двумя остатками сайтов модификации тяжелой цепи Ig. В некоторых вариантах, полипептид тяжелой цепи Ig может быть модифицирован таким образом, чтобы содержать два мотива, которые могут быть смежными относительно друг друга, или которые могут быть разделены одним, двумя, тремя, четырьмя или более (например, от приблизительно 1 до приблизительно 25, от приблизительно 25 до приблизительно 50, или от приблизительно 50 до приблизительно 100, или более аминокислот. Альтернативно или дополнительно, если природная последовательность аминокислот предусматривает один или более остатков аминокислот последовательности мотива сульфатазы, выбранные остатки аминокислот в сайтах модификации последовательности аминокислот тяжелой цепи полипептида Ig могут быть модифицированы таким образом, чтобы обеспечить мотив сульфатазы в сайте модификации.

Последовательность аминокислот поверхностно-доступного участка петли может быть модифицирована таким образом, чтобы обеспечить мотив сульфатазы, при этом модификации могут включать замену и/или вставку. Например, если модификация производится в домене СН1, поверхностно-доступный участок петли может содержать последовательность аминокислот NSGALTSG (SEQ ID NO:202), и меченая альдегидом последовательность может представлять собой, например, NSGALCTPSRG (SEQ ID NO:203), например, в которой остатки "TS" последовательности NSGALTSG (SEQ ID NO:202) заменены на "CTPSR" (SEQ ID NO:204) таким образом, что мотив сульфатазы содержит последовательность LCTPSR (SEQ ID NO:17). В качестве другого примера, если модификация производится в домене СН2, поверхностно-доступный участок петли может содержать последовательность аминокислот NKALPAP (SEQ ID NO:84), и меченая альдегидом последовательность может представлять собой, например, NLCTPSRAP (SEQ ID NO:205), например, в которой остатки "KAL" последовательности NKALPAP (SEQ ID NO:84) заменены на "LCTPSR" (SEQ ID NO:17) таким образом, что мотив сульфатазы содержит последовательность LCTPSR (SEQ ID NO:17). В качестве другого примера, если модификация производится в домене СН2/СН3, поверхностно-доступный участок петли может содержать последовательность аминокислот KAKGQPR (SEQ ID NO:206), и меченая альдегидом последовательность может представлять собой, например, KAKGLCTPSR (SEQ ID NO:207), например, в которой остатки "GQP" последовательности KAKGQPR (SEQ ID NO:206) заменены на "LCTPS" (SEQ ID NO:208) таким образом, что мотив сульфатазы содержит последовательность LCTPSR (SEQ ID NO:17).

Как отмечается выше, выделенный меченый альдегидом полипептид Ig может содержать константную область легкой цепи, модифицированную таким образом, чтобы содержать мотив сульфатазы, как изложено выше, при том, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи поверхностно-доступного участка петли константной области легкой цепи полипептида Ig. Иллюстративные примеры поверхностно-доступных участков петли константной области легкой цепи представлены на фиг.1А и 1В.

В некоторых случаях, целевой иммуноглобулин модифицирован таким образом, чтобы содержать мотив сульфатазы, как изложено выше, при том, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи участка константной области легкой цепи Ig, соответствующего одному или более из: 1) аминокислот 130-135; 2) аминокислот 141-143; 3) аминокислоты 150; 4) аминокислот 162-166; 5) аминокислот 163-166; 6) аминокислот 173-180; 7) аминокислот 186-194; 8) аминокислот 211-212; 9) аминокислот 220-225; 10) аминокислот 233-236; причем нумерация аминокислот основана на нумерации аминокислот легкой цепи каппа человека, как изображено на фиг.1В.

Примеры поверхностно-доступных участков петли легкой цепи Ig (например, легкая цепь каппа человека) включают: 1) RTVAAP (SEQ ID NO:209); 2) PPS; 3) Gly (см., например, Gly в положении 150 последовательности легкой цепи каппа человека, изображенной на фиг.1 В); 4) YPREA (SEQ ID NO:210); 5) PREA (SEQ ID NO:226); 6) DNALQSGN (SEQ ID NO:211); 7) TEQDSKDST (SEQ ID NO:212); 8) НК; 9) HQGLSS (SEQ ID NO:213); и 10) RGEC (SEQ ID NO:214), как показано на фиг.1А и 1В.

Примеры поверхностно-доступных участков петли легкой цепи лямбда Ig включают QPKAAP (SEQ ID NO:215), PPS, NK, DFYPGAV (SEQ ID NO:216), DSSPVKAG (SEQ ID NO:217), TTP, SN, HKS, EG и APTECS (SEQ ID NO:218), как показано на фиг.1B.

В некоторых случаях, целевой иммуноглобулин модифицирован таким образом, чтобы содержать мотив сульфатазы, как изложено выше, при том, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи участка константной области легкой цепи Ig крысы, соответствующего одному или более из: 1) аминокислот 1-6; 2) аминокислот 12-14; 3) аминокислот 121-22; 4) аминокислот 31-37; 5) аминокислот 44-51; 6) аминокислот 55-57; 7) аминокислот 61-62; 8) аминокислот 81-83; 9) аминокислот 91-92; 10) аминокислот 102-105; причем нумерация аминокислот основана на нумерации аминокислот легкой цепи крысы, как указано в SEQ ID NO:10 (и изображено на фиг.1В).

Неограничивающие примеры последовательностей аминокислот меченой альдегидом тяжелой цепи полипептидов IgG1 показаны на фиг.7Б, 8Б, 9Б, 11Б, 12Б, 14Б, 15Б, 17Б, 23Б, 25Б, 27Б и 29Б, с мотивом LCTPSR (SEQ ID NO:17) сульфатазы в домене CH1 (см., например, фиг.7Б, 8Б, 9Б и 23Б), домене СН2 (на фиг.11Б, 12Б, 14Б и 25Б), домене СН2/СН3 (на фиг.15Б и 27Б) и около С-конца (на фиг.17Б и 29Б).

Неограничивающие примеры последовательностей аминокислот меченой альдегидом легкой цепи каппа полипептидов показаны на фиг.20Б и 32Б.

Мотив сульфатазы может быть расположен в пределах или вблизи одной или нескольких указанных последовательностей аминокислот таких сайтов модификации легкой цепи Ig. Например, полипептид легкой цепи Ig может быть модифицирован в одной или нескольких таких последовательностей аминокислот, чтобы обеспечить мотив сульфатазы, смежный и N-концевой и/или смежный и C-концевой относительно таких сайтов модификации. Альтернативно или дополнительно, полипептид легкой цепи Ig может быть модифицирован в одной или нескольких из указанных последовательностей аминокислот, чтобы обеспечить вставку мотива сульфатазы между любыми двумя остатками сайтов модификаций легкой цепи Ig. Альтернативно или дополнительно, если природная последовательность аминокислот предусматривает один или более остатков аминокислот последовательности мотива сульфатазы, выбранные остатки аминокислот сайтов модификации последовательности аминокислот легкой цепи полипептида Ig могут быть модифицированы таким образом, чтобы обеспечить мотив сульфатазы на сайте модификации.

Последовательность аминокислот поверхностно-доступного участка петли модифицирована таким образом, чтобы обеспечить мотив сульфатазы, при этом модификации могут включать замену и/или вставку. Например, если модификация произведена в участке CL, поверхностно-доступный участок петли может содержать последовательность аминокислот DNALQSGN (SEQ ID NO:211), и меченая альдегидом последовательность может представлять собой, например, DNALCTPSRQSGN (SEQ ID NO:219), например, в которой последовательность "CTPSR" (SEQ ID NO:204) вставлена между "DNAL" (SEQ ID NO:220) и последовательностями "QSGN" (SEQ ID NO:221) поверхностно-доступного участка петли, таким образом, что мотив сульфатазы представляет собой LCTPSR (SEQ ID NO:17).

В одном из вариантов, модификация константной области Ig в существенной мере не изменяет функциональных свойств константной области тяжелой цепи. Например, часть Fc (например, домены СН2 и CH3 антител IgA или IgG; и домены СН2, CH3 и СН4 антител IgM или IgE) могут иметь различные свойства связывания и эффекторные функции. Не ограничивающие примеры связывания с Fc и эффекторных функций включают, например, связывание с рецептором Fc (FcR), связывание с C1q и активность в виде антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Модификация константной области Ig с целью введения альдегидной метки, как описано в данном описании, в существенной мере не увеличивает и не уменьшает одну или более из связывания с Fc и любой эффекторной функции тяжелой цепи, например, модификация не увеличивает и не уменьшает связывания с FcR и/или эффекторную функцию более чем на приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5% или приблизительно 10%, по сравнению с родительским полипептидом Ig.

Модификация константной области Ig таким образом, чтобы обеспечить альдегидную метку, как описано в данном описании, в существенной мере не уменьшает сродства связывания с антигеном у антитела, содержащего меченую альдегидом константную область Ig.

Модификация константной области Ig таким образом, чтобы обеспечить альдегидную метку, как описано в данном описании, в существенной мере не снижает выработку полипептида Ig, например, меченый альдегидом полипептид Ig может экспрессироваться в клетке-хозяине и может быть свернут должным образом, чтобы получить функциональный полипептид.

Меченая альдегидом тяжелая цепь Ig может содержать вариабельную область Ig, или может не содержать вариабельной области Ig. Также меченая альдегидом легкая цепь Ig может содержать вариабельную область Ig, или может не содержать вариабельной области Ig. Вариабельные области Ig хорошо известны в данной области, и могут обеспечивать специфичность связывания антигена с полипептидом Ig.

Меченая альдегидом тяжелая цепь Ig может содержать, в дополнение к альдегидной метке, одну или более дополнительных модификаций, например, гликозилирование, и т.п.

В настоящем описании предлагается меченое альдегидом антитело, содержащее тяжелую цепь Ig и легкую цепь Ig, причем тяжелая цепь Ig и/или легкая цепь Ig содержат альдегидную метку. Меченое альдегидом антитело может содержать тяжелую цепь Ig с одной, двумя, тремя или более альдегидными метками; и легкую цепь Ig без альдегидных меток. Меченое альдегидом антитело может содержать тяжелую цепь Ig без альдегидных меток; и легкую цепь Ig с одной, двумя, тремя или более альдегидными метками. Меченое альдегидом антитело может содержать тяжелую цепь Ig с одной, двумя, тремя или более альдегидными метками; и легкую цепь Ig с одной, двумя, тремя или более альдегидными метками.

Меченое альдегидом антитело по настоящему изобретению может обладать любым из множества вариантов специфичности связывания с антигеном. Меченое альдегидом антитело может связываться с любым из множества антигенов, в том числе, например, присутствующим на раковой клетке антигеном; присутствующим на аутоиммунной клетке антигеном; присутствующим на патогенном микроорганизме антигеном; присутствующим на зараженной вирусом клетке антигеном (например, клетка человека, зараженная вирусом иммунодефицита), например, CD4 или gp120; присутствующим на пораженной клетке антигеном; и т.п. Например, меченое альдегидом антитело может связываться с антигеном, как отмечено выше, при том, что антиген присутствует на поверхности клетки.

Например, меченое альдегидом антитело может специфично связываться с присутствующим на раковой клетке антигеном. Неограничивающие примеры антигенов рака, которые могут быть распознаны и связаны (например, специфично связаны) с меченым альдегидом антителом по настоящему изобретению, включают антигены, присутствующие на карциномах, клетках рака предстательной железы, клетках рака молочной железы, клетках рака ободочной и прямой кишки, клетках меланомы, клетках Т-клеточного лейкоза, клетках Т-клеточной лимфомы, клетках В-клеточной лимфомы, клетках неходжкинской лимфомы, и т.п.

Неограничивающие примеры антигенов, присутствующих на конкретных раковых клетках включают, например, СА125, СА15-3, СА19-9, L6, Lewis Y, Lewis X, альфа-фетопротеин, СА 242, плацентарную щелочную фосфатазу, простато-специфический антиген, кислую фосфатазу предстательной железы, эпидермальный фактор роста, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, анти-трансферриновый рецептор, р97, MUC1-KLH, HER2, CEA, gp100, MART1, простато-специфический антиген, человеческий хорионический гонадотропин, рецептор IL-2, EphB2, CD19, CD20, CD22, CD52, CD33, CD38, CD40, муцин, Р21, MPG и онкогенный продукт Neu. В некоторых вариантах антиген представляет собой CD19. В других вариантах антиген представляет собой CD22.

Неограничивающие примеры антител, которые могут быть модифицированы таким образом, чтобы содержать альдегидную метку, как описано в данном описании, включают, не ограничиваясь ими, анти-CD19 антитело и анти-CD22 антитело.

Формилглицин-образующие ферменты (FGE)

Фермент, который в мотиве сульфатазы окисляет цистеин или серин до FGly, здесь и в дальнейшем называется формилглицин-образующим ферментом (FGE). Как обсуждалось выше, "FGE" используется в данном описании для обозначения FGly-образующих ферментов, которые опосредуют модификацию цистеина (С) мотива сульфатазы до FGly, а также FGly-образующих ферментов, которые опосредуют модификацию серина (S) мотива сульфатазы до FGly. Следует отметить, что, в целом, FGly-образующие ферменты, которые в мотиве сульфатазы превращают С в FGly, в литературе обозначают как FGE, и ферменты, которые в мотиве сульфатазы превращают S в FGly, обозначают как Ats-B-подобные. Однако для целей настоящего изобретения "FGE" используется в общем для обозначения обоих видов FGly-образующих ферментов, с пониманием того, что подходящий FGE будет выбран в зависимости от целевого реакционно-способного партнера, содержащим подходящий мотив сульфатазы (т.е. C-содержащий или S-содержащий).

Как доказывается повсеместным присутствием сульфатаз, содержащих FGly на активном сайте, FGE найдены в широком спектре типов клеток, в том числе эукариот и прокариот. Существует как минимум две формы FGE. Эукариотические сульфатазы содержат цистеин в мотиве сульфатазы и модифицируются "SUMF1-типом" FGE (Cosma et al. Cell 2003, 113, (4), 445-56; Dierks et al. Cell 2003, 113, (4), 435-44). FGly-образующий фермент (FGE) кодируется геном SUMF1. Прокариотические сульфатазы могут содержать цистеин или серин в мотиве сульфатазы, и модифицируются "SUMF1-типом" FGE, или "AtsB-типом" FGE, соответственно (Szameit et al. J Biol Chem 1999, 274, (22), 15375-81). Считается, что в эукариотах данная модификация происходит котрансляционно или вскоре после трансляции в эндоплазматическом ретикулуме (ER) (Dierks et al. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(22):11963-8). Без привязки к теории, считается, что в прокариотах FGE SUMF1-типа функционирует в цитозоле, и FGE AtsB-типа функционирует около или в мембране клетки. FGE SUMF2 также описан у вторичноротых (deuterostomia), в том числе у позвоночных и иглокожих (echinodermata) (см., например, Рере et al. (2003) Cell 113, 445-456, Dierks et al. (2003) Cell 113, 435-444; Cosma et al. (2004) Hum. Mutat. 23, 576-581).

В целом, FGE, используемый для содействия модификации находящегося в мотиве сульфатазы альдегидной метки целевого полипептида цистеина или серина в FGly, выбирают в зависимости от присутствующего в альдегидной метка мотива сульфатазы. FGE может быть природным для клетки-хозяина, в которой экспрессируется меченый альдегидом полипептид, или клетка-хозяин может быть генетически модифицирована таким образом, чтобы экспрессировать подходящий FGE. В некоторых вариантах может быть желательным использовать мотив сульфатазы, совместимый с человеческим FGE (например, FGE SUMF1-типа, см., например, Cosma et al. Cell 113, 445-56 (2003); Dierks et al. Cell 113, 435-44 (2003)), и экспрессировать меченый альдегидом белок в человеческой клетке, которая экспрессирует FGE, или в клетке-хозяине, обычно в клетке млекопитающего, генетически модифицированной таким образом, чтобы экспрессировать человеческий FGE.

В целом, FGE для использования в способах, раскрытых в данном описании, может быть получен из природных источников или получен синтетическим путем. Например, подходящий FGE может происходить из биологических источников, которые в природе вырабатывают FGE или которые генетически модифицированы, чтобы экспрессировать рекомбинантный ген, кодирующий FGE. Нуклеиновые кислоты, кодирующие целый ряд FGE, известны в данной области и легко доступны (см., например, Preusser et al. 2005 J. Biol. Chem. 280(15):14900-10 (Epub 2005 Jan 18); Fang et al. 2004 J Biol Chem. 79(15):14570-8 (Epub 2004 Jan 28); Landgrebe et al. Gene. 2003 Oct 16; 316:47-56; Dierks et al. 1998 FEBS Lett. 423(1):61-5; Dierks et al. Cell. 2003 May 16; 113(4):435-44; Cosma et al. (2003 May 16) Cell 113(4):445-56; Baenziger (2003 May 16) Cell 113(4):421-2 (обзор); Dierks et al. Cell. 2005 May 20; 121(4):541-52; Roeser et al. (2006 Jan 3) Proc Natl Acad Sci USA 103(1):81-6; Sardiello et al. (2005 Nov 1) Hum Mol Genet. 14(21):3203-17; WO 2004/072275; WO 2008/036350; патентную публикацию США №2008/0187956; и номер доступа GenBank NM_182760). Соответственно, в данном описании предлагаются рекомбинантные клетки-хозяева, генетически модифицированные таким образом, чтобы экспрессировать FGE, подходящий для использования с альдегидной меткой меченого целевого полипептида. В некоторых вариантах применяемый FGE может представлять собой фермент природного происхождения (может содержать последовательность аминокислот дикого типа). В других вариантах применяемый FGE может иметь неприродное происхождение, т.е. в некоторых случаях может содержать последовательность аминокислот, которая как минимум на 80% идентична, как минимум на 90% идентична или как минимум на 95% идентична последовательности фермента дикого типа. Поскольку FGE изучены структурно и функционально, и доступны последовательности аминокислот из нескольких примеров таких ферментов, то варианты, которые сохраняют ферментную активность, могут быть легко сконструированы.

Если бесклеточный способ применяется для модификации содержащего мотив сульфатазы полипептида, может использоваться выделенный FGE. Любые традиционные методики очистки белка могут применяться для выделения FGE, см., например, Guide to Protein Purification (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Например, лизат может быть получен из клеток, которые вырабатывают целевой FGE, и очищают с использованием ВЭЖХ, эксклюзионной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии, и т.п.

Векторы экспрессии и генетически модифицированные клетки-хозяева

В данном изобретении предлагается нуклеиновая кислота, кодирующая меченые альд полипептиды Ig, а также конструкты и клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту. Такие нуклеиновые кислоты включают последовательность ДНК, содержащую открытую рамку считывания, которая кодирует меченый альдегидом полипептид Ig и, в большинстве вариантов, способна экспрессироваться в подходящих условиях. "Нуклеиновая кислота" включает ДНК, кДНК, мРНК и векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты.

В данном изобретении предлагается рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую меченый альдегидом полипептид Ig, как изложено выше. Рекомбинантная нуклеиновая кислота может содержать:

1) нуклеотидную последовательность, кодирующую меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig (но не вариабельную область тяжелой цепи Ig, т.е. при том, что рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит нуклеотидной последовательности, кодирующей домен Ig VH);

2) нуклеотидную последовательность, кодирующую меченый альдегидом полипептид Ig, причем полипептид Ig содержит домен Ig VH и меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig;

3) нуклеотидную последовательность, кодирующую меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig (но не вариабельную область легкой цепи Ig, при том, что рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит нуклеотидной последовательности, кодирующей домен Ig VL);

4) нуклеотидную последовательность, кодирующую меченый альдегидом полипептид Ig, при том, что полипептид Ig содержит домен Ig VL и меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig;

5) нуклеотидную последовательность, кодирующую меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig (но не вариабельную область тяжелой цепи Ig, при том, что рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит нуклеотидной последовательности, кодирующей домен Ig VH); и нуклеотидную последовательность, кодирующую меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig (но не вариабельную область легкой цепи Ig, при том, что рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит нуклеотидной последовательности, кодирующей домен Ig VL);

6) нуклеотидную последовательность, кодирующую меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig (но не вариабельную область тяжелой цепи Ig, при том, что рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит нуклеотидной последовательности, кодирующей домен Ig VH); и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область легкой цепи Ig (но не вариабельную область легкой цепи Ig, при том, что рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит нуклеотидной последовательности, кодирующей домен Ig VL), причем константная область легкой цепи Ig не содержит альдегидной метки;

7) нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область тяжелой цепи Ig (но не вариабельную область тяжелой цепи Ig, при том, что рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит нуклеотидной последовательности, кодирующей домен Ig VH), причем константная область тяжелой цепи Ig не содержит альдегидной метки; и нуклеотидную последовательность, кодирующую меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig (но не вариабельную область легкой цепи Ig, при том, что рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит нуклеотидной последовательности, кодирующей домен Ig VL);

8) нуклеотидную последовательность, кодирующую первый меченый альдегидом полипептид Ig, при том, что первый меченый альдегидом полипептид Ig содержит домен Ig VH и меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig; и нуклеотидную последовательность, кодирующую второй меченый альдегидом полипептид Ig, при этом второй меченый альдегидом полипептид Ig содержит домен Ig VL и меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig;

9) нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полипептид Ig, при том, что первый полипептид Ig содержит альдегидную метку, при этом первый полипептид Ig содержит домен Ig VH и меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig; и нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полипептид Ig, при этом второй полипептид Ig содержит домен Ig VL и константную область легкой цепи Ig, причем константная область легкой цепи Ig не содержит альдегидной метки; или

10) нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полипептид Ig, при том, что первый полипептид Ig содержит домен Ig VH и константную область тяжелой цепи Ig, при этом константная область тяжелой цепи Ig не содержит альдегидной метки; и нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полипептид Ig, при этом второй полипептид Ig содержит альдегидную метку, причем второй полипептид Ig, содержит домен Ig VL и меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig.

В данном изобретении предлагается рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, как изложено выше, при этом нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид(ы) Ig, функционально связана с промотором. В некоторых вариантах, если целевой рекомбинантный вектор экспрессии кодирует как тяжелые, так и легкие цепи Ig (с вариабельными областями Ig или без них), последовательности, кодирующие тяжелые и легкие цепи, могут быть функционально связаны с одним тем же промотором или с разными промоторами.

Если рекомбинантный вектор экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL), следует понимать, что большое количество аминокислотных последовательностей VH и VL, а также кодирующих их нуклеотидных последовательностей известны в данной области и могут использоваться. См., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).

В тех случаях, когда рекомбинантный вектор экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую или легкую цепь Ig без последовательностей вариабельной области, вектор может содержать сайт встраивания для вариабельной области 5' Ig кодирующей полипептид нуклеотидной последовательности Ig. Например, рекомбинантный вектор экспрессии может содержать, в порядке от 5' к 3':

1) сайт встраивания для нуклеотидной последовательности, кодирующей домен VH; и нуклеотидную последовательность, кодирующую меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig;

2) сайт встраивания для нуклеотидной последовательности, кодирующей домен VL; и нуклеотидную последовательность, кодирующую меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig.

В данном изобретении также предлагается библиотека рекомбинантных векторов экспрессии, которая может включать множество членов-рекомбинантных векторов экспрессии, например:

1) первый рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий, в порядке от 5' к 3', сайт встраивания для нуклеотидной последовательности, кодирующей домен VH; и нуклеотидную последовательность, кодирующую первую меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig, содержащую альдегидную метку в пределах или вблизи первого поверхностно-доступного участка петли;

2) второй рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий, в порядке от 5' к 3', сайт встраивания для нуклеотидной последовательности, кодирующей домен VH; и нуклеотидную последовательность, кодирующую вторую меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig, содержащую альдегидную метку в пределах или вблизи второго поверхностно-доступного участка петли;

3) третий рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий, в порядке от 5' к 3', сайт встраивания для нуклеотидной последовательности, кодирующей домен VH; и нуклеотидную последовательность, кодирующую третью меченую альдегидом константную область тяжелой цепи Ig, содержащую альдегидную метку в пределах или вблизи третьего поверхностно-доступного участка петли;

и их комбинации, причем каждый дополнительный член-рекомбинантный вектор экспрессии может содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие меченые альдегидом полипептиды Ig, содержащие альдегидные метки в пределах или вблизи другого поверхностно-доступного участка петли.

В некоторых случаях, рекомбинантный вектор экспрессии в библиотеке будет также содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Ig, которая может содержать или не содержать вариабельную область, и которая может содержать или не содержать альдегидную метку.

В данном изобретении также предлагается библиотека рекомбинантных векторов экспрессии, которая может включать множество членов-рекомбинантных векторов экспрессии, например:

1) первый рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий, в порядке от 5' к 3', сайт встраивания для нуклеотидной последовательности, кодирующей домен VL; и нуклеотидную последовательность, кодирующую первую меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig, содержащую альдегидную метку в пределах или вблизи первого поверхностно-доступного участка петли;

2) второй рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий в порядке от 5' к 3', сайт встраивания для нуклеотидной последовательности, кодирующей домен VL; и нуклеотидную последовательность, кодирующую вторую меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig, содержащую альдегидную метку в пределах или вблизи второго поверхностно-доступного участка петли;

3) третий рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий, в порядке от 5' к 3', сайт встраивания для нуклеотидной последовательности, кодирующей домен VL; и нуклеотидную последовательность, кодирующую третью меченую альдегидом константную область легкой цепи Ig, содержащую альдегидную метку в пределах или вблизи третьего поверхностно-доступного участка петли;

и их комбинации, при этом каждый дополнительный член-рекомбинантный вектор экспрессии может содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие меченые альдегидом полипептиды Ig, содержащие альдегидные метки в пределах или вблизи другого поверхностно-доступного участка петли.

В некоторых случаях, рекомбинантный вектор экспрессии в библиотеке будет также содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь Ig, которая может содержать или не содержать вариабельную область, и которая может содержать или не содержать альдегидную метку.

На фиг.2 показан пример схемы создания библиотеки меченых альдегидом полипептидов Ig, в которых каждый член-полипептид Ig содержит альдегидную метку в ином положении. Например, "меченая кассета" тяжелой цепи Ig или легкой цепи Ig модифицирована альдегидными метками, которые далее могут быть дополнителнены химически. Такие кассеты могут быть применены для различных Fv с целью получения конъюгата антитела с лекарственным средством.

Нуклеиновые кислоты, предусмотренные в данном описании, могут быть предложены как часть вектора (также называемого конструктом), широкое разнообразие которых известно в данной области, и нет необходимости детально разъяснять здесь их особенности. Примеры векторов включают, не ограничиваясь ими, плазмиды; космиды; вирусные векторы (например, ретровирусные векторы); невирусные векторы; искусственные хромосомы (искусственные хромосомы дрожжей (YAC), ВАС, и т.д.); мини-хромосомы; и т.п. Выбор вектора будет зависеть от множества факторов, таких как вид клетки, в которой желательно разведение, и цели разведения.

Векторы могут поддерживаться внехромосомно клетке-хозяине или могут интегрировать в геном клетки-хозяина. Векторы подробно описываются в многочисленных публикациях, хорошо известных специалисту в данной области, в том числе, например, Short Protocols in Molecular Biology (1999) F. Ausubel, et al., eds., Wiley & Sons. Векторы могут предусматривать экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих целевой полипептид (например, меченый альдегидом полипептид, FGE, и т.п.), могут предусматривать амплификацию целевых нуклеиновых кислот, или то и другое.

Примеры векторов, которые могут применяться, включают, не ограничиваясь ими, полученные от рекомбинантного бактериофага ДНК, плазмидную ДНК или космидную ДНК. Например, могут использоваться плазмидные векторы, такие как pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 и серия векторов М13 mp. Векторы бактериофага могут включать λgt10, λgt11, λgt18-23, λZAP/R и серию векторов бактериофага EMBL. Космидные векторы, которые могут использоваться, включают, не ограничиваясь ими, pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 и серии векторов charomid 9. Альтернативно, могут быть сконструированы рекомбинантные вирусные векторы, в том числе, но не ограничиваясь ими, полученные от вирусов, таких как вирус герпеса, ретровирусы, вирус осповакцины, поксвирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, или вирус бычьей папилломы.

Для экспрессии целевого белка (например, меченого альдегидом полипептида Ig или FGE) может быть использована кассета экспрессии. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий целевую нуклеиновую кислоту. Вектор экспрессии обеспечивает транскрипционную и трансляционную регуляторную последовательность, и может предусматривать индуцибельную или конститутивную экспрессию, при этом кодирующий участок функционально связан с и находится под транскрипционным контролем участка инициации транскрипции и функционально связан с участками терминации транскрипции и трансляции. Такие контрольные области могут быть присущими гену, кодирующему полипептид (например, полипептид Ig или FGE), или могут происходить из экзогенных источников. В целом, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности могут включать, не ограничиваясь ими, последовательности промотора, сайты связывания с рибосомой, транскрипционные старт- и стоп-последовательности, трансляционные старт- и стоп-последовательности, и последовательности энхансера или активатора. В дополнение к конститутивным и индуцибельным промоторам, мощные промоторы (например, Т7, ЦМВ, и т.п.) находят применение в конструктах, описанных в данном описании, особенно, если высокие уровни экспрессии желательны в системе экспрессии in vivo (клеточной) или in vitro. Дальнейшие примеры промоторов включают промоторы вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промоторы вируса саркомы Рауса (RSV), промоторы аденовирусов, промотор немедленно раннего гена ЦМВ человека (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985) и промотор длинного концевого повтора (LTR) RSV (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781, 1982). Также может быть обеспечен промотор, например, 5'UTR ретровируса.

Векторы экспрессии, в общем, содержат подходящие рестрикционные сайты, расположенные около последовательности промотора, чтобы обеспечить вставку последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих целевые белки. Селекционный маркер, функционирующий в организме хозяина экспрессии, может присутствовать для облегчения селекции клеток, содержащих вектор. Кроме того, экспрессионный конструкт может содержать дополнительные элементы. Например, вектор экспрессии может содержать одну или две системы репликации, что позволяет ему поддерживаться в организме, например в клетках млекопитающего или насекомого для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Кроме того, экспрессионный конструкт может содержать ген селекционного маркера, чтобы обеспечить селекцию трансформированных клеток-хозяев. Селекционные гены хорошо известны в данной области и варьируют в зависимости от используемой клетки-хозяина.

Экспрессионные конструкты, кодирующие меченые альдегидом полипептиды Ig, также могут создаваться с использованием методов амплификации (например, полимеразной цепной реакции (ПЦР)), при том, что как минимум один праймер амплификации (т.е. как минимум прямой и/или обратный праймер) содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую альдегидную метку. Например, праймер амплификации, содержащий кодирующую альдегидную метку последовательность, разработан с целью обеспечения амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Ig. Продукт удлинения, получаемый в результате опосредованного полимеразой синтеза с прямого праймера, содержащего альдегидную метку, дает нуклеиновокислотный продукт амплификации, кодирующий слитый белок, состоящий из меченого альдегидом полипептида Ig. Продукт амплификации далее вставляют в выбранный экспрессионный конструкт, чтобы получить конструкт экспрессии меченого альдегидом полипептида.

Клетки-хозяева

В данном изобретении предлагаются генетически модифицированные клетки-хозяева, содержащие целевую нуклеиновую кислоту, в том числе генетически модифицированная клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный вектор экспрессии, как изложено выше. Любая из целого ряда подходящих клеток-хозяев может использоваться для получения меченого альдегидом полипептида Ig. Клетка-хозяин, используемая для выработки меченого альдегидом полипептида Ig, может необязательно обеспечивать FGE-опосредованную модификацию, таким образом, что полученный полипептид Ig содержит FGly-содержащую альдегидную метку после экспрессии и модификации FGE. Альтернативно, клетка-хозяин может обеспечивать выработку не модифицированного меченого альдегидом полипептида Ig (например, за счет отсутствия экспрессии FGE, которая способствует конверсии альдегидной метки).

Альдегидная группа модифицированной альдегидной метки может применяться для разнообразных целей, в том числе, но не ограничиваясь ими, визуализации, с использованием флуоресценции или мечения эпитопа (например, электронной микроскопии с использованием частиц золота, снабженных реакционно-способными альдегидными группами); иммобилизации белка (например, получение микромассивов белка); изучения и применения динамики и локализации белка; и конъюгации белков с целевой группой (например, группами, которые улучшают период полувыведения (например, поли(этиленгликоль)) родительского белка, группой для нацеливания на что-либо (например, чтобы увеличить доставку к месту действия) и биологически активные группы (например, терапевтические группы).

В целом, полипептиды, описанные в данном описании, можно экспрессировать в прокариотах или эукариотах в соответствии с традиционными способами, в зависимости от цели экспрессии. Таким образом, в настоящем изобретении далее предлагается клетка-хозяин, например генетически модифицированная клетка-хозяин, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую меченый альдегидом полипептид. Клетка-хозяин далее может необязательно содержать рекомбинантный FGE, который может быть эндогенным или гетерологичным по отношению к клетке-хозяину.

Клетки-хозяева для продуцирования (в том числе продуцирования в больших масштабах) не модифицированного или (если клетка-хозяин экспрессирует подходящий FGE) модифицированного меченого альдегидом полипептида Ig, или для продуцирования FGE (например, для применения в неклеточном способе) могут быть выбраны как любые из множества доступных клеток-хозяев. Примеры клеток-хозяев включают клетки прокариотических или эукариотических одноклеточных организмов, таких как дрожжи, бактерии (например, штаммы Escherichia coli, виды Bacillus, (например, В. subtilis), и т.п.) или грибы (например, S. cerevisiae, виды Pichia, и т.д.), а также могут использоваться другие клетки-хозяева. Примеры клеток-хозяев, первоначально происходящих из высшего организма, такого как насекомые, позвоночные животные, особенно млекопитающие (например, СНО, HEK, и т.п.) могут использоваться в качестве экспрессионных клеток-хозяев.

Подходящие линии клеток млекопитающих включают, не ограничиваясь ими, клетки HeLa (например, Американская Коллекция Типовых Культур (АТСС) № CCL-2), клетки СНО (например, АТСС №№ CRL9618 и CRL9096), клетки СНО DG44 (Urlaub (1983) Cell 33:405), клетки СНО-K1 (АТСС CCL-61), клетки 293 (например, АТСС № CRL-1573), клетки Vero, клетки NIH 3Т3 (например, АТСС № CRL-1658), клетки Huh-7, клетки BHK (например, АТСС № CCL10), клетки PC12 (АТСС № CRL1721), клетки COS, клетки COS-7 (АТСС № CRL1651), клетки RAT1, клетки мыши L (АТСС № CCLI.3), клетки почки эмбриона человека (HEK) (АТСС № CRL1573), клетки HLHepG2, и т.п.

Конкретно представляющие интерес системы экспрессии включают системы экспрессии, полученные из бактериальных, дрожжевых клеток, клеток насекомых и клеток млекопитающих. Характерные для каждой из этих категорий системы представлены ниже.

Продукт может быть выделен любыми подходящими средствами, известными в данной области. В дальнейшем могут применяться любые пригодные методики очистки белка, причем подходящие методики очистки белка описаны в in Guide to Protein Purification (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Например, лизат может быть получен из клетки, содержащей вектор экспрессии, экспрессирующий меченый альд полипептид Ig, и очищен с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), эксклюзионной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии, и т.п.

Способы превращения и модификации альдегидной метки

Превращение альдегидной метки, присутствующей в меченом альдегидом полипептиде Ig, может быть достигнуто клеточными (in vivo) или бесклеточными способами (in vitro). Также модификация модифицированной альдегидной метки меченого альдегидом полипептида может быть достигнута клеточными (in vivo) или бесклеточными способами (in vitro). Более подробно они описаны ниже.

Превращение и модификация "in vivo" в клетках-хозяевах

Превращение альдегидной метки меченого альдегидом полипептида может быть достигнуто экспрессией меченого альдегидом полипептида в клетке, которая содержит подходящий FGE. В данном варианте, модификация цистеина или серина альдегидной метки происходит в ходе или после трансляции в клетке-хозяине. FGE клетки-хозяина может быть эндогенным для клетки-хозяина, или клетка-хозяин может быть рекомбинантной, чтобы содержать подходящий FGE, гетерологичный для клетки-хозяина. Экспрессия FGE может быть обеспечена системой экспрессии, эндогенной для гена FGE (например, экспрессия обеспечивается промотором и другими контрольными элементами, присутствующими в природном гене FGE клетки-хозяина), или может быть обеспечена рекомбинантной системой экспрессии, в которой кодирующая FGE последовательность функционально связана с гетерологичным промотором, чтобы обеспечить конститутивную или индуцибельную экспрессию.

Условия, пригодные для использования с целью обеспечения конъюгации группы реакционно-способного партнера с меченым альдегидом полипептидом, сходны с описанными в Mahal et al. (1997 May 16) Science 276(5315):1125-8.

В некоторых случаях, если способ осуществляется в клетке, клетка находится in vitro, например, в культуре клеток in vitro, например, когда клетка выращивается in vitro в суспензии отдельных клеток или как прикрепленная клетка.

Превращение и модификация "in vitro" (бесклеточное)

In vitro (бесклеточная) модификация альдегидной метки меченого альдегидом полипептида Ig может быть достигнуто путем контакта меченого альдегидом полипептида с FGE в условиях, подходящих для модификации цистеина или серина мотива сульфатазы альдегидной метки с образованием FGly. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая меченый альдегидом полипептид Ig, может экспрессироваться в системе транскрипции/трансляции in vitro в присутствии подходящего FGE, чтобы обеспечить образование меченых альдегидом полипептидов Ig.

Альтернативно, выделенный, не модифицированный меченый альдегидом полипептид Ig может быть выделен после рекомбинантного продуцирования в клетке-хозяине, в отсутствие подходящего FGE, или получен синтетически. Далее обеспечивают контакт выделенного меченого альдегидом полипептида Ig с подходящим FGE в таких условиях, чтобы обеспечить модификацию альдегидной метки. Меченый альдегидом полипептид Ig может быть развернут способами, известными в данной области (например, с использованием нагревания, изменения рН, хаотропных агентов (таких как мочевина и т.п.), органических растворителей (например, углеводородов: октан, бензол, хлороформ), и т.д.), и обеспечивают контакт денатурированного белка с подходящим FGE. Меченый Альд полипептид Ig далее может быть снова свернут в подходящих условиях.

Относительно модификации модифицированной альдегидной метки, модификацию обычно осуществляют in vitro. Превращенный меченый альдегидом полипептид Ig выделяют из источника получения (например, выработка рекомбинантной клеткой-хозяином, синтетическое получение), и обеспечивают контакт с содержащим реакционно-способный партнер лекарственным средством или другой группой в условиях, подходящих для того, чтобы обеспечить конъюгацию лекарственного средства или другой группы с FGly альдегидной метки.

В некоторых случаях, комбинацию клеточной модификации и неклеточной модификации используют для создания модифицированной альдегидной метки с последующей бесклеточной модификацией модифицированной альдегидной метки. В некоторых вариантах, осуществляется комбинация бесклеточной модификации и клеточной модификации.

Группы для модификации полипептидов иммуноглобулина

Меченые альдегидом, FGly-содержащие полипептиды Ig могут быть подвергнуты модификации, чтобы обеспечить присоединение широкого спектра групп. Примеры целевых групп включают, но не обязательно ограничиваясь ими, лекарственное средство, обнаруживаемую метку, низкомолекулярное соединение, растворимый в воде полимер, синтетический пептид, и т.п.

Таким образом, в данном изобретении предлагается конъюгат полипептида Ig (также обозначенный в данном описании как "конъюгат Ig"), который содержит:

полипептид Ig (например, тяжелая цепь Ig или легкая цепь Ig, или Ig, содержащий как тяжелую, так и легкую цепи) и ковалентно конъюгированную группу, при этом полипептид Ig содержит модифицированный мотив сульфатазы формулы:

X1(FGly')X2Z2X3Z3

причем FGly' представлен формулой:

при том, что J1 представляет собой ковалентно связанную группу;

каждый L1 представляет собой двухвалентную группу, независимо выбранную из алкилена, замещенного алкилена, алкенилена, замещенного алкенилена, алкинилена, алкинилена, арилена, замещенного арилена, циклоалкилена, замещенного циклоалкилена, гетероарилена, замещенного гетероарилена, гетероциклена, замещенного гетероциклена, ацила, амидо, ацилокси, уретанилена, тиоэфира, сульфонила, сульфонамида, сульфонильного эфира, -О-, -S-, -NH- и замещенного амина;

n представляет собой число от 0 до 40;

Z2 представляет собой остаток пролина или аланина;

X1 присутствует или отсутствует, и, если присутствует, то представляет собой любую аминокислоту, при условии, что, если мотив сульфатазы расположен на N-конце полипептида, то X1 присутствует;

каждый из Х2 и Х3 независимо представляет собой любую аминокислоту; и

Z3 представляет собой алифатическую аминокислоту или основную аминокислоту;

и

при этом конъюгат Ig представляет ковалентно связанную группу на доступной для растворителя поверхности, когда находится в свернутом состоянии.

В данном изобретении предлагается антитело, конъюгированное с целевой группой, причем антитело, конъюгированное с целевой группой, обозначено как "конъюгат антитела". Конъюгат антитела по настоящему изобретению может содержать: 1) константную область тяжелой цепи Ig, конъюгированную с целевой группой; и константную область легкой цепи Ig, конъюгированную с целевой группой; 2) константную область тяжелой цепи Ig, конъюгированную с целевой группой; и константную область легкой цепи Ig, которая не конъюгирована с целевой группой; или 3) константную область тяжелой цепи Ig, которая не конъюгирована с целевой группой; и константную область легкой цепи Ig, конъюгированную с целевой группой. Объект конъюгат антитела может также содержать домены VH и/или VL.

Целевая группа представлена в виде компонента реакционно-способного партнера для реакции с альдегидом остатка FGly модифицированной альдегидной метки меченого полипептида Ig. Поскольку способы модификации меченого полипептида Ig совместимы с обычными химическими процессами, в способах по настоящему изобретению может использоваться широкий интервал коммерчески доступных реактивов, чтобы обеспечить прикрепление целевой группы к остатку FGly альдегида меченого полипептида Ig. Например, аминоокси, гидразид или производные тиосемикарбазида из множества целевых групп являются подходящими реакционно-способными партнерами, легко доступны или могут быть получены с использованием стандартных химических способов.

Например, чтобы присоединить поли(этиленгликоль) (ПЭГ) группу к меченому полипептиду Ig, из моноамино-ПЭГ и аминооксиглицина с использованием стандартных протоколов может быть получен аминоокси-ПЭГ может быть. Далее аминоокси-ПЭГ может реагировать с модифицированным (например, FGly-модифицированным) альдегидом меченого полипептида Ig, чтобы обеспечить присоединение ПЭГ группы. Введение биотиновой группы в модифицированный меченый альдегидом полипептид может быть достигнуто с использованием аминооксибиотина, гидразидбиотина или 2,4-динитрофенилгидразина.

На основе данного описания, средний специалист в данной области может легко адаптировать любую из множества групп, чтобы обеспечить реакционно-способного партнера для конъюгации с меченым альдегидом полипептидом как предложено в данном описании. Средний специалист в данной области будет понимать, что важны такие факторы, как рН и стерические помехи (т.е. доступность альдегидной метки для реакции с целевым реакционно-способным партнером). Модификация условий реакции для обеспечения оптимальных условий конъюгации находится в пределах компетенции среднего специалиста, и является рутинной в данной области. В целом, это проведение реакций конъюгации обычно желательно при рН ниже 7, причем рН составляет приблизительно 5,5, приблизительно 6, приблизительно 6,5, обычно значение приблизительно 5,5 является оптимальным. Если конъюгацию проводят с меченым альдегидом полипептидом, присутствующим в или на живой клетке, условия выбирают таким образом, чтобы они были физиологически совместимыми. Например, значение рН может быть временно снижено на период времени, достаточный, чтобы позволить реакции происходить, но в пределах периода, переносимого клеткой, содержащей альдегидную метку (например, от приблизительно 30 минут до 1 часа). Физиологические условия для проведения модификации меченых альдегидом полипептидов на поверхности клетки могут быть сходны с используемыми в реакции кетон-азид для модификации клеток, несущих азиды на поверхности клетки (см., например, патент США 6,570,040).

В целом, группа или группы могут быть предложены для одной или более из широкого разнообразия функций или признаков. Примеры групп включают обнаружимые метки (например, метки красителя (такие как хромофоры, флюорофоры), биофизические зонды (спин-метки, зонды ядерного магнитного резонанса (ЯМР)), метки для метода типа резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) (например, как минимум один член пары FRET, в том числе как минимум один член пары флюорофор/гаситель), метки для метода типа резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) (например, как минимум один член пары BRET), иммунообнаружимые метки (например, FLAG, His(6), и т.п.), метки локализации (например, чтобы идентифицировать ассоциацию меченого полипептида на тканевом или молекулярно-клеточном уровне (например, ассоциация с типом ткани, или конкретной мембраной клетки)), и т.д.); активизируемые светом динамические группы (например, опосредованное азобензеном закрытие пор, опосредованные азобензеном структурные изменения, мотивы распознавания фотоэрозии); водорастворимые полимеры (например, ПЭГилирование); метки очистки (например, чтобы облегчить выделение аффинной хроматографией (например, присоединение эпитопа FLAG, например, DYKDDDDK (SEQ ID NO:222)); домены локализации на мембране (например, липиды или якоря типа гликофосфатидилинозитол (ГФИ)); метки иммобилизации (например, для облегчения прикрепления полипептида к поверхности, в том числе селективного прикрепления); лекарственные средства (например, чтобы облегчить нацеливание лекарственного средства, например, путем присоединения лекарственного средства к антителу); группы для целенаправленной доставки (например, лиганды для связывания с рецептором-мишенью (например, чтобы облегчить прикрепление вируса, прикрепление нацеливающего белка, присутствующего на липосоме, и т.д.)), и т.п.

Конкретные неограничивающие примеры приведены ниже.

Обнаружимые метки

Композиции и способы по настоящему изобретению могут применяться для доставки обнаруживаемой метки к меченому альдегидом Ig, например, если J1 представляет собой обнаруживаемую метку. Примеры обнаружимых меток включают, но не обязательно ограничиваясь ими, флуоресцентные молекулы (например, аутофлуоресцентные молекулы, молекулы, которые флуоресцируют при контакте с реактивом, и т.п.), радиоактивные метки (например, 111In, 125I, 131I, 212В, 90Y, 186Rh, и т.п.); биотин (например, для обнаружения реакцией биотина и авидина); флуоресцентные метки; реактивы для визуализации, и т.п. Обнаружимые метки также включают пептиды или полипептиды, которые могут быть обнаружены путем связывания с антителом, например, связывания поддающегося обнаружению меченного обнаруживаемой меткой антитела или обнаружения связанного антитела в анализе сендвичевого типа.

Прикрепление целевых молекул к подложке

Способы могут предусматривать конъюгацию меченого альдегидом иммуноглобулина с группой, облегчающей прикрепление иммуноглобулина к твердой подложке (например, чтобы облегчить проведение анализа), или с группой, облегчающей легкое отделение (например, гаптен, распознаваемый антителом, связанным с магнитной бусиной). В одном из вариантов, способы по изобретению применяются, чтобы обеспечить прикрепление белка к матрице (например, чипу) в определенной ориентации. Например, может быть создан полипептид, содержащий альдегидную метку на выбранном сайте (например, в пределах или вблизи N-конца), и способы и композиции по изобретению применяются для доставки группы к преобразованной альдегидной метке. Далее группа может использоваться в качестве сайта присоединения для прикрепления полипептида к подложке (например, твердая или полутвердая подложка, особенно подложка, подходящая для использования в качестве микрочипа в анализах с высокой производительностью).

Прикрепление молекул для доставки к сайту-мишени

Реакционно-способный партнер для меченого альдегидом полипептида может включать низкомолекулярное лекарственное средство, токсин или другую молекулу для доставки в клетку, что может обеспечивать фармакологическую активность или может служить мишенью для доставки других молекул.

Также предусматривается применение реакционно-способного партнера, который содержит один партнер связывания из пары (например, лиганд, связывающуюся с лигандом часть рецептора, связывающуюся с рецептором часть лиганда, и т.п.). Например, реакционно-способный партнер может содержать полипептид, который служит вирусным рецептором и, при связывании с белком оболочки вируса или капсидным белком вируса, облегчает прикрепление вируса к поверхности клетки, на которой экспрессируется меченый модифицированным альдегидом белок. Альтернативно, реакционно-способный партнер содержит антиген, который специфично связывается антителом (например, моноклональное антитело), чтобы облегчить обнаружение и/или отделение клеток-хозяев, экспрессирующих меченый модифицированным альдегидом полипептид.

Растворимые в воде полимеры

В некоторых случаях, конъюгат Ig содержит ковалентно связанный растворимый в воде полимер, например, когда J1 представляет собой растворимый в воде полимер. Группой особенного интереса является растворимый в воде полимер. "Растворимый в воде полимер" обозначает полимер, который растворим в воде и обычно является в существенной мере неиммуногенным, обычно с молекулярной массой более чем приблизительно 1000 Да. Способы и композиции, описанные в данном описании, могут применяться для присоединения одного или более растворимых в воде полимеров к меченому альдегидом полипептиду. Присоединение растворимого в воде полимера (например, ПЭГ) к полипептиду, особенно фармацевтически активному (терапевтическому) полипептиду может быть желательным, поскольку такая модификация может увеличивать терапевтический индекс, увеличивая период полувыведения из сыворотки в результате повышения устойчивости к действию протеолитических ферментов и/или снижения почечного клиренса. Дополнительно, присоединение одного или более полимеров (например, ПЭГилирование) может снижать иммуногенность фармацевтических препаратов белковой природы.

В некоторых вариантах, эффективная гидродинамическая молекулярная масса растворимого в воде полимера составляет более чем приблизительно 10000 Да, более чем приблизительно 20000-500000 Да, более чем приблизительно 40000-300000 Да, более чем приблизительно 50000-70000 Да, обычно более чем приблизительно 60000 Да. В некоторых вариантах, эффективная гидродинамическая молекулярная масса растворимого в воде полимера составляет от приблизительно 10 кДа до приблизительно 20 кДа, от приблизительно 20 кДа до приблизительно 25 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 30 кДа, от приблизительно 30 кДа до приблизительно 50 кДа, или от приблизительно 50 кДа до приблизительно 100 кДа. Под "эффективной гидродинамической молекулярной массой" подразумевается эффективный размер сольватированной водой цепи полимера, определенный методом эксклюзионной хроматографии на водной основе (ЭХВО). Если растворимый в воде полимер содержит полимерные цепи, содержащие повторяющиеся фрагменты полиалкиленоксида, такие как повторяющиеся фрагменты этиленоксида, молекулярная масса каждой цепи может составлять от приблизительно 200 Да до приблизительно 80000 Да, или от приблизительно 1500 Да до приблизительно 42000 Да, причем интервал от 2000 до приблизительно 20000 Да представляет особый интерес. Если не указано конкретно, молекулярная масса обозначает атомную молекулярную массу. Линейные, разветвленные и заряженные на конце водорастворимые полимеры (например, ПЭГ) представляют особый интерес.

Полимеры, пригодные в качестве групп, присоединяемых к меченому альдегидом полипептиду, могут демонстрировать широкий интервал молекулярной массы и типов субъединиц полимера. Такие субъединицы могут включать биологический полимер, синтетический полимер или их комбинацию. Примеры таких растворимых в воде полимеров включают: декстран и производные декстрана, в том числе сульфат декстрана, P-амино поперечно-сшитый декстрин, и карбоксиметилдекстрин, целлюлозу и производные целлюлозы, в том числе метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу, крахмал и декстрины, а также производные и гидролакты крахмала, полиалкиленгликоль и его производные, в том числе полиэтиленгликоль, метоксиполиэтиленгликоль, гомополимеры полиэтиленгликоля, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры этиленгликоля с пропиленгликолем, причем указанные гомополимеры и сополимеры не замещены или замещены на одном конце с алкильной группой, гепарином и фрагментами гепарина, поливиниловым спиртом и поливинилэтиловыми эфирами, поливинилпирролидоном, аспартамидом и полиоксиэтилированными полиолами, декстраном и производными декстрана, декстрином и производными декстрина. Следует понимать, что различные производные конкретно заявленных растворимых в воде полимеров также включены.

Растворимые в воде полимеры, например, описанные выше, хорошо известны, особенно полимеры на основе полиалкиленоксида, такие как полиэтиленгликоль "ПЭГ" (см., например, "Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications", J. M. Harris, Ed., Plenum Press, New York, N.Y. (1992); и "Polyethylene glycol) Chemistry and Biological Applications", J. M. Harris and S. Zalipsky, Eds., ACS (1997); и Международные патентные заявки: WO 90/13540, WO 92/00748, WO 92/16555, WO 94/04193,WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28937, WO 95/11924, WO 96/00080, WO 96/23794, WO 98/07713, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/30727, WO 99/32134, WO 99/33483, WO 99/53951, WO 01/26692, WO 95/13312, WO 96/21469, WO 97/03106, WO 99/45964, а также патенты США №№4,179,337; 5,075,046; 5,089,261; 5,100,992; 5,134,192; 5,166,309; 5,171,264; 5,213,891; 5,219,564; 5,275,838; 5,281,698; 5,298,643; 5,312,808; 5,321,095; 5,324,844; 5,349,001; 5,352,756; 5,405,877; 5,455,027; 5,446,090; 5,470,829; 5,478,805; 5,567,422; 5,605,976; 5,612,460; 5,614,549; 5,618,528; 5,672,662; 5,637,749; 5,643,575; 5,650,388; 5,681,567; 5,686,110; 5,730,990; 5,739,208; 5,756,593; 5,808,096; 5,824,778; 5,824,784; 5,840,900; 5,874,500; 5,880,131; 5,900,461; 5,902,588; 5,919,442; 5,919,455; 5,932,462; 5,965,119; 5,965,566; 5,985,263; 5,990,237; 6,011,042; 6,013,283; 6,077,939; 6,113,906; 6,127,355; 6,177,087; 6,180,095; 6,194,580; 6,214,966).

Примеры полимеров, представляющих интерес, включают содержащие полиалкиленоксид, полиамид алкиленоксид или их производные, в том числе полиалкиленоксид и полиамид алкиленоксид, содержащие повторяющиеся фрагменты этиленоксида формулы -(СН2-СН2-O)-. Другие примеры полимеров, представляющих интерес, включают полиамид с молекулярной массой более чем приблизительно 1000 Да формулы, -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n- или -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-, причем X и Y являются двухвалентными радикалами, которые могут быть одинаковыми или различными, и могут быть разветвленными или линейными, и n представляет собой дискретное целое число от 2 до 100, обычно от 2 до 50, и при этом один или оба из X и Y содержат биосовместимый, в существенной мере не антигенный, растворимый в воде повторяющийся фрагмент, который может быть линейным или разветвленным. Дальнейшие примеры растворимых в воде повторяющихся фрагментом включают этиленоксид формулы -(СН2-СН2-O)- или -(СН2-СН2-O)-. Количество таких растворимых в воде повторяющихся фрагментов может значительно варьировать, причем обычное количество таких фрагментов составляет от 2 до 500, от 2 до 400, от 2 до 300, от 2 до 200, от 2 до 100, и чаще всего от 2 до 50. Примером варианта является такой, в котором один или оба из X и Y выбраны из: ((СН2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)- или -((СН2)n1-(O-СН2-СН2)n2-(СН2)n1-), причем n1 равно от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4 и чаще всего от 1 до 3, при том, что п2 равно от 2 до 50, от 2 до 25, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 8, и чаще всего от 2 до 5. Дальнейший пример варианта - такой, в котором X представляет собой -(СН2-СН2)-, при том, что Y представляет собой -(CH2-(СН2-СН2-O)3-СН2-СН2-СН2)- или -(СН2-СН2-СН2-(O-СН2-СН2)3-СН2)-.

Полимер может содержать один или более спейсеров или линкеров. Примеры спейсеров или линкеров включают линейные или разветвленные фрагменты, содержащие один или более повторяющихся фрагментов, используемых в водорастворимом полимере, диамино и или дикарбоновые группы, природные или неприродные аминокислоты или их производные, а также алифатические группы, в том числе алкил, арил, гетероалкил, гетероарил, алкокси, и т.п., которые могут содержать, например, до 18 атомов углерода или даже дополнительную полимерную цепь.

Полимерная группа, или один или более спейсеров или линкеров полимерной группы, если они присутствуют, могут содержать полимерные цепи или фрагменты, которые являются биостабильными или поддаются биологическому разложению. Например, полимеры с повторяющимися фрагментами демонстрируют различную степень стабильности в физиологических условиях, в зависимости от лабильности связи. Полимеры с такими связями могут быть распределены по категориям их относительной скорости гидролиза в физиологических условиях, на основании известных значений скорости гидролиза низкомолекулярных аналогов, например, от менее стабильного к более стабильному, например, полиуретаны (-NH-C(O)-O-)> полиортоэфиры (-O-C((OR)(R'))-O-)> полиамиды (-C(O)-NH-). Подобным образом, системы связей, присоединяющих водорастворимый полимер к молекуле-мишени, могут быть биостабильными или поддающимися биологическому разложению, например, от менее стабильной к более стабильной: карбонатная (-О-С(О)-О-)> сложноэфирная (-С(О)-О-)> уретановая (-NH-C(O)-O-)> ортоэфирная (-O-C((OR)(R'))-О-)> амидная (-C(O)-NH-). В целом, может быть желательным избегать использования сульфатированных полисахаридов, в зависимости от лабильности сульфатной группы. Кроме того, может быть менее желательным использование поликарбонатов и поли(сложных эфиров). Такие связи приведены для примера, и не предназначены для ограничения видов связей, которые могут использоваться в полимерных цепях или системах связей водорастворимых полимеров, пригодных для модифицированных меченых альдегидом полипептидов, раскрытых в данном описании.

Синтетические пептиды

В некоторых случаях, конъюгат Ig содержит ковалентно связанный пептид, например, при том, что J1 представляет собой пептид. Подходящие пептиды включают, не ограничиваясь ими, цитотоксические пептиды; ангиогенные пептиды; анти-ангиогенные пептиды; пептиды, которые активизируют В-клетки; пептиды, которые активизируют Т-клетки; противовирусные пептиды; пептиды, которые препятствуют слиянию вируса; пептиды, которые увеличивают выработку одной или более популяций лимфоцитов; антимикробные пептиды; факторы роста; рилизинг-факторы гормона роста; вазоактивные пептиды; противовоспалительные пептиды; пептиды, которые регулируют метаболизм глюкозы; антитромботический пептид; антиноцицептивный пептид; вазодиляторный пептид; ингибитор агрегации тромбоцитов; болеутоляющее средство; и т.п.

Если J1 представляет собой пептид, то пептид может быть синтезирован химическим путем, чтобы содержать группу, способную к реакции с модифицированным FGly-содержащим полипептидом Ig. Длина подходящего синтетического пептида составляет от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 100 аминокислот, или более 100 аминокислот; например, длина подходящего пептида составляет от приблизительно 5 аминокислот (ак) до приблизительно 10 ак, от приблизительно 10 ак до приблизительно 15 ак, от приблизительно 15 ак до приблизительно 20 ак, от приблизительно 20 ак до приблизительно 25 ак, от приблизительно 25 ак до приблизительно 30 ак, от приблизительно 30 ак до приблизительно 40 ак, от приблизительно 40 ак до приблизительно 50 ак, от приблизительно 50 ак до приблизительно 60 ак, от приблизительно 60 ак до приблизительно 70 ак, от приблизительно 70 ак до приблизительно 80 ак, от приблизительно 80 ак до приблизительно 90 ак, или от приблизительно 90 ак до приблизительно 100 ак.

Пептид может быть модифицирован для введения α-нуклеофил-содержащей группы (например, аминоокси или гидразидной группы), например, может вступать в реакцию с FGly-содержащим полипептидом Ig, с образованием конъюгата, в котором меченый альдегидом полипептид Ig и пептид связаны гидразонной или оксимной связью, соответственно. Выше описаны примеры синтеза пептида, таким образом, что синтетический пептид содержит реакционно-способную группу, способную к реакции с преобразованной альдегидной меткой.

Подходящие пептиды включают, не ограничиваясь ими, hLF-11 (N-концевой фрагмент лактоферрина длиной 11 аминокислот), антимикробный пептид; гранулизин, антимикробный пептид; Плектазин (NZ2114; SAR 215500), антимикробный пептид; ингибиторы слияния вируса, такие как Фузеон (энфувиртид), TRI-1249 (Т-1249; см., например, Matos и др. (2010) PLoS One 5:е9830), TRI-2635 (Т-2635; см., например, Eggink и др. (2009) J. Biol. Chem. 284:26941), Т651 и TRI-1144; ингибиторы рецептора С5а, такие как РМХ-53, JPE-1375 и JSM-7717; РОТ-4, ингибитор человеческого фактора комплемента С3; Панкреат (производная последовательность INGAP, HIP-человеческий про-островковый белок); соматостатин; аналог соматостатина, такой как DEBIO 8609 (Занвар), октреотид, октреотид (C2L), октреотид QLT, октреотид LAR, Сандостатин LAR, SomaLAR, Соматулин (ланреотид), см., например, Deghenghi и др. (2001) Endocrine 14:29; ТН9507 (Тезаморелин, рилизинг-фактор гормона роста); POL7080 (аналог протегрина, антимикробный пептид); релаксин; агонист рилизинг-фактора кортикотропина, такой как уротензин, совагин, и т.п.; производное белка теплового шока, такое как DiaPep277; ингибитор входа вируса иммунодефицита человека; имитатор протеина-20 теплового шока, например, AZX100; активизирующий рецептор тромбина пептид, например, ТР508 (Хризалин); имитатор урокортина 2 (например, агонист CRF2), такой как урокортин-2; иммуноактиватор, такой как Задаксин (тималфазин; тимозин-α1), см., например, Sjogren (2004) J. Gastroenterol. Hepatol. 19:S69; пептид E2 ингибитор входа вируса гепатита С (HCV), такого как HCV3; желудочковый натрийуретический пептид, такой как HANP (Sun 4936; карперитид); аннексиновый пептид; дефензин (антимикробный пептид), такой как hBD2-4; дефензин (антимикробный пептид), такой как hBD-3; дефензин (антимикробный пептид), такой как РМХ-30063; гистатин (антимикробный пептид), такой как гистатин-3, гистатин-5, гистатин-6 и гистатин-9; гистатин (антимикробный пептид), такой как РАС-113; индолицидин (антимикробный пептид), такой как MX-594AN (Омниганин; CLS001); индолицидин (антимикробный пептид), такой как Омнигард (MBI-226; CPI-226); антимикробный пептид, такой как цекропин насекомых; антимикробный пептид, такой как лактоферрин (талактоферрин); производное LL-37/кателицидина (антимикробный пептид), такое как Р60.4 (ОР-145); магайнин (антимикробный пептид), такой как Пексиганан (MSI-78; Супонекс); протегрин (антимикробный пептид), такой как IB-367 (Изеганан); пептид аган; бета-натрийуретический пептид, такой как Натрекор, или Норатак (Незиритид) или уларитид; биваларудин (Ангиомакс), ингибитор тромбина; производное пептида С; кальцитонин, такой как Миакальцин (Фортикал); производное энкефалина; стимулирующий эритропоэз пептид, такой как Гематид; модулятор закрытия промежутка, такой как Данегаптид (ZP1609); гастрин-высвобождающий пептид; грелин; глюкагон-подобный пептид; глюкагон-подобный аналог пептида-2, такой как ZP1846 или ZP1848; дипептид глюкозаминил мурамил, такой как GMDP; антибиотический гликопептид, такой как Оритаванцин; производное тейкопланина, такое как Далбаванцин; гонадотропин-высвобождающий гормон (GnRH), такой как Золадекс Люпон) или Трипторелин; депсипептид ингибитор гистондезацетилазы (ГДАЦ), такой как РМ02734 (Ирвалек); интегрин, такой как эптифибатид; аналог инсулина, такой как Гумулог; кагалалидный депсипептид, такой как РМ02734; ингибитор калликреина, такой как Калбитор (экаллантид); антибиотик, такой как Телаванцин; липопептид, такой как Кубицин или МХ-2401; рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона (ЛГРГ), такой как гозерелин; синтетический аналог декапептидного агониста ЛГРГ, такой как Трейстар (трипторелина памоат); ЛГРГ, такой как Элигард; пептидный ингибитор канала белка М2; метрелептин; пептидный агонист рецептора меланокортина, такой как бремаланотид/РТ-141; меланокортин; мурамилтрипептид, такой как Мепакт (мифамуртид); основной пептид миелинового белка, такой как МВР 8298 (дирукотид); блокатор потенциалзависимых кальциевых каналов N-типа, такой как Зиконотид (Приалт); пептидный гормон паращитовидной железы; паратиреоидньгй аналог, такой как 768974; аналог пептидного гормона, такой как UGP281; ингибитор F2-α рецептора простагландина, такой как PDC31; ингибитор протеазы, такой как PPL-100; сурфаксин; миметик тромобспондина-1 (TSP-1), такой как CVX-045 или АВТ 510; вазоактивный кишечный пептид; вазопрессин; пептидный агонист Y2R, такой как RG7089; обинепептид; и ТМ30339.

Лекарственные средства для конъюгации с меченым альдегидом полипептидом иммуноглобулина

Любые из целого ряда лекарственных средств пригодны для использования или могут быть модифицированы таким образом, чтобы считаться пригодными для использования в качестве реакционно-способного партнера для конъюгации с меченым альд полипептидом Ig. Примеры лекарственных средств включают низкомолекулярные лекарственные средства и пептидные лекарственные средства. Таким образом, в данном изобретении предлагается конъюгат лекарственного средства с антителом.

"Низкомолекулярное лекарственное средство" в данном описании обозначает соединение, например органическое соединение, которое демонстрирует целевую фармацевтическую активность, и молекулярная масса которого, в общем, не превышает приблизительно 800 Да, или не превышает 2000 Да, но может включать молекулы размером до 5 кДа и даже размером более чем приблизительно 10 кДа. Неорганическая молекула небольшого размера обозначает молекулу, не содержащую атомов углерода, в то время как органическая молекула небольшого размера обозначает соединение, содержащее как минимум один атом углерода.

"Пептидное лекарственное средство" в данном описании обозначает содержащие аминокислоты полимерные соединения, и подразумевается, что оно включает природные и неприродные пептиды, олигопептиды, циклические пептиды, полипептиды и белки, а также пептидомиметики. Пептидные лекарственные средства могут быть получены химическим синтезом или могут вырабатываться генетически кодируемым источником (например, рекомбинантным источником). Молекулярная масса пептидных лекарственных средств может варьировать, и может составлять от 200 Да до 10 кДа или более.

В некоторых случаях, лекарственное средство представляет собой химиотерапевтическое противораковое средство. Например, если антитело обладает специфичностью в отношении клетки опухоли, антитело может быть модифицировано, как описано в данном описании, чтобы содержать альдегидную метку, и может быть впоследствии модифицировано с образованием FGly-модифицированного антитела, а далее может быть конъюгировано с химиотерапевтическим противораковым средством. Противораковые химиотерапевтические средства включают непептидные соединения (т.е. небелковые), которые уменьшают пролиферацию раковых клеток, и включают цитотоксические средства и цитостатические средства. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, производные нитрозомочевины, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, растительные алкалоиды (барвинок) и стероидные гормоны. Также могут использоваться пептидные соединения.

Подходящие противораковые химиотерапевтические средства включают доластатин и его активные аналоги и производные; ауристатин и его активные аналоги и производные. См., например, WO 96/33212, WO 96/14856 и USPN 6,323,315. Например, доластатин 10 или ауристатин РЕ могут быть включены в конъюгат антитела с лекарственным средством по настоящему изобретению. Подходящие химиотерапевтические противораковые средства также включают мейтанзиноиды и их активные аналоги и производные (см., например, ЕР 1391213; и Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623); и дуокармицины и их активные аналоги и производные (например, включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ 1-ТМ1).

Средства, действие которых состоит в уменьшении клеточной пролиферации, известны в данной области и широко применяются. Такие средства включают алкилирующие средства, такие как производные ипритного азота, нитрозомочевины, этиленимина, алкилсульфонаты и триазены, в том числе, не ограничиваясь ими, мехлорэтамин, циклофосфамид (Цитоксан™), мелфалан (L-сарколизин), кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), семустин (метил-CCNU), стрептозоцин, хлорозотоцин, ипритный урацил, хлорметин, ифосфамид, хлорамбуцил, пипоброман, триэтиленмеламин, триэтилентиофосфорамин, бусульфан, дакарбазин и темозоломид.

Антиметаболитные средства включают аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина, и ингибиторы аденозиндезаминазы, в том числе, не ограничиваясь ими, цитарабин (ЦИТОЗАР-У), арабинозид цитозин, фторурацил (5-ФУ), флоксуридин (FudR), 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин (6-МР), пентостатин, 5-фторурацил (5-ФУ), метотрексат, 10-пропаргил-5,8-дидеазафолат (PDDF, СВ3717), 5,8-дидеазатетрагидрофолиевая кислота (DDATHF), лейковорин, флударабина фосфат, пентостатин и гемцитабин.

Подходящие природные продукты и их производные (например, алкалоиды барвинка, противоопухолевые антибиотики, ферменты, лимфокины и эпиподофиллотоксины), включают, не ограничиваясь ими, Ara-С, паклитаксел (Таксол®), доцетаксел (Таксотер®), дезоксикоформицин, митомицин-С, L-аспарагиназу, азатиоприн; брехинар; алкалоиды, например винкристин, винбластин, винорельбин, виндезин, и т.д.; подофиллотоксины, например этопозид, тенипозид, и т.д.; антибиотики, например антрациклин, даунорубицина гидрохлорид (дауномицин, рубидомицин, церубидин), идарубицин, доксорубицин, эпирубицин, морфолинопроизводные, и т.д.; феноксизона бисциклопептиды, например дактиномицин; основные гликопептиды, например блеомицин; антрахиноновые гликозиды, например пликамицин (митрамицин); антрацендионы, например митоксантрон; азиринопирролиндолдионы, например митомицин; макроциклические иммуносупрессанты, например циклоспорин, FK-506 (такролимус, програф), рапамицин, и т.д.; и т.п.

Другие антипролиферативные цитотоксические агенты представляют собой навельбин, СРТ-11, анастрозол, летрозол, капецитабин, релоксафин, циклофосфамид, ифосфамид и дролоксафин.

Влияющие на микротрубочки средства, которые обладают антипролиферативной активностью, также подходят для применения и включают, не ограничиваясь этим, аллоколхицин (NSC 406042), Галихондрин В (NSC 609395), колхицин (NSC 757), производные колхицина (например, NSC 33410), доластатин 10 (NSC 376128), мейтанзин (NSC 153858), ризоксин (NSC 332598), паклитаксел (Таксол®), производные Таксола®, доцетаксел (Таксотер®), тиоколхицин (NSC 361792), тритилцистерин, винбластина сульфат, винкристина сульфат, природные и синтетические эпотилоны, в том числе, не ограничиваясь ими, эпотилон А, эпотилон В, дискодермолид; эстрамустин, нокодазол, и т.п.

Гормональные модуляторы и стероиды (в том числе синтетические аналоги), пригодные для использования, включают, не ограничиваясь ими, адренокортикостероиды, например преднизон, дексаметазон, и т.д.; эстрогены и прогестины, например капроат гидроксипрогестерона, ацетат медроксипрогестерона, ацетат мегестрола, эстрадиол, кломифен, тамоксифен; и т.д.; и средства для угнетения функции надпочечников, например аминоглутетимид; 17α-этинилэстрадиол; диэтилстильбэстрол, тестостерон, флуоксиместерон, дромостанолона пропионат, тестолактон, метилпреднизолон, метилтестостерон, преднизолон, триамцинолон, хлортрианизен, гидроксипрогестерон, аминоглутетимид, эстрамустин, медроксипрогестерона ацетат, лейпролид, флутамид (Дрогенил), торемифен (Фарестон) и Золадекс®. Эстрогены стимулируют пролиферацию и дифференциацию; таким образом, соединения, которые связываются с рецептором эстрогена, применяются, чтобы блокировать данную активность. Кортикостероиды могут препятствовать пролиферации Т-клеток.

Другие пригодные химиотерапевтические средства включают комплексы металлов, например цисплатин (цис-ДДП), карбоплатин, и т.д.; производные мочевины, например гидроксимочевину; и гидразины, например N-метилгидразин; эпиподофиллотоксины; ингибитор топоизомеразы; прокарбазин; митоксантрон; лейковорин; тегафур; и т.п. Другие антипролиферативные средства, представляющие интерес, включают иммуносупрессанты, например микофеноловую кислоту, талидомид, дезоксиспергуалин, азаспорин, лефлуномид, мизорибин, азаспиран (SKF 105685); Иресса® (ZD 1839, 4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-метокси-6-(3-(4-морфолинил)пропокси)хиназолин); и т.п.

Таксаны также пригодны для применения. "Таксаны" включают паклитаксел, а также любое активное производное или пролекарство таксана. "Паклитаксел" (который следует понимать в данном описании, как включающий аналоги, композиции и производные, такие как доцетаксел, ТАКСОЛ™, ТАКСОТЕР™ (композиция доцетаксела), 10-дезацетильные аналоги паклитаксела и 3'N-дезбензоил-3'N-трет-бутоксикарбонильные аналоги паклитаксела) может быть легко получен с использованием способов, известных квалифицированным специалистам в данной области (см. также WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; патенты США 5,294,637; 5,283,253; 5,279,949; 5,274,137; 5,202,448; 5,200,534; 5,229,529; и ЕР 590,267), или получены из различных коммерческих источников, в том числе, например, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (T7402 из Taxus brevifolia; или T-1912 из Taxus yannanensis).

Паклитаксел следует понимать как обозначающий не только общую химически доступную форму паклитаксела, но и его аналоги и производные (например, доцетаксел Таксотер™, как отмечалось выше) и конъюгаты паклитаксела (например, паклитаксел-ПЭГ, паклитаксел-декстран или паклитаксел-ксилоза).

Также в пределах термина "таксан" находится множество известных производных, включая как гидрофильные производные, так и гидрофобные производные. Производные таксана включают, не ограничиваясь ими, производные галактозы и маннозы, описанные в Международной патентной заявке WO 99/18113; пиперазино и другие производные, описанные в WO 99/14209; производные таксана, описанные в WO 99/09021, WO 98/22451, и патенте США 5,869,680; 6-тиопроизводные, описанные в WO 98/28288; производные сульфенамида, описанные в патенте США 5,821,263; и производные таксола, описанные в патенте США 5,415,869. Он также включает пролекарства паклитаксела, в том числе, но не ограничиваясь ими, описанные в WO 98/58927; WO 98/13059; и патенте США 5,824,701.

Модификаторы биологической реакции, пригодные для использования, включают, не ограничиваясь ими, (1) ингибиторы активности тирозинакиназы (RTK); (2) ингибиторы активности серин/треонинкиназы; (3) антагонисты связанных с опухолью антигенов, такие как антитела, которые специфично связываются с антигеном опухоли; (4) агонисты рецептора апоптоза; (5) интерлейкины-2; (6) EFN-α; (7) IFN-γ; (8) колониестимулирующие факторы; и (9) ингибиторы ангиогенеза.

Способы модификации лекарственных средств для введения реакционно-способного партнера для реакции с 2-формилглицином

Пептидные лекарственные средства, которые конъюгируют с меченым альд полипептидом Ig, нужно модифицировать, чтобы ввести реакционно-способного партнера для реакции с альдегидом остатка FGly меченого альд полипептида Ig. Поскольку способы модификации меченого альд полипептида совместимы с обычными химическими процессами, любой из широкого спектра коммерчески доступных реактивов может использоваться для обеспечения конъюгации. Например, аминоокси, гидразид, гидразин или тиосемикарбазидные производные целого ряда целевых групп являются пригодными реакционно-способными партнерами, и легко доступны или могут быть получены с применением стандартных химических способов.

Если лекарственное средство представляет собой пептидное лекарственное средство, реакционно-способная группа (например, аминоокси или гидразид) может быть расположена в области N-конца, на N-конце, в области C-конца, на C-конце, или во внутреннем положении пептида. Так, пример способа включает синтез пептидного лекарственного средства, содержащего аминооксигруппу. В этом примере пептид синтезируется из защищенного Вое предшественника. Аминогруппа пептида может реагировать с соединением, содержащим карбоксильную группу и окси-N-Boc группу. В качестве примера, аминогруппа пептида реагирует с 3-(2,5-диоксопирролидин-1-илокси)пропановой кислотой. Другие вариации соединения, содержащего карбоксильную группу и окси-N-защитную группу, могут содержать различное количество атомов углерода в алкиленовом линкере и заместители на алкиленовом линкере. Реакция между аминогруппой пептида и соединением, содержащим карбоксильную группу и окси-N-защищенную группу, проходит в рамках стандартной химии сочетания пептидов. Примеры реагентов пептидного сочетания, которые могут применяться, включают, не ограничиваясь ими, ДЦК (дициклогексилкарбодиимид), ДИК (диизопропилкарбодиимид), ди-и-толуоилкарбодиимид, БДФ (1-бензотриазол диэтилфосфат-1-циклогексил-3-(2-морфолинилэтил)карбодиимид), ЭДК (1-(3-диметиламинопропил-3-этил-карбодиимида гидрохлорид), цианурфторид, цианурхлорид, ТФФГ (тетраметилфторформамидиния гексафторфосфонат), ДФФА (дифенилфосфоразидат), БОФ (бензотриазол-1- илокситрис(диметиламино)фосфония гексафторфосфат), ГБТУ (О-бензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат), ТБТУ (O-бензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат), ТСТУ (O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат), ГАТУ (N-[(диметиламино)-1-Н-1,2,3-триазоло[4,5,6]-пиридин-1-илметилен]-N-метилметанаминия гексафторфосфата N-оксид), БОФ-С1 (бис(2- оксо-3-оксазолидинил)фосфиния хлорид), РуВОР ((1-Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)-трис(пирролидино)фосфония тетрафторфосфат), BrOP (бромотрис(диметиламино)фосфония гексафторфосфат), ДЭФБТ (3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотриазин-4(3Н)-он) PyBrOP (бромотрис(пирролидино)фосфония гексафторфосфат). В качестве неограничивающего примера, HOBt и ДИК могут применяться как реагенты пептидного сочетания.

Удаление защитной группы для высвобождения аминоокси группы выполняется на пептиде, содержащем N-защитную группу. Снятие защиты с N-оксисукцинимидной группы, например, происходит согласно стандартным условиям снятия защиты для группы циклического амида. Условия удаления защитной группы можно найти в Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3rd Ed., 1999, John Wiley & Sons, NY и Harrison et al. Некоторые условия снятия защиты включают гидразиновый реактив, аминный реактив или натрия боргидрид. Снятие защиты с группы Вое может осуществляться с помощью ТФУ. Другие реактивы для снятия защиты включают, не ограничиваясь ими, гидразин, метилгидразин, фенилгидразин, натрия боргидрид и метиламин. Продукт и промежуточные соединения могут быть очищены обычными средствами, такими как очистка методом ВЭЖХ.

Средний специалист в данной области будет понимать, что важны такие факторы, как рН и стерические помехи (т.е. доступность альдегидной метки для реакции с целевым реакционно-способным партнером). Модификация условий реакции для обеспечения оптимальных условий конъюгации находится в пределах компетенции среднего специалиста, и является рутинной в данной области. В целом, это проведение реакций конъюгации обычно желательно при рН ниже 7, причем рН составляет приблизительно 5,5, приблизительно 6, приблизительно 6,5, обычно значение приблизительно 5,5 является оптимальным. Если конъюгацию проводят с меченым альдегидом полипептидом, присутствующим в или на живой клетке, условия выбирают таким образом, чтобы они были физиологически совместимыми. Например, значение рН может быть временно снижено на период времени, достаточный, чтобы позволить реакции происходить, но в пределах периода, переносимого клеткой, содержащей альдегидную метку (например, от приблизительно 30 минут до 1 часа). Физиологические условия для проведения модификации меченых альдегидом полипептидов на поверхности клетки могут быть сходны с используемыми в реакции кетон-азид для модификации клеток, несущих азиды на поверхности клетки (см., например, патент США 6,570,040).

Низкомолекулярные соединения, содержащие или модифицированные таким образом, чтобы содержать α-нуклеофильную группу, которая служит реакционно-способным партнером с альдегидом FGly метки альд, также предусмотрены для использования в качестве лекарственных средств в конъюгатах Ig с лекарственным средством по настоящему изобретению. В данной области известны общие схемы химического синтеза и условия, пригодные для синтеза представляющего интерес соединения (см., например, Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001; или Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978).

Поэтому молекулы небольшого размера, содержащие аминоокси или гидразоновую группу для реакции с альдегидом FGly меченого альд полипептида Ig, доступны или могут быть легко синтезированы. Группа аминоокси или гидразоновая группа может быть введена в молекулу небольшого размера с использованием стандартных методов химического синтеза.

Конъюгаты Ig

В некоторых вариантах, объект конъюгат Ig представляет собой конъюгат антитела. Например, в данном изобретении предлагается конъюгат антитела, который содержит объект конъюгат Ig, причем конъюгат антитела связывается с антигеном. Конъюгат антитела может содержать группу J1, ковалентно связанную только с константной областью тяжелой цепи Ig, ковалентно связанную только с константной областью легкой цепи Ig, или группу J1, ковалентно связанную с константной областью тяжелой цепи Ig, и группу J1, ковалентно связанную с константной областью легкой цепи Ig.

Конъюгат антитела может обладать любым из множества видов специфичности связывания с антигеном, как изложено выше, в том числе, например, присутствующим на раковой клетке антигеном; присутствующим на аутоиммунной клетке антигеном; присутствующим на патогенном микроорганизме антигеном; присутствующим на зараженной вирусом клетке антигеном (например, клетка человека, зараженная вирусом иммунодефицита), например, CD4 или gp120; присутствующим на пораженной клетке антигеном; и т.п. Например, конъюгат антитела может связываться с антигеном, как отмечено выше, при том, что антиген присутствует на поверхности клетки.

Конъюгат антитела по настоящему изобретению может содержать как группу J1 любое из множества соединений, как изложено выше, например, лекарственное средство (например, пептидное лекарственное средство, низкомолекулярное лекарственное средство, и т.п.), растворимый в воде полимер, обнаруживаемую метку, синтетический пептид, и т.п.

Конъюгат антитела по настоящему изобретению может связываться с антигеном с подходящим сродством связывания, например, от приблизительно 5×10-6 М до приблизительно 10-7 М, от приблизительно 10-7 М до приблизительно 5×10-7 М, от приблизительно 5×10-7 М до приблизительно 10-8 М, от приблизительно 10-8 М до приблизительно 5×10-8 М, от приблизительно 5×10-8 М до приблизительно 10-9 М, или сродством связывания более 10-9 М.

В качестве неограничивающих примеров, объект конъюгат антитела может связываться с антигеном, присутствующим на раковой клетке (например, специфический для опухоли антиген; антиген, который чрезмерно экспрессируется на раковой клетке; и т.п.), и группа J1 может представлять собой цитотоксическое соединение (например, цитотоксическую молекулу небольшого размера, синтетический цитотоксический пептид, и т.п.). Например, объект конъюгат антитела может быть специфичным в отношении CD19, причем группа J1 представляет собой цитотоксическое соединение (например, цитотоксическая молекула небольшого размера, цитотоксический синтетический пептид, и т.п.). В качестве другого примера, объект конъюгат антитела может быть специфичным в отношении CD22, причем группа J1 может представлять собой цитотоксическое соединение (например, цитотоксическую молекулу небольшого размера, цитотоксический синтетический пептид, и т.п.).

В качестве дальнейших неограничивающих примеров, объект конъюгат антитела может связываться с антигеном, присутствующим на зараженной вирусом клетке (например, при том, что антиген кодируется вирусом; при этом антиген экспрессируется на типе клеток, который заражен вирусом; и т.п.), и группа J1 может представлять собой ингибитор слияния вируса. Например, объект конъюгат антитела может связываться с CD4, и группа J1 может представлять собой ингибитор слияния вируса. В качестве другого примера, объект конъюгат антитела может связываться с gp120, и группа J1 может представлять собой ингибитор слияния вируса.

Композиции

Конъюгаты Ig (включающие конъюгаты антитела) по настоящему изобретению могут быть введены в композиции множеством различных способов. В целом, если конъюгат Ig представляет собой конъюгат Ig с лекарственным средством, конъюгат Ig вводят в композицию, до определенной степени совместимую с лекарственным средством, конъюгированным с Ig, подлежащим лечению состоянием, и используемым способом введения.

Конъюгат Ig (например, конъюгат Ig с лекарственным средством) может быть предложен в любой подходящей форме, например, в форме фармацевтически приемлемой соли, и может быть введен в композицию для любого подходящего способа введения, например, перорального, местного применения или парентерального введения. Если конъюгат Ig предложен как жидкость для инъекции (как в тех вариантах, когда его вводят внутривенно или непосредственно в ткань), конъюгат Ig может быть предложен в виде дозированной лекарственной формы, готовой к применению, или в виде стабильного при хранении порошка для разведения или жидкости, состоящей из фармацевтически приемлемых носителей и вспомогательных веществ.

Способы введения в композицию конъюгата Ig могут быть адаптированы на основе доступных в данной области. Например, конъюгат Ig может быть предложен в фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество конъюгата Ig и фармацевтически приемлемого носителя (например, солевого раствора). Фармацевтическая композиция необязательно может содержать другие добавки (например, буферы, стабилизаторы, консерванты, и т.п.). Особый интерес в некоторых вариантах представляют собой препараты, пригодные для введения млекопитающему, особенно пригодные для введения человеку.

Способы лечения

Конъюгаты Ig с лекарственным средством по настоящему изобретению находят применение в лечении состояния или заболевания у субъекта, которое поддается лечению введением родительского лекарственного средства (т.е. лекарственного средства до конъюгации с Ig). "Лечение" означает, что достигается как минимум облегчение симптомов, связанных с состоянием, поразившим хозяина, причем облегчение в широком смысле обозначает как минимум уменьшение величины параметра, например, симптома, связанного состоянием, которое лечат. Как таковое, лечение также включает ситуации, в которых патологическое состояние, или как минимум связанные с ним симптомы, полностью подавляются, например, не возникают вообще, или происходит их остановка, например, прекращение, таким образом, что хозяин более не страдает от состояния, или как минимум симптомов, которыми характеризуется состояние. Поэтому лечение включает: (i) предотвращение, т.е. снижение риска развития клинических симптомов, в том числе отсутствие развития клинических симптомов, например, предупреждение прогресса заболевания до патологического состояния; (ii) торможение, т.е. остановка развития или дальнейшего развития клинических симптомов, например, смягчение или полное торможение активного заболевания; и/или (iii) облегчение, т.е. регресс клинических симптомов.

В контексте рака, термин "лечение" включает любое или все из: уменьшение роста солидной опухоли, торможение репликации раковых клеток, уменьшение общей опухолевой нагрузки и облегчение одного или более симптомов, связанных с раком.

Субъект, получающий лечение, может быть таким, который нуждается в терапии, когда хозяин, получающий лечение, отвечает на лечение с применением родительского лекарственного средства. Соответственно, множество субъектов может отвечать на лечение с использованием конъюгатов Ig с лекарственным средством, раскрытых в данном описании. В общем, такие субъекты являются "млекопитающими", причем особый интерес представляет собой человек. Другие субъекты могут включать домашних животных (например, собаки и кошки), домашний скот (например, коровы, свиньи, козы, лошади, и т.п.), грызунов (например, мыши, морские свинки и крысы, например, как в животных моделях заболевания), а также приматов, кроме человека (например, шимпанзе и обезьян).

Количество конъюгата Ig с лекарственным средством для введения может быть изначально определено на основании дозы и/или схемы лечения в инструкции по применению родительского лекарственного средства. В целом, конъюгат Ig с лекарственным средством может обеспечивать целенаправленную доставку и/или увеличение периода полувыведения из сыворотки связанного лекарственного средства, таким образом, обеспечивая как минимум одно из снижения дозы или уменьшения количества доз в схеме лечения. Таким образом, конъюгат Ig с лекарственным средством может обеспечивать снижение дозы и/или уменьшение количества доз в схеме лечения относительно родительского лекарственного средства до конъюгации в конъюгате Ig с лекарственным средством по настоящему изобретению.

К тому же, как отмечается выше, поскольку конъюгат Ig с лекарственным средством может обеспечивать контролируемую стехиометрию доставки лекарственного средства, дозы конъюгатов Ig с лекарственным средством могут быть вычислены на основании количества молекул лекарственного средства, предложенных на основе конъюгата Ig с лекарственным средством.

В некоторых вариантах, вводят множественные дозы конъюгата Ig с лекарственным средством. Частота введения конъюгата Ig с лекарственным средством может варьировать в зависимости от любого из множества факторов, например тяжести симптомов, и т.п. Например, в некоторых вариантах, конъюгат Ig с лекарственным средством вводят 1 раз в месяц, 2 раза в месяц, 3 раза в месяц, каждую вторую неделю (qow), 1 раз в неделю (qw), 2 раза в неделю (biw), 3 раза в неделю (tiw), 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, 6 раз в неделю, через день (qod), ежедневно (qd), 2 раза в день (qid) или 3 раза в день (tid).

Способы лечения рака

В данном изобретении предлагаются способы доставки химиотерапевтического противоракового средства в организм индивидуума, страдающего раком. Способы пригодны для лечения широкого спектра видов рака, в том числе карциномы, саркомы, лейкоза и лимфомы.

Виды карциномы, которые можно лечить с применением способа по изобретению включают, не ограничиваясь ими, карциному пищевода, печеночно-клеточную карциному, базально-клеточную карциному (форма рака кожи), плоскоклеточную карциному (различные ткани), карциному мочевого пузыря, в том числе переходно-клеточную карциному (злокачественное новообразование мочевого пузыря), бронхогенную карциному, карциному ободочной кишки, карциному ободочной и прямой кишки, карциному желудка, карциному легкого, в том числе мелкоклеточную карциному и немелкоклеточную карциному легкого, карциному надпочечников, карциному щитовидной железы, карциному поджелудочной железы, карциному молочной железы, карциному яичника, карциному предстательной железы, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, сосковидную карциному, сосковидную аденокарциному, цистаденокарциному, карциному мозга, почечно-клеточную карциному, карциному протоков in situ или карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильмса, карциному шейки матки, карциному матки, карциному яичка, остеогенную карциному, карциному эпителия, назофарингеальную карциному, и т.п.

Саркомы, которые можно лечить с применением способа по изобретению включают, не ограничиваясь ими, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, хордому, остеогенную саркому, остеосаркому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, саркому Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому и другие виды саркомы мягких тканей.

Другие солидные опухоли, которые можно лечить с применением способа по изобретению, включают, не ограничиваясь ими, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, акустическую неврому, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому и ретинобластому.

Виды лейкоза, которые можно лечить с применением способа по изобретению, включают, не ограничиваясь ими: а) хронические миелопролиферативные синдромы (неопластические расстройства полипотентных гемопоэтических стволовых клеток); б) острый миелогенный лейкоз (неопластическая трансформация полипотентной гемопоэтической стволовой клетки или гемопоэтической клетки с ограниченной способностью к дифференцировке; в) хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ; клональная пролиферация иммунологически незрелых и функционально некомпетентных лимфоцитов маленького размера), в том числе B-клеточный ХЛЛ, пролимфоцитарный лейкоз ХЛЛ Т-клеток и волосато-клеточный лейкоз; и г) острые лимфобластные лейкозы (характеризуемые аккумуляцией лимфобластов). Лимфомы, которые можно лечить с применением способа по изобретению, включают, не ограничиваясь ими, лимфомы В-клеток (например, лимфома Буркитта); лимфому Ходжкина; неходжкинскую лимфому В-клеток; и т.п.

Примеры

Следующие примеры приведены с целью обеспечить среднего специалиста в данной области полным раскрытием и описанием того, как осуществить и применить настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения контекста того, что изобретатели расценивают как их изобретение, а также не предназначены для представления того, что описанные ниже эксперименты представляют исчерпывающий перечень или являются единственными выполненными экспериментами. Приложены старания, чтобы гарантировать точность относительно используемых чисел (например, количества, температура, и т.п.), но следует учитывать, что возможны некоторые ошибки эксперимента и отклонения. Если не указанно иное, части представляют собой части по массе, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, и давление равно или приблизительно равно атмосферному. Могут использоваться стандартные сокращения, например по, пары оснований; Кб, тысячи пар оснований; пл, пиколитр(ы); с или сек., секунда(ы); мин, минута(ы); час, час(ы); ак, аминокислота(ы); нт, нуклеотид(ы); в/м, внутримышечный(о); в/б, внутрибрюшинный(о); п/к, подкожный(о); и т.п.

Пример 1: Клонирование специфичных антител CD19 и CD22

Гены, кодирующие специфичные вариабельные области легкой цепи CD19 и CD22, были синтезированы и клонированы в плазмиду, содержащую константную область легкой цепи каппа человеческого IgG, с использованием рестрикционных сайтов NcoI и BsiWI. Константный участок легкой цепи плазмиды был дикого типа или содержал LCTPSR (SEQ ID NO:17) или LATPSR (SEQ ID NO:24), которые были вставлены в плазмиду с использованием мутагенеза Quikchange.

Гены, кодирующие специфичные вариабельные области тяжелой цепи CD19 и CD22, были синтезированы и клонированы в плазмиду, содержащую константную область тяжелой цепи человеческого IgG, с использованием рестрикционных сайтов EcoRI и NheI. Константный участок тяжелой цепи плазмиды был дикого типа или содержал LCTPSR (SEQ ID NO:17) или LATPSR (SEQ ID NO:24), которые были вставлены в плазмиду с использованием мутагенеза Quikchange.

На фиг.3 показаны последовательности аминокислот константных областей легкой цепи (верхняя последовательность) и тяжелой цепи (нижняя последовательность) анти-CD19, с мотивом сульфатазы LCTPSR в константной области тяжелой цепи. Сигнальный пептид показан строчными буквами; вариабельная область подчеркнута; доступные для растворителя области петли в константных областях показаны полужирным шрифтом с подчеркиванием. Последовательность LCTPSR показана полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Начальный метионин (М) присутствует в последовательностях аминокислот тяжелой и легкой цепи для целей облегчения экспрессии и может необязательно присутствовать в этих и всех последовательностях аминокислот тяжелых и легких цепей, описанных в данном описании.

Последовательности анти-CD19 и анти-CD22 дикого типа

Последовательности аминокислот тяжелых и легких цепей анти-CD22 дикого типа (не меченое альдегидом) показаны на фиг.6Б и 19Б, соответственно. Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелые и легкие цепи анти-CD22 дикого типа (не меченое альдегидом), показаны на фиг.6А и 15А, соответственно.

Последовательности аминокислот тяжелых и легких цепей анти-CD19 дикого типа (не меченое альдегидом) показаны на фиг.19Б и 31Б, соответственно. Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелые и легкие цепи анти-CD19 дикого типа (не меченое альдегидом), показаны на фиг.19А и 31А, соответственно.

Последовательности тяжелых цепей анти-CD19 и анти-CD22, модифицированные для введения LCTPSR

Аминокислотные последовательности константных областей тяжелой цепи анти-CD22, модифицированных для введения последовательности альдегидной метки LCTPSR (которая распознается и превращается под действием FGE), показаны на фиг.7Б, 8Б и 9Б, на которых альдегидная метка расположена на участке СН1; фиг.11Б, 12Б и 13Б, на которых альдегидная метка расположена на участке СН2; фиг.15Б, на которых альдегидная метка расположена на участке СН2/CH3; и фиг.17Б, на которых альдегидная метка расположена вблизи C-конца. На фиг.7А, 8А, 9А, 11А, 12А, 13А и 15А предложены нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности аминокислот, показанные на фиг.7А, 8Б, 9Б, 11Б, 12Б, 13Б и 15Б, соответственно.

Последовательности аминокислот константных областей тяжелой цепи анти-CD19, модифицированные для введения последовательности альдегидной метки LCTPSR (которая распознается и превращается под действием FGE), показаны на фиг.23Б, на которой альдегидная метка расположена на участке СН1; фиг.25Б, на которой альдегидная метка расположена на участке СН2; фиг.27Б, на которой альдегидная метка расположена на участке СН2/CH3; и фиг.29Б, на которой альдегидная метка расположена вблизи С-конца. На фиг.19А, 21А, 23А и 25А предложены нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности аминокислот, показанные на фиг.19Б, 21Б, 23Б и 25Б, соответственно.

Последовательности тяжелых цепей анти-CD19 и анти-CD22, модифицированные для введения LATPSR

Последовательности аминокислот константных областей тяжелой цепи анти-CD22, модифицированные для введения контрольной последовательности LATPSR (которая не распознается FGE), показаны на фиг.10Б, на которой контрольная последовательность расположена на участке СН1; фиг.14Б, на которой контрольная последовательность расположена на участке СН2; фиг.16Б, на которой контрольная последовательность расположена на участке СН2/CH3; и фиг.18Б, на которой контрольная последовательность расположена вблизи С-конца. На фиг.10А, 14А, 16А и 18А предложены нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности аминокислот, показанные на фиг.10Б, 14Б, 16Б и 18Б, соответственно.

Аминокислотные последовательности константных областей тяжелой цепи анти-CD19, модифицированные для введения контрольной последовательности LATPSR (которая не распознается FGE), показаны на фиг.24Б, на которой контрольная последовательность расположена на участке СН1; фиг.26Б, на которой контрольная последовательность расположена на участке СН2; фиг.28Б, на которой контрольная последовательность расположена на участке СН2/CH3; и фиг.30Б, на которой контрольная последовательность расположена вблизи С-конца.

Последовательности легких цепей анти-CD19 и анти-CD22, модифицированные для введения LCTPSR

Последовательность аминокислот константной области легкой цепи анти-CD22, модифицированная для введения последовательности альдегидной метки LCTPSR, показана на фиг.20Б. На фиг.20А предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность аминокислот, показанную на фиг.20Б. На фиг.21Б предложена последовательность аминокислот константной области легкой цепи анти-CD22, модифицированного для введения контрольной последовательности LATPSR; на фиг.21А предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность аминокислот, показанную на фиг.21Б.

Последовательность аминокислот константной области легкой цепи анти-CD19, модифицированная для введения последовательности альдегидной метки LCTPSR, показана на фиг.32Б. На фиг.32А предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность аминокислот, показанную на фиг.32Б. На фиг.33Б предложена последовательность аминокислот легкой цепи константной области анти-CD22, модифицированная для введения контрольной последовательности LATPSR; на фиг.33А предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность аминокислот, показанную на фиг.33Б.

Пример 2: Экспрессия и очистка специфичных антител CD19 и CD22

Плазмиды, содержащие гены, кодирующие специфичные тяжелые и легкие цепи CD19 или CD22, были трансфицированы в клетки СНО-K1, стабильно экспрессирующие человеческий FGE, с использованием реактива для трансфекции Липофектамин 2000. По 12 мкг плазмид тяжелой и легкой цепи использовали на каждые 10 мл не бессывороточной среды Опти-МЕМ. После истечения 5 час при температуре 37°С Опти-МЕМ удаляли, и добавляли безбелковую среду Экс-Целл 325. Через 72 час при 37°С среду собирали и очищали от обломков клеток. Очищенную среду объединяли с буфером связывания Протеина А и смолой с Протеином А и инкубировали с вращением в течение 1 час при комнатной температуре (RT). Смесь наносили на колонку, чтобы обеспечить вымывание несвязанного материала. Смолу промывали буфером связывания Протеина А, и затем элюировали 5 буфером элюации Протеина А.

Константные области тяжелой цепи анти-CD19 и анти-CD22 были модифицированы для введения альдегидной метки в домен СН1, домен СН2 или домен CH3. Легкие цепи анти-CD19 и анти-CD22 также были модифицированы для введения альдегидной метки. Меченые альдегидом анти-CD19 и меченые альдегидом анти-CD22 антитела анализировали методом белкового блоттинг-анализа. Результаты показаны на фиг.4.

Как показано на фиг.4, введение альдегидной метки не нарушало экспрессии, свертывания или секреции белка, "альд" обозначает модификацию константной области для введения LCTPSR - последовательности, которая распознается FGE. "С2А" обозначает модификацию константной области для введения "LATPSR" - последовательности, которая не распознается FGE.

Меченые альдегидом анти-CD19 и анти-CD22 антитела включают альдегидные метки как в тяжелой, так и в легкой цепи.

Пример 3: Конъюгация аминоокси FLAG пептида с очищенным, меченым альдегидом антителом

Очищенные антитела объединяли с 1 мМ аминоокси FLAG пептида и 100 мМ MES буфера (рН 5,5) на 16 час при комнатной температуре (RT). Образцы разгоняли методом электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и анализировали методом вестерн-блоттинга с использованием анти-FLAG антитела, чтобы обнаружить конъюгацию пептида FLAG с антителом.

Результаты показаны на фиг.5. На фиг.5 показаны результаты блоттинг-анализа белка для меченых альдегидом анти-CD19 и меченых альдегидом анти-CD22 антител, химически конъюгированных с аминоокси-FLAG.

На фиг.5А схематически изображена экспрессия белка, с последующей альдегид-специфической химической конъюгацией. Вестерн-блот, с использованием в качестве зонда козьего анти-человеческого IgG или анти-FLAG антитела, иллюстрирует пример конъюгации белка. Не наблюдалось метки для меченого (LATPSR) антитела С2А (нижняя панель).

На фиг.5Б показана метка аминоокси FLAG меченых анти-CD19 и анти-CD22 IgG. Нагрузка белком и введение метки контролировались методом вестерн-блоттинга. "CtoA" обозначает антитела, модифицированные для введения последовательности LATPSR.

В то время как настоящее изобретение описано со ссылкой на его конкретные варианты, квалифицированным специалистам следует понимать, что различные модификации могут быть внесены, и эквиваленты могут быть заменены без отхода от истинного духа и объема изобретения. Кроме того, множество модификаций может быть осуществлено для адаптации конкретной ситуации, материала, композиции вещества, способа, стадии или стадий способа, к задаче, духу и контексту настоящего изобретения. Все такие модификации рассматриваются как находящиеся в пределах объема приложенной формулы изобретения.

1. Антитело для получения конъюгата антитела, содержащее полипептид иммуноглобулина Ig, содержащий последовательность аминокислот мотива сульфатазы,

при том, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи доступного для растворителя участка петли константной области Ig полипептида Ig,

где мотив сульфатазы содержит последовательность аминокислот формулы X1Z1X2Z2X3Z3, причем

Z1 представляет собой цистеин, серин или 2-формилглицин (FGly);

Z2 представляет собой остаток пролина или аланина;

Z3 является алифатической аминокислотой или основной аминокислотой;

X1 присутствует или отсутствует и, если присутствует, может представлять собой любую аминокислоту;

каждый из X2 и X3 независимо представляет собой любую аминокислоту,

где доступный для растворителя участок петли является доступной для растворителя петлей, из:

константной области тяжелой цепи Ig, и соответствует аминокислотам 1-6, 16-22, 42-46, 99-120, 148-156, 208-214 или 220-228 аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи IgG1, представленной в SEQ ID NO: 2; или

константной области легкой цепи Ig, и соответствует аминокислотам 44-51 аминокислотной последовательности константной области легкой цепи каппа, представленной в SEQ ID NO: 1.

2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что Z3 представляет собой аргинин (R).

3. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что каждый из X1, если он присутствует, X2 и X3 независимо представляет собой алифатическую аминокислоту, серосодержащую аминокислоту или полярную, незаряженную аминокислоту.

4. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что X1, если он присутствует, представляет собой L, М, V, S или Т.

5. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что каждый из X2 и X3 независимо представляет собой S, Т, А, V, G или С.

6. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что мотив сульфатазы расположен в пределах или примыкает к доступному для растворителя участку петли константной области тяжелой цепи Ig.

7. Антитело по п. 6, отличающееся тем, что константная область тяжелой цепи Ig представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1.

8. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что мотив сульфатазы расположен в пределах или примыкает к доступному для растворителя участку петли константной области легкой цепи Ig.

9. Антитело по п. 8, отличающееся тем, что константная область легкой цепи Ig представляет собой константную область легкой цепи каппа.

10. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что полипептид Ig содержит два или более мотивов сульфатазы.

11. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что мотив сульфатазы содержит аминокислотную последовательность L(C/S)TPSR.

12. Антитело по п. 11, отличающееся тем, что мотив сульфатазы содержит аминокислотную последовательность LCTPSR (SEQ ID NO: 17).

13. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что доступный растворителю участок петли является доступным растворителю участком петли константной области тяжелой цепи IgG1 и имеет аминокислотную последовательность:

ASTKGP (SEQ ID NO: 71);

KSTSGGT (SEQ ID NO: 72);

NSGALTSG (SEQ ID NO: 202);

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 77);

SHEDPEV (SEQ ID NO: 223);

NKALPAP (SEQ ID NO: 84); или

KAKGQPR (SEQ ID NO: 206); или

является доступным растворителю участком петли константной области легкой цепи каппа, и имеет аминокислотную последовательность DNALQSGN (SEQ ID NO: 211).

14. Антитело по п. 13, отличающееся тем, что мотив сульфатазы содержит аминокислотную последовательность LCTPSR (SEQ ID NO: 17),

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли ASTKGP (SEQ ID NO: 71) модифицирована в ASTKGLCTPSR;

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли NSGALTSG (SEQ ID NO: 202) модифицирована в NSGALCTPSRG (SEQ ID NO: 203);

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 77) модифицирована в EPKSCDKTHTCPPCPLCTPSRELLGG;

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли SHEDPEV (SEQ ID NO: 223) модифицирована в SHEDLCTPSREV;

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли NKALPAP (SEQ ID NO: 84) модифицирована в NLCTPSRAP;

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли KAKGQPR (SEQ ID NO: 206) модифицирована в KAKGLCTPSR (SEQ ID NO: 207); или

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли DNALQSGN (SEQ ID NO: 211) модифицирована в DNALCTPSRQSGN (SEQ ID NO: 219).

15. Антитело по п. 13, отличающееся тем, что антитело содержит константную область тяжелой цепи IgG1, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую:

остаткам 136-469 из SEQ ID NO: 16;

остаткам 136-467 из SEQ ID NO: 19;

остаткам 136-468 из SEQ ID NO: 21;

остаткам 144-476 из SEQ ID NO: 50;

остаткам 136-468 из SEQ ID NO: 26;

остаткам 136-470 из SEQ ID NO: 28;

остаткам 136-467 из SEQ ID NO: 30;

остаткам 144-475 из SEQ ID NO: 54;

остаткам 136-468 из SEQ ID NO: 34; или

остаткам 144-476 из SEQ ID NO: 58; или

константную область легкой цепи каппа, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую:

остаткам 134-245 из SEQ ID NO: 44; или

остаткам 133-244 из SEQ ID NO: 68.

16. FGly-модифицированное антитело, включающее антитело по любому из пунктов 1-15, где мотив сульфатазы в полипептиде иммуноглобулина (Ig) модифицирован формилглицин-образующим ферментом (FGE) таким образом, чтобы содержать остаток 2-формилглицина (FGly), для конъюгирования с ним молекулы.

17. Конъюгат антитела для направленной доставки ковалентно конъюгированной молекулы, который содержит:

FGly-модифицированное антитело по п. 16; и

ковалентно конъюгированную молекулу,

причем FGly ковалентно связан с молекулой.

18. Конъюгат антитела по п. 17, отличающийся тем, что ковалентно присоединенная молекула выбрана из лекарственного средства, детектируемой метки, водорастворимого полимера и синтетического пептида.

19. Конъюгат антитела по п. 17, отличающийся тем, что указанный конъюгат антитела содержит два или более модифицированных мотивов сульфатазы.

20. Конъюгат антитела по п. 18, отличающийся тем, что ковалентно присоединенная молекула представляет собой низкомолекулярное лекарственное средство.

21. Конъюгат антитела по п. 20, отличающийся тем, что указанное низкомолекулярное лекарственное средство представляет собой противораковое химиотерапевтическое средство.

22. Конъюгат антитела по п. 21, отличающийся тем, что указанное противораковое химиотерапевтическое средство представляет собой алкилирующее средство, нитрозомочевину, антиметаболит, противоопухолевый антибиотик, алкалоид барвинка или стероидный гормон.

23. Конъюгат антитела по п. 18, отличающийся тем, что ковалентно присоединенная молекула представляет собой водорастворимый полимер.

24. Конъюгат антитела по п. 23, отличающийся тем, что водорастворимый полимер представляет собой поли(этиленгликоль).

25. Конъюгат антитела по п. 18, отличающийся тем, что ковалентно присоединенная молекула представляет собой детектируемую метку.

26. Конъюгат антитела по п. 25, отличающийся тем, что детектируемая метка представляет собой средство для визуализации.

27. Конъюгат антитела по п. 17, отличающийся тем, что указанный конъюгат антитела содержит молекулу, ковалентно связанную с константной областью тяжелой цепи Ig, и молекулу, ковалентно связанную с константной областью легкой цепи Ig.

28. Конъюгат антитела по п. 17, отличающийся тем, что указанное антитело специфично связывается с опухолевым антигеном на раковой клетке.

29. Конъюгат антитела по п. 28, отличающийся тем, что полипептид Ig через модифицированный FGly-остаток ковалентно присоединен к цитотоксическому средству.

30. Конъюгат антитела по п. 17, отличающийся тем, что указанное антитело специфично связывается с антигеном на клетке, зараженной вирусом.

31 Конъюгат антитела по п. 30, отличающийся тем, что антиген кодируется вирусом.

32. Конъюгат антитела по п. 30, отличающийся тем, что полипептид Ig через модифицированный FGly-остаток ковалентно присоединен к ингибитору слияния вируса.

33. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид иммуноглобулина (Ig) с альдегидным тэгом для получения антитела по п. 1, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид Ig, где полипептид Ig содержит мотив сульфатазы, где мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи доступного для растворителя участка петли константной области полипептида Ig,

где мотив сульфатазы содержит последовательность аминокислот формулы X1Z1X2Z2X3Z3, причем

Z1 представляет собой цистеин или серин;

Z2 представляет собой остаток пролина или аланина;

Z3 является алифатической аминокислотой или основной аминокислотой;

X1 присутствует или отсутствует и, если присутствует, может представлять собой любую аминокислоту;

каждый из X2 и X3 независимо представляет собой любую аминокислоту,

где доступный для растворителя участок петли является доступной для растворителя петлей, из:

константной области тяжелой цепи Ig, и соответствует аминокислотам 1-6, 16-22, 42-46, 99-120, 148-156, 208-214 или 220-228 аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи IgG1, представленной в SEQ ID NO: 2; или

константной области легкой цепи Ig, и соответствует аминокислотам 44-51 аминокислотной последовательности константной области легкой цепи каппа, представленной в SEQ ID NO: 1.

34. Нуклеиновая кислота по п. 33, отличающаяся тем, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи доступного для растворителя участка петли константной области тяжелой цепи Ig.

35. Нуклеиновая кислота по п. 34, отличающаяся тем, что полипептид Ig дополнительно содержит вариабельную область тяжелой цепи Ig.

36. Нуклеиновая кислота по п. 33, отличающаяся тем, что мотив сульфатазы расположен в пределах или вблизи доступного для растворителя участка петли константной области легкой цепи Ig.

37. Нуклеиновая кислота по п. 33, отличающаяся тем, что полипептид Ig дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи Ig.

38. Нуклеиновая кислота по п. 33, отличающаяся тем, что мотив сульфатазы содержит аминокислотную последовательность L(C/S)TPSR.

39. Нуклеиновая кислота по п. 38, отличающаяся тем, что мотив сульфатазы содержит аминокислотную последовательность LCTPSR (SEQ ID NO: 17).

40. Нуклеиновая кислота по п. 33, отличающаяся тем, что доступный растворителю участок петли:

является доступным растворителю участком петли константной области тяжелой цепи IgG1 и имеет аминокислотную последовательность:

ASTKGP (SEQ ID NO: 71);

KSTSGGT (SEQ ID NO: 72);

NSGALTSG (SEQ ID NO: 202);

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 77);

SHEDPEV (SEQ ID NO: 223);

NKALPAP (SEQ ID NO: 84); или

KAKGQPR (SEQ ID NO: 206); или

является доступным растворителю участком петли константной области легкой цепи каппа и имеет аминокислотную последовательность DNALQSGN (SEQ ID NO: 211).

41. Нуклеиновая кислота по п. 40, отличающаяся тем, что мотив сульфатазы содержит аминокислотную последовательность LCTPSR (SEQ ID NO: 17), и

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли ASTKGP (SEQ ID NO: 71) модифицирована в ASTKGLCTPSR;

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли NSGALTSG (SEQ ID NO: 202) модифицирована в NSGALCTPSRG (SEQ ID NO: 203);

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 77) модифицирована в EPKSCDKTHTCPPCPLCTPSRELLGG;

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли SHEDPEV (SEQ ID NO: 223) модифицирована в SHEDLCTPSREV;

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли NKALPAP (SEQ ID NO: 84) модифицирована в NLCTPSRAP;

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли KAKGQPR (SEQ ID NO: 206) модифицирована в KAKGLCTPSR (SEQ ID NO: 207); или

где аминокислотная последовательность доступной растворителю петли DNALQSGN (SEQ ID NO: 211) модифицирована в DNALCTPSRQSGN (SEQ ID NO: 219).

42. Нуклеиновая кислота по п. 40, отличающаяся тем, что антитело содержит:

константную область тяжелой цепи IgG1, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую:

остаткам 136-469 из SEQ ID NO: 16;

остаткам 136-467 из SEQ ID NO: 19;

остаткам 136-468 из SEQ ID NO: 21;

остаткам 144-476 из SEQ ID NO: 50;

остаткам 136-468 из SEQ ID NO: 26;

остаткам 136-470 из SEQ ID NO: 28;

остаткам 136-467 из SEQ ID NO: 30;

остаткам 144-475 из SEQ ID NO: 54;

остаткам 136-468 из SEQ ID NO: 34; или

остаткам 144-476 из SEQ ID NO: 58; или

константную область легкой цепи каппа, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую:

остаткам 134-245 из SEQ ID NO: 44; или

остаткам 133-244 из SEQ ID NO: 68.

43. Рекомбинантный вектор экспрессии для экспрессии полипептида Ig в клетке-хозяине, который содержит нуклеиновую кислоту по п. 33-42, функционально связанную с промотором.

44. Рекомбинантный вектор экспрессии по п. 43, отличающийся тем, что вектор содержит сайт встраивания для вариабельной области Ig в 5' направлении относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид Ig с альдегидным тэгом.

45. Вектор экспрессии по п. 43, отличающийся тем, что клетка-хозяин является клеткой млекопитающего.

46. Библиотека рекомбинантных векторов экспрессии, которая содержит:

популяцию рекомбинантных векторов экспрессии по п. 43, при том, что каждый член популяции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид иммуноглобулина, который содержит альдегидный тэг отличным от других образом.

47. Библиотека FGly-модифицированных антител, где каждое антитело содержит полипептид иммуноглобулина (Ig) с альдегидным тэгом, которая содержит:

популяцию FGly-модифицированных антител по п. 16, при том, что указанная популяция включает члены, содержащие полипептиды Ig, которые содержат альдегидный тэг отличным от других образом.

48. Фармацевтическая композиция, которая содержит:

а) эффективное количество конъюгата антитела по п. 17; и

б) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

49. Композиция по п. 48, отличающаяся тем, что ковалентно присоединенная молекула выбрана из лекарственного средства, детектируемой метки, водорастворимого полимера или синтетического пептида.

50. Композиция по п. 49, отличающаяся тем, что ковалентно присоединенная молекула выбрана из низкомолекулярного лекарственного средства.

51. Композиция по п. 50, отличающаяся тем, что низкомолекулярное лекарственное средство представляет собой противораковое химиотерапевтическое средство.

52. Композиция по п. 51, отличающаяся тем, что химиотерапевтическое противораковое средство представляет собой алкилирующее средство, нитрозомочевину, антиметаболит, противоопухолевый антибиотик, алкалоид барвинка или стероидный гормон.

53. Композиция по п. 49, отличающаяся тем, что ковалентно присоединенная молекула представляет собой водорастворимый полимер.

54. Композиция по п. 53, отличающаяся тем, что водорастворимый полимер представляет собой поли(этиленгликоль).

55. Композиция по п. 49, отличающаяся тем, что ковалентно присоединенная молекула представляет собой детектируемую метку.

56. Композиция по п. 55, отличающаяся тем, что детектируемая метка представляет собой средство для визуализации.

57. Способ получения конъюгата антитела, который включает этапы:

проведение реакции FGly-модифицированного антитела по п. 16 с реакционно-способным партнером, содержащим группу, реагирующую с альдегидом, и молекулу, для образования продукта реакции, содержащего молекулу, ковалентно конъюгированную с FGly-модифицированным полипептидом Ig, через модифицированный остаток FGly.

58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что молекула представляет собой лекарственное средство, детектируемую метку, водорастворимый полимер или синтетический пептид.

59. Способ по п. 57, отличающийся тем, что группа, реагирующая с альдегидом, представляет собой аминоокси или гидразид реакционно-способную группу.

60. Способ направленной доставки лекарственного средства индивидууму, нуждающемуся в этом, включающий введение указанному индивидууму эффективного количества конъюгата антитела по п. 17, где присоединенная молекула является лекарственным средством и где конъюгат антитела специфически связывается с антигеном, присутствующим на поверхности клетки.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к пищевой, сельскохозяйственной, косметической и фармацевтической отраслям. Получают суспензию растительных белков, выбранных из группы, включающей гороховые белки, картофельные белки и кукурузные белки, с содержанием сухого вещества от 10 до 15%.

Группа изобретений относится к молочной промышленности. Молочный продукт с гидролизованным белком с низким содержанием лактозы получают следующим способом.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный полипептид, обладающий трипсиноподобной эндопептидазной активностью. Изобретение касается также способа получения такого полипептида, включающего культивирование рекомбинантной клетки-хозяина Bacillus subtilis, содержащей полинуклеотид, кодирующий заявленный полипептид, функционально связанный с одной или более контрольными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида в условиях, благоприятных для продукции полипептида; и выделения полипептида.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выявления присутствия двух или более представляющих интерес белков с известными аминокислотными последовательностями в образце растительного происхождения (варианты) и способу сохранения генотипа сорта трансгенного растения.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Разводят пшеничный глютен в воде с гидромодулем не менее 1:1.
Изобретение относится к биотехнологии. Плоды и кожуру бананов взвешивают, промывают, измельчают и смешивают с предварительно подогретой до 45±1°C водой в соотношении 1:3.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выделения низкомолекулярных пептидов из сырья животного происхождения, которые могут служить в качестве биологически активных веществ при создании фармацевтических или косметических композиций.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской диагностики. Предложен способ детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей или ткани млекопитающего, добавляют к образцу ионный детергент, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при получении рекомбинантных форм представляющих практический интерес белков. Предложен способ получения рекомбинантного белка через его гибридный предшественник с природным сайтом расщепления энтеропептидазой, который обеспечивает повышение качества (гомогенности) и выхода целевого продукта в условиях, когда гибридный белок обнаруживает дополнительные (скрытые) сайты расщепления энтеропептидазой.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению аналогов инсулина из их соответствующих предшественников, и может быть использовано в медицине.

Данное изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связывают дельта-подобный лиганд 4 (DLL4) человека, охарактеризованные последовательностями определяющих комплементарность участков (CDR).

Настоящее изобретние относится к области иммунологии. Предложено выделенное анти-IL-17F антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, которые охарактеризованы последовательностями CDR тяжелой и легкой цепи.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено антитело к человеческому СD52.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии. Описаны новые аденовирусные штаммы с улучшенной серопревалентностью.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению агониста рецептора паратиреоидного гормона (PTH), и может быть использовано в медицине. Полученный пептид или его фармацевтическую соль используют в составе фармацевтической композиции для лечения заболеваний, характеризующихся дисфункцией РТН или дисбалансом кальция или фосфатов.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена ДНК-конструкция, кодирующая слитый белок-предшественник, в котором вспомогательная аминокислотная последовательность связана с N-концом последовательности зрелого целевого полипептида переходной областью, предназначенной для распознавания и расщепления гибридного предшественника специфической протеазой с образованием немодифицированной зрелой формы интересующего белка.

Данное изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с CD70 человека, охарактеризованные аминокислотными последовательностями CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи.

Изобретение относится к области биохимии. Представлены варианты моноклонального антитела против CD52 человека.

Изобретения касаются способа конструирования библиотеки белков, полученных из консенсусной последовательности домена фибронектина типа III (FN3) с повышенной стабильностью, и библиотеки, полученной таким способом.

Данное изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связывают дельта-подобный лиганд 4 (DLL4) человека, охарактеризованные последовательностями определяющих комплементарность участков (CDR).
Наверх