Способ получения экзосом из крови

Авторы патента:

C12N5/00 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Владельцы патента RU 2608509:

Кастарнова Елена Сергеевна (RU)
Оробец Владимир Александрович (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения экзосом из крови, в котором кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию с помощью центрифугирования при 600 g в течение 20 минут. Клеточную фракцию подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS при рН 7,4, инкубации в течение 15 минут с последующим центрифугированием в течение 25 минут при 600 g и сбором первого супернатанта. Затем проводят встряхивание с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 500 g и сбор второго супернатанта. Фильтрацию и ультрацентрифугирование выполняют одновременно с помощью ультрацентрифужных фильтровальных пробирок. Полученный суммарный пул экзосом крови включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови. Изобретение позволяет повысить выход целевого продукта. 1 табл., 5 пр.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения экзосом из крови, и может быть использовано для изоляции и исследования микровезикул крови в диагностических целях.

Уровень техники

Известен способ выделения микровезикул эритроцитов из надосадочной жидкости, который включает забор крови, промывание эритроцитов, инкубацию отмытых клеток в присутствии кальция и ионофора А 23187, центрифугирование при 1000 g в течение 10 минут для получения супернатанта, ультрацентрифугирование супернатанта при 100000 g в течение 60 минут, получение осадка, содержащего микровезикулы (см. Allan D., Thomas P., Limbrick AR: The isolation and characterization of 60 nm vesicles (nanovesiclts) produced during ionophore A 23187 - induced budding of human erythrocytes. Biochem J 1980, 188 881-887).

Недостатком данного способа является длительность и трудоемкость выделения экзосом, низкий выход микровезикул, выделенных из крови.

Известен способ получения экзосом из плазмы крови, заключающийся в следующем. Образцы плазмы фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,220 мкм для удаления клеточного дебриса и более крупных частиц и разделяют компоненты плазмы при помощи белковой жидкостной хроматографии, фракции объединяют и концентрируют путем центрифугирования с помощью 3 кДа-отсекающих фильтров (Millipore), затем сконцентрированный препарат наносят на сахарозный градиент 0,2-0,5 M в 20 мМ трис, pH 8,0 и ультрацентрифугируют при 175000 g в течение 16 часов. Частицы, находящиеся в диапазоне концентрации сахарозы 1,08-1,15 г/мл, объединяют, отмывают раствором PBS (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 M NaCl, pH 7,5) и осаждают при помощи ультрацентрифугирования при 175000 g в течение 2 часов (см. Looze С, Yui D., Leung L., Ingham M., Yao X., Wu W.W., Shen R.-F., Daniels M.P., Levine S.J. Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPAR as an exosome - associated protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 378. P. 433-438).

Недостатками данного способа являются недостаточная чистота целевого продукта, наличие примеси микрочастиц диаметром 100-220 нм, трудоемкость и длительность, более 23 часов, выделения экзосом, ограниченное количество экзосом, выделенных из плазмы крови.

Известен способ получения экзосом из плазмы крови, заключающийся в следующем. Клетки и дебрис удаляют путем последовательного центрифугирования периферической крови, супернатант фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Экзосомы плазмы крови выделяют с помощью коммерческого набора ExoQuick™ Exosome Precipitation Solution (см. System Biosciences Inc., Mountain View, CA, USA) (Ge Q., Zhou Y., Lu J., Bai Y., Xie X., Lu Z., miRNA in plasma exosome is stable under different storage conditions // Molecules. 2014. V. 19. P. 1568-1575).

Недостатками данного способа являются его недостаточная чистота целевого продукта, наличие примеси микрочастиц диаметром 100-220 нм, трудоемкость и длительность, более 10 часов, выделения экзосом, высокая стоимость коммерческого набора для выделения экзосом, ограниченное количество экзосом, выделенных из плазмы крови.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ получения экзосом из крови, включающий разделение крови на бесклеточную и клеточную фракции с помощью центрифугирования с последующим получением экзосом путем ультрацентрифугирования, при этом кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию, затем клетки крови последовательно, в две стадии, обрабатывают сначала буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, затем равным объемом 0,15-0,35% раствора трипсина в PBS, далее плазму и полученные супернатанты объединяют, удаляют клеточный дебрис и примеси неэкзосомального происхождения путем центрифугирования при 15000-20000 g в течение 10-20 минут и фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а суммарный пул экзосом осаждают ультрацентрифугированием при 100000-160000 g в течение 60-120 минут.

В способе, обработку буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, осуществляют в течение 5 минут с последующим центрифугированием в течение 20 минут при 300 g и сбором супернатанта.

В способе, обработку 0,15-0,35% раствором трипсина в PBS, осуществляют в течение 5 минут с последующим добавлением ингибитора фермента, перемешиванием, осаждением клеток крови центрифугированием в течение 20 минут при 300 g и сбором супернатанта (см. пат. RU №2556825, МПК C12N 5/00, опубл. 20.07.2015 г.).

Недостатком данного способа является длительность и сложность получения экзосом из крови в широкой лабораторно-диагностической практике.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения экзосом из крови, обладающего сокращением длительности и снижением трудоемкости способа изоляции экзосом из крови, а также увеличением выхода экзосом, повышением чистоты целевого продукта.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к сокращению длительности и снижению трудоемкости способа изоляции экзосом из крови.

Технический результат достигается с помощью способа получения экзосом из крови, включающего разделение крови на бесклеточную и клеточную фракции с помощью центрифугирования с последующим получением экзосом путем ультрацентрифугирования, причем разделение крови на плазму и клеточную фракции проводят с помощью центрифугирования, затем клеточную фракцию подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS, в качестве которого используют 10 мМ фосфатного буфера, 0,15 М NaCl, содержащим 5 мМ ЭДТА, производят сбор первого супернатанта, центрифугирование и сбор второго супернатанта, затем плазму и полученные супернатанты объединяют, для получения суммарного пула экзосом крови, удаляют клеточный дебрис и примеси неэкзосомального происхождения путем центрифугирования, проводят фильтрацию через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а суммарный пул экзосом осаждают ультрацентрифугированием при 100000 g в течение 60 минут, при этом фильтрацию и ультрацентрифугирование проводят одновременно с помощью ультрацентрифужных фильтровальных пробирок, причем разделение крови на плазму и клеточную фракции проводят с помощью центрифугирования, при 400-600 g в течение 10-20 минут, а клеточную фракцию подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS, при pH 7,4, проводят инкубацию в течение 5-15 минут с последующим центрифугированием в течение 15-25 минут при 400-600 g и сбором первого супернатанта, затем проводят резкое встряхивание с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 500 g и сбор второго супернатанта.

Сущность способа получения экзосом из крови заключается в следующем.

Проводят сбор периферической крови в вакутейнер или другие пробирки для сбора и консервирования крови. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 400-600 g в течение 10-20 мин. Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS, в качестве которого используют 10 мМ фосфатного буфера, 0,15 М NaCl, при pH 7,4, содержащим 5 мМ ЭДТА, проводят инкубацию в течение 5-15 мин с последующим центрифугированием в течение 15-25 минут при 400-600 g, сбором первого супернатанта, затем проводят резкое встряхивание пробирки с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 500 g и сбор второго супернатанта. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови, для этого из объединенного образца удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 25000-35000 g в течение 5-15 минут, экзосомы осаждают ультрацентрифугированием в ульрацентрифужных фильтровальных пробирках с диаметром пор 0,1 мкм при 100000 g в течение 60 минут.

В результате получают суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, что позволяет повысить выход целевого продукта и в последующем повысить чувствительность диагностических систем путем увеличения количества диагностического материала в анализе.

Таким образом, экзосомы представляют собой микровезикулы размером 20-100 нм, активно секретируемые через каскад экзоцитоза, при этом экзосомы секретируются в определенных физиологических условиях из различных типов клеток организма и предназначены для межклеточных взаимодействий (см. Гусаченко О.Н., Зенкова М.А., Власов В.В. «Нуклеиновые кислоты экзосом: маркеры заболеваний и молекулы межклеточной коммуникации // Биохимия. 2013. Т. 78. №1, с. 5-13), экзосомы переносят биомаркеры состояния продуцирующих их клеток, служат для ранней диагностики, определения стадии и факта прогрессии различных заболеваний, в том числе онкологической патологии, что поможет оказать своевременное лечение и оценить его эффективность (см. Medvedeva N.V., Nanobiotechnology and nanomedicine /N.V. Medvedeva, О.M. Ipatova, D. IvanovIu // Biomed Khim - 2006. – T. 52 - №6. - С. 529-546), а выполнение способа изоляции экзосом из крови путем разделения исходного образца крови на плазму и клеточную фракцию, проведения центрифугирования при 400-600 g в течение 10-20 мин, при этом клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS рН 7,4, с последующей инкубацией 5-15 мин, с центрифугированием в течение 15-25 минут при 400-600 g, проведением встряхивания пробирки с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 500 g, удаление клеточного дебриса центрифугированием при 25000-35000 g в течение 5-15 минут, одновременное проведение фильтрации и ультрацентрифугирования в ульрацентрифужных фильтровальных пробирках с диаметром пор 0,1 мкм при 100000 g в течение 60 минут позволяет снизить трудозатраты, связанные с изоляцией экзосом из крови, и уменьшить длительность способа с 4,0 до 2,3 часов.

Краткое описание чертежей и иных материалов

В таблице дан способ изоляции экзосом из крови, концентрация белка в пробе.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа изоляции экзосом из крови.

Пример 1. Проводят сбор периферической крови в вакутейнер или другие пробирки для сбора и консервирования крови. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 300 g в течение 8 мин.

Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS в количестве 10 мМ фосфатного буфера, 0,15 М NaCl, при рН 7,4, содержащим 5 мМ ЭДТА, проводят инкубацию в течение 4 мин с последующим центрифугированием 10 минут при 300 g, сбор первого супернатанта, затем проводят встряхивание пробирки с последующим центрифугированием в течение 8 минут при 400 g, сбор второго супернатанта.

Для оценки количества выделенных экзосом с использованием способа-прототипа и предлагаемого способа была измерена концентрация белка в 1 мл анализируемого вещества с использованием коммерческого набора NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, США) по протоколу, рекомендованному производителем.

В примере 1 получают невысокий суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, что не позволяет сохранить выход целевого продукта.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 400 g в течение 10 мин. Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, рН 7,4), содержащим 5 мМ ЭДТА (5 мин инкубация с последующим центрифугированием 15 минут при 400 g, сбор первого супернатанта); затем проводят встряхивание пробирки с последующим центрифугированием 10 минут при 500 g и сбор второго супернатанта. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови. Для этого из объединенного образца удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 25000 g в течение 15 минут, экзосомы осаждают ультрацентрифугированием в ульрацентрифужных фильтровальных пробирках с диаметром пор 0,1 мкм при 100000 g в течение 60 минут.

В результате получают высокий суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, что позволяет сохранить выход целевого продукта, а также сократить трудовые и финансовые затраты.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, но кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 500 g в течение 15 мин. Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, рН 7,4), содержащим 5 мМ ЭДТА (10 мин инкубация с последующим центрифугированием 20 минут при 500 g, сбор первого супернатанта), затем проводят встряхивание пробирки с последующим центрифугированием 10 минут при 500 g и сбор второго супернатанта. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови, для этого из объединенного образца удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 30000 g в течение 10 минут, экзосомы осаждают ультрацентрифугированием в ульрацентрифужных фильтровальных пробирках с диаметром пор 0,1 мкм при 100000 g в течение 60 минут.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, но кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 600 g в течение 20 мин.

Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, рН 7,4), содержащим 5 мМ ЭДТА (15 мин инкубация с последующим центрифугированием 25 минут при 600 g, сбор первого супернатанта); затем резким встряхиванием пробирки с последующим центрифугированием 10 минут при 500 g, сбор второго супернатанта.

Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови. Для этого из объединенного образца удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 35000 g в течение 5 минут, экзосомы осаждают ультрацентрифугированием в ульрацентрифужных фильтровальных пробирках с диаметром пор 0,1 мкм при 100000 g в течение 60 минут. Для оценки количества выделенных экзосом с использованием способа-прототипа и предлагаемого способа была измерена концентрация белка в 1 мл анализируемого вещества с использованием коммерческого набора NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, США) по протоколу, рекомендованному производителем. Результаты исследования (см. пример 4 таблицы) представлены в таблице.

Пример 5. Проводят аналогично примеру 1, но кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 700 g в течение 25 мин.

Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, рН 7,4), содержащим 5 мМ ЭДТА (20 мин инкубация с последующим центрифугированием 30 минут при 700 g, сбор первого супернатанта); затем резким встряхиванием пробирки с последующим центрифугированием 15 минут при 600 g, сбор второго супернатанта.

В результате, получают суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, при этом при измерении концентрации белка выявлено, что его значения практически не отличаются от значений концентрации белка по примеру 3, однако значительно увеличилось количество затрачиваемого времени (2,7 часа).

Таким образом, наиболее оптимальными являются примеры 2, 3 и 4, причем реализация предлагаемого способа позволяет сохранить эффективность изоляции экзосом из крови (см. табл.), при этом сокращается трудоемкость и длительность проведения способа с 4,0 до 2,3 часов.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- упрощение и сокращение длительности способа с 4,0 до 2,3 часов их изоляции из крови;

- позволяет снизить трудозатраты, связанные с изоляцией экзосом из крови.

Способ получения экзосом из крови, включающий разделение крови на бесклеточную и клеточную фракции с помощью центрифугирования с последующим получением экзосом путем ультрацентрифугирования, причем разделение крови на плазму и клеточную фракции проводят с помощью центрифугирования, затем клеточную фракцию подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS, в качестве которого используют 10 мМ фосфатного буфера, 0,15 М NaCl, содержащим 5 мМ ЭДТА, производят сбор первого супернатанта, центрифугирование и сбор второго супернатанта, затем плазму и полученные супернатанты объединяют для получения суммарного пула экзосом крови, удаляют клеточный дебрис и примеси неэкзосомального происхождения путем центрифугирования, проводят фильтрацию через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а суммарный пул экзосом осаждают ультрацентрифугированием при 100000 g в течение 60 минут, отличающийся тем, что фильтрацию и ультрацентрифугирование проводят одновременно с помощью ультрацентрифужных фильтровальных пробирок, причем разделение крови на плазму и клеточную фракции проводят с помощью центрифугирования при 600 g в течение 20 минут, а клеточную фракцию подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS при рН 7,4, проводят инкубацию в течение 15 минут с последующим центрифугированием в течение 25 минут при 600 g и сбором первого супернатанта, затем проводят встряхивание с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 500 g и сбор второго супернатанта.

Настоящее изобретение относится к способам дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток. В частности, в настоящем изобретении предложены способы характеризации клеток, дифференцировавших в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, на основании анализа уникальных маркеров клеточной поверхности.

Способ определения биологической активности вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи при производстве ассоциированных препаратов (варианты) // 2606848

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Предложены способы определения биологической активности монокомпонентов в ассоциированных комбинированных ди- и тривакцинах, содержащих вакцинные штаммы вируса кори (Л-16), эпидемического паротита (Л-3) и/или краснухи (Орлов).

Способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов с помощью клеточных тест-систем // 2604804

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека.

Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем // 2604802

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области гигиенической безопасности объектов пищевого назначения. Предложен способ определения безопасности пищевых ингредиентов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека.

Понижающая регуляция трансктипции sine/alu ретротранспозонов для индукции или восстановления способности к пролиферации и/или плюрипотентности стволовой клетки // 2603731

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ индукции, и/или восстановления, и/или поддержания фенотипа без признаков старения или его аспектов, в частности способности к пролиферации и/или плюрипотентности в клетке млекопитающего.

Вакцина против ehrlichia canis // 2603274

Изобретение касается вакцинной композиции. Охарактеризованная вакцинная композиция содержит эффективное иммунизирующее количество инактивированной Ehrlichia canis (Е.

Новый способ получения дифференцированных клеток // 2603094

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения зрелых мегакариоцитарных клеток.

Способ дифференцировки живых сперматозоидов с помощью диагностической культуральной среды при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения // 2603084

Настоящее изобретение относится к области андрологии, репродуктологии и клинической эмбриологии. Способ дифференцировки живых сперматозоидов при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения предусматривает использование диагностической культуральной среды для дифференцировки живых сперматозоидов с увеличенной концентрацией пентоксифиллина 3,6 мМ/л и кофеином в концентрации 5 мМ/л.

Устройство для направления миграции клеток и способ направления миграции клеток посредством такого устройства // 2603083

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено устройство и способ направления миграции клеток, а также способ изготовления данного устройства.

Способ активации цитотоксических лимфоцитов человека // 2603079

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения активированных цитотоксических лимфоцитов, и может быть использовано в медицине. Выделяют периферические мононуклеары из крови онкологических больных или доноров и культивируют их в бессывороточной среде ex-vivo с добавлением рекомбинантных человеческих IL-2 в концентрации от 125 нг/мл до 500 нг/мл и IL-15 в концентрации от 2,5 нг/мл до 5 нг/мл.

Применение стромальных стволовых клеток жировой ткани для лечения свищей // 2608641

Изобретение относится к клеточной технологии. Описано применение полученных из жировой ткани стромальных стволовых клеток в производстве фармацевтической композиции для лечения свища у субъекта, где указанные полученные из жировой ткани стромальные стволовые клетки являются аллогенными по отношению к субъекту, которого предстоит лечить. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения свища. 27 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр.

Клеточная линия меланомы кожи человека mel ibr eemc, предназначенная для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы // 2608959

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, предназначенных для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы, и может быть использовано в медицине. Клеточную линию меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС получают из клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr. Полученная линия клеток хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157. Изобретение позволяет получить клеточную линию меланомы кожи человека, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и характеризуется экспрессией антигенов гистосовместимости I класса, дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44 и отсутствием антигенов гистосовместимости II класса. 1 табл.

Клеточная линия crov cel муцинозного рака яичников человека, предназначенная для разработки лечения таргетными препаратами // 2608960

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, предназначенных для разработки лечения таргетными препаратами, и может быть использовано в медицине. Клеточная линия crov Cel муцинозного рака яичников человека характеризуется наличием в 9 экзоне гена PIK3CA соматической миссенс-мутации Е542К (с.1624 G/A), приводящей к аминокислотной замене в 542 кодоне (p.Glu542Lys). Мутация зарегистрирована в международной базе данных (COSMIC, COSM760Id) и ассоциирована с повышенной чувствительностью к терапии ингибиторами mTOR. Полученная линия клеток хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под номером Н-160. Изобретение позволяет получить клеточную линию crov Cel муцинозного рака яичников человека, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. 8 ил., 3 табл.

Способ выделения мезенхимных стволовых клеток из орбитальной жировой ткани // 2609657

Изобретение относится к области биотехнологии, тканевой инженерии, конкретно к выделению мезенхимных стволовых клеток (МСК) из орбитальной жировой ткани (ОЖТ), и может быть использовано в медицине. Способ включает измельчение ОЖТ на фрагменты, расщепление фрагментов раствором коллагеназы, осаждение клеток путем центрифугирования в течение 5 минут, перенос их в пластиковый культуральный флакон. Расщепление фрагментов ОЖТ проводят раствором коллагеназы второго типа в сбалансированном растворе Хэнкса в соотношении 1 мг/мл на 0,1 г жировой ткани при температуре 37°С в шейкере в течение 60 минут. Полученную суспензию центрифугируют со скоростью 1300 оборотов в минуту, после чего жировую фракцию вместе с клетками, осажденными на дно, переносят в пластиковый культуральный флакон, который заполняют 5 мл питательной среды следующего состава: 45 мл среды DMEM/F12, 5 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 2 ммоль L-глутамина, 100 мкл смеси антибиотиков, состоящей из 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина, и культивируют в CO2-инкубаторе при 37°С и 5% CO2 в атмосфере, на вторые сутки при замене питательной среды на свежую того же состава проводят удаление эритроцитов и других клеток стромально-сосудистой фракции, а также плавающих на поверхности фрагментов жировой ткани. Изобретение позволяет повысить однородность и качество получения популяции МСК с улучшением их чистоты, эффективно использовать исходный тканевой материал. 2 ил., 2 пр.

Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток // 2610176

Изобретение относится к биохимии. Описана популяция панкреатических эндокринных клеток, которые соэкспрессируют NKX6.1 и инсулин, и где менее 10% клеток в популяции экспрессируют глюкагон, где популяцию панкреатических эндокринных клеток получают дифференцировкой плюрипотентных стволовых клеток человека, полученных из устойчивых линий эмбриональных стволовых клеток человека, где указанная дифференцировка включает первую стадию культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей агонист рецептора TGF-β, выбранный из группы, состоящей из активина А, активина В, TGFβ-I, TGFβ-II, GDF-8 и GDF-11, в концентрации от около 2 нг/мл до 100 нг/мл, и дополнительную стадию культивирования клеток панкреатической эндодермы в среде, содержащей от 20 нМ до 500 нМ (2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламино)бензолактам. Также описаны способы формирования такой популяции. Изобретение расширяет арсенал панкреатических эндокринных клеток, полученных искусственным путём. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 6 пр.

Способы и композиции для применения в клеточной терапии // 2610427

Изобретение относится к области биохимии, а именно к применению мезенхимальных стволовых клеток в способе лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний, а также для производства лекарственного средства для лечения симптомов указанных заболеваний. Мезенхимальные стволовые клетки применяются путем их введения в лимфатическую систему субъекта. Дополнительные аспекты изобретения относятся к набору и способу лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний. Изобретение обеспечивает улучшенную терапию стволовыми клетками. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Высокобезопасный способ получения очищенных фракций стволовых клеток // 2611201

Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения фракций стволовых клеток, имеющих происхождение из липидной ткани, включающий стадии: (a) сбора или получения образца липидной ткани, содержащей стволовые клетки; (b) промывания образца со стадии (а) подходящим водным буфером; (c) инкубирования образца со стадии (b) с ферментом, способным перерабатывать липидную ткань и извлекать из нее стволовые клетки; (d) инактивирования фермента, использованного на стадии (с), и извлечения водной фазы из продукта со стадии (с); (e) очистки водной фазы, полученной на стадии (d); (f) титрования водной фазы, полученной на стадии (е), и, если необходимо, ее разбавления, чтобы получить конечную фракцию стволовых клеток с желаемой концентрацией и объемом, в котором материал, содержащий стволовые клетки, обрабатывают в шприце на всем протяжении по меньшей мере стадий: (а), (b) и (с), указанный шприц, выполняет функции собирающего устройства, фазового разделителя и технологического реактора. Изобретение обеспечивает высокобезопасный способ получения очищенных фракций стволовых клеток липидного происхождения, в котором предусматривается использование индивидуального собирающего устройства; снижение количества переносов и манипуляций, которым подвергается материал, содержащий стволовые клетки, понижая до минимума риски загрязнения, потери материала и случайный обмен образцами, и дальнейшее упрощение взаимодействия и сотрудничества между персоналом, извлекающим сырьевой материал, и экспертом по выделению стволовых клеток. 11 з.п. ф-лы, 1 пр.

Способ получения препарата на основе стволовых клеток, выделенных из ткани селезенки свиней, для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных // 2611205

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии и биофармакологии, конкретно к получению препарата на основе стволовых клеток, выделенных из ткани селезенки свиней, для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных. Изобретение может найти применение в ветеринарии для лечения и профилактики широкого круга заболеваний домашних и сельскохозяйственных животных. Способ включает введение в клеточно-культуральную среду, полученную из измельченной ткани селезенки свиней, обработанной 0,5%-ным раствором метронидазола и 0,05%-ным раствором хлоргексина с последующими дезагрегацией ее 0,25%-ным раствором трипсина и культивированием клеточного материала с концентрацией клеток 1,5⋅106-2,0⋅106 на 1 мл ростовой среды Игла-MEM с добавлением 10-15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в присутствии стимулятора роста клеточных культур Пинексида, препарата «Повин ВМ», в состав которого входят водный раствор полиэтиленгликоля, водный раствор поливинилпирролидона, коммерческий раствор Версена, раствор тетрациклина и коммерческий раствор трипсина. Изобретение позволяет расширить группу препаратов на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных с расширенным спектром его применения в лечении и восстановлении структуры утраченных органов животных. 7 ил., 28 пр.

Способ культивирования адгезионных клеток // 2612154

Изобретение относится к клеточной технологии. Описан способ получения адгезионных клеток в соответствии с которым: a. адгезионные клетки вносят в культуральный сосуд, который содержит микроносители в культуральной среде; b. клетки амплифицируют, проводя несколько последовательных пассажей клеток в том же самом культуральном сосуде, причем каждый пассаж клеток, следующий за первым пассажем клеток, проводят: i. используя всю или часть популяции клеток, которая была получена в течение предшествующего пассажа клеток, после проведения ферментативной обработки популяции клеток для открепления клеток от микроносителей; и ii. внося культуральную среду и увеличивая количество микроносителей; и c. популяцию адгезионных клеток, полученную в течение последнего пассажа клеток, собирают после необязательного проведения ферментативной обработки указанной популяции клеток для открепления клеток от микроносителей. Изобретение расширяет арсенал средств для получения адгезионных клеток. 3 н. и 37 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл., 7 пр.

Связывающие sdf-1 нуклеиновые кислоты и их применение // 2612388

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине для получения лекарственного средства для лечения рака. Получают молекулу L-нуклеиновой кислоты, связывающуюся с SDF-1, которая содержит в 5'→3' направлении первый участок нуклеотидов, коровую нуклеотидную последовательность и второй участок нуклеотидов или в 5'→3' направлении второй участок нуклеотидов, коровую нуклеотидную последовательность и первый участок нуклеотидов. При этом коровая нуклеотидная последовательность содержит 5'GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG3' (SEQ ID NO: 57), где указанный первый и второй участок нуклеотидов имеет достаточную степень обратной комплиментарности для гибридизации друг с другом, где при гибридизации формируется двухнитевая структура и где двухнитевая структура состоит из четырех-шести пар оснований. Указанная нуклеиновая кислота может быть модифицирована HES или PEG. Изобретение позволяет способствовать мобилизации клеток, экспрессирующих рецепторы SDF-1, в периферическую кровь пациента. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 43 ил., 3 табл., 14 пр.