Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты



Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты
Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты
Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты

 


Владельцы патента RU 2609431:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ, НИ ТГУ) (RU)

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) включает хроматографическое определение продуктов гидролиза. При этом анализ проводят на хроматографической колонке с фазой, представляющей собой диоксид кремния, модифицированный пентафторфенилом 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, при 28 °С. Причем адсорбировавшиеся на продукты гидролиза ДНК элюируют смесью воды с добавлением муравьиной кислоты и ацетонитрила в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой со скоростью элюирования 0,6 мл/мин. Техническим результатом является обеспечение возможности приемлемого разделения продуктов химического гидролиза ДНК с целью идентификации аддуктов ДНК. 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

В последние годы интенсивно развивается направление выявления маркеров, так или иначе связанных с ДНК опухолевых клеток. К этим маркерам относятся опухоле-специфичные мутации, метилированные фрагменты ДНК и аддукты ДНК. Аддукты ДНК аддукты могут быть потенциальными маркерами риска возникновения рака легкого, так как их содержание в тканях является результирующей взаимодействия канцерогенных факторов и реакцией организма с учетом индивидуальных особенностей систем метаболизма и репарации. Наличие патогенетически значимых для опухоли изменений ДНК в циркулирующих ДНК крови идентифицируют и количественно определяют методами масс-спектрометрии (TOF/TOF, TOF/MS, реже MS/MS). Для масс-спектрометрического анализа аддукты ДНК необходимо высвободить в виде отдельных модифицированных азотистых оснований и/или нуклеозидов. Для этого ДНК подвергается термическому, химическому или энзиматическому гидролизу. В то время как многие аддукты ДНК, включая 7-алкил-гуанин‚ 3-алкил-аденин и 8-нитро-гуанин, термически неустойчивы и могут быть селективно высвобождены из структуры ДНК путем нагрева [1, 2], другие повреждения ДНК стабильны и требуют расщепления. Этот шаг может быть выполнен либо путем ферментативного, либо путем химического гидролиза. При химическом гидролизе ДНК расщепляется путем разрыва обеих эфирных связей и фосфатных N-гликозидных между дезоксирибозой и пуриновым (пиримидиновым) основанием. В ходе такого гидролиза в смеси наблюдается большой набор соединений различных классов, но сходных по физико-химическим свойствам, что затрудняет их хроматографическое разделение. При этом очевидно, что без хроматографического разделения смеси невозможно корректно идентифицировать продукты гидролиза, в том числе и аддукты ДНК методами масс-спектрометрии.

Известны различные способы разделения продуктов химического гидролиза ДНК методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) – обращенно-фазовая хроматография и хроматография гидрофильного взаимодействия. Каждый из методов имеет ряд недостатков. Обращенно-фазовая хроматография не способна качественно разделить полярные компоненты, что вынуждает использовать более длинные колонки для увеличения времени удерживания, что приводит к удорожанию анализа, а также уменьшению стабильности масс-спектрометрической системы при дальнейшей идентификации аддуктов ДНК. Хроматография гидрофильного взаимодействия позволяет эффективно разделить все продукты гидролиза ДНК, но при этом требует длительной пробоподготовки, в ходе которой есть вероятность потери аддуктов ДНК и других продуктов гидролиза.

Известен способ хроматографического разделения продуктов гидролиза ДНК продуктов с помощью хроматографии гидрофильного взаимодействия (HILIC) - варианта нормальнофазной хроматографии на специальных колонках [3]. В качестве неподвижной фазы используется амидная колонка TSKgel Amide-80 2,0×150 мм с размером зерна 3 мкм. В качестве элюентов используется ацетонитрил и 10 миллимоль ацетата аммония в воде. Общее время анализа составляет 100 минут. Для проведения хроматографического разделения образец должен представлять собой смесь продуктов гидролиза в ацетонитриле или метаноле, для чего образец содержащий продукты гидролиза ДНК, упаривают под током азота и затем сухой остаток растворяют в ацетонитриле. Существенными недостатками данного метода являются трудоемкость пробоподготовки, а так же длительное время разделения продуктов гидролиза - 100 минут, что увеличивает стоимость одного анализа в несколько раз. Кроме того, для идентификации продуктов гидролиза необходимо растворение стандартных образцов веществ в ацетонитриле или метаноле, что не представляется возможным для некоторых соединений.

Известен другой способ разделения продуктов гидролиза ДНК с помощью обращенно-фазной хроматографии на колонках С18 [4]. Данный способ находит более широкое применение, так как анализируемая проба и стандарты веществ находятся в водном растворе. В качестве колонки для разделения используется Restec Ultra C18 4,6×250 мм с размером зерна 5 мкм. В качестве элюентов используются ацетонитрил и 85 миллимолярного ацетата аммония в воде. Недостатком данного способа недостаточное удерживание на колонке полярных компонентов, поэтому для улучшения разделения полярных компонентов в данном способе предлагается использовать более длинные колонки, но при этом увеличивается время анализа и расход элюентов, что также увеличивает стоимость разделения.

Технической задачей настоящего изобретения является разработка способа хроматографического разделения и определения продуктов химического гидролиза ДНК с целью идентификации аддуктов ДНК.

Поставленная задача решается тем, что способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), включает хроматографическое определение продуктов гидролиза, но в отличие от прототипа, анализ проводят на хроматографической колонке с фазой представляющей собой диоксид кремния, модифицированный пентафторфенилом 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, при 28 °С, причем адсорбировавшиеся на продукты гидролиза ДНК элюируют смесью воды с добавлением муравьиной кислоты и ацетонитрила в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой со скорость элюирования 0,6 мл/мин.

При скорости потока 0,6 мл/мин, используют спектрофотометрический детектор с длиной волны 260 нм с последующим определением времени удержания и площадей хроматографических пиков продуктов химического гидролиза ДНК.

Для анализа используют колонки с сорбентом Luna PFP(2), обеспечивающим выдающуюся селективность для сильнополярных соединений, сложных природных продуктов, изомеров и других близко родственных соединений. Это достигается за счёт использования пентафлуорофенила на пропильном линкере, который обеспечивает множество механизмов удерживания в отличие от традиционных носителей с обратной фазой (С18, С8), в которых селективность обеспечивается только одним механизмом взаимодействия.

Механизмы взаимодействия, обеспечивающие селективность
колонкам Luna PFP(2):

• Водородные граничные взаимодействия;

• Диполь-дипольные взаимодействия;

• Ароматические и π-π взаимодействия;

• Гидрофобные взаимодействия.

Основными преимуществами Luna PFP(2) является превосходная селективность, достигаемая за счёт 4 механизмов взаимодействия и ортогональную селективность даже при использовании традиционных обращённо-фазовых систем с подвижной фазой.

Применение муравьиной кислоты позволяет использовать данный способ разделения продуктов гидролиза ДНК для масс-спектрометрического детектирования продуктов гидролиза ДНК, в отличие от фосфатных буферов. Также применение муравьиной кислоты позволяет повысить эффективность ионизации продуктов гидролиза в положительном режиме при масс-спектрометрическом детектировании.

Использование градиентного режима позволяет последовательно десорбировать компоненты смеси с неподвижной фазы, а также применение ацетонитрила до 25 % в качестве элюента позволяет существенно сократить стоимость анализа.

Использование заявляемых условий позволяет добиться приемлемого разделения продуктов химического гидролиза ДНК с целью идентификации аддуктов ДНК.

В дальнейшем способ поясняется примерами.

ПРИМЕР 1. Путем растворения готовят водный раствор стандартных веществ: аденин, гуанин, цитизин, цитидин, тимин, тимидин, 2-дезоксигуанозин. Далее из анализируемой смеси отбирают пробу объёмом 1 мкл и вводят в жидкостной хроматограф. Для разделения смеси используют колонку Phenomenex Luna PFP(2) 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, где разделение проводят в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой. Скорость элюирования 0,6 мл/мин. Детекция продуктов гидролиза осуществляется спектрофотометрическим детектором при длине волны 260 нм. В результате анализа определяют времена удерживания продуктов гидролиза для идентификации: аденин (время удержания = 2,727 мин), гуанин (время удержания = 4,187 мин), цитизин (время удержания = 4,873 мин), цитидин (время удержания = 5,807 мин), тимин (время удержания = 7,940 мин), тимидин (время удержания = 8,073 мин), 2-дезоксигуанозин (время удержания = 8,560 мин).

На рисунке 1 представлена хроматограмма стандартных веществ, характерных для химического гидролиза ДНК.

ПРИМЕР 2. ДНК выделенную колоночным методом подвергают химическому гидролизу 0,1 М соляной кислотой при 70 °С в течение 4 часов. После охлаждают до комнатной температуры и нейтрализуют эквимолярным количеством гидроксида натрия. Далее из анализируемой смеси отбирают пробу объёмом 1 мкл и вводят в жидкостной хроматограф. Для разделения смеси используют колонку Phenomenex Luna PFP(2) 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, где разделение проводят в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой. Скорость элюирования 0,6 мл/мин. Детекция продуктов гидролиза осуществляется спектрофотометрическим детектором при длине волны 260 нм. В результате анализа определяют времена удерживания продуктов гидролиза для идентификации: аденин (время удержания = 2,727 мин), гуанин (время удержания = 4,007 мин), цитизин (время удержания = 4,847 мин), цитидин (время удержания = 5,747 мин), тимин (время удержания = 7,933 мин), тимидин (время удержания = 8,180 мин), 2-дезоксигуанозин (время удержания = 8,607 мин).

На рисунке 2 представлена хроматограмма продуктов химического гидролиза ДНК.

Источники информации

1. Googin M., Loeber R., Prk S., Walker V., Wickliffe J., and Tretyakova N. HPLC-ESI+-MS/MS analysis of N7-gunine-N7-guanine DNA cross-links in tissues of mice exposed to 1,3-butadiene. 2007 // Chemical Research in Toxicology. 20, 5: 839-847.

2. Singer B., and Grunberger D. Molecular Biology of Mutagens and Carcinogens. 1983. Plenum Press, New York and London.

3. Chen P., Li W., Li Q., Wang Y., Li Z., Ni Y., Koike K.

4. Kelly M.C., White B., Smyth M.R. Separation of oxidatively damaged DNA nucleobases and nucleosides on packed and monolith C18 columns by HPLC-UV-EC // Journal of Chromatography B. 863 (2008) 181-186.

1. Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), включающий хроматографическое определение продуктов гидролиза, отличающийся тем, что анализ проводят на хроматографической колонке с фазой, представляющей собой диоксид кремния, модифицированный пентафторфенилом 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, при 28 °С, причем адсорбировавшиеся на продукты гидролиза ДНК элюируют смесью воды с добавлением муравьиной кислоты и ацетонитрила в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой со скорость элюирования 0,6 мл/мин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при скорости потока 0,6 мл/мин используют спектрофотометрический детектор с длиной волны 260 нм с последующим определением времени удержания и площадей хроматографических пиков продуктов химического гидролиза ДНК.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области геологии и может быть использовано при поиске скоплений углеводородов. Предложен способ обнаружения углеводородов с использованием подводного аппарата, снабженного одним или несколькими измерительными компонентами.

Изобретение относится к цифровой фотографии для медицинских целей, в частности, такой как биологическая ткань, в ближней инфракрасной области спектра. Технический результат заключается в повышении контрастной чувствительности и отношения сигнал/шум видеосистемы для наблюдения малоконтрастных объектов, находящихся в мутной среде, упрощении устройства для формирования телевизионного изображения в мутных средах с преобладающим над поглощением рассеянием.

Изобретение относится к измерительной технике, а именно к приборам для измерения концентрации газа, присутствующего в окружающей среде. Газоанализатор содержит два источника инфракрасного излучения, основной и дополнительный, измерительную кювету, интерференционный светофильтр, основной и дополнительный приемники инфракрасного излучения, два усилителя.

Изобретение относится к обработке изображений. Уменьшено влияние разницы между пробами клетки-мишени и разницы в условиях формирования изображения и так далее.

Рефрактометрический детектор содержит измерительный оптико-механический блок, включающий оптически связанные источник света, объектив, щелевую диафрагму, проточную кварцевую кювету, призму в виде трапеции с острыми углами 45° для юстировки детектора, плоскопараллельную кварцевую пластину зануления, двухплощадочный фотодиод, а также электронный блок.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапевтической стоматологии, и может быть использовано как способ и устройство для диагностики заболеваний слизистой оболочки полости рта, а именно для дифференциальной диагностики плоского лишая, лейкоплакии и глоссалгии.

Изобретение относится к технике измерений и может использоваться в автомобильной, сельскохозяйственной, авиационной, нефтеперерабатывающей и других отраслях промышленности, где необходимо проводить оперативный анализ качества моторного масла.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для диагностики заболеваний тканей пародонта на разных стадиях. Для осуществления способа исследуют слюну, в качестве показателя воспалительного процесса определяют концентрацию свободного оксипролина спектрофотометрическим методом.

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано для измерения влажности древесины в процессе сушки и хранения. Способ измерения влажности древесины заключается в том, что устанавливают источник и приемник ИК-излучения поперек волокон древесины на выбранную глубину, измеряют поток ИК-излучения, прошедший через древесину, сравнивают полученные измерения с заранее определенной калибровочной зависимостью, связывающей изменение потока ИК-излучения, прошедшего через древесину с влажностью древесины, определенной весовым способом в фиксированные моменты времени, и вычисляют влажность древесины.

Изобретение относится к оптическим устройствам детектирования и идентификации газовых сред и предназначено для качественного анализа состава молекулярных газов, которое найдет применение в качестве оптоэлектронного идентификатора для детектирования токсичных газов, контроля качества пищевых продуктов, мониторинга окружающей среды и для профилактики болезней дыхания по составу выдыхаемого воздуха.

Изобретение относится к измерительной технике, в частности к оптическим методам измерения концентрации дисперсных частиц, взвешенных в жидкости. Способ оптического измерения счетной концентрации частиц в жидких средах включает измерение среднего гидродинамического диаметра частиц методом динамического рассеяния света, расчет по измеренному значению эффективности экстинкции частиц, измерение оптической плотности на одной из длин волн видимого диапазона и расчет по полученным данным счетной концентрации частиц. Устройство для оптического измерения счетной концентрации дисперсных частиц в жидких средах содержит лазер, светодиодный источник, направление излучения которого совпадает с направлением излучения лазера, поворотное зеркало, направляющее на образец излучение одного из этих источников, расположенные по ходу лазерного луча диафрагму, фокусирующую линзу, кювету с образцом, фотоприемник, измеряющий интенсивность проходящего излучения, и расположенную под углом к лазерному лучу систему сбора рассеянного излучения, включающую диафрагму, собирающую линзу и фотоприемник, измеряющий зависимость от времени интенсивности рассеянного излучения. Технический результат изобретения заключается в возможности осуществления измерений абсолютных концентраций частиц, расширении диапазона диаметров частиц, для которых применим метод, а также в повышении точности определения концентрации. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.
Наверх