Способ аффинной хроматографии для получения очищенного белка

Авторы патента:

C07K1/22 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2609633:

НОВАРТИС АГ (CH)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения очищенного белка, представляющего интерес, с использованием матрицы для аффинной хроматографии (АС), с которой связывается белок. Промывку матрицы АС осуществляют промывочным раствором, содержащим аргинин или производное аргинина, со значением рН приблизительно 8,5-9,5, где указанную промывку осуществляют без присутствия незабуферивающей соли. Производное аргинина выбрано из группы, состоящей из ацетиларгинина, агматина, аргининовой кислоты, N-альфа-бутироил-аргинина, N-альфа-пивалоил-аргинина, 3-гуанидинпропионовой кислоты, 4-гуанидинмасляной кислоты, L-2-амино-3-гуанидинпропионовой кислоты гидрохлорида, Nωнитро-L-аргинина бензилового эфира р-толуолсульфонатной соли и гомоаргинина. Изобретение позволяет увеличить концентрацию целевого белка в пуле и приводит к 3-кратному уменьшению содержания белков клетки-хозяина, 4-кратному снижению содержания низкомолекулярных соединений и к уменьшению уровня образования агрегатов. 10 з.п. ф-лы, 9 табл., 3 пр.

 

Уровень техники

Эффективное удаление загрязнений в процессе аффинной хроматографии, включая белки клетки-хозяина (HCP) и родственные примеси, такие как высокомолекулярные (HMW) и низкомолекулярные (LMW) соединения, является решающим фактором в технологии производства и выделения белков. Чистота белка после первой стадии очистки (стадии “захвата”) оказывает значительное влияние на тип и число последующих стадий, необходимых для получения очищенного продукта. Стадия “захвата” также является критической, потому что на данной стадии происходит концентрирование продукта, что обеспечивает применение пропорционально уменьшенных, более дешевых колонок в последующих стадиях очистки. Поэтому важно оптимизировать удаление загрязнений при осуществлении первой хроматографической стадии. В случае очистки антител, указанная первая стадия обычно основана на аффинности антител к белку А или его производным.

Условия с низкими значениями pH (например, в диапазоне pH 3-4) необходимы для элюирования связанного целевого белка из колонки для аффинной хроматографии, но их недостатком является потенциальная способность вызывать агрегацию. Исторически, менее жесткие условия, такие как pH в диапазоне 5-5,5, применяли, чтобы удалить из колонки неспецифически связанные примеси при одновременном сохранении взаимодействия мишень-белок А. Степень извлечения, однако, часто снижается в результате частичной элюции целевого белка в указанных условиях, особенно, если работают с нагрузками высокой плотности.

Показано, что аминокислота аргинин повышает растворимость определенных осажденных белков (M, Tsumoto K, Nitta S, Adschiri T, Ejima D, Arakawa T, и Kumagai I. Biochem. Biophys. Res. Commun. 328, 189-197 (2005); Umetsu M, Tsumoto K, Hara M, Ashish K, Goda S, Adschiri T, Kumagai I. J Biol Chem. 2003 Mar 14;278(11):8979-87), снижает образование агрегатов (Arakawa T, Tsumoto K. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Apr 25;304(1):148-52, и Arakawa T, Biophys. Chem. 127 (2007), pp. 1-8 (Review)) и снижает неспецифическую адсорбцию белков на поверхностях (Ejima D, J Chromato A, 05 и Schneider CP, J. Phys. Chem. B 113 (2009), pp. 2050-2058). Кроме того, показано, что в отличие от гидрохлорида гуанидина аргинин не вызывает раскручивания белков (Arakawa T, Biochem. Biophys. Res. Commun. 304 (2003), pp. 148-152 и Nakakido M, Biophys. Chem. 137 (2008), pp. 105-109).

По существу, аргинин применяли для элюирования белков из колонок для аффинной хроматографии и очистительных колонок других типов. Например, Arakawa et al. описывают способы элюирования антител из колонки, содержащей белок А, с применением элюирующего буфера, содержащего 0,5-2,0 M аргинина при pH 4,1-5,0 (Arakawa et al. (2004) Protein Expression and Purification 36:244-248; Tsumoto, K. et al. (2004) Biotechnol. Prog. 20:1301-1308; патентная публикация США № 20050176109). Кроме того, патент США № 7501495, Ejima et al., описывает способы элюирования белков из колонки для гель-фильтрации с помощью проявляющего раствора, содержащего гидрохлорид аргинина. Ghose et al. описывают способы элюирования целевых белков, недериватизированного силикагеля с применением градиента аргинина в качестве элюанта (Ghose, S. et al. (2004) Biotech. Bioeng. 87:413-423). Патентная публикация США № 20030050450, Coffman et al., описывает способы диссоциирования Fc-содержащих молекул из комплексов Fc-содержащей молекулы и белка A, где комплексы Fc-белок А наносят на колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC) и колонку промывают буфером, содержащим аргинин.

Barron et al. описывают промежуточный промывочный раствор для хроматографии с помощью белка A, содержащий от 0,5 до 2,0 M аргинина в фосфатно-ацетатном буфере со значением pH 5,0-7,5 (оптимально 1 M аргинина, 0,1 M фосфатно-ацетатного буфера с pH 5,0). Как сообщают, указанная стадия промывки раствором аргинина способствует удалению примеси HCP. Авторы также тестировали промежуточный промывочный раствор, который содержал хлорид натрия в концентрациях 0,5-2,0 M при значениях pH 5,0-7,5, и сообщили, что промывка NaCl не вызывала существенного снижения HCP (Barron et al., “Improving Purity on Protein A Affinity Media Through Use of an Arginine Intermediate Wash Step”, http://www.priorartdatabase.com/IPCOM/000127319). Кроме того, Barron et al. сообщили, что снижение значения pH промывочного буфера оказывало благоприятный эффект в условиях, используемых в эксперименте.

В течение продолжительного времени существует потребность в усовершенствованных способах для улучшения процесса очистки и увеличения степени извлечения продукта. Настоящее раскрытие удовлетворяет данную потребность и предоставляет дополнительные преимущества.

Сущность изобретения

Изобретение предлагает эффективный и надежный промывочный раствор для аффинной хроматографии, а также способы промывки с использованием указанного раствора. Указанный промывочный раствор применяют на стадии промывки перед стадией элюирования, и его применение эффективно удаляет низкомолекулярные (LMW) соединения, высокомолекулярные (HMW) соединения и белки клеток-хозяев (HCP) из исходного материала, наносимого на матрицу, что приводит в то же время к высоким значениям выхода белка, представляющего интерес, элюируемого из аффинной матрицы. Указанный промывочный раствор характеризуется присутствием аргинина при высоком значении pH, т.е. выше 8,0, без присутствия незабуферивающей соли. Указанная комбинация аргинина (или производного аргинина) с высоким значением pH позволяет удалить значительно больше примесей, чем промывочные растворы, содержащие аргинин при более низком значении pH, и дает в результате более острую форму пика элюции, коррелирующего с высокой концентрацией выделенного белка, представляющего интерес.

Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения очищенного белка, представляющего интерес (например, антитела, фрагмента антитела или белка), с применением матрицы для аффинной хроматографии (AC), с которой связывается белок, представляющий интерес, способ включает промывку матрицы AC промывочным раствором, содержащим аргинин или производное аргинина, со значением pH выше 8,0, без присутствия незабуферивающей соли. В предпочтительном варианте осуществления значение pH промывочного раствора составляет по меньшей мере 8,1, более предпочтительно по меньшей мере 8,5 и еще более предпочтительно по меньшей мере 8,9 или 9,0. В одном варианте осуществления значение pH промывочного раствора составляет приблизительно 8,5-9,5. В другом варианте осуществления значение pH промывочного раствора составляет приблизительно 8,9-9,0.

В другом варианте осуществления способ также включает (a) загрузку смеси, содержащей белок, представляющий интерес, на матрицу AC; (b) промывку матрицы AC промывочным раствором, содержащим аргинин или производное аргинина, со значением pH выше 8,0; и (c) элюирование белка, представляющего интерес, из матрицы AC, где промывку осуществляют без присутствия незабуферивающей соли.

В определенном варианте осуществления матрица AC представляет собой колонку, содержащую белок А. В других различных вариантах осуществления матрицу AC выбирают из группы, состоящей из колонки, содержащей белок G, колонки, содержащей белок A/G, колонки, содержащей белок L, колонки для металл-аффинной хроматографии (IMAC), колонки с кальмодулином, колонки MEP HyperCelTM, колонки для связывания мальтоза-связывающего белка (MBP), колонки для связывания глутатион-S-трансферазы (GST), колонки для связывания Strep-Tag II и колонки с красителем для аффинной хроматографии. В других вариантах осуществления матрица AC включает смолу, выбранную из группы, состоящей из CaptureSelect IgG-CHl, CaptureSelect IgG-Fc (Hu), CaptureSelect LC-kappa (Hu), CaptureSelect LC-lambda (Hu), CaptureSelect IgG4 (Hu), CaptureSelect IgG1 (Hu), CaptureSelect IgG3 (Hu), CaptureSelect IgM и CaptureSelect IgA. В других вариантах осуществления матрица AC включает смолу, выбранную из группы, состоящей из IgSelect, KappaSelect, LamdaFabSelect и Capto L.

Подходящие белки, представляющие интерес, включают, но без ограничения, антитела (и другие белки, содержащие Fc-фрагменты, такие как Fc-слитые белки) и фрагменты антител, хотя другие белки, которые связываются с аффинными матрицами, описанными здесь, также могут быть очищены по способам изобретения.

По другому аспекту изобретение предлагает способ получения очищенного антитела, фрагмента антитела или белка, содержащего Fc-фрагмент (например, Fc-слитый белок), с использованием колонки, содержащей белок А, способ включает (a) загрузку смеси, содержащей антитело, фрагмент антитела или белок, на колонку, содержащую белок А; (b) промывку колонки, содержащей белок А, промывочным раствором, содержащим (i) аргинин или производное аргинина, со значением pH выше 8,0 (например, приблизительно 8,5-9,5 или приблизительно 8,9-9,0); и (c) элюирование антитела, фрагмента антитела или белка из колонки, содержащей белок А, где промывку осуществляют без присутствия незабуферивающей соли.

По другому аспекту способ необязательно включает уравновешивание колонки, содержащей белок А, перед загрузкой и/или элюированием белка, представляющего интерес (например, антитела, фрагмента антитела или белка, содержащего Fc-фрагмент (например, Fc-слитого белка)), из колонки, содержащей белок А. Например, изобретение предлагает способ получения очищенного антитела, фрагмента антитела или белка, содержащего Fc-фрагмент (например, Fc-слитого белка), с использованием колонки, содержащей белок А, способ включает (a) уравновешивание колонки, содержащей белок А (например, с применением уравновешивающего буфера для регулирования значения pH и удаления остаточного содержания буфера для хранения); (b) загрузку смеси, содержащей антитело, фрагмент антитела или белок, на колонку, содержащую белок А; (c) промывку колонки, содержащей белок А, промывочным раствором, содержащим (i) аргинин или производное аргинина, со значением pH выше 8,0 (например, приблизительно 8,5-9,5 или приблизительно 8,9-9,0); и (d) элюирование антитела, фрагмента антитела или белка из колонки, содержащей белок А, где промывку осуществляют без присутствия незабуферивающей соли. Способ также может включать стадию уравновешивания колонки, содержащей белок А, перед элюированием антитела, фрагмента антитела или белка.

В определенном варианте осуществления промывочный раствор содержит аргинин или аргинин-HCl предпочтительно в концентрации в диапазоне приблизительно 0,1-0,5 M. В другом конкретном варианте осуществления аргинин или аргинин-HCl присутствует в концентрации 0,25 M или приблизительно 0,25 M. В других конкретных вариантах осуществления промывочный раствор содержит производное аргинина, например, производное, выбранное из группы, состоящей из ацетиларгинина, N-альфа-бутироил-аргинина, агматина, аргининовой кислоты и N-альфа-пивалоил-аргинина.

Способ изобретения эффективен для удаления различных примесей, включая высокомолекулярные и низкомолекулярные (HMW и LMW, соответственно) соединения и белки клетки-хозяина (HCP). В определенном варианте осуществления промывочный раствор также содержит одну или более забуферивающих солей (например, ацетат натрия, фосфат натрия или Трис).

Подробное описание изобретения

Изобретение предлагает улучшенный промывочный раствор для аффинной хроматографии, такой как аффинная хроматография с помощью белка А, который наносят на колонку перед элюированием белка, представляющего интерес, для удаления примесей. Улучшенный промывочный раствор содержит аргинин или производное аргинина, со значением pH выше 8,0 (например, pH выше 8,1, предпочтительно pH выше 8,5, например, приблизительно в диапазоне 8,5-9,5 или приблизительно 8,9-9,0), без присутствия незабуферивающей соли. Обычно промывочный раствор является водным раствором.

Указанная уникальная комбинация аргинина или производного аргинина и высокого значения pH позволяет удалить значительно больше примесей, чем обычно используемые процедуры, не оказывая воздействия на степень извлечения продукта. Кроме того, данное условие проведения промывки дает в результате более острую форму пика, связанную с более высокой концентрацией целевого белка в элюате, что желательно для увеличения эффективности последующих дополнительных процессов очистки.

Эффективное удаление примесей, включая белки клетки-хозяина (HCP) и родственные примеси, такие как высокомолекулярные (HMW) соединения и низкомолекулярные (LMW) соединения, является решающим фактором в технологии производства и выделения целевого белка. Аффинную хроматографию часто применяют в качестве первой стадии многостадийного процесса очистки целевого белка (например, антитела), и чистота целевого белка после аффинной хроматографии в значительной степени влияет на вид и число последующих стадий очистки. Другой важной ролью аффинной хроматографии является концентрирование продукта, которое создает возможность для применения менее дорогостоящих колонок пропорционально меньшего размера и емкостей (мешки или стальные резервуары) в последующих стадиях очистки. Поэтому, особенно важно оптимизировать удаление примесей во время стадии аффинной хроматографии, сохраняя в то же время высокую концентрацию промежуточного продукта и не ухудшая выход продукта.

В зависимости от матрицы, условия с низкими значениями pH, обычно в диапазоне pH 3-4, необходимы для элюирования связанного целевого белка из аффинной матрицы, и их недостатком является возможное индуцирование агрегации. Исторически, менее жесткие условия, такие как pH 5,0-5,5, использовали для удаления из колонки с помощью промывки неспецифически связанных примесей и в то же время для поддержания взаимодействия между целевым белком и аффинной матрицей. Степень извлечения целевого белка, однако, часто снижается вследствие частичного элюирования целевого белка в указанных условиях, особенно при работе с нагрузками высокой плотности. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления промывочный раствор, предлагаемый настоящим изобретением, предпочтительно используется при значении pH выше 8,0 (например, предпочтительно pH выше 8,1, более предпочтительно pH выше 8,5, например, приблизительно в диапазоне 8,5-9,5 или приблизительно 8,9-9,0), которое поддерживает связывание целевого белка с аффинной матрицей и в то же время позволяет удалить примеси.

Обычно, промывочные растворы, содержащие аргинин, включают незабуферивающие соли. Однако одно преимущество настоящего изобретения состоит в том, что стадия промывки, используемая в изобретении, не требует присутствия незабуферивающей соли. В данном контексте термин “незабуферивающая соль” обозначает соль, которая является солью такого типа и присутствует в такой концентрации, что она существенно не влияет на значение pH промывочного раствора в применяемых условиях (например, высокое значение pH) после добавления кислоты или основания. Незабуферивающие соли включают ионные соли, галогенные соли, включая соли, которые содержат Cl или Br, и, в особенности, галогенные соли, содержащие щелочные металлы или щелочноземельные металлы, включая натрий (Na), калий (K), кальций (Ca) или магний (Mg), натрий (Na) или калий (K) (т.е. NaCl, KCl, CaCl2 и MgCl2). В определенном варианте осуществления промывку осуществляют без присутствия NaCl.

Термин “незабуферивающая соль” не включает буферообразующие соли, такие как ацетат натрия, фосфат натрия и Трис, которые существенно влияют на поддержание значения pH промывочного раствора(ов) в применяемых условиях. Таким образом, такие буферообразующие соли могут быть включены в промывочные растворы изобретения.

Большое биофизическое разнообразие примесей, представленных в обычных неочищенных продуктах или клеточных экстрактах, обуславливает весьма разнотипные виды взаимодействий с твердой фазой хроматографического носителя и/или связанного целевого белка. Более или менее крепкое прикрепление примесей может являться результатом нековалентных межмолекулярных взаимодействий между двумя молекулами, таких как образование водородных связей, электростатические взаимодействия, гидрофобные и Ван-дер-Ваальсовы силы, или комбинацией указанных типов взаимодействия. В связи с этим обнаружили, что комбинация нескольких различных механизмов (т.е. аргинин или производное аргинина в комбинации с pH выше 8,0) является более эффективной для удаления примесей, чем традиционные методы.

В контексте применения аргинина в промывочном растворе сообщалось, что аргинин обладает способностью солюбилизировать некоторые осажденные белки (Umetsu, M. et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 328:189-197; Tsumoto, K. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 312:1383-1386), уменьшать образование агрегатов (Arakawa, T. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:148-152) и снижать неспецифическую адсорбцию белков на поверхностях (Ejima, D. et al. (2005) J. Chromatogr. A. 1094:49-55). Вне связи с механизмом, снижение агрегации белков может возникать в результате маскировки гидрофобных участков белков, которые взаимодействуют с аргинином. Данное взаимодействие может происходить между гуанидиновой группой аргинина и триптофановыми группами белков, или в результате образования гидрофобного участка при группировании аргинина, или может являться комбинацией таких эффектов.

В данном контексте фраза “высокое значение pH” относится к значению pH выше 8,0, которое приводит к значительному уменьшению содержания примесей, по сравнению с промывочным раствором, содержащим аргинин или производное аргинина при низком или нейтральном значении pH (например, pH приблизительно 5,0-7,0), которое используется в предшествующих способах промывки. Например, в одном варианте осуществления промывочный раствор с “высоким значением pH” обуславливает по меньшей мере приблизительно 2-3-кратное уменьшение HCP, и/или по меньшей мере приблизительно 3-4-кратное снижение уровней LMW, и/или общее уменьшение агрегации по меньшей мере приблизительно на 30-50% или больше по сравнению с промывочным раствором, содержащим аргинин, с низким или нейтральным значением pH 7,0.

В конкретных вариантах осуществления “высокое” значение pH промывочного раствора составляет по меньшей мере приблизительно 8,1, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 8,5 и более предпочтительно приблизительно 8,5-9,5 или приблизительно 8,9-9,0. Показательные условия промывки с “высоким значением” pH включают, например, значения pH 8,1 или приблизительно 8,1, 8,2 или приблизительно 8,2, 8,3 или приблизительно 8,3, 8,4 или приблизительно 8,4, 8,5 или приблизительно 8,5, 8,6 или приблизительно 8,6, 8,7 или приблизительно 8,7, 8,8 или приблизительно 8,8, 8,9 или приблизительно 8,9, 9,0 или приблизительно 9,0, 9,1 или приблизительно 9,1, 9,2 или приблизительно 9,2, 9,3 или приблизительно 9,3, 9,4 или приблизительно 9,4, 9,5 или приблизительно 9,5, 10,0 или приблизительно 10,0, 10,1 или приблизительно 10,1, 10,2 или приблизительно 10,2, 10,3 или приблизительно 10,3, 10,4 или приблизительно 10,4 и 10,5 или приблизительно 10,5. Промывочный раствор также может содержать один или более буфер (т.е. буферообразующие соли) для регулирования и/или поддержания значения pH. Неограничивающие примеры типичных буферов, которые можно вводить в промывочный раствор(ы), включают Трис (трис(гидроксиметил)метиламин), бис-Трис, бис-Трис пропан, гистидин, триэтаноламин, диэтаноламин, формиат, ацетат, MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), фосфат, HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), цитрат, MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота), бицин (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин), трицин (N-трис(гидроксиметил)метилглицин), TES (2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновая кислота), PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновая кислота)), какодилат (диметиларсиновая кислота) и SSC (цитратно-солевой буфер).

Способ очистки изобретения позволяет эффективно удалять различные примеси, включая высокомолекулярные и низкомолекулярные (HMW и LMW, соответственно) соединения и белки клетки-хозяина (HCP). Как подробно описано в примерах, способ позволяет эффективно уменьшить содержание соединений HMW, соединений LMW и HCP в промывочном элюате, в то же время позволяя достичь высокого процентного выхода целевого белка и высокой концентрации целевого белка. Например, в различных вариантах осуществления описанный здесь способ дает в результате процентный выход целевого белка, который выше 97%, более предпочтительно выше 98%, наиболее предпочтительно выше 99%.

В других вариантах осуществления способ изобретения приводит к процентному снижению загрязняющих примесей HMW или LMW в элюате, что составляет по меньшей мере приблизительно 2-кратное уменьшение, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 3-кратное уменьшение, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 4-кратное уменьшение, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 5-кратное уменьшение и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 6-кратное уменьшение. В других вариантах осуществления способ приводит к уменьшению HCP в элюате, выраженному в виде логарифма снижения концентрации (LRV), который составляет по меньшей мере приблизительно 1,1, или по меньшей мере приблизительно 1,2, или по меньшей мере приблизительно 1,3, или по меньшей мере приблизительно 1,4, или по меньшей мере приблизительно 1,5, или по меньшей мере приблизительно 1,6, или по меньшей мере приблизительно 1,7, или по меньшей мере приблизительно 1,8, или по меньшей мере приблизительно 1,9, или по меньшей мере приблизительно 2,0, или по меньшей мере приблизительно 2,1, или по меньшей мере приблизительно 2,2, или по меньшей мере приблизительно 2,3, или по меньшей мере приблизительно 2,4, или по меньшей мере приблизительно 2,5, или по меньшей мере приблизительно 2,6, или по меньшей мере приблизительно 2,7, или по меньшей мере приблизительно 2,8, или по меньшей мере приблизительно 2,9, или по меньшей мере приблизительно 3,0.

Вне связи с механизмом, высокое значение pH может способствовать частичной денатурации HCP и HMW, тогда как стабильные белки, включая мономерные антитела, не подвергаются воздействию в указанных условиях. Денатурирование контаминантных белков может проявляться в виде незначительного изменения структуры, которое может быть достаточным для ослабления неспецифического связывания. Поэтому высокое значение pH промывочного раствора может быть существенным увеличением устранения примесей путем дестабилизации их взаимодействия со связанным целевым белком или с твердым носителем аффинной матрицы.

Таким образом, в одном аспекте изобретение предлагает способ получения очищенного белка (например, антитела, фрагмента антитела или белка, содержащего Fc-фрагмент (например, Fc-слитый белок)) с применением аффинной хроматографической (AC) матрицы, с которой связывается целевой белок, способ включает промывку матрицы AC промывочным раствором, содержащим аргинин или производное аргинина, со значением pH выше 8,0 (например, предпочтительно pH выше 8,1, более предпочтительно pH выше 8,5, например приблизительно в диапазоне 8,5-9,5 или приблизительно 8,9-9,0) без присутствия незабуферивающей соли, перед элюированием целевого белка с матрицы AC. Матрица AC необязательно может быть уравновешена перед загрузкой целевого белка и/или перед элюированием целевого белка.

В данном контексте термин “аффинная хроматографическая матрица” или “матрица AC” обозначает твердофазный носитель, обычно гель или смолу, который позволяет провести разделение биохимических смесей на основе высокоспецифичного связывающего взаимодействия между целевым белком и матрицей AC, такого как взаимодействие между рецептором и лигандом, ферментом и субстратом или антигеном и антителом. Таким образом, твердофазный носитель содержит мишень, к которой целевой белок способен обратимо прикрепляться в зависимости от буферных условий. Неограничивающие примеры иммобилизованных носителей или твердофазных носителей, которые могут содержать матрицу AC, включают гелевую матрицу, такую как шарики агарозы (например, коммерчески доступные матрицы Sepharose), и стеклянную матрицу, такую как пористые стеклянные шарики (например, коммерчески доступные матрицы ProSep).

Связывание целевого белка с матрицей AC обычно достигается с помощью колоночной хроматографии. То есть матрицу AC формируют внутри колонки, биохимическую смесь, содержащую целевой белок, пропускают через колонку, с последующей промывкой колонки путем пропускания через колонку промывочного раствора, с последующим элюированием целевого белка из колонки путем пропускания через колонку элюирующего буфера.

Альтернативно связывание белка, представляющего интерес, с матрицей AC можно осуществить с помощью обработки в объеме, при которой биохимические смеси, содержащие белок, представляющий интерес, инкубируют с матрицей AC в сосуде, чтобы обеспечить связывание белка, представляющего интерес, с матрицей AC, твердофазный носитель удаляют из сосуда (например, с помощью центрифугирования или фильтрации с использованием вакуумного насоса), твердофазный носитель промывают для удаления примесей и вновь получают (например, с помощью центрифугирования или фильтрации с использованием вакуумного насоса) и белок, представляющий интерес, элюируют с твердофазного носителя.

В еще одном варианте осуществления можно использовать комбинацию обработки в объеме и колоночной хроматографии. Например, начальное связывание белка, представляющего интерес, с матрицей AC можно осуществить с помощью обработки в объеме и затем можно поместить твердофазный носитель в колонку с последующим проведением промывки и элюирования целевого белка из колонки.

Природа конкретной твердофазной матрицы, в особенности связывающие свойства мишени, прикрепленной к твердой фазе, определяет тип(ы) белка(ов), который можно очистить с применением указанной твердофазной матрицы. Например, в предпочтительном варианте осуществления изобретения матрица AC представляет собой колонку, содержащую белок А, которая содержит в качестве мишени, прикрепленной к твердой фазе, белок бактериальной клеточной стенки, белок А, который специфически связывает домены CH2 и CH3 в Fc-фрагменте определенных иммуноглобулинов. Связывающие свойства белка A общепризнанны в данной области.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения белок, представляющий интерес (который необходимо очистить), представляет собой антитело, фрагмент антитела или белок, содержащий Fc-фрагмент (например, Fc-слитый белок). Кроме того, дополнительные белки, которые можно очистить с применением хроматографии на белке А, включают Fc-содержащие белки (например, Fc-слитые белки). В той степени, в какой белок способен к специфическому связыванию с матрицей на основе белка А, он может быть очищен согласно способам изобретения. Различные смолы, содержащие белок А, хорошо известны в данной области, и они подходят для применения в изобретении. Неограничивающие примеры коммерчески доступных смол, содержащих белок А, включают MabSelect, MabSelect Xtra, MabSelect Sure, rProtein A Sepharose FF, rmpProtein A Sepharose FF, Protein A Sepharose CL-4B и nProtein A Sepharose 4 FF (все коммерчески доступны в GE Healthcare); ProSep A, ProSep-vA High Capacity, ProSep-vA Ultra и ProSep-Va Ultra Plus (все коммерчески доступны в Millipore); Poros A и Mabcapture A (коммерчески доступны в Poros); IPA-300, IPA-400 и IPA-500 (все коммерчески доступны в RepIiGen Corp.); Affigel protein A и Affiprep protein A (коммерчески доступны в Bio-Rad); Protein A Ceramic Hyper D F (коммерчески доступна в Pall Corporation); Ultralink Immobilized protein A и Agarose protein A (коммерчески доступны в PIERCE); и Protein A Cellthru 300 и Protein A Ultraflow (коммерчески доступны в Sterogen Bioseparations).

В другом варианте осуществления смола представляет собой CaptureSelect IgG-CH1 (применима для очистки IgG человека и всех Fab-фрагментов), CaptureSelect IgG-Fc (Hu) (специфична к IgG человека, с обнаружением всех четырех подклассов), CaptureSelect LC-kappa (Hu) (применима для очистки всех продуктов, содержащих легкие каппа-цепи Ig человека (прежнее название CaptureSelect Fab kappa)), CaptureSelect LC-lambda (Hu) (применима для очистки всех продуктов, содержащих легкие лямбда-цепи Ig человека (прежнее название CaptureSelect Fab lambda)), CaptureSelect IgG4 (Hu) (высокоспецифична в отношении IgG4 человека без перекрестного связывания с другими подклассами или видами), CaptureSelect IgGl (Hu) (высокоспецифична в отношении IgGl человека без перекрестного связывания с другими подклассами или видами), CaptureSelect IgG3 (Hu) (высокоспецифична в отношении IgG3 человека без перекрестного связывания с другими подклассами или видами), CaptureSelect IgM (смола для связывания IgM, применимая для IgM человека, мыши и крысы) или CaptureSelect IgA (применима для очистки IgA человека, IgA-димеров и секреторного IgA (slgA)), которые коммерчески доступны в BAC. В другом варианте осуществления смола представляет собой IgSelect (аффинный носитель для очистки IgG человека), KappaSelect (аффинный носитель для очистки Fab-фрагментов, содержащих кара-цепи), LamdaFabSelect (аффинный носитель для очистки Fab-фрагментов, содержащих лямбда-цепи) или Capto L (смола для захвата антител и фрагментов антител), которые коммерчески доступны в GE Healthcare Life Sciences.

Другие системы для аффинной хроматографии, которые можно использовать в изобретении, включают, например, колонки, содержащие белок G, белок A/G и белок L, которые также являются иммуноглобулинсвязывающими бактериальными белками со связывающими свойствами, общепризнанными в данной области. Таким образом, матрицу AC, которая представляет собой матрицу на основе белка G, матрицу на основе белков A/G или матрицу на основе белка L, можно использовать для очистки антител, фрагментов антител или белков, содержащих Fc-фрагмент (например, Fc-слитые белки).

Другие неограничивающие примеры матриц AC и типов белков, для очистки которых они используются, включают следующие: колонка для металл-аффинной хроматографии (IMAC) (для очистки белков, обладающих сродством к ионам металлов, таких как гистидин-меченые белки), аффинная хроматография на колонке с кальмодулином (для очистки белков, меченных кальмодулинсвязывающим пептидом (CBP)), колонка MEP HyperCelTM (матрица на основе целлюлозы, на которой избирательно связывается иммуноглобулин), колонка для связывания мальтоза-связывающего белка (MBP) (например, смола Dextrin SepharoseTM, которая избирательно связывает белки, меченные MBP), колонка для связывания глутатион-S-трансферазы (GST) (например, смола Glutathione SepharoseTM, которая избирательно связывает белки, меченные GST) и колонка для связывания Strep-Tag II (например, смола на основе сефарозы Strep-TactinTM, которая избирательно связывает белки, меченные Strep-Tag II). Кроме того, иммуноаффинные матрицы, которые содержат антитело в качестве мишени, прикрепленной к твердой фазе, могут применяться для очистки целевого антигена, который специфически связывается с антителом, прикрепленным к твердой фазе.

Хотя представляющее интерес изобретение описывается здесь конкретно в отношении очистки антител с применением хроматографии на основе белка А, любой белок (включая гибридные белки) поддается очистке с применением способов промывки, описанных здесь, в той мере, в какой указанный белок известен в данной области своей способностью к избирательному связыванию с определенной матрицей AC.

В данном контексте термин “антитело” включает целые антитела и любой антиген-связывающий фрагмент (т.е. “антиген-связывающие фрагменты” (также известные как “антиген-связывающие участки”)) или их отдельные цепи. Целые антитела представляют собой гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (обозначается VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (обозначается VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит только из одного домена CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые участками определения комплементарности (CDR), которые чередуются с участками, являющимися более консервативными, называемыми каркасными участками (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, организованных в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки), и первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Термин “антитело” также включает мультимерные формы антител, такие как минитела, bis-scFv, диатела, триатела, тетратела и химически конъюгированные Fab’-мультимеры.

Термин “фрагмент антитела” (также называемый “антигенсвязывающий фрагмент” или “антигенсвязывающий участок”) в данном контексте обозначает один или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином “антигенсвязывающий фрагмент” антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2 фрагмент, бивалентный фрагмент представляет собой по существу фрагмент Fab с частью шарнирной области (см. FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (v) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (vi) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; (vii) выделенный гипервариабельный участок (CDR); и (viii) нанотело (также известное как однодоменное антитело (sdAb)), которое представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один вариабельный домен и два константных домена. Однодоменные антитела включают фрагменты VHH (однодоменные антитела, сконструированные из неканонических антител, обнаруженных у представителей семейства верблюдовых), а также фрагменты VNAR (однодоменные антитела, полученные из неканонических антител (IgNAR, 'иммуноглобулиновый новый антигенный рецептор) хрящевых рыб).

Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, их можно соединить с применением рекомбинантных методов синтетическим линкером, позволяющим получить их в виде одной белковой цепи, в которой участки VL и VH соединяют попарно с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см. например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином “антигенсвязывающий фрагмент” антитела. Указанные фрагменты антител получают с применением традиционных технологий, известных специалистам в данной области, и проводят скрининг фрагментов в отношении их полезности таким же образом, как и скрининг интактных антител. Химерные молекулы (или слитые молекулы), содержащие антигенсвязывающий домен или его эквивалент, слитый с другим полипептидом или молекулой, также охватываются настоящим изобретением.

Промывочные растворы изобретения содержат аргинин или производное аргинина. Аргинин, который можно использовать в настоящем изобретении, может представлять собой природную аминокислоту аргинина (например, L-аргинин), D-аргинин или производное аргинина. В данном контексте термин “производное аргинина” обозначает молекулы, полученные из аминокислоты аргинина, либо D- либо L-формы, с помощью химических или физических процессов, которые не изменяют цвиттер-ионные, амфотерные или биполярные свойства аргинина (например, которые могут нарушать неспецифические взаимодействия между примесями и каркасом смолы, лигандом белка А или связанным на матрице целевым белком).

Неограничивающие примеры производных аргинина включают ацилированный аргинин, такой как ацетиларгинин и N-альфа-бутироил-аргинин, агматин, аргининовая кислота и N-альфа- пивалоил-аргинин. Аргинин или производное аргинина можно использовать в форме соли присоединения кислоты. Примеры кислоты, которая может образовывать соль присоединения кислоты, включают соляную кислоту и т.п. Другие производные включают, но без ограничения, 3-гуанидинпропионовую кислоту, 4-гуанидинмасляную кислоту, L-2-амино-3-гуанидинпропионовой кислоты гидрохлорид, L-2-амино-3-гуанидинпропионовой кислоты гидрохлорид, Nωнитро-L-аргинина бензилового эфира p-толуолсульфонатную соль и гомоаргинин.

Концентрация аргинина или производного аргинина в промывочном растворе обычно составляет от 0,05 до 0,85 M (что соответствует верхнему пределу растворимости аргинина в воде при 20°C) (например, 0,05 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M или 0,85 M), более предпочтительно от 0,1 до 0,5 M (например, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M или 0,5 M). В различных вариантах осуществления концентрация аргинина или производного аргинина может составлять, например, 0,05 M, 0,1 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M или 0,8 M или от 0,1 M до 0,5 M. В определенных вариантах осуществления концентрация аргинина или производного аргинина в промывочном растворе составляет 0,25 M или больше. В конкретных вариантах осуществления аргинин представлен в концентрации 0,1 M или приблизительно 0,1 M, 0,25 M или приблизительно 0,25 M или 0,5 M или приблизительно 0,5 M.

Хотя изобретение описывается здесь в отношении стадии промывки в процессе аффинной хроматографии, специалисту в данной области легко понять, что дополнительные стадии осуществляются как до, так и после стадии промывки для обеспечения очистки целевого белка на аффинной хроматографической матрице. Например, перед стадией промывки и/или элюирования способы изобретения могут включать стадию уравновешивания, во время которой уравновешивают аффинную хроматографическую матрицу, и/или стадию загрузки или “захвата”, во время которой биохимическую смесь, (например, собранные клетки), содержащую целевой белок, наносят на матрицу AC.

Подходящие уравновешивающие буферы обычно характеризуются приблизительно нейтральным значением pH для соответствия загрузочному раствору (~7,0+/-0,5), чтобы предотвратить преципитацию. Обычно уравновешивающий буфер не должен содержать соль (NaCl), но он содержит только буфер (фосфат для указанного диапазона pH) в достаточно высокой для буфера концентрации (> приблизительно 20 мМ). Подходящие условия для уравновешивающего буфера будут меняться в зависимости от природы матрицы AC и целевого белка, который очищают, и специалист в данной области легко может определить такие условия с использованием способов и информации, общепринятых в данной области. Неограничивающие примеры уравновешивающего буфера для очистки антител на колонке, содержащей белок А, представлены в примерах.

Кроме того, после стадии промывки, как упоминалось выше, способы изобретения могут включать стадию элюирования, во время которой элюирующий буфер наносят на аффинную хроматографическую матрицу, чтобы элюировать целевой белок с матрицы. Подходящие условия для элюирующего буфера будут меняться в зависимости от природы матрицы AC и целевого белка, который нужно очистить, и специалист в данной области может легко определить такие условия с применением способов и информации, общепринятых в данной области. Обычно элюирование целевого белка из матрицы AC осуществляют при кислом значении pH. Неограничивающие примеры элюирующих буферов для очистки антител на колонке, содержащей белок А, указаны в примерах.

По другому аспекту изобретение предлагает способы удаления примесей из смесей, содержащих антитела, во время очистки с применением белка А антитела или другого Fc-содержащего белка. Таким образом, изобретение предлагает способ получения очищенного антитела, фрагмента антитела или белка, содержащего Fc-фрагмент, с применением колонки, содержащей белок А, способ включает

(a) загрузку смеси, содержащей антитело, фрагмент антитела или белок, на колонку, содержащую белок А;

(b) промывку колонки, содержащей белок А, промывочным раствором, содержащим аргинин или производное аргинина, при значении pH выше 8,0 (например, pH выше 8,1, предпочтительно pH выше 8,5 и более предпочтительно приблизительно в диапазоне 8,5-9,5 или приблизительно 8,9-9,0); и

(c) элюирование антитела, фрагмента антитела или белка из колонки, содержащей белок А, где промывку осуществляют без присутствия незабуферивающей соли. Необязательно способ также включает промывку колонки, содержащей белок А, уравновешивающим буфером перед элюированием антитела или фрагмента антитела из колонки, содержащей белок А. Необязательно способ также может включать уравновешивание колонки, содержащей белок А, перед загрузкой белка, представляющего интерес, и/или перед элюированием белка, представляющего интерес.

Предпочтительные концентрации и диапазоны концентраций аргинина (и производных аргинина) описаны выше. Например, в одном варианте осуществления аргинин присутствует в концентрации приблизительно 0,25 M или в концентрации 0,25 M. В другом варианте осуществления аргинин присутствует в концентрации в диапазоне 0,1-0,5 M. Предпочтительные значения pH и диапазоны pH также описаны выше. Например, значение pH соответствует значению pH выше 8,0 (например, предпочтительно pH выше 8,1, более предпочтительно pH выше 8,5, например, приблизительно в диапазоне 8,5-9,5 или приблизительно 8,9-9,0).

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не следует истолковывать как ограничивающие. В особенности, примеры относятся к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых в настоящей заявке, включено здесь в явной форме посредством ссылки во всей полноте.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Высокое значение pH само по себе не повышает чистоту продукта

В данном примере оценивают эффект значения pH в чистом виде на удаление примесей из раствора, содержащего антитела, во время аффинной хроматографии. В связи с этим сравнивают два промывочных раствора: один раствор содержит 1 M NaCl со значением pH 7,0 и другой раствор содержит 1 M NaCl со значением pH 9,0.

Осветленные супернатанты клеточных культур млекопитающих, содержащие от 0,2 до 3,0 г/л моноклонального антитела #1, собирают с помощью глубинной фильтрации и очищают с применением колонки ALC, в частности, колонки, содержащей белок А (GE Healthcare), согласно условиям, описанным ниже в таблице 1:

Таблица 1
Рабочий режим колонки, содержащей белок А, в примере 1
Стадия Буфер CV RST* (мин) Комментарий
Уравновешивание 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0 5 4
Загрузка Бесклеточный продукт** q.s. 4
Промывка 1 Разный (см. таблицу 2) 6 4
Промывка 2 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0 3 4
Элюирование 20 мМ уксусная кислота 5 4 Сбор фракции, соответствующей пику (280 нм): 100-100 mAU
CIP 0,1 M NaOH 4 4
Хранение 20 мМ уксусная кислота/ацетат натрия, 2% бензиловый спирт, pH 5,1 5 4
*RST: время удерживания; **плотность заполнения: в соответствии с заранее установленной емкостью динамического связывания: 36 г антитела на литр смолы

В уравновешенную колонку загружают осветленный продукт и вначале промывают либо W1-N7 (1 M NaCl, pH 7,0) либо W2-N9 (1 M NaCl, pH 9,0), как описано в таблице 2 ниже:

Таблица 2
Перечень тестируемых промывочных растворов
Номер Буфер Сокращенное название буфера
1 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1 M NaCl, pH 7,0 W1-N7
2 20 мМ NaH2-/Na2H-PO4/NaOH, 1 M NaCl, pH 9,0* W2-N9
*Значение pH, доведенное с помощью 1 M Трис

Затем колонку промывают уравновешивающим буфером, как описано в таблице 1 (т.е. 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0), и затем проводят элюирование при низком значении pH. Элюат анализируют в отношении концентрации антител с помощью аналитической ALC, в отношении HMW/LMW с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) и в отношении содержания HCP с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, разработанного для той же самой клеточной линии.

Показатели процентного выхода при очистке с помощью белка А моноклонального антитела #1 с применением двух различных промывочных растворов, приведенных в таблице 2, представлены ниже в таблице 3.

Таблица 3
Сравнение эффектов низкого и высокого значений pH на эффективность ALC
Эксперимент Выход продукта* (%) Концентрация (мг/мл) HMW (%) LMW (%) HCP (ч/млн)
Загрузка (осветленный продукт) 2,32 370962
W1-N7 100,8 20,00 1,3 0,4 9315
W2-N9 101,9 20,28 1,2 0,5 8984
*Загрузка в мл -> элюат в г

Как показано в таблице 3, изменение значения pH от нейтрального (pH 7,0) до основного (pH 9,0) не оказывает эффект на выход, концентрирование пула элюата, уровни содержания частиц HMW или LMW или на концентрацию HCP. По существу, результаты показывают, что высокое значение pH само по себе не приводит к повышению чистоты продукта. Однако, как показано в следующих примерах, высокое значение pH в комбинации с аргинином оказывает существенный эффект на чистоту продукта.

Пример 2: Аргинин (в комбинации с высоким значением pH) является важным вспомогательным веществом

В данном примере сравнивают характеристики различных промывочных буферов, чтобы определить, какой промывочный раствор и значение pH являются наиболее эффективными для удаления примесей из раствора, содержащего антитела, при осуществлении аффинной хроматографии. В частности, сравнивают четыре промывочных раствора: раствор, содержащий 1 M NaCl pH 7,0, раствор, содержащий 250 мМ аргинина, pH 7,0, раствор, содержащий 250 мМ аргинина, pH 8,9, и раствор, содержащий 500 мМ Трис, pH 8,9. Трис включают, чтобы определить, оказывает ли сам Трис эффект на удаление примесей.

Осветленные супернатанты клеточных культур млекопитающих, содержащие от 0,2 до 2,5 г/л моноклонального антитела #3, собирают с помощью глубинной фильтрации и очищают с применением колонки ALC, в частности, колонки, содержащей белок А (GE Healthcare), в соответствии с условиями, описанными ниже в таблице 4.

Таблица 4
Рабочий режим колонки, содержащей белок А, в примере 2
Стадия Буфер CV RST* (мин) Комментарий
Уравновешивание 1 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0 3 4
Уравновешивание 2 Буфер для промывки 1 3 4
Загрузка Бесклеточный продукт** q.s. 4
Промывка 1 Различный (см. таблицу 5) 6 или 12 4
Промывка 2 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0 3 4
Элюирование 50 мМ уксусная кислота 5 4 Сбор фракции, соответствующей пику (280 нм): 100-100 mAU
CIP 0,1 M NaOH 3 4
Хранение 20 мМ ацетат натрия, 2% бензиловый спирт, pH 5,1 5 4
*RST: время удерживания; **плотность заполнения: 30 г антитела на литр смолы

В уравновешенную колонку загружают осветленный продукт и вначале промывают либо W1-N7, W3-Arg7, W4-Arg9 либо W5-T9, как описано в таблице 5 ниже.

Таблица 5
Перечень тестируемых промывочных растворов
Номер Буфер Сокращенное название буфера
3 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1 M NaCl, pH 7,0 W1-N7
4 250 мМ L-аргинин, pH 7,0** W3-Arg7
5 250 мМ L-аргинин, pH 8,9** W4-Arg9
6 500 мМ Трис, pH 8,9 W5-T9
**Значение pH, доведенное с помощью 1 M Трис

Затем колонку промывают уравновешивающим буфером, как описано в таблице 4 (т.е. 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0), и затем осуществляют элюирование при низком значении pH. Элюат анализируют в отношении концентрации антител с помощью аналитической ALC, в отношении HMW/LMW с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) и в отношении содержания HCP с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, разработанного для той же самой клеточной линии.

Показатели процентного выхода при очистке с помощью белка А моноклонального антитела #3 с применением четырех различных промывочных растворов, приведенных в таблице 5, представлены ниже в таблице 6.

Таблица 6
Сравнение промывочного буфера ALC, содержащего NaCl, и буфера на основе аргинина при различных значениях pH и буфера на основе Трис
Название Выход продукта* (%) Концентрация (г/л) HMW (%) LMW (%) HCP (ч/млн)
Собранный продукт - 1,53 >600000**
W1-N7 100,1 17,13 3,1 0,6 32000
W3-Arg7 99,1 18,94 2,3 0,4 28273
W4-Arg9 99,3 19,72 1,5 0,1 9210
W5-T9*** 98,1 16,44 3 0,6 54876
*Загрузка в мл -> элюат в г; **значение HCP точно не установлено; ***промывку осуществляли в виде 12 CV вместо 6

Как показано в таблице 6, очевидно, что буферы на основе аргинина более эффективно удаляют HMW, LMW и HCP, чем промывочный буфер с высоким содержанием соли. Кроме того, указанный эффект усиливается в условиях высокого значения pH. В особенности, применение промывочного буфера, содержащего аргинин, с высоком значением pH 8,9 (W4-Arg9), без присутствия незабуферивающей соли, приводит к 3-кратному уменьшению содержания HCP, 4-кратному снижению содержания LMW и к уменьшению уровня образования агрегатов с 2,3 до 1,5% по сравнению с промывочным буфером, содержащим аргинин со значением pH 7,0 (W3-Arg7). Несмотря на сравнимые показатели выхода продукта, более высокое значение pH также увеличивает концентрацию продукта в пуле.

Поскольку Трис используют для регулирования значения pH в буферах, содержащих аргинин, и требуется около 300 мМ Трис для получения значения pH 8,9, в эксперимент включен промывочный раствор, содержащий 500 мМ Трис с высоким pH (т.е. W5-T9). Однако, как показано в таблице 6, W5-T9 не оказывает эффекта на удаление HMW или LMW. В действительности, уровень HCP даже выше в случае W5-T9, чем в случае промывочного раствора, содержащего NaCl. Учитывая, что промывку осуществляют в оптимальных условиях для Трис (например, имеется в виду увеличенная почти в два раза концентрация Трис по сравнению с самой высокой концентрацией, используемой в других буферах, и увеличение в два раза времени промывки), результаты позволяют предположить, что Трис сам по себе не оказывает эффекта, наблюдаемого при промывке. Кроме того, ясно, что высокое значение pH как таковое не приводит к желаемому удалению примесей.

Пример 3: Промывочный раствор на основе аргинина в комбинации с высоким значением pH существенно снижает содержание примесей

В данном примере оценивают эффект условий трех различных промывочных буферов на чистоту трех моноклональных антител. Конкретно, сравнивали три промывочных раствора: (1) низкое значение pH (W6-Ace5), (2) высокое содержание соли (W1-N7) и (3) аргинин и высокое значение pH (W7-Arg9).

Три моноклональных антитела (#1, #2 и #4) собирают с помощью глубинной фильтрации и очищают с применением колонки ALC, в частности, колонки, содержащей белок А (GE Healthcare), в соответствии с условиями, описанными ниже в таблице 7.

Таблица 7
Рабочий режим колонки, содержащей белок А, в примере 4
Стадия Буфер CV RST* (мин)
Уравновешивание 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0 (LOESL0073) 6 4
Загрузка Бесклеточный продукт** q.s. 4
Промывка 1 Разный (см. таблицу 11) 3 4
Промывка 2 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0*** 3 4
Элюирование 20 мМ уксусная кислота 4 4
CIP 0,1 M NaOH 3 4
Хранение 20 мМ уксусная кислота/ацетат натрия, 2% бензиловый спирт, pH 5,1 4 4
*RST: время удерживания; **плотность заполнения: в соответствии с заранее установленной емкостью динамического связывания: 36/42/36 г By/Qg/Bp, соответственно на литр смолы; ***стадию пропускают, если промывку 1 осуществляют раствором 20 мМ ацетата натрия, pH 5,0

Уравновешенную колонку загружают осветленным продуктом и промывают растворами, указанными в таблице 8 ниже.

Таблица 8
Перечень тестируемых промывочных растворов
Номер Буфер Сокращенное название буфера
1 20 мМ ацетат натрия, pH 5,0 W6-Ace5
2 20 мМ NaH2-/Na2H-PO4, 1 M NaCl, pH 7,0 W1-N7
3 250 мМ L-аргинин/L-аргинин-HCl, pH 9,0* W7-Arg9
*аналогично W4-Arg9, но значение pH регулируют с помощью L-аргинина, а не Трис

Затем колонку промывают уравновешивающим буфером, как описано в таблице 7 (т.е. 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0), и затем осуществляют элюирование при низком значении pH. Элюат анализируют в отношении концентрации антител с помощью аналитической ALC, в отношении HMW/LMW с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) и в отношении содержания HCP с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, разработанного для той же самой клеточной линии.

В таблице 9 обобщены эффекты условий, создаваемых различными промывочными буферами ALC, на чистоту трех моноклональных антител в элюате, которые оценивали по выходу антитела, концентрациям продукта в пулах элюатов, показателям содержания HCP и HMW.

Таблица 9
Обобщенные результаты эксперимента по сравнению эффективности ALC, полученные после промывки раствором с низким значением pH (W6-Ace5), раствором с высоким содержанием соли (W1-N7) или раствором аргинина с высоким значением pH (W7-Arg9), для трех моноклональных антител (#1, #2 и #4)
mAb Промывочный буфер Выход продукта (%) Концентрация (г/л) HCP (ч/млн) HMW (%)
#1 полученный продукт NA 2,29 381238 NA
#1 W6-Ace5 84,5 16,2 35287 3,9
#1 W1-N7 100 20,0 9315 1,3
#1 W7-Arg9 98,6 19,9 10755 1,0
#4 полученный продукт NA 1,91 253087 NA
#4 W6-Ace5 92,7 19,5 17981 2,8
#4 W1-N7 97,6 19,0 14894 1,3
#4 W7-Arg9 94,1 20,7 6679 0,9
#2 полученный продукт NA 1,72 603649 NA
#2 W6-Ace5 94,8 16,1 11001 8,8
#2 W1-N7 98,5 16,4 6607 8,4
#2 W7-Arg9 98,8 13,7 1759 8,3
Строки, выделенные полужирным шрифтом, соответствуют композиции продукта; концентрация: концентрация в элюате; HCP: белки клетки-хозяина; HMW: высокомолекулярные соединения; LRV: логарифм снижения концентрации; NA: не применимо

Как показано выше в таблице 9, промывка раствором с низким значением pH (W6-Ace5) дает показатели выхода от 84,5 до 94,8% (среднее значение: 90,7%), и промывка раствором с высоким содержанием соли (W1-N7) дает средний выход 98,7% (от 97,6 до 100%). Промывка раствором, содержащим аргинин, с высоким значением pH (W7-Arg9) дает в результате самый высокий выход среди трех промывочных растворов со средним значением выхода 97,2% (от 94,1 до 98,8%).

Не выявлено четкой тенденции изменения концентраций в элюатах при сравнении разных промывочных буферов, используемых во время ALC, с различными антителами. В целом обнаруживают сравнимые диапазоны значений, и ни один из буферов не дает в результате самого высокого или самого низкого значения концентрации.

В отношении удаления примесей, можно установить общую последовательность для трех промывочных буферов. Наихудший показатель уменьшения HCP, как и в других случаях, получен для промывочного раствора с низким значением pH (W6-Ace5), за ним следует раствор с высоким содержанием соли (W1-N7). Наиболее высокий показатель удаления примесей получен для раствора, содержащего аргинин, с высоким значением pH 9,0 (W7-Arg9). В частности, среднее значение показателя удаления примесей, выраженного в виде логарифма снижения концентрации примесей, составляет log 1,3 после промывки раствором с низким значением pH (W6-Ace5), после промывки раствором с высоким содержанием соли (W1-N7) показатель составляет log 1,6, и наиболее высокий показатель удаления примесей log 1,9 получают после промывки раствором, содержащим аргинин, с pH 9,0 (W7-Arg9).

В отношении уровней HMW, указанные уровни различны в случае трех различных моноклональных антител, и удаление HMW является зависимым от моноклонального антитела. В целом, раствор с низким значением pH (W6-Ace5) является наименее эффективным в уменьшении уровней HMW. Более высокие результаты получают при использовании раствора с высоким содержанием соли (W1-N7). Однако самые низкие значения HMW в элюате ALC, как и в других тестах, обнаруживают при использовании промывочного раствора, содержащего аргинин, с высоким значением pH 9,0 (W7-Arg9). Для двух моноклональных антител наблюдается уменьшение HMW в 3,1 или 3,9 раза, соответственно, при использовании раствора с низким значением pH (W6-Ace5) по сравнению с результатами, полученными при использовании раствора с высоким значением pH 9,0 (W7-Arg9), тогда как для моноклонального антитела #2 обнаружено только незначительное снижение HMW.

В целом, указанный пример демонстрирует, что новая комбинация аргинина и высокого значения pH существенно увеличивает чистоту и концентрацию антител по сравнению со стандартными промывочными буферами, что определяли по выходу продукта, концентрации продукта в пулах, содержанию HCP в пулах и по уровню HMW в пулах. Промывка, осуществляемая с применением в растворе специфической комбинации аргинина и высокого значения pH, дает в результате более высокую очистку продукта и более высокую концентрацию продукта в элюате, и в то же время снижает потери продукта. Кроме того, снижение уровней HCP и HMW уменьшает нагрузку на последующие стадии производства и выделения продукта и повышает общую эффективность процесса в терминах качества и рентабельности. Кроме того, поскольку любой контаминант, такой как HCP или частицы HMW, может служить центром последующей агрегации продуктов, уменьшение их количества во время стадии “захвата” будет замедлять процессы агрегации, связанной с примесями.

1. Способ получения очищенного белка, представляющего интерес, с использованием матрицы для аффинной хроматографии (АС), с которой связывается белок, представляющий интерес, где способ включает промывку матрицы АС промывочным раствором, содержащим аргинин или производное аргинина, выбранное из группы, состоящей из ацетиларгинина, агматина, аргининовой кислоты, N-альфа-бутироил-аргинина, N-альфа-пивалоил-аргинина, 3-гуанидинпропионовой кислоты, 4-гуанидинмасляной кислоты, L-2-амино-3-гуанидинпропионовой кислоты гидрохлорида, Nωнитро-L-аргинина бензилового эфира р-толуолсульфонатной соли и гомоаргинина, со значением рН приблизительно 8,5-9,5, где указанную промывку осуществляют без присутствия незабуферивающей соли.

2. Способ по п. 1, где способ включает:

a) загрузку смеси, содержащей белок, представляющий интерес, на матрицу АС;

b) промывку матрицы АС промывочным раствором, содержащим аргинин или производное аргинина, выбранное из группы, состоящей из ацетиларгинина, агматина, аргининовой кислоты, N-альфа-бутироил-аргинина, N-альфа-пивалоил-аргинина, 3-гуанидинпропионовой кислоты, 4-гуанидинмасляной кислоты, L-2-амино-3-гуанидинпропионовой кислоты гидрохлорида, Nωнитро-L-аргинина бензилового эфира р-толуолсульфонатной соли и гомоаргинина, при значении рН приблизительно 8,5-9,5; и

c) элюирование белка, представляющего интерес, с матрицы АС,

где указанную промывку осуществляют без присутствия незабуферивающей соли.

3. Способ по п. 1 или 2, где белок, представляющий интерес, представляет собой антитело, фрагмент антитела или Fc-слитый белок.

4. Способ по п. 3, где матрица АС представляет собой колонку, содержащую белок А.

5. Способ по п. 1, где значение рН составляет приблизительно 8,9-9,0.

6. Способ по п. 1, где рН составляет 9,0 или приблизительно 9,0.

7. Способ по п. 1, где аргинин присутствует в концентрации в диапазоне 0,1-0,5 М.

8. Способ по п. 7, где аргинин присутствует в концентрации 0,25 М или приблизительно 0,25 М.

9. Способ по п. 1, где промывочный раствор содержит аргинин-HCl.

10. Способ по п. 1, где промывочный раствор удаляет примеси, выбранные из группы, состоящей из высокомолекулярных соединений (HMW), белков клетки-хозяина (НСР) и низкомолекулярных соединений (LMW).

11. Способ по п. 1, где промывочный раствор содержит одну или более буферообразующих солей.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ получения препарата белка из образца смеси, содержащей белок, являющийся целью выделения, и по меньшей мере один НСР.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вариантов альбумина, у которых изменен период полужизни в плазме по сравнению с исходным альбумином, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к кристаллу циклопептида формулы I, способам его получения и применению для получения соединения, обладающего противогрибковой активностью. Кристалл циклопептида обладает высокой чистотой и стабильностью.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения полипептидного мультимера, который включает первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, или помимо первого и второго полипептидов мультимер включает один или два третьих полипептида, обладающих антигенсвязывающей активностью, или помимо первого, второго и третьего полипептидов мультимер включает четвертый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, и способ включает стадии: (a) экспрессии ДНК, которая кодирует первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, и ДНК, которая кодирует второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, или экспрессии ДНК, которая кодирует первый, второй и третий полипептиды, обладающие антигенсвязывающей активностью, или экспрессии ДНК, которая кодирует первый, второй, третий и четвертый полипептиды, обладающие антигенсвязывающей активностью; и (b) сбора продукта экспрессии стадии (а) с использованием аффинной хроматографии с белком А.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению меченого альдегидом антитела для конъюгации с интересующим лекарственным средством, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к способу эффективного получения полипептидного фрагмента, подходящего для связывания способом NCL. Способ получения включает стадию взаимодействия полипептида, состоящего из первого полипептидного фрагмента, имеющего на N-конце цистеиновый аминокислотный остаток, и второго полипептидного фрагмента, связанного через вставочную последовательность -Cys-W-(His)n-Z-Met- с CNBr для получения первого полипептидного фрагмента, имеющего на N-конце цистеиновый аминокислотный остаток, и третьего полипептидного фрагмента, стадию последующего взаимодействия с третьим полипептидным фрагментом с соединением, представленным формулой (I), и соединением, представленным формулой (II), для получения второго полипептидного фрагмента, имеющего модифицированный С-конец.

Изобретение относится к области биоорганической химии, фармакологии, молекулярной биологии и может быть использовано для получения терапевтически значимых полиамидных миметиков олигонуклеотидов (ПНК), перспективных лекарств направленного действия, обладающих повышенной стабильностью в биологических средах.

Изобретение относится к новому соединению формулы I-1, характеризующемуся эффектами тромболизиса, акцептирования свободных радикалов и направленного действия на тромб.

Изобретение относится к двухстадийному способу хроматографии для очистки белков, в частности моноклональных антител, с использованием только четырех буферных растворов, полученных из маточного раствора.

Изобретение относится к способу получения циклопептидного соединения формулы I высокой чистоты, где R представляет собой Н или катион, способный образовывать фармацевтически приемлемую соль.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены способы очистки моноклонального антитела. Способы включают обработку образца с помощью поглощающей смолы для аффинной хроматографии, дезактивирование вирусов в полученном элюате путем понижения рН до 3-4, обработку полученного элюата с помощью фильтра глубинного типа с последующей обработкой с помощью ионообменной мембраны и дополнительную стадию хроматографии полученного элюата с получением моноклонального антитела. Также заявленный способ может включать стадию осветления образца перед обработкой на поглощающей смоле для аффинной хроматографии и стадии нанофильтрования, ультрафильтрования и диафильтрования на заключительном этапе очистки моноклонального антитела. Предложенный способ очистки обеспечивает высокую степень чистоты моноклональных антител без ущерба для выхода продукта и может быть использован для получения моноклональных антител высокой чистоты. 2 н. и 29 з.п. ф-лы, 8 ил., 16 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ получения иммуноглобулина человека и препарат иммуноглобулина человека, полученный вышеуказанным способом. Способ содержит в себе стадии растворения компонента Кона (Cohn component) I+II+III или компонента Кона II+III в воде для инъекций; осаждение каприловой кислотой или каприлатом; первый этап анионообменной хроматографии, включающий доведение рН фильтрата, полученного на этапе (2), до 5,2, очистку анионообменной хроматографией и получение элюирующего раствора; осаждение IgM, включающее регулирование проводимости элюирующего раствора, полученного на этапе (3), до 500-1000 мкСм/см с помощью воды и дальнейшее доведение рН до 6,0-7,3, с последующим выдерживанием в течение 1-2 ч, фильтрацию и сбор фильтрата; второй этап анионообменной хроматографии, включающий доведение рН фильтрата, полученного на этапе (4), до 5,6, последующую очистку анионообменной хроматографией и сбор элюирующего раствора; получение иммуноглобулина человека посредством диализа элюирующего раствора, полученного на этапе (5), путем ультрафильтрации, получение фармацевтической формы и инактивация вирусов. Изобретение расширяет арсенал способов для получения иммуноглобулина человека. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 2 пр.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложена автоматизированная система бесклеточного получения белка, способ бесклеточного получения белка и реакционный набор для автоматизированного бесклеточного получения белка. Система включает блок реакции экспрессии белка, блок контроля температуры реакции, массив пипеток, блок перемещения массива пипеток, блок очистки белков и блок крепления многолуночных планшетов с многолуночным планшетом. Причём блок реакции экспрессии белка содержит реакционный сосуд с диализной трубкой. Блок очистки белков включает устройство применения магнитного поля для крепления целевого белка к магнитным микросферам с последующим прикреплением магнитных микросфер к стенке, а многолуночный планшет обеспечен растворами, необходимыми для получения белков. Способ включает стадии получения смеси для бесклеточной экспрессии белка, экспрессии белка, очистки белка с использованием магнитных частиц и диализа очищенного белка. Реакционный набор содержит набор многолуночных планшетов с индивидуальными лунками для хранения раствора с аминокислотами, необходимыми для транскрипции и трансляции, источником энергии и буфером, диализные трубки с диализной мембраной. Изобретения обеспечивают повышение уровня экспрессии белка. 3 н. и 21 з.п. ф-лы, 11 ил., 8 пр.

Изобретение относится к способу получения гликопептидов тритерпенового гликозида - глицирризиновой кислоты общей формулы (lIa-g) В предложенном способе продукт получают из глицирризиновой кислоты (ГК) без предварительной защиты гидроксильных групп углеводной части молекулы, превращая ее в активированный трис-оксибензотриазольный эфир с помощью N-гидрооксибензотриазола (HOBu) и N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC) или трис-оксисукцинимидный эфир с помощью N-гидроксисукцинимида (HOSu) и DCC в среде тетрагидрофурана или диоксана при 0-+5°C 1 ч, 20-22°C - 24 ч, затем образующийся активированный эфир вводят в реакцию с аминокислотой (АК) (L-фенилаланин, L-тирозин, L-лейцин, L-изолейцин, L-метионин, L-валин, S-бензил-L-цистеин) в растворе 1N водного раствора гидроокиси натрия и N,N'-диметилформамида при мольном соотношении реагентов ГК/HOBt/DCC/AK, равном 1/3.0-3.5/3.0-3.5/4-5, или ГК/HOSu/DCC/AK=1/4-5/3.0-3.5/4-5. Предложен новый эффективный способ, позволяющий получить ценные вещества с высокими выходами. 3 з.п. ф-лы, 7 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ уменьшения количества красящего агента в растворе, содержащем ингибитор альфа1 протеиназы (recA1PI), полученный из культуры клеток, включающий инкубирование раствора, содержащего recA1PI, с восстанавливающим агентом, который представляет собой цистеин или DTT в концентрации от 1 до 100 мМ, при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 60°С, и отделение recA1PI от красящего агента. 5 з.п. ф-лы, 19 ил., 2 табл., 13 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению производных фактора свертывания крови VII и VIIa, их конъюгатов с полимерами, способными увеличивать время полувыведения из кровотока, комплексов с ними, полученных путем связывания носителя с конъюгатом, к генам, кодирующим производные, к экспрессирующим векторам, содержащим эти гены, трансформантам с введенными экспрессирующими векторами, к способам их получения, фармацевтическим композициям и способам лечения, и может быть использовано в медицине для предупреждения или лечения гемофилии или улучшения свертываемости крови. Получают производное FVII, соединенное по своему С-концу с пептидным линкером для связи с непептидильным полимером, способным увеличивать время полувыведения FVII или FVIIa из кровотока. При этом пептидный линкер представляет собой частичную последовательность супероксиддисмутазы SOD1, ее мутированную последовательность или последовательность GGGGSC. Изобретение позволяет получить производное FVII, способное связываться с носителем, увеличивающим время полувыведения из кровотока при сохранении активности FVII. 17 н. и 25 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 8 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению гликозилированных полипептидов, обладающих сродством к соматостатиновым рецепторам, и может быть использовано в медицине для лечения или профилактики связанных с соматостатином заболеваний. Гликозилированные полипептиды SRIF14 и SRIF28 получают путем гликозилирования Asn или Cys. Изобретение обеспечивает получение гликозилированных полипептидов, обладающих сродством к соматостатиновым рецепторам и лучшей стабильностью в крови по сравнению с соматостатином. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 19 ил., 10 табл., 88 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описано изобретение, включающее применение иммобилизованного нековалентного комплекса неонатального Fc-рецептора и бета-2-микроглобулина (b2m), связанного с хроматографическим материалом, в качестве лиганда для аффинной хромотографии при аффинной хромотографии с восходящим линейным градиентом рН, где нековалентный комплекс неонатального Fc-рецептора (FcRn) и бета-2-микроглобулина (b2m) биотинилирован, а хроматографический материал модифицирован стрептавидином. В одном варианте аффинную хроматографию с восходящим линейным градиентом рН применяют для разделения антител или химерных полипептидов, содержащих, по меньшей мере, Fc-участок. Изобретение расширяет арсенал средств, применяемых в качестве лигандов в аффинной хромотографии с восходящим линейным градиентом рН. 13 з.п. ф-лы, 12 ил., 12 табл., 9 пр.

Группа изобретений относится к области биохимии. Представлен способ получения конъюгата физиологически активного белка и непептидного полимера, включающий взаимодействие указанного белка с непептидным полимером, имеющим реакционноспособные группы по обоим концам или по трем концам, в реакционном растворе, содержащем органический растворитель, для связывания указанного белка с указанным полимером, посредством этого получение конъюгата, где указанный белок имеет два или более N-конца, указанный полимер связан с N-концом указанного белка, где органический растворитель представляет собой спирт, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, реакционный раствор содержит органический растворитель в количестве от 30 до 55% по объему от общего объема реакционного раствора, рН реакционного раствора составляет от 4,5 до 7,0. Представлен способ получения конъюгата физиологически активного белка, непептидного полимера и носителя, включающий получение конъюгата физиологически активного белка и непептидного полимера вышеуказанным способом и ковалентное связываение носителя с непептидным полимером конъюгата. Группа изобретений позволяет получать конъюгат с высоким выходом и чистотой. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантному получению антиангиогенных пептидов, и может быть использовано в медицине. Способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида Тумастина - производного модифицированного фрагмента [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, предусматривает культивирование штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS, разрушение клеточной биомассы в присутствии ингибитора протеаз, центрифугирование клеточного лизата и отделение клеточного супернатанта, содержащего гибридный белок, хроматографическую очистку гибридного белка на колонне с анионообменным сорбентом, протеолитическое расщепление с помощью TEV-протеиназы, хроматографическую очистку антиангиогенного пептида Тумастина. Изобретение позволяет получить с высоким выходом антиангиогенный пептид Тумастин. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.
Наверх