Способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных


 


Владельцы патента RU 2609771:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" (ФГБНУ ВНИТИБП) (RU)
Федеральное казенное предприятие "Армавирская биологическая фабрика" (ФКП "Армавирская биофабрика") (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано при получении эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных. Для этого получают антигенную фракцию путем культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы и ресуспендированием 0,8-1,2% раствором дезмола до концентрации 4-10 млрд/мл микробных тел. Далее прогревают в течение 55-65 мин при температуре 93-98°C и смесь центрифугируют при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин. К супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 суток. Затем к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9-12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40-46°C в течение 1,5-2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры и отмывкой. Использование данного способа - получение эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных - позволяет увеличить срок хранения целевого продукта при сохранении его специфической активности. 3 з.п. ф-лы, 7 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных.

Известен способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных, включающий приготовление питательных сред, посевного материала, культивирования Fusobacterium necrophorum для получения бактериальной массы, выделение из нее антигенной фракции с последующей сенсибилизацией формализованных эритроцитов и получения целевого продукта их отмывкой (Заявка на изобретение РФ №2003120464/13, МПК С12Р 21/00, G01N 33/555, С12Р 21/00, C12R 1:01; опубл. 27.02.2005, бюл. №6).

Недостатком указанного способа является недостаточный срок хранения эритроцитарного антигена.

Техническим результатом изобретения является увеличение срока хранения целевого продукта при сохранении его специфической активности.

Технический результат достигается в способе получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных, включающий приготовление питательных сред, посевного материала, культивирования Fusobacterium necrophorum для получения бактериальной массы, выделение из нее антигенной фракции с последующей сенсибилизацией формализованных эритроцитов и получения целевого продукта их отмывкой тем, что антигенную фракцию получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ и ресуспендированием 0,8-1,2% раствором дезмола до концентрации 4-10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55-65 мин при температуре 93-98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9-12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40-46°C в течение 1,5-2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры и отмывкой.

Технический результат также достигается в способе получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных тем, что полученную бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ отделяют центрифугированием при 15000-20000 тыс. g, в течение 20-30 мин.

Технический результат также достигается в способе получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных тем, что в качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты баранов, или крупного рогатого скота, или лошадей.

Технический результат также достигается в способе получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных тем, что отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2-0,3% формалина или 0,1-0,2М фосфатно-буферным раствором с рН 7,2-7,4, содержащим 0,2-0,3% формалина, методом отстоя или центрифугированием при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин до полного просветления.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».

Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Впервые предложен способ эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных, где антигенную фракцию получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ и ресуспендированием раствором дезмола в определенных условиях, что позволило существенно увеличить срок хранения целевого продукта при сохранении его специфической активности, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 15000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 0,8% раствором дезмола до концентрации 4 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55 мин при температуре 93°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5 тыс. g, в течение 20 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40°C в течение 1,5 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты баранов.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2% формалина или 0,1М фосфатно-буферным раствором с рН 7,2, содержащим 0,2% формалина, методом отстоя до полного просветления.

Пример 2. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 24 ч в анаэробных условиях при 38°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 20000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 1,2% раствором дезмола до концентрации 10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 65 мин при температуре 98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 3,0 тыс. g, в течение 30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 46°C в течение 2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты баранов.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,3% формалина или ОДМ фосфатно-буферным раствором с рН 7,4, содержащим 0,3% формалина, методом отстоя до полного просветления.

Пример 3. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 15000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 0,8% раствором дезмола до концентрации 4 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55 мин при температуре 93°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5 тыс. g, в течение 20 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40°C в течение 1,5 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты крупного рогатого скота.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2% формалина или 0,1М фосфатно-буферным раствором с рН 7,2, содержащим 0,2% формалина, центрифугированием при 1,5 тыс. g, в течение 20 мин до полного просветления.

Пример 4. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 24 ч в анаэробных условиях при 38°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 20000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 1,2% раствором дезмола до концентрации 10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 65 мин при температуре 98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 3,0 тыс. g, в течение 30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 46°C в течение 2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты крупного рогатого скота.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,3% формалина или 0,2М фосфатно-буферным раствором с рН 7,4, содержащим 0,3% формалина, центрифугированием при 3,0 тыс. g, в течение 30 мин до полного просветления.

Пример 5. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 15000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 0,8% раствором дезмола до концентрации 4 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55 мин при температуре 93°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5 тыс. g, в течение 20 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40°C в течение 1,5 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты лошадей.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2% формалина или ОДМ фосфатно-буферным раствором с рН 7,2, содержащим 0,2% формалина, методом отстоя до полного просветления.

Пример 6. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 24 ч в анаэробных условиях при 38°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 20000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 1,2% раствором дезмола до концентрации 10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 65 мин при температуре 98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 3,0 тыс. g, в течение 30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 46°C в течение 2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты лошадей.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,3% формалина или 0,2М фосфатно-буферным раствором с рН 7,4, содержащим 0,3% формалина, методом отстоя до полного просветления.

Пример 7. Эффективность эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных определяют на белых мышах через 2 года хранения эритроцитарного антигена, полученного согласно примерам 1-6 и прототипа. 50 животных заражают титрованной культурой возбудителя в дозе 10 ЛД50 гомологичного штамма в объеме 0,2 мл под кожу корня хвоста. Диагностику некробактериоза определяют в капельной реакции непрямой гемагглютинации (КРНГА) эритроцитарного антигена на предметном стекле с сывороткой крови исследуемого животного, полученной через 14 суток после их заражения культурой возбудителя. В результате исследования при диагностике эритроцитарным антигеном, полученным согласно примерам 1-6, у всех 50 животных было определено наличие некробактериоза (т.е. подтверждено 100%-ное заражение), в то время при использовании для диагностики эритроцитарного антигена, полученного согласно прототипу, через 2 года хранения, наличие некробактериоза подтвердилось лишь у 20 животных, т.е. только в 40% случаев было подтверждено наличие некробактериоза.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать эритроцитарный антиген для диагностики некробактериоза животных, обладающий более длительным сроком хранения с сохранением высокой специфичности.

1. Способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных, включающий приготовление питательных сред, посевного материала, культивирования Fusobacterium necrophorum для получения бактериальной массы, выделение из нее антигенной фракции с последующей сенсибилизацией формализованных эритроцитов и получения целевого продукта их отмывкой, отличающийся тем, что антигенную фракцию получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ и ресуспендированием 0,8-1,2% раствором дезмола до концентрации 4-10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55-65 мин при температуре 93-98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9-12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40-46°C в течение 1,5-2 ч с последующим охлаждением до их комнатной температуры и отмывкой.

2. Способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных по п. 1, отличающийся тем, что полученную бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ отделяют центрифугированием при 15000-20000 тыс. g, в течение 20-30 мин.

3. Способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных по п. 1, отличающийся тем, что в качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты баранов, или крупного рогатого скота, или лошадей.

4. Способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных по п. 1, отличающийся тем, что отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2-0,3% формалина или 0,1-0,2 М фосфатно-буферным раствором с рН 7,2-7,4, содержащим 0,2-0,3% формалина, методом отстоя или центрифугированием при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин до полного просветления.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицинской микробиологии и санитарной эпидемиологии. Предложен способ получения имитаторов патогенных биологических агентов путем обработки суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания СВЧ-облучением с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Вт/см3 двукратно по 5 минут.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикума для определения концентрации лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано в технологии изготовления референс-панели сывороток, содержащих антигены и антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности тест-систем иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных и иммуноблотов.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения эритроцитарного сибиреязвенного антигена для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению диагностических препаратов. При осуществлении предлагаемого способа получения сыворотки для диагностики алеутской болезни норок (АБН) получают высокоочищенный вирусный антиген путем гомогенизации органов инфицированных АБН норок с последующим трехкратным замораживанием/размораживанием гомогената, дезинтеграции клеточного гомогената трехкратной ультразвуковой обработкой, осаждением неразрушенных клеток двукратным низкоскоростным центрифугированием, последующим осаждением иммунных комплексов, уплотнением осадка низкоскоростным центрифугированием, экстрагированием иммунных комплексов (ИК) минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратной экстракции на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, осаждением ИК высокоскоростным центрифугированием из объединенных экстрактов при 30000 об/мин в течение 2,5 часов, извлечением ИК из осадка минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратного экстрагирования на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, диссоциацией иммунных комплексов в кислой среде в течение 1 часа на холоду, отделением вируса АБН-Ф от антител высокоскоростным ультрацентрифугированием, растворением осадка в минимальном количестве карбонатного буфера, отделением ферритина от вирусных частиц на колонке с сефарозой 6B в системе карбонатного буфера.
Изобретение относится к медицине, а именно к малоинвазивным методам в хирургической эндокринологии, и касается дифференциальной диагностики образований шеи. Способ включает ультразвук-контролируемую тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию, которую выполняют однократно одной иглой через один прокол.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе.
Группа изобретений относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ печати биологических лигандов, представляющих собой олигосахариды, и/или полисахариды, и/или пептиды, и/или гликопептиды, и/или биотин.

Изобретение относится к способу получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. Указанный способ включает стерилизацию культуры авирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 107, суспендирование высушенной бактериальной массы в 0,15 М растворе NaCl, обработку полученной суспензии ультразвуком, центрифугирование взвеси разрушенных клеток с последующим отделением супернатанта и высаливание из него гликопротеиновой фракции, на основе которой получают диагностикум.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения антирабической диагностической сыворотки. Для этого проводят иммунизацию животных-продуцентов антигенным материалом и адъювантом.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения вируса гриппа с моногликозилированным гемагглютинин-антигеном (НА-антиген).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению агониста рецептора паратиреоидного гормона (PTH), и может быть использовано в медицине. Полученный пептид или его фармацевтическую соль используют в составе фармацевтической композиции для лечения заболеваний, характеризующихся дисфункцией РТН или дисбалансом кальция или фосфатов.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения рекомбинантного биологически активного пептида на основе пептидов, входящих в состав миелопида.

Группа изобретений относятся к области биохимии. Предложен способ получения полипептида и способ получения сниженного количества гликоформы G(0) и/или повышенного количества гликоформы G(1) полипептида.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ снижения накопления лактата от 5% до 40% при культивировании клеток млекопитающих и способ получения антитела.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве белковой пищевой добавки. Предложен способ получения белковой биомассы путем глубинного культивирования гриба Pleurotus pulmonarius РР-3.2 на крахмал-аммонийной среде в условиях аэрации при рН 5,5-6,0 и 23-25°C.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан новый штамм вируса ветряной оспы (VZV).

Предложен способ получения рекомбинантного полипептида. Способ включает культивирование клеток CHO в среде с общим содержанием аминокислот от около 40 до примерно 100 мМ при условиях, включающих в себя, по крайней мере, один температурный сдвиг и, по крайней мере, один сдвиг pH, и экспрессирование рекомбинантного полипептида.

Изобретение касается способа получения рекомбинантного белка SAV-RGD, где SAV - мономер стрептавидина, RGD - меланома-адресующий олигопептид, имеющий аминокислотную последовательность Ser-Arg-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Phe-Pro-Gly-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Ser-Gln-Glu.

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии. Описана вакцина против некробактериоза, содержащая инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин, адсорбированный на гидроокиси алюминия, и дополнительно сапонин, глицерин и натриевую соль сукцината хитозана при определенном соотношении компонентов.
Наверх