Способ получения биопрепарата, обладающего ноотропным действием

Изобретение относится к области фармакологии, а именно к способу получения пептидного биопрепарата ноотропного действия. Способ получения пептидного биопрепарата ноотропного действия заключается в гомогенизации личинок трутневого расплода в охлажденном изотоническом растворе NaCl, кипячении гомогената личинок трутневого расплода с целью денатурации белков, удалении осадка с помощью бумажного фильтра и очистки с использованием мембраны на ультрафильтрационной установке Vivaflow 50/200, позволяющей выделить пептиды массой до 5 кДа. Вышеописанный способ позволяет получить пептидный препарат, обладающий ноотропным действием. 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и фармации и касается получения лекарственных средств и биологически активных препаратов природного происхождения, обладающих ноотропным действием.

Проблема лекарственных препаратов, несмотря на появление на фармацевтическом рынке новых форм и широкого ассортимента, остается на сегодня одной из острых в медицине. Не являются исключением препараты, используемые в нейрологии и психиатрии. Лекарственные средства синтетического происхождения, как правило, имеют ряд побочных эффектов, поэтому в последние годы приоритетным направлением в создании лекарственных средств является поиск и извлечение их из природных источников.

Известно средство, обладающее ноотропным и адаптогенным действием, и способ его получения из высушенной недефибринированной крови марала, изюбра или пятнистого оленя (RU 2130314, 20.05.1999). Недостатком данного изобретения является трудоемкость процесса и ограниченность получения сырья для препарата сезонными и географическими рамками.

Известно ноотропное средство растительного происхождения на основе лабазника обыкновенного (RU 2314115, 10.01.2008). Средство представляет собой водно-этанольный экстракт надземной части лабазника. Недостатком данного препарата является то, что не указана природа активного действующего вещества и трудоемкость, связанная с обработкой растительного сырья и процессом экстрагирования. Кроме этого сопутствующий гипоксический эффект препарата ограничивает возможность его применения, как ноотропного средства.

Трутневый расплод - продукт пчеловодства, характеризующийся легкоусвояемым химическим состав веществ и содержащий в себе сбалансированный комплекс физиологически активных регуляторов роста и развития организма.

Личинка трутневого расплода, как биообъект, характеризуется чрезвычайно высокой скоростью роста и обменных процессов. Преимуществом использования личинок трутневого расплода, как источника биологически активных веществ, является относительная дешевизна и доступность сырья.

В медицинской практике известно его широкое использование в качестве адаптогенного средства при повышенных физических и умственных нагрузках (RU 2287334, 20.11. 2006; RU 2456005, 20.07.2012; RU 2390270, 27.05.2010; RU 2233666, 10.08.2004).

Трутневый расплод нормализует сон, способствует повышению аппетита и оказывает успокаивающие действие [3].

Известен препарат «Апиларнил», полученный на основе личинок трутневого расплода, который положительно воздействует на больных неврастениями, депрессивными неврозами [4]. Недостатком данного средства является его пероральное введение, что сопровождается ферментативным расцеплением биологически активного вещества препарата ферментами желудочно-кишечного тракта.

Наиболее близким (прототип) по биологическим свойствам и химическому составу является ноотропный биопрепарат на основе личинок трутневого расплода [5]. Недостатком данного способа получения пептидов до 5000 кДа является то, что для очистки используют трудоемкий метод гель-фильтрации, использующийся в основном в аналитических целях. В то время как установка для тангенциальной ультрафильтрации Vivaflow 50/200 отличается высокой технологичностью: позволяет получать большие количества биопрепарата за короткий промежуток времени, отделять пептиды в узком диапазоне молекулярных масс и одновременно осуществлять их концентрирование.

Использование заявляемого биопрепарата дает несомненное преимущество, так как появляется возможность его введения, как интраназально, так и внутримышечно, и другими способами, минуя разрушающее действие ферментов желудочно-кишечного тракта. В описанных ранее способах использование трутневого расплода рекомендовано в качестве общеукрепляещего средства и не рекомендовано в роли источника природных регуляторных пептидов, обладающих ноотропным характером действия. Пептиды личинок расплода являются эндогенными факторами регуляции обменных процессов и характеризуются высокой биологической активностью, специфичностью действия и отсутствием побочных эффектов, включая иммуногенность.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала природных средств, обладающих ноотропным действием. Изучение ноотропного эффекта данной группы биорегуляторов, выделенных из личинок трутневого расплода, ранее никем не проводилось.

Поставленная задача решается описываемым способом приготовления препарата на основе пептидов личинок трутневого расплода: гомогенизация 6-8-дневных личинок трутневого расплода в охлажденном изотоническом растворе NaCl, кипячение гомогената личинок трутневого расплода в течение 10 минут с целью денатурации белков, удаление осадка с помощью бумажного фильтра и очистка с использованием мембраны с номинальной отсекаемой молекулярной массой 5 кДа на ультрафильтрационной установке Vivaflow 50/200.

Молекулярную массу пептидов, входящих в состав биопрепарата, определяют методом гель-хроматографии на Sephadex G-25, а спектр пептидов - ВЭЖХ на хроматографе Bio RAD NGC Quest™ 100 с колонкой Discovery BIO Wide Pore С18, 15cm × 4.6mm, 5μт. Установлено, что в состав пептидов входят вещества с молекулярной массой до 5 кДа.

На данном этапе субстанция представляет собой водные растворы пептидов с молекулярной массой до 5 кДа, являющиеся слабыми кислотами и слабыми основаниями и существующие в растворе в виде цвиттер-ионов, значение pI которых находится в пределах 5,0-7,0. Основа биопрепарата - пептиды, биологические активные вещества, действующие в относительно малых концентрациях. Действующая концентрация пептидов определялась спектрофотометрически и методом Лоури и составила около 100 мкг/мл.

Для доказательства ноотропного эффекта применены физиолого-фармакологические методы, используемые для оценки действия нейропсихотропных лекарственных средств: тест «Открытое поле» и «Выработка условного пищедобывательного рефлекса».

Введение биопрепарата осуществлялось интраназально за 15 минут до помещения животного в условия экспериментальной установки. В качестве лабораторных животных были выбраны белые беспородные крысы-самцы, возрастом 3 месяца и массой 200-250 грамм. Животных содержали в условиях вивариума при искусственном освещении свет/тень 12:12 со свободным доступом к воде и пище. Все животные были разбиты на 2 группы: Группа I (опытная) - животным интраназально вводили пептиды трутневого расплода в дозе 10 мкг/кг; Группа II (контрольная) - 0,9% раствор NaCl.

Физиолого-фармакологическую активность препарата на основе пептидов личинок трутневого расплода в тесте «Выработка условного пищедобывательного рефлекса» сравнивали со средством близкого назначения и состава - селанк (RU 2045958 С1, 20.10.95). Селанк является ноотропным средством широкого спектра действия, рекомендованным для назального применения, основное действующее вещество, обуславливающее ее эффект - гептапептид Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro. Для этого синтетический пептид вводили животным в дозе 250 мкг/кг (группа III).

Результаты наблюдений подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрических методов. Для оценки достоверности двух выборок использовали U-критерий Уилкинсона (непараметрический критерий Манна-Уитни).

Тест «Открытое поле». Установка «Открытое поле» представляет собой круглую площадку (d для крыс - 97 см), ограниченную бортами высотой 40-60 см. Площадка с выделением центральной части разделена на 18 секторов, на пересечении которых имеется 16 отверстии d=2-3 см [5]. Животных помещали в центральную часть установки и в течение 5 минут регистрировали с помощью видеооборудования следующие параметры: горизонтальная и вертикальная двигательная активность (ГДА и ВДА), количество заходов в центральную зону, обнюхивание отверстий, наличие реакций замирания (отчаяния или «freezing»), дефекацию и груминг.

В результате исследования биологических свойств препарата в тесте «Открытое поле» было обнаружено, что введение пептидов трутневого расплода вызывает достоверное увеличение двигательной (число вертикальных стоек) и ориентировочно-исследовательской активности (число заходов в центр, обнюхивании и реакций груминга) (Таблица 1). Кроме этого у опытных крыс снижается уровень дефекации, что говорит о снижении эмоциональной тревожности животных.

Тест «Выработка условного пищедобывательного рефлекса».

Лабораторных животных с пищевой депривацией помещали в стартовый отсек Т-образного лабиринта, в одном из рукавов которого находилась кормушка с пищей (в качестве подкрепления применяли кусочки хлеба массой 0,2 грамма). Через 30-60 секунд после посадки животного в стартовый отсек открывали дверцу. Звуковой раздражитель открывания дверки служил условным раздражителем. В качестве критериев выработки рефлекса выбирали 8 правильных пробежек из 10 предъявляемых. В данном тесте регистрировали время пробежки животного от стартового отсека до кормушки, число правильных и неправильных ответов (заходы в пустой рукав) [1, 2, 6]. В течение 5 дней вырабатывали пищевой условный рефлекс на звуковой раздражитель. Прежде, чем приступить к выработке рефлексов животных адаптировали: за день до эксперимента лабораторных крыс помещали в условия установки Т-лабиринта.

В результате исследования было обнаружено, что процесс обучения в группе животных, получавших пептиды, происходил значительно быстрее: количество правильно выполненных реакций в этой группе достоверно выше, чем у контрольной группы (Таблица 2). Особенно эффект обучения был выражен на 2-й и 4-й день. Таким образом, введение пептидов трутневого расплода в период обучения способствует ускорению формированию условных правильных реакций (УПР) у крыс.

Введение пептидов, кроме увеличения числа правильных условных реакций, вызывало достоверное снижение латентных периодов, к тому же во все эти дни опытным животным требовалась меньшая продолжительность звукового раздражителя по сравнению с контрольными животными.

Эффект от введения пептидов трутневого расплода сравним с действием синтетического препарата селанк: отсутствуют достоверные отличия по показателям «количество правильно выполненных реакций» и «время пробежки». Исходя из полученных данных можно сделать вывод об однонаправленном и сопоставимом действии исследуемых пептидов, в то время как вводимая концентрация пептидов личинок трутневого расплода была в 25 раз меньше концентрации синтетических пептидов.

В ходе исследований в экспериментах на животных было выявлено, что пептидный биопрепарат, полученный из личинок трутневого расплода, обладает нейростимулирующим действием, а именно ноотропным эффектом.

Литература

1. Deacon R.M.J. Appetitive position discrimination in the T-maze // Nature Protocols. - 2006. - V. 1. - №1. - P. 13-15.

2. Deacon R.M.J., Rawlins J.N.P. T-maze alternation in the rodent // Nature Protocols. - 2006. - V. 1. - №1. - P.7-12.

3. Mbaya J.S.K. Usages of bee products in folk medicine in Kenya / J.S.K. Mbaya // Bee products: Propreties, applications and apitherapy: program 7 Abstracts International Conference. Israel. - 1996. - P. 98.

4. Косман. Д. Эффективность апиларнила в лечении неврозов / Д. Косман, Н.В. Илиешиу, О. Молодван. // Междунар. конгр. по пчеловодству (1983; Бухарест): Материалы. Бухарест. - 1983. - С. 406.

5. Моисеева А.А., Генгин М.Т. Изучение ноотропного эффекта биопрепарата на основе личинок трутневого расплода // Вестник ВолгГМУ: приложение. - Волгоград: Изд-во ВолгГМУ. - 2014. - С. 86-87.

6. Самотруева М.А., Теплый Д.Л., Тюренков И.Н. Экспериментальные модели поведения // Журнал функциональных и прикладных исследований. - 2009. - №2 (27).

Способ получения пептидного биопрепарата ноотропного характера действия, заключающийся в гомогенизации 6-8-дневных личинок трутневого расплода в охлажденном изотоническом растворе NaCl, кипячении гомогената личинок трутневого расплода в течение 10 минут с целью денатурации белков, удалении осадка с помощью бумажного фильтра и очистки с использованием мембраны на ультрафильтрационной установке Vivaflow 50/200, позволяющей выделить пептиды массой до 5 кДа.