Способ получения рекомбинантного противоопухолевого токсина на основе белков барназа-барстар и адресного полипептида дарпина с эффектом моментальной отмены цитотоксического действия

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и медицины, в частности к способу получения рекомбинантного противоопухолевого токсина - химерного бифункционального белка, состоящего из адресного полипептида Darpin 9-29, специфичного к гистохимическому маркеру HER2/neu, и высокоактивной бактериальной рибонуклеазы барназы, соединенных гибким пептидным линкером. Для осуществления указанного способа получают рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pETDa путём встраивания в штамм E.coli BL21(DE3) плазмиды pETDa. Указанная плазмида получена путём клонирования рекомбинантного фрагмента ДНК, кодирующего указанный выше химерный белок, в плазмидный вектор pET22 по сайтам рестрикции NdeI/HindIII. Настоящее изобретение позволяет получить адресный белок, характеризующийся сниженным риском побочного воздействия за счет возможности моментальной отмены цитотоксичности, для нацеливающей на HER2/neu терапии опухолей, гиперэкспрессирующих рецептор HER2. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 11 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области белковой инженерии, биотехнологии и медицины и касается способа получения рекомбинантного белка противоопухолевого токсина, далее Таргерназа, специфичного к клеткам, экспрессирующим рецептор HER2, предназначенного для использования в качестве терапевтического агента для таргетной терапии опухолей, гиперэкспрессирующих рецептор HER2, и характеризующегося сниженным риском побочного воздействия за счет возможности моментальной отмены цитотоксичности. Изобретение может найти применение в медицине при создании лекарств, подавляющих рост опухолевых клеток.

Уровень техники

Создание новых терапевтических агентов для таргетной терапии опухолевых заболеваний - одна из важнейших задач современной биологии и медицины. Выявление целого ряда специфических мишеней, характерных для того или иного типа опухолевых клеток, а также развитие методов молекулярной диагностики опухолей, сделали возможным направленное и избирательное воздействие на очаги заболевания в организме человека. Одной из наиболее клинически значимых мишеней для таргетной терапии опухолей является рецептор HER2 (из уровня техники известный также как HER2/neu, или ЕrbВ2) - член семейства рецепторов эпидермального фактора роста человека. Данный рецептор играет важную роль в контроле пролиферации и дифференцировки клеток, в то время как его нерегулируемая экспрессия (гиперэкспрессия) сопровождает развитие многих опухолей и ассоциируется с повышенным риском метастазирования и устойчивостью к химиотерапии (Поляновский О.Л., Лебеденко Е.Н., Деев С.М. // Биохимия. 2011. Т. 77. С. 289-311).

В настоящее время в клинической практике для направленного и избирательного воздействия на опухоли с гиперэкспрессией онкомаркеров семейства ERBB/HER широко применяют антитела: препарат гуманизированных антител Trastuzumab (Carter P.J., Presta L.G. // US Patent US 6054297 (А)), специфичный к онкомаркеру HER2, и препарат гуманизированных антител Pertuzumab (Alavattam S. et al. // US Patent US 20130095172 (A1)).

Однако применение антител самих по себе не всегда достаточно эффективно. Например, при длительном применении Trastuzumab проявляет кардиотоксичность и некоторые другие побочные эффекты, у многих больных развивается невосприимчивость к лечению (Поляновский О.Л., Лебеденко Е.Н., Деев С.М. // Биохимия. 2011. Т. 77. С. 289-311). Терапевтическое действие противоопухолевых антител желательно усиливать. Одним из способов к усилению воздействия антител на опухолевые клетки является конъюгация антител с цитотоксичными агентами, то есть создание так называемых иммунотоксинов - терапевтических агентов направленного действия, которые избирательно связываются с опухолевыми клетками и вызывают их гибель (Sharkey R.M., Goldenberg D.M. // СА Cancer J. Clin. 2006. V. 56. P. 226-243).

В качестве адресных белков для налепливания на онкомаркер HER наиболее широко применяют антитела, в том числе гуманизированное антитело 4D5, известное как Trastuzumab, гуманизированное антитело 2С4, специфичное к другому домену HER2, известное как Pertuzumab, а также их фрагменты, в том числе одноцепочечные (Поляновский О.Л., Лебеденко Е.Н., Деев С.М. // Биохимия. 2011. Т. 77. С. 289-311). К недостаткам, присущим антителам, можно отнести склонность к агрегации, а также трудности с их получением.

В последнее время в качестве адресных компонентов бифункциональных противоопухолевых агентов все большее внимание привлекают искусственные адресные полипептиды DARPin, благодаря малому размеру молекул, высокой стабильности и эффективному фолдингу. Получены DARPin, узнающие онкомаркер HER2, которые связываются с ним с субнаномолярной афинностью (Steiner D., Forrer P., Pluckthun Α. // J. Mol. Biol. 2008. V. 382. P. 1211-1227).

В качестве токсина внимание исследователей привлекли рибонуклеазы, которые отличаются своей доступностью и отсутствием токсичности вне клетки. Был получен слитый белок на основе одноцепочечного мышиного мини-антитела и человеческой панкреатической РНКазы (De Lorenzo С et al. // FEBS Lett. 2002. V. 516. P. 208-212), a затем на основе гуманизированного мини-антитела и человеческой панкреатической РНКазы, - с целью уменьшить иммуногенность противоракового рекомбинантного белка (Lorenzo С. et al. // Cancer Res. 2004. V. 64. P. 4870-4874).

Применение РНКаз человеческого происхождения лимитировано ингибированием их природным ингибитором РНКаз (RI), присутствующим в клетках. Были сделаны попытки преодолеть это обстоятельство путем направленного мутагенеза человеческой РНКазы с целью получения устойчивых к ингибитору мутантов (Erickson Н.А. et al. // Protein Eng. Des. Sel. 2006. V. 19. P. 37-45), а также продолжен поиск подходящих РНКаз другого происхождения. Так, в качестве эффективного противопухолевого агента хорошо зарекомендовала себя рибонуклеаза леопардовой лягушки - Ranpirnase (Onconase®) (Goldenberg D., Hansen H., Leung S. // US Patent US 2003099629 (A1)). Для того чтобы избежать неспецифического захвата токсичной РНКазы нетрансформированными клетками, был получен рекомбинантный биспецифический белок, включающий РНКазу лягушки и адресные aнти-EGFR-антитела одноцепочечного формата и показана его эффективность в качестве агента, элиминирующего EGFR-положительные опухолевые клетки (Kiesgen S., Arndt М.А., С., et al. // Cancer Lett. 2015. V. 357(1). P. 364-373). Основным недостатком использования РНКазы лягушки в качестве токсина являются трудности с ее получением, что определенно ограничивает сферу ее применения. Еще одна рибонуклеаза - барназа, - добываемая из бактерий, лишена этих недостатков. Была показана селективная цитотоксичность и противоопухолевый эффект иммунотоксина на ее основе (Balandin T.G., Edelweiss Ε., Andronova N.V., Treshalina E.M., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. // Invest New Drugs. 2011. V. 29(1). P. 22-32). Как и рибонуклеаза лягушки, барназа не ингибируется в присутствии человеческого плацентарного ингибитора РНКаз. Барназа в составе рекомбинантных белков обладает высокой стабильностью и способностью вновь принимать нативную биологически активную конформацию после прекращения действия хаотропных агентов (Martsev S.P., Tsybovsky Y.I., Stremovskiy О.А., Odintsov S.G., Balandin T.G, Arosio P., Kravchuk Z.I., Deyev S.M. // Protein Eng. Des. Sel. 2004. V. 17 (1). P. 85-93). Еще одним интересным свойством барназы является наличие ее природного ингибитора белка барстара. Бактериальная рибонуклеаза барназа и ее природный ингибитор барстар представляют собой белки небольшой молекулярной массы (24.4 и 10 кДа, соответственно), стабильные в широком диапазоне рН и температуры, устойчивые к действию протеаз и низко иммуногенные. Барназа и барстар при взаимодействии образуют прочный комплекс и характеризуются чрезвычайно быстрой кинетикой (kon ~ 108 М-1 с-1) и высокой аффинностью связывания (коэффициент ассоциации Κac ~ 1014 M-1) (Schreiber G., Fersht A.R. // Nat. Struct. Biol. 1996. V. 3. P. 427-4311).

Изобретение решает задачу получения Таргерназы, противоопухолевого токсина на основе белков барназа-барстар и адресного полипептида дарпина, специфичного к клеткам, экспрессирующим рецептор HER2, и характеризующегося сниженным риском побочного воздействия за счет возможности моментальной отмены цитотоксичности. Поставленная задача получения Таргерназы в клетках Е.coli достигается за счет:

1) рекомбинантной плазмиды pETDa-Ba, содержащей ген Таргерназы и ген барстара в составе вектора экспрессии рЕТ22;

2) штамма Е.coli BL21(DE3)/pETDa-Ba, получаемого путем трансформации штамма BL21(DE3) плазмидой pETDa-Ba и отбора клона трансформанта с наиболее высоким уровнем синтеза Таргерназы;

3) способа получения Таргерназы из биомассы штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pETDa-Ba.

В результате решения поставленной задачи получают следующий технический результат:

1) высокий уровень индуцируемого синтеза (45% от суммарного клеточного белка) и стабильную продукцию Таргерназы, которые обеспечиваются штаммом Е.coli BL21 (DE3)/pETDa-Ba;

2) высокую специфическую цитотоксичность Таргерназы;

3) сниженный риск побочного воздействия за счет возможности моментальной отмены цитотоксичности Таргерназы;

Раскрытие изобретения

Разработан способ получения Таргерназы, - химерного бифункционального белка, состоящего из адресного полипептида Darpin 9-29 (Steiner D., Forrer P., Pluckthun A. // J. Mol. Biol. 2008. V. 382. P. 1211-1227), специфичного к гистохимическому маркеру HER2/neu, и высокоактивной бактериальной рибонуклеазы барназы, соединенных гибким пептидным линкером. Таргерназа обладает способностью специфически связываться с раковыми клетками, гиперэкспрессирующими указанный маркер, и интернализоваться в них. При интернализации в клетки обладает цитостатическим действием за счет гидролиза внутриклеточной РНК и последующего прекращения биосинтеза белка. При взаимодействии Таргерназы с природным ингибитором барназы - рекомбинантным белком барстар - цитотоксический эффект Таргерназы моментально отменяется, что может быть использовано в случае гиперчувствительной реакции организма на РНКазную активность или передозировки лекарственного средства. Сочетание таких свойств Таргерназы выгодно отличает его от всех известных и применяемых в клинической практике аналогов.

Экспрессирующую рекомбинантную плазмиду pETDa-Ba получают путем клонирования последовательности, кодирующей Таргерназу и барстар, в вектор рЕТ22 (рЕТ System Manual, 10th Edition Rev.B 0403, Novagen Inc. (2003)) по сайтам рестрикции NdeI/HindIII (фиг. 1). Для преодоления чрезвычайной токсичности рибонуклеазы барназы для бактериальной клетки ген целевого белка ставят под контроль индуцируемого промотора фага Т7, кроме того, в конструкцию включают ген ингибитора барназы, барстара, под собственным промотором. В процессе культивирования ингибитор барстар, синтезирующийся в бактериальной клетке одновременно с Таргерназой, полностью ингибирует ее РНК-азную активность, что позволяет проводить наработку клеток штамма-продуцента, но требует последующей очистки Таргерназы от ингибитора барстара.

Путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) (Studier, F.W. and Moffatt, B.A. // J. Mol. Biol. 1986. V. 189. P. 113-130) сконструированной плазмидой pETDa-Ba, отбора и культивирования клонов трансформантов с высоким уровнем синтеза химерного белка получают рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pETDa-Ba - продуцент Таргерназы. Синтез Таргерназы в полученном рекомбинантном штамме осуществляется при культивировании на обычных селективных средах с добавлением индуктора изопропил-D-тиогалактозида (ИПТГ) или лактозы.

В способе получения рекомбинантной Таргерназы биомассу рекомбинантного штамма Е.соli-продуцента Таргерназы разрушают ультразвуком в лизирующем буфере, содержащем Tris-HCl, K2НРО4 и хлорид натрия. Целевой белок, изначально снабженный олигогистидиновой последовательностью, выделяют при помощи металлохелатной аффинной хроматографии. В бактериальных клетках Таргерназа образует чрезвычайно устойчивый комплекс со своим ингибитором барстаром (KD 10-13 М-1) и в стандартной процедуре аффинной хроматографии на Ni2+-сефарозе выделяется совместно с ним в виде прочного комплекса, поэтому основной проблемой при очистке является отделение ингибитора барстара. Поэтому очистку Таргерназы от барстара осуществляют в денатурирующих для комплекса Таргерназа-барстар условиях с использованием 6 M гуанидингидрохлорида и 0.5 M NaCl. Затем Таргерназу дочищают при помощи анионообменной хроматографии.

Таким образом, настоящее изобретение включает 3 объекта:

Первый объект - рекомбинантная плазмида pETDa-Ba, обеспечивающая синтез Таргерназы в клетках Escherichia coli и состоящая из фрагмента ДНК с последовательностью SEQ ID №1 и фрагмента плазмиды рЕТ22.

Второй объект - рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21 (DE3)/pETDa-Ba.

Третий объект - способ получения высокоочищенной Таргерназы с использованием штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pETDa-Ba.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - Физическая и генетическая карты вектора pETDa-Ba. Обозначено положение гена Таргерназы, других элементов вектора, уникальных сайтов рестрикции.

Фиг. 2 - Физическая и генетическая карты вектора рМТ643. Обозначено положение гена Барстар, других элементов вектора, уникальных сайтов рестрикции.

Фиг. 3 - Гель-электрофорез Таргерназы после финишной очистки анионообменной хроматографией на Сефарозе Q. Дорожки 1-3 - очищенные образцы Таргерназы, дорожка M - молекулярный маркер.

Фиг. 4 - Гель-электрофорез белка Барстар после финишной очистки анионообменной хроматографией на Сефарозе Q. Дорожка 1 - очищенный образец Барстар, дорожка M - молекулярные маркеры.

Фиг. 5 - Кинетика связывания Таргерназы с рекомбинантным антигеном HER2/neu, определенная методом поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore). Количество антигена HER2/neu: 1.5 нг/чип или 1500 RU. Концентрация целевого белка: 12 мкМ (график 1), 2.4 мкМ (график 2), 0.48 мкМ (график 3).

Фиг. 6 - Определение РНКазной активности Таргерназы в сравнении с барназой дикого типа и рибонуклеазой А методом кислотно-растворимого осадка.

Фиг. 7 - Определение способности барстар ингибировать РНКазную активность Таргерназы. РНКазная активность Таргерназы (пунктирная линия) и ее ингибирование барстаром (сплошная линия).

Фиг. 8 - Выживаемость опухолевых клеток SKBR3 и SKOV3 при обработке Таргерназой на 3 сутки. Контроль - клетки СНО.

Табл. 1 - Схема разведения барстар.

Табл. 2 - Схема внесения Таргерназы.

Табл. 3 - Схема совместного внесения Таргерназы и барстар.

Осуществление изобретения.

Пример 1. Получение рекомбинантной плазмиды pETDa-Ba

Плазмиду pETDa-Ba получают путем клонирования фрагмента ДНК с последовательностью SEQ ID №1 в вектор рЕТ22 (рЕТ System Manual, 10th Edition Rev.B 0403, Novagen Inc. (2003)) по сайтам рестрикции NdeI/HindIII.

Пример 2. Получение рекомбинантного штамма - продуцента Таргерназы

Полученной рекомбинантной плазмидой pETDa-Ba трансформируют штамм Е.coli BL21(DE3) [F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), dcm, gal, λ(DE3)] (Studier, F.W. and Moffatt, В.Α. // J. Mol. Biol. 1986. V. 189. P. 113-130). Выбор данного штамма в качестве реципиента для продукции Таргерназы обусловлен тем, что он синтезирует РНК-полимеразу фага Т7, а также обладает сниженной протеазной активностью, что способствует повышению выхода целевых белков.

Поскольку первичные трансформанты DE3-реципиентов могу заметно отличаться по уровню экспрессии целевого белка (Vethanayagam J., Flower Α. // Microbial Cell Factories. 2005. V. 4. P. 3-7) для селекции наиболее активного продуцента Таргерназы и параметров индукции синтеза Таргерназы отдельные клоны трансформантов выращивают в условиях «автоиндукции» (Studier F.W. // Protein Expr. Purif. 2005. V. 41. №1. P. 207-234) в течение 24-48 часов при 25°С с периодическим отбором аликвот суспензии клеток. Для получения грубого экстракта осадок клеток из 100-200 мкл культуры суспендируют в 100 мкл лизирующего буфера для нанесения на ДСН-ПААГ, прогревают 3 мин при 85°С, клеточный дебрис удаляют центрифугированием (12000 об/мин, 5 мин) и 5 мкл полученного экстракта анализируют путем электрофореза в 15% денатурирующем полиакриламидном геле.

Появление отчетливой полосы размером порядка 31.4 кДа в образцах анализируемых штаммов при ее отсутствии в контрольном реципиентом штамме BL21(DE3) принимают за доказательство способности штамма синтезировать Таргерназу.

Клон трансформанта, отличающийся наибольшим выходом Таргерназы, обозначают BL21 (DE3)/pETDa-Ba.

Выход Таргерназы в полученном нами штамме Е.coli BL21(DE3)/pETDa-Ba составляет 45% от суммарного белка клетки.

Клетки полученного рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pETDa-Ва характеризуются следующими признаками.

Морфологические признаки: Клетки имеют продолговатую палочковидную форму, при делении не почкуются.

Культуральные признаки: Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. Время генерации около 30 мин в жидкой LB-среде. На 2-2,5% питательном агаре "Difco" образуются круглые, гладкие, желтоватые колонии с ровными краями. При выращивании на жидких LB- и YT-средах образуется интенсивная ровная мутность. Физиолого-биохимические признаки: Оптимальная температура культивирования - от 25 до 30°С, оптимум рН - 7,6. Источником азота служат органические соединения (в виде триптона, дрожжевого экстракта).

Уровень синтеза Таргерназы в сконструированном штамме составляет около 25 мг/л при титре культуры 1×109 кл/мл, что следует из данных определения Таргерназы в образцах биомассы штамма-продуцента с помощью электрофореза в 15% ДСН-ПААГ.

Пример 3. Получение биомассы рекомбинантного штамма - продуцента Таргерназы

Свежую ночную культуру клеток Е.coli BL21(DE3) выращивают на жидкой среде LB, разбавляют свежей средой в соотношении 1 к 100 и инкубируют до достижения логарифмической фазы роста (3 часа при 37°С, до оптической плотности около 0,6). Полученную суспензию клеток после охлаждения на ледяной бане переносят в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируют в течение 8 с при 12000 об/мин, 4°С (Eppendorf Centrifuge 5417R). Все последующие центрифугирования проводят при тех же уловиях. Осадок клеток промывают последовательно в 400, 200 и 100 мкл стерильного 10%-ного глицерина. Клетки ресуспендируют в 50 мкл стерильного 10%-ного глицерина и переносят в кюветы для электропорации с зазором 0,1 см (Eppendorf). К суспензии клеток добавляют 0,5 мкл обессоленного раствора ДНК плазмиды pETDa-Ba, электропорацию проводят при напряжении 1,8 KB (Eppendorf Multiporator). Добавляют 1 мл среды LB и оставляют на 30 мин при 37°С, затем рассевают на 10 чашек Петри с агаризованной средой LB с ампициллином (конечная концентрация 150 мг/л).

Для получения посевного материала чашки Петри, засеянные трансформантами, инкубируют 16 ч при 37°С в инкубаторе, затем смывают колонии 2 мл среды YPTS, содержащей ампициллин (150 мг/л) и глюкозу (10 г/л). Суспензию клеток переносят с чашки Петри в жидкую автоиндукционную питательную среду ZYM-5052 (Studier F.W. // Protein Expr. Purif. 2005. V. 41. №1. P. 207-234), содержащую ампициллин (150 мг/л), и культивируют при температуре 25°С при интенсивной аэрации (скорость качалки 180 об/мин) в течение суток.

Выход биомассы составляет от 8.0 до 15.0 г/л культуральной среды в зависимости от температуры культивирования после индукции.

Пример 4. Выделение и очистка препарата Таргерназы

Биомассу ресуспендируют в 150 мл дегазированного раствора I (5 мМ Трис-НСl, 40 мМ K2НРО4,500 мМ NaCl рН 8.0) и перемешивают на магнитной мешалке на ледяной бане до полного исчезновения комков. Затем суспензию клеток разрушают ультразвуком 5 раз по 10 с при мощности 60 Вт с интервалом 2-4 мин на ледяной бане с солью и при перемешивании. Полученный клеточный лизат центрифугируют в течение 30 мин при 18500 g, декантируют надосадочную жидкость, содержащую растворимую фракцию целевого белка, и фильтруют через мембрану с размером пор 0.22 мкм (MilliPore). Корректируют рН лизата до значения 8.0 с помощью 1 M раствора Трис.

Исходное содержание целевого белка в лизате составляет 10-15%, концентрация целевого белка - 0.2-0.3 мг/мл.

Раствор, содержащий целевой белок, наносят на колонку с Ni Sepharose FF, уравновешенную 10-кратным объемом раствора I (5 мМ Трис-НСl, 40 мМ K2НРО4,500 мМ NaCl рН 8.0), со скоростью 0,15-0,3 мл/мин, затем для элюции примесных белков колонку промывают 3 объемами раствора I со скоростью 0,15-0,3 мл/мин. Для денатурации комплекса Таргерназа-барстар, иммобилизованного на колонке, носитель промывают 25 объемами раствора I с 6 M гуанидин гидрохлоридом со скоростью 0,15-0,3 мл/мин. Затем Таргерназу, освобожденную от ингибитора барстар, ренатурируют непосредственно на колонке плавным градиентом (60 объемов колонки) гуанидин гидрохлорида от 6 до 0 M в растворе I при скорости 0,03 мл/мин.

После ренатурации Таргерназы, иммобилизованной на колонке, промывают колонку 10 объемами раствора I с 15 мМ имидазола и 0.2% Triton Х-100 со скоростью 0,15-0,3 мл/мин, затем 20 объемами раствора I с той же скоростью. Таргерназу элюируют с колонки раствором I с 250 мМ имидазолом с той же скоростью.

На этой стадии концентрация Таргерназы в элюате составляет 1.0-2.0 мг/мл. Содержание Таргерназы составляет 60-70% по данным электрофореза.

Полученный после аффинной хроматографии элюат разбавляют раствором II (5 мМ Трис-НСl, 40 мМ K2НРО4, рН 7.5) в 20 раз и наносят со скоростью 0,3 мл/мин на колонку Sepharose Q FF, уравновешенную 10-кратным объемом раствора II с 25 мМ NaCl. Колонку промывают 15 объемами раствора II с 25 мМ NaCl, а затем элюируют Таргерназу со скоростью 0,3 мл/мин градиентом NaCl от 25 до 250 мМ в растворе II. Объем градиента составляет 60 объемов колонки. Целевой белок элюируют с колонки при концентрации NaCl около 100 мМ. Концентрация Таргерназы в элюате составляет от 2.0 до 8.0 мкг/мл. Содержание целевого белка - 95-98%. Выход целевого белка - от 15 до 30 мг/л культуры. Для хранения белок переводят в буфер для хранения следующего состава: 5 мМ Трис-НСl, 40 мМ K2НРО4, 500 мМ NaCl рН 8.0, 30% глицерин с помощью колонок NAP-5, PD-10 (фиг. 3).

Пример 5. Получение биомассы рекомбинантного штамма - продуцента барстар

Для наработки биомассы, содержащей рекомбинантный барстар, клетки Е.coli BL21(DE3) трансформируют плазмидой рМТ643 (Hartley R.W. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 5978-5984), несущей ген целевого белка барстара под контролем tac-промотора (фиг. 2). Полученные колонии трансформантов переносят в питательную среду YTPSM (1% дрожжевой экстракт, 1% триптон, 150 мМ NaCl, 20 мМ KН2РО4, 80 мМ K2НРО4, 2 мМ MgCl2, рН 7.5) и культивируют при 37°С с аэрацией до достижения стационарной фазы роста, затем клетки осаждают центрифугированием при 7000 g при 4°С. Биомассу замораживают или немедленно используют для выделения белка. Выход биомассы составляет 5.0 г/л культуральной среды.

Пример 6. Выделение и очистка препарата барстар

Все процедуры проводят при +4°С. Клетки ресуспендируют в буфере УЗ (20 мМ Трис-НСl, 10 мМ KН2РО4, 10 мМ EDTA, 10 мМ DTT, 100 мМ NaCl, рН 8) и разрушают с помощью ультразвука. Полученный лизат осветляют центрифугированием при 18500 g, нуклеиновые кислоты отделяют осаждением 0.04% полиэтиленимином, а белки фракционируют ступенчатым высаливанием сульфатом аммония в концентрации 40 и 80% от насыщения. Осадок, выпавший при концентрации сульфата аммония 80% от насыщения, содержащий целевой белок, растворяют в буфере ГФ (0.1 M Трис-НСl, 10 мМ EDTA, 10 мМ DTT, рН 8.0). Исходное содержание целевого белка в сульфат-аммонийном осадке составляет около 10%. Полученный раствор целевого белка (объем прим. 25 мл) подвергают гель-фильтрации, а затем анионообменной хроматографии на сефарозе Q. Образец наносят на колонку С16/100 с 180 мл носителя Sephacryl S-200, уравновешенную буфером TSDT (20 мМ Трис-НСl, 20 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 0,05% Tween-20, рН 8.5), собирают фракцию белка в объеме 115-140 мл. На этой стадии концентрация целевого белка барстара в элюате составляет 0.2-0.3 мг/мл. Содержание целевого белка барстара составляет 60-70% по данным электрофореза. Фракцию, полученную после гель-фильтрации, содержащую целевой белок, объемом 115-140 мл наносят на колонку HiTrap с Q сефарозой FF, промывают колонку буфером TSDT, затем буфером TDG (20 мМ Трис-НСl, 4 мМ DTT, 10% глицерин, рН 8,5) и элюируют градиентом NaCl от 0 до 500 мМ в буфере TDG. Гомогенный барстар элюируют при концентрации NaCl 100 мМ (Рис. 9). Для длительного хранения очищенный белок переводят в буфер SB2 (15 мМ трис-НСl, 1.5 мМ EDTA, 75 мМ NaCl, 40% глицерин, рН 8.0), содержащий 1 мМ DTT, и хранят при -20°С. Выход целевого белка барстара составляет 24 мг из 1 л культуральной жидкости. Содержание целевого белка барстара составляет 96% по данным электрофореза и последующей фотометрии (фиг. 4).

Пример 7. Проверка рецептор-связывающих характеристик Таргерназы

С помощью метода поверхностного плазмонного резонанса на приборе BIAcore (GE Healthcare, LifeSciences) определяют константу связывания Таргерназы с онкомаркером HER2/neu (фиг. 5). Было показано, что Таргерназа, выделенная способом, описанным в примере 3, с высокой специфичностью взаимодействуют с антигеном HER2/neu (константа диссоциации 2×10-8 М).

Пример 8. Проверка ферментативной (РНКазной) активности Таргерназы

Сохранение функций барназы как токсического агента в составе Таргерназы проверяют путем определения ферментативной РНКазной активности. Для этого используют модифицированный сравнительный метод кислоторастворимого осадка. В качестве субстрата используют дрожжевую РНК.

Исследуемую пробу белка растворяют в концентрации 1,25 мкМ в буферном растворе 0.125 M Трис-HCl, рН 8.5 и затем получают серию последовательных 5-кратных разведений образца в том же буфере. В качестве отрицательного контрольного образца используют буферный раствор 0.125 M Трис-HCl, рН 8.5. В качестве положительных контрольных образцов используют образцы барназы дикого типа и рибонуклеазы А с известной молярной концентрацией. К 40 мкл каждого образца добавляют 160 мкл раствора дрожжевой РНК (в концентрации 2 г/л) в 0.125 M Трис-HCl, рН 8.5 на льду. Реакционную смесь инкубируют 30 минут при +37°С. Реакцию останавливают добавлением 200 мкл 6% хлорной кислоты и инкубируют смесь 15 мин при 0°С. После чего центрифугируют при 16000 g в течение 10 минут. Супернатанты разбавляют в 10 раз и измеряют оптическую плотность при 260 нм (OD260) относительно контрольного образца. Большим значениям оптической плотности соответствует большая рибонуклеазная активность. 1 ед. акт. рибонуклеазы в исследуемой пробе соответствует приращению OD260 на 0.05 единиц.

Величина РНКазной активности Таргерназы обычно колеблется в диапазоне от 4.8×106 до 11,3×106 ед. акт./нмоль, что составляет от 30 до 70% рибонуклеазной активности барназы дикого типа из Е.coli (фиг. 6).

Пример 9. Проверка ингибирования барстаром РНКазной активности Таргерназы

Способность барстар связываться с Таргерназой оценивают по его способности ингибировать рибонуклеазную активность Таргерназы. Серию разведений образцов барстар в диапазоне концентраций от 2.6 до 13 нМ в 0.125 M Трис-HCl (рН 8.5) предварительно инкубируют с 24 нМ раствором барназы, а затем используют эти смеси для определения активности РНКазы методом осаждения нерастворимой в кислоте дрожжевой РНК, как описано в примере 8. Барстар полностью ингибирует РНКазную активность Таргерназы при добавлении в 1.5-кратном молярном избытке (в перерасчете на молекулу барназы) (фиг. 7).

Пример 10. Определение цитотоксической активности Таргерназы на модельных культурах клеток

Поскольку адресный домен Таргерназы специфичен к HER2/neu - рецептору эпидермального фактора роста 2 человека, то в качестве модельных клеток для исследования цитотоксичности Таргерназы используют следующие опухолевые клетки человека: аденокарциномы яичника человека SKOV-3 с гиперэкспрессией онкомаркера HER2/neu, ~ 2.6×105 молекул/клетку (Dean G.S., Pusztai L., Xu F.J., O'Briant K., DeSombre K., et al. // Clin. Cancer Res. 1998, V. 4. P. 2545-2550) и аденокарциномы молочной железы человека SKBR-3 с гиперэкспрессией рецептора HER2/neu: ~ 1×106 молекул/клетку (Hynes N.E., Gerber Н.А., Saurer S., Groner В. // J. Cell. Biochem. 1989. V. 39. №2. P. 167-173).

Ростовую культуральную среду готовят в стерильных условиях. К 435 мл среды RPMI добавляют 10 мл однократного раствора пенициллина и стрептомицина, 5 мл 200 мМ раствора глутамина, 50 мл сыворотки крови эмбриона теленка. Подготовленную культуральную среду хранят в течение 1 мес при температуре от 2 до 8°С. Стерильный раствор МТТ готовят в концентрации 5 мг/мл в культуральной среде непосредственно перед употреблением.

Испытуемый образец Таргерназы разводят в стерильных условиях средой RPMI до концентрации 400 нМ (12,6 мкг/мл). Затем непосредственно перед испытанием методом последовательных двухкратных разбавлений в среде RPMI готовят серии растворов с концентрацией образца 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ. Из лунок плоскодонных культуральных 96-луночных планшетов с подготовленными опухолевыми клетками удаляют ростовую среду и вносят приготовленные разведения испытуемого образца (по 0,2 мл на лунку), используя на каждое разведение не менее 3 лунок с клеточным монослоем (лунки ΟΠΟ). Для контроля состояния клеточного монослоя в 3 лунки вносят по 0,2 мл ростовой среды (лунки ОПМ). В три лунки последнего столбца планшета добавляют по 0,2 мл ростовой среды (лунки ОПС), а в другие 9 лунок - по 0,2 мл испытуемого образца во всех тестируемых концентрациях - по одной лунке на одну концентрацию (лунки ОПЭ). Планшет инкубируют в течение 72 ч в СО2-инкубаторе в стандартных условиях. Для определения максимального процента снижения жизнеспособности клеток значение токсичности определяют дополнительно через 4, 5, 6 и 7 сут.

Процент выживших опухолевых клеток определяют с помощью МTT-теста и последующей спектроскопии. Из лунок 96-луночного плоскодонного планшета удаляют ростовую среду и вносят 0,2 мл раствора МТТ. Инкубируют в течение 1 ч в СО2-инкубаторе в стандартных условиях. По окончании инкубации раствор МТТ осторожно сливают и в каждую лунку добавляют по 0,1 мл ДМСО. Планшет инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Определение оптической плотности проводят при длине волны 545 нм.

Выживаемость клеток под действием Таргерназы рассчитывают по формуле:

ОПМ - оптическая плотность в контрольных лунках (клетки без испытуемого образца),

ОПО - оптическая плотность в опытных лунках (клетки с испытуемым образцом),

ОПЭ - оптическая плотность в лунках без клеток с испытуемым образцом,

ОПС - оптическая плотность в лунках без клеток с ростовой средой.

Цитотоксичность Таргерназы на опухолевых клетках проявляется не сразу, - через 2 сут клетки еще жизнеспособны, а заметный эффект начинает проявляться лишь на 3 сутки. Поэтому значения IC50 определяют на 3 сутки. Графики выживаемости опухолевых клеток на 3 сутки в зависимости от концентрации Таргерназы представлены на фиг. 8. На основании этих графиков определяют концентрации растворов Таргерназы, при которых жизнеспособность НЕR2/nеu-позитивных клеток снижается на 50% (IC50). Значение IC50 для клеток SKBR3 обычно составляет 0.006-0.008 мкМ. Клетки SKOV3 - более устойчивы к действию Таргерназы. Максимальный процент снижения жизнеспособности клеток SKBR3 обычно составляет 73% на 5-й день исследования при концентрации Таргерназы 0.32 мкМ = 10 мкг/мл.

Пример 11. Определение отмены цитотоксического действия Таргерназы в результате взаимодействия с ингибитором барстаром на модельных культурах клеток

Для определения возможности отмены цитотоксического действия Таргерназы в результате взаимодействия с барстаром готовят рабочие разведения барстара - 1/50, 1/100, 1/250, 1/500 и 1/1000. Для разбавления используют ростовую культуральную среду. Процедуру проводят в лунках 48-луночного планшета по следующей схеме. При этом в каждую лунку добавляют по 0,1 мл соответствующего разведения.

Затем добавляют в лунки А1-А5 по 0,1 мл испытуемого образца Таргерназы с концентрацией 0,6 мкг/мл, а в лунки В1-В5 - по 0,1 мл стандарта Таргерназы с концентрацией 0,6 мкг/мл. При добавлении перемешивают содержимое лунок пипетированием. Инкубируют планшет в термостате в течение 1 часа при 37°С.

Затем из лунок 96-луночного планшета с клетками удаляют ростовую среду и переносят по 0,1 мл содержимого лунок А1-В5 48-луночного планшета в лунки 96-луночного планшета с клетками по следующей схеме

В лунки F2-F4 вносят по 0,1 мл 50-кратно разбавленного барстара - это контроль стандартного образца барстара (KB). В лунки F5-F7 вносят по 0,1 мл раствора испытуемого образца с концентрацией 0,6 мкг/мл. В лунки F8-F10 - по 0,1 мл раствора стандарта Таргерназы с концентрацией 0,6 мкг/мл. В оставшиеся ячейки, обозначенные на схеме «к/к», добавляют по 0,1 мл ростовой культуральной среды.

После добавления растворов, лунки 2-11 рядов В-Е 96-луночного планшета содержат испытуемый и стандартный образцы Таргерназы с концентрацией 0,3 мкг/мл.

Разведения «Барстара» в лунках планшета приведены на следующей схеме.

После нанесения планшеты инкубируют в термостате 72 ч при температуре 37°С, содержании углекислого газа 5,0% и влажности 70% и анализируют результаты.

Результаты опыта учитывают, если соблюдаются следующие условия:

- отсутствует дегенерация клеточного монослоя во всех лунках, куда не вносились белковые образцы;

- отсутствует дегенерация клеточного монослоя в лунках F2-F4;

- в контрольных лунках F5-F10 наблюдается дегенерация большей части клеточного монослоя;

- в лунках В2-Е11 наблюдается различная степень дегенерации клеточного монослоя, которая усиливается по мере увеличения разбавления барстара;

- в лунках В2-Е5 отсутствует дегенерация большей части клеточного монослоя (отмена активности Таргеназы при помощи барстар).

Эффект отмены цитотоксичности наступает при 1.5-кратном молярном избытке барстара.

1. Рекомбинантная плазмида pETDa-Ba, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli химерного белка, состоящего из адресного полипептида Darpin 9-29 и барназы, соединенных гибким пептидным линкером, и имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID №2, причем указанная плазмида получена путем клонирования рекомбинантного фрагмента ДНК с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 в плазмидный вектор рЕТ22 по сайтам рестрикции NdeI/HindIII.

2. Рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pETDa-Ba, содержащий рекомбинантную плазмиду pETDa-Ba по п. 1 - продуцент химерного белка, состоящего из адресного полипептида Darpin 9-29 и барназы, соединенных гибким пептидным линкером.

3. Способ получения химерного белка, состоящего из адресного полипептида Darpin 9-29 и барназы, соединенных гибким пептидным линкером, и имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID №2, из биомассы штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pETDa-Ba по п. 2, включающий разрушение клеток дезинтеграцией, удаление клеточного дебриса, выделение индивидуального химерного белка, состоящего из адресного полипептида Darpin 9-29 и барназы, соединенных гибким пептидным линкером, при помощи двухстадийной металлохелатной аффинной хроматографии, включающей стадии белковой денатурации/ренатурации, и очистку при помощи анионообменной хроматографии.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, в частности к биопрепаратам и микробным композициям для деградации органических отходов, и может быть использовано для быстрой, эффективной переработки органических отходов быта человека, животноводства и птицеводства в качественное органическое удобрение.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молочной промышленности, медицине и ветеринарии. Предложенный штамм бактерий Lactobacillus acidophilus ЛИА-Т-193 обладает высокой кислотообразующей активностью.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Штамм Lactobacillus paracasei 1 обладает высокой антагонистической активностью, высоким уровнем кислотообразования, повышенными адгезивными свойствами, устойчивостью к ряду антибиотических препаратов и высокой скоростью накопления биомассы.

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для создания биозащиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста. Группа изобретений включает: штаммы гриба вида Trichoderma longibrachiatum (3 варианта); биопрепарат для стимулирования роста растений и их защиты от фитопатогенов на основе этих штаммов и способ получения этого биопрепарата.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus paracasei MCC1849, обладающий высокой стимулирующей продуцирование IL-12 активностью.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой Штамм микроорганизмов Achromobacter spanius 10-50-TS2, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за №В-12405, в качестве средства повышения устойчивости растений в условиях хлоридного засоления почв.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению (R)-фенилметилсульфоксида. Способ предусматривает окисление фенилметилсульфида с применением биокатализатора - иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток Gordonia terrae ИЭГМ 136.
Заявленная группа изобретений относится к биотехнологии. Способ получения сухой бактериальной закваски для производства кисломолочных продуктов предусматривает раздельное культивирование штаммов Streptococcus thermophilus КД7 41 №2 ВКПМ В-10403 и Streptococcus thermophilus ЗЛ-047 ВКПМ В-10707.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae.

Предложены штамм Lactobacillus mucosae для получения ферментированных пищевых продуктов и пищевой продукт, содержащий указанный штамм. Штамм Lactobacillus mucosae депонирован в CNCM под номером I-4429.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена ДНК-конструкция, кодирующая слитый белок-предшественник, в котором вспомогательная аминокислотная последовательность связана с N-концом последовательности зрелого целевого полипептида переходной областью, предназначенной для распознавания и расщепления гибридного предшественника специфической протеазой с образованием немодифицированной зрелой формы интересующего белка.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантного получения CTR1. Получают плазмидную ДНК pNdCTR1, кодирующую гибридный полипептид GST-NdCTR1, состоящий из N-концевого полипептидного фрагмента глутатион-S-трансферазы (GST), соединенного через сайт гидролиза тромбином с полипептидным фрагментом N-концевого домена высокоаффинного импортера меди человека CTR1 (NdCTR1).

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Предложен экспрессирующий плазмидный вектор, обеспечивающий синтез в клетках Е.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой продуцирующую L-треонин или L-триптофан рекомбинантную клетку-хозяин Е. coli, где в клетке-хозяине делетирован по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из генов, кодирующих белок YsaA, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO 2, белок YdaS, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO 4, и белок YbiX, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO 6.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантный микроорганизм из рода Escherichia, обладающий усиленной способностью к продукции L-триптофана, где указанный рекомбинантный микроорганизм был модифицирован путем делеции, части или полностью, лидерного пептида, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, в регуляторной области экспрессии, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, на эндогенном триптофановом опероне.

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pER-TA1GyrA-AcSer, предназначенную для одновременного биосинтеза двух белков - гибридного полипептида, содержащего аминокислотную последовательность тимозина α1 человека и интеина, и фермента E.

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, предназначенную для одновременного биосинтеза двух белков - гибридного полипептида, содержащего аминокислотную последовательность тимозина β4 человека и интеин, и фермента E.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированному тамавидину, и может быть использовано для детекции связанной с биотином субстанции. Получают модифицированный биотин-связывающий белок на основе тамавидина с последовательностью SEQ ID NO: 2, который содержит до 7 мутаций и при этом остаток аспарагина в 115 положении заменен на цистеин.

Настоящее изобретение к биохимии, в частности к способу получения антитела. Указанный способ предусматривает культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, содержащий первую область инициации трансляции (TIR), функционально связанную с полинуклеотидом, кодирующим тяжелую цепь антитела, и вторую TIR, функционально связанную с полинуклеотидом, кодирующим лёгкую цепь антитела, и извлечение антитела из культуры клетки-хозяина.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантной продукции белков, и может быть использовано для получения антимикробного пептида аципенсина-1 русского осетра Acipenser gueldenstaedtii.

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и медицины, в частности к способу получения рекомбинантного противоопухолевого токсина - химерного бифункционального белка, состоящего из адресного полипептида Darpin 9-29, специфичного к гистохимическому маркеру HER2neu, и высокоактивной бактериальной рибонуклеазы барназы, соединенных гибким пептидным линкером. Для осуществления указанного способа получают рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21pETDa путём встраивания в штамм E.coli BL21 плазмиды pETDa. Указанная плазмида получена путём клонирования рекомбинантного фрагмента ДНК, кодирующего указанный выше химерный белок, в плазмидный вектор pET22 по сайтам рестрикции NdeIHindIII. Настоящее изобретение позволяет получить адресный белок, характеризующийся сниженным риском побочного воздействия за счет возможности моментальной отмены цитотоксичности, для нацеливающей на HER2neu терапии опухолей, гиперэкспрессирующих рецептор HER2. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 11 пр.

Наверх