Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида



Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида

Владельцы патента RU 2611408:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова" (RU)

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и представляет собой способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида, включающий фиксирование срезов ткани органов в 10%-ном формалине, окрашивание флуоресцентным красителем, промывку водой, обезвоживание, заделку в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопирование на флуоресцентном микроскопе, отличающийся тем, что в качестве флуоресцентного красителя используют производные 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.11.7.02.6]дец-8-енов формулы

где Y=2-NO2, 3-NO2, 4-NO2, 3-СООН, 4-СООН,

а окрашивание осуществляют 1,5% спиртовым раствором красителя, смешанным с 1% водным раствором гидроксида натрия в соотношении 1:1. Изобретение обеспечивает повышение информативности за счет увеличенной контрастности рельефа поверхности и способствует большей сохранности гистологических срезов. 3 табл., 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и предназначено для исследования вне- и внутриклеточной локализации амилоида в тканях, а также жидких средах.

Известен флуоресцентный способ выявления растворенных в воде фибрилл амилоида с помощью бензантрона (3-морфолино-7Н-бензо[de]антрацен-7-он) (Gorbenko G., Trusova V., Kirilova Ε., Kirilov G., Kalnina I., Vasilev Α., Kaloyanova S., Deligeorgiev T. New fluorescent probes for detection and characterization of amyloid fibrils // Chemical Physics Letters. - 2010. - Vol. 495. - P. 275-279).

Недостатками данного способа являются то, что этот препарат не апробирован на гистологических срезах, не производится в промышленных масштабах для лабораторного использования и не лицензирован. Как антраценовое производное 3-морфолино-7Н-бензо[de]антрацен-7-он возможно является канцерогеном, что исключает возможность его использования как лекарственного средства.

Известен способ гистохимического определения амилоида с помощью красителя Конго красный [по Н.Н. Benhold (1923), в кн.: Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. 646 с]. Недостатком данного способа является низкая информативность, заключающаяся в отсутствии возможности получения количественного результата.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является диагностический способ флуоресцентного выявления амилоида в гистологических срезах органов людей, умерших от амилоидоза, с помощью окрашивания срезов тиофлавином Т, либо S (Bums J., Pennock C.A., Steward P.J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine Τ // Journal of pathology and bacteriology. - 1967. - Vol.94. - P. 337; Bancroft J.D., Stevens A. Theory and practice of histological techniques Ed. 2 / Churchill Livingstone. - Edinburgh & London, 1982 UK.), который заключается в том, что парафиновые срезы органов, зафиксированные в 10% формалине, предварительно окрашивают железным гематоксилином, после чего докрашивают 1% раствором тиофлавина Τ или S.

Докрашенные срезы подкисляют в растворе лимонной кислоты, высушивают, заделывают в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопируют на флуоресцентном микроскопе. При окрашивании тиофлавином Τ амилоид выглядит как зелено-коричневые флуоресцирующие объекты (рисунки 1а, 1б). Например, на рис. 1а изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочке (Кл), канальцах (Кн) и цитоплазме эпителия канальцев (Э) (объектив 40х), а на рис. 1б - свечение амилоидных депозитов в клубочке, после окрашивания тиофлавином Т.

На препаратах почки амилоидные депозиты в просвете канальцев и растворенные в цитоплазме эпителия канальцев выглядят как ярко-зеленые практически однородные объекты. В стенках сосудов и между капиллярными петлями почечных клубочков амилоид светится менее интенсивно коричневатым оттенком. Участки тканей, не содержащие амилоид, выглядят темно-зелеными, практически черными. Клеточные ядра дифференцируются как округлые несветящиеся объекты.

При замерах интенсивности свечения с помощью фотоумножителя максимум флуоресценции тиофлавина приходился на 534 нм. Интенсивность свечения интактных и пораженных амилоидом тканей приведена в таблице 1. Высокий размах вариационного ряда свидетельствует о том, что интенсивность флуоресценции амилоида, меченого тиофлавином, значительно различается в разных участках ткани почки, что может свидетельствовать о наличии концентрационной зависимости.

Этот же способ используется для выявления амилоида в биологических средах (плазма крови, спинно-мозговая жидкость) больных людей, а также изучения амилоида in vitro, как выделенного из тканей больных людей или животных, так и искусственно приготовленных из белков-амилоидогенов (Козлов В.А., Сапожников С.П., Шептухина А.И., Голенков А.В. Сравнительный анализ различных моделей амилоидоза // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2015. - №1. - С. 5-11; Сулацкая А.И., Волова Е.А., Комиссарчик Я.Ю., Снигиревская Е.С., Маскевич Α.Α., Дробченко Е.А., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. Исследование кинетики образования амилоидных фибрилл на основе инсулина // Цитология. - 2013. - Ν 11. - С.809-814).

Недостатком данного способа является дороговизна тиофлавинов (стоимость 25 г составляет 3318,16 руб., http://www.zymophore.ru/), они не производятся в Российской Федерации и закупаются за рубежом.

Задачей изобретения является расширение ассортимента препаратов со свойствами окрашивания гистологических срезов для оценки интенсивности амилоидогенеза, которые могут заменить дорогостоящий тиофлавин.

Технический результат - повышение экономичности за счет пониженной стоимости препаратов, информативности за счет увеличенной контрастности рельефа поверхности.

Технический результат достигается тем, что способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида, включающий фиксирование срезов ткани органов в 10%-ном формалине, окрашивание флуоресцентным красителем, промывку водой, обезвоживание, заделку в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопирование на флуоресцентном микроскопе согласно изобретению, в качестве флуоресцентного красителя используют производные 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.117.02.6]дец-8-енов формулы

где Y=2-NO2, 3-NO2, 4-NO2, 3-COOH, 4-COOH, а окрашивание осуществляют 1,5% спиртовым раствором красителя, смешанным с 1% водным раствором гидроксида натрия в соотношении 1:1.

Сущность способа флуоресцентного гистологического выявления амилоида заключается в следующем.

На основе представлений о супрамолекулярном неферментативном взаимодействии амилоида с известными флуоресцентными зондами тиофлавином Т (Сулацкая А.И. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя: автореф. дис. … докт.биол. наук / А.И. Сулацкая; Институт цитологии РАН. - Санкт-Петербург, 2013. - 22 с. ) и конго-красным (Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid like proteins with a pleated sheet conformation // J. Histochem. and Cytochem. - 1989. - Vol.37. - N 1273. 1281) осуществлен синтез производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.1.7.02.6]дец-8-енов формулы (1a-д), перспективных как флуоресцентные зонды, селективных к амилоиду.

Синтез исследуемых веществ (1a-д) осуществляли взаимодействием легкодоступных N-арил-2,5-дигидропиррол-2,5-дионов с фуран-2-карбальдегидом при эквимольном соотношении реагентов при комнатной температуре. В качестве растворителя использовали абсолютный 1,4-диоксан. Чистоту синтезированных продуктов контролировали по данным тонкослойной хроматографии, а структуру подтверждали методами ИК, ЯМР 1Н-спектроскопии.

Соединения (1a-д) представляют собой кристаллические вещества светло-желтого или оранжевого цвета, константы и данные элементного анализа которых приведены в таблице №2.

Флуоресцентные свойства апробированных веществ (1a-д), имеющих, подобно тиофлавину Т, строение молекулярного ротора, в сухом кристаллическом виде проявлялись при возбуждении ультрафиолетом в видимом диапазоне 421-435,5 нм. Ни спиртовой, ни водно-спиртовой растворы этих веществ в диапазоне концентраций от 0,75% до 1,5% регистрируемой с помощью ФЭУ-39 флуоресценции не обнаруживали.

Примеры выполнения способа.

Пример 1

Эксперименты проведены на 5 мкм парафиновых срезах почек человека с ранее клинически установленным и гистологически подтвержденным диагнозом амилоидоза. Обезличенные препараты были предоставлены «Республиканским бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Чебоксары. Депарафинированные срезы были предварительно окрашены гематоксилином, а затем в течение 3 мин дополнительно обработаны водно-спиртовыми растворами любого из производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло-[5.2.11.7.02.6]дец-8-енов формулы (1а-д). Водно-спиртовые растворы были получены следующим путем. Вначале соединения формулы (1а-д) растворяли в 96% спирте с получением спиртового раствора 1,5% концентрации, а затем к полученному раствору добавляли 1% водный раствор гидроксида натрия в соотношении 1:1 по объему. Конечная концентрация препаратов (1а-д) в полученном водно-спиртовом растворе составляла 0,75%, а среда такого раствора щелочная (рН>7). После окрашивания срезы были промыты водой, обезвожены и заделаны в полистирол.

Микроскопию срезов осуществляли на микроскопе «Люмам-4». Флуориметрию осуществляли с помощью микролюминиметра ФМЭЛ-1А, запирающий светофильтр ЖС18, λвозбужд.=410 нм, светофильтры ФС, БС, СЗС. Электрические параметры на всех замерах определялись следующими параметрами: входное напряжение 900 В, сопротивление усилителя 106 Ом. В насадке был установлен зонд 0,5. Для измерения использовали ФЭУ-39, показания снимали с цифрового вольтметра, данные представлены в милливольтах (мВ). Микрофотографии получены с помощью цифровой камеры Levenhuk С800 NG 8М, USB 2.0.

На окрашенных препаратах максимум флуоресценции наблюдался при 534 нм.

После обработки парафиновых срезов амилоидной почки подщелоченными водно-спиртовыми растворами всех исследуемых веществ структуры (1a-д) наблюдалось интенсивное зеленое свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцевых структурах (рисунки 2а-2д, объектив 40х). Например, на рис. 2а изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцевых структурах, после окрашивания препаратом (1а); на рис. 2г изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцах, после окрашивания препаратом (1г); на рис. 2д изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцах, после окрашивания препаратом (1д).

Меньшее по интенсивности свечение обнаруживалось в клубочках с хорошо выявляемым париетальным листком капсулы и темно-зелеными депозитами амилоида, расположенными между петель клубочка, эпителия канальцев и эндотелии артериол. Например, на рис. 2а1 изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1а); на рис. 2б изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1б); на рис. 2в изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1в).

Обнаруживаемое свечение равномерно располагалось в цитоплазме клеток. Клеточные ядра выглядели как темные нефлуоресцирующие овальные объекты. Интенсивность флуоресценции депозитов в канальцах различается на порядок, что может быть обусловлено количественными различиями содержания амилоида на разных участках срезов (таблица 3).

Как следует из данных, представленных в таблице, интенсивность флуоресценции исследуемых препаратов (1а-д) значительно не различается, что объясняется близостью их химического строения.

При применении соединений (1а-д), по сравнению с окраской тиофлавином Т, увеличивается информативность окраски за счет увеличенной контрастности рельефа поверхности. Кроме того, при окрашивании тиофлавином необходима инкубация срезов в 1% растворе лимонной кислоты, что необходимо для возбуждения флуоресценции тиофлавина. Тогда как в заявленном способе окрашивания необходимости в такой обработке нет. Поскольку рН растворов красителей, приготавливаемых по заявленному способу, имеет щелочную реакцию, то он более физиологичен, поскольку нативные (живые) ткани имеют рН≥7,37 (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник / Под. ред. акад. АМН СССР С.С. Дебова. - 2-е изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 1990. - 528 с, С. 452-455. ISBN 5-225-01515-8). Данное обстоятельство должно способствовать большей сохранности гистологических срезов, чем при их обработке кислотами.

Заявленный способ позволяет селективно локализовать амилоид как свободно расположенный в межклеточном пространстве, так и внутриклеточно, а также в жидких средах и может быть использован в судебно-медицинской экспертизе, клинической диагностике амилоидоза, экспериментальной биологии и медицине.

Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида, включающий фиксирование срезов ткани органов в 10%-ном формалине, окрашивание флуоресцентным красителем, промывку водой, обезвоживание, заделку в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопирование на флуоресцентном микроскопе, отличающийся тем, что в качестве флуоресцентного красителя используют производные 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.11.7.02.6]дец-8-енов формулы

где Y=2-NO2, 3-NO2, 4-NO2, 3-СООН, 4-СООН,

а окрашивание осуществляют 1,5% спиртовым раствором красителя, смешанным с 1% водным раствором гидроксида натрия в соотношении 1:1.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области сельского хозяйства, плодоводству и селекции. Способ включает промораживание однолетних побегов в период покоя в камере искусственного климата.

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа количественного определения метоклопрамида в лекарственных формах, воде и биологических жидкостях.
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике, и может быть использовано для ранней дифференциальной диагностики острого панкреатита и рака поджелудочной железы.

Изобретение относится к области разработки лекарственных препаратов для лечения онкологических заболеваний. Предложен способ выявления веществ и их композиций с противоопухолевой активностью, основанный на увеличении продукции репортерного белка, кодируемого рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, в ответ на воздействие веществ или их композиций на молекулярные мишени из числа протеинкиназы mTOR, топоизомераз I и II, гистон деацетилаз и неизвестных мишеней, ингибируемых соединениями LY294002 и LY303511.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ получения ДНК-праймеров и зондов для малоинвазивной пренатальной ПЦР-диагностики трисомии 21-й хромосомы у плода по крови беременной женщины, характеризующийся тем, что выбирают сайт дифференциального метилирования фетальной ДНК 21-й хромосомы и ДНК 21-й хромосомы взрослого человека, чувствительный к эндонуклеазам, синтезируют прямой и обратный праймер, соответствующие ампликону длиной от 60 до 300 п.н., а также зонд, соответствующий этому ампликону, проводят ПЦР в реальном времени смеси образцов после их обработки эндонуклеазой рестрикции, отбирают пары праймеров и зонды, обеспечивающие эффективность реакции ПЦР в реальном времени выше 90% и линейность при изменении относительной концентрации образцов выше 90%.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике и касается способа определения мозговой изоформы креатинфосфокиназы в крови человека.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для применения индоцианина зеленого в качестве оптической метки наночастиц, содержащих лекарственное вещество белковой природы.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для экспресс-анализа количества сахара в крови. Гексокиназный способ неинвазивного определения сахара в крови включает в подготовку прибора для определения сахара в крови, в котором используют пробу и реагент, помещение их в кювету для перемешивания с получением раствора, содержащего конгломерат реактива с сахаром в слюне, у которого повышается спектральная чувствительность и достигает порога на двух значениях 190 нм и 340 нм, установку кюветы в рабочий прибор, включение источника светового излучения, а также фильтра-селектора, направляемых поочередно на кварцевую кювету с упомянутым раствором, осуществление контроля оптической плотности многосекционным фотоприемником и определение значения сахара в крови посредством обработки процессором данных об оптической плотности.

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа количественного определения группы стигминов в субстанциях. Сущность способа заключается в том, что в исследуемую пробу прибавляют 20-30 мл очищенной воды для аминостигмина, ривастигмина, пиридостигмина бромида или спирта этилового 95% для неостигмина метилсульфата и физостигмина салицилата.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ определения обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой, отличающийся тем, что проводят определение уреазной активности следующим образом: в одну из лунок микропланшета вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером, в две другие вносят водные растворы мочевины с фосфатным буфером, содержащие уреазу с известной концентрацией 5 и 10 Ед/л соответственно, а в остальные лунки вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером и образцами ротовой жидкости, затем во все лунки вносят фенол/нитропруссидный реагент и гипохлорит, после чего измеряют оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 546 нм и рассчитывают концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Ед/л, при значении уреазной активности выше 15,85±2,11 Ед/л регистрируют обсемененность полости рта уреазопозитивной микробиотой.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к диагностике. Способ идентификации и количественного определения специфической молекулы-мишени в образце, включающий: тестирование и выбор первого лиганда или множества первых лигандов и второго лиганда или множества вторых лигандов, соединенных с детектируемой меткой, в отношении связывания с молекулой-мишенью; или выбор первого лиганда или множества первых лигандов и второго лиганда или множества вторых лигандов, соединенных с детектируемой меткой, в отношении связывания с молекулой-мишенью; скрининг образца, содержащего специфическую молекулу-мишень, в высокопроизводительном скрининговом анализе, включающий добавление первого и второго лиганда, каждый из которых имеет первую и вторую детектируемую метку, связывание каждого из первого и второго лигандов с отдельными и специфическими сайтами на специфической молекуле-мишени, где скрининговый анализ не требует стадии промывания; обнаружение излучения света, когда первый и второй лиганды специфически связываются со специфической молекулой-мишенью; измерение интенсивности излучаемого света и по интенсивности света проводят идентификацию и количественное определение специфической молекулы-мишени в образце. Способ количественного определения специфического белка в образце. Способ скрининга потенциального терапевтического соединения. Способ скрининга потенциального терапевтического соединения. Способ диагностики заболевания или расстройства. Вышеописанная группа решений позволяет эффективно идентифицировать и определить количество специфической молекулы-мишени в образце. 6 н. и 26 з.п. ф-лы, 19 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, и предназначено для прогнозирования спонтанного наступления беременности в течение года после проведения хирургического лечения бесплодия у женщин с I и II стадиями наружного генитального эндометриоза. У женщин до оперативного лечения определяют относительное содержание CD86+ нейтрофилов и при его значении, равном 31% или менее в нейтрофильном гейте, прогнозируют наступление беременности в течение года после проведения хирургического лечения бесплодия. Изобретение позволяет оценить шанс спонтанного наступления беременности после проведения лечебной лапароскопии, своевременно скорректировать тактику ведения пациенток и оценить необходимость ЭКО. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа идентификации и раздельного количественного определения танина и галловой кислоты при совместном присутствии в растительном сырье и фитопрепаратах без предварительного разделения. Сущность способа заключается в том, что навеску растительного сырья заливают нагретой до кипения водой, кипятят с обратным холодильником, извлечение процеживают, не дожидаясь охлаждения, в мерную колбу, доводят объем раствора, если необходимо, водой до метки. Далее измеряют оптическую плотность фильтрата, разведенного боратным буферным раствором с рН 9,0, относительно буфера при длинах волн 275±2 нм и 305±2 нм и рассчитывают содержание галловой кислоты и танина в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах. Использование способа позволяет повысить точность одновременного определения танина и галловой кислоты при совместном присутствии в растительном сырье и фитопрепаратах. 5 ил., 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области диагностики, а именно к способу определения длительности болезни при лихорадке Ку у лиц в возрасте до 50 лет. Способ определения длительности болезни при лихорадке Ку, заключающийся в том, что в сыворотке крови больных в возрасте до 50 лет определяют активность каталазы на 1 или 2 неделях болезни, затем, решая регрессионные уравнения зависимости между активностью каталазы, длительностью эндотоксикоза и продолжительностью заболевания, определяют длительность болезни при лихорадке Ку в днях, при этом при определении активности каталазы сыворотки крови на 1 неделе болезни определяют длительность болезни с точностью до 1-2 дней, а при определении активности каталазы сыворотки крови на 2 неделе болезни - с точностью до 1-3 дней. Вышеописанный способ повышает точность определения длительности болезни при лихорадке Ку. 3 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа количественного определения флуоресцеина натрия. Сущность способа заключается в том, что прозрачную полиметакрилатную матрицу выдерживают в анализируемом растворе при встряхивании в течение 15 минут, при этом в анализируемый раствор добавляют раствор NaOH для создания среды кислотностью pH 9. Оценку концентрации флуоресцеина натрия осуществляют по градуировочному графику интенсивности полосы при максимуме флуоресценции 440 нм. Использование способа позволяет с высокой точностью определять флуоресцеин натрия в растворах. 3 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа определения феназепама. Сущность способа заключается в том, что готовят растворы определяемого вещества в концентрации 0,02 мг/мл и образца сравнения. В качестве растворителя для приготовления испытуемых растворов используют 0,1М раствор натрия гидроксида. В качестве образца сравнения используют натрия нитрат. Измеряют оптическую плотность раствора определяемого вещества и образца сравнения на спектрофотометре при длине волны 345 нм. Расчет результатов проводят по формуле ,где Dx и Dвос - оптические плотности определяемого вещества и образца сравнения соответственно; аx и авос - точные навески определяемого вещества и образца сравнения соответственно; V1 и V2 -объемы приготовленного раствора определяемого вещества; V3 - объем аликвоты определяемого вещества; - объем приготовленного раствора образца сравнения; 100 - коэффициент для пересчета в проценты; W - влажность, %; 0,0208 - коэффициент пересчета по натрия нитрату в 0,1M растворе натрия гидроксида. Использование способа позволяет с высокой точностью определять феназепам в исследуемых образцах. 3 пр.

Изобретение относится к области аналитической химии, и касается способа определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата и O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в биологическом материале. Сущность способа заключается в том, что биологический объект, содержащий O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат или O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, измельчают, трижды обрабатывают смесью ацетона и этилацетата, взятых в соотношении 6:4 по объему, каждый раз в течение 30 минут. Полученные извлечения объединяют, экстрагент испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном. Ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетонитриле. Полученный раствор разбавляют водой в соотношении 1:4 по объему, образующийся водно-ацетонитрильный раствор насыщают хлоридом натрия. Далее дважды экстрагируют этилацетатом, органические экстракты объединяют, упаривают до сухого остатка. Остаток растворяют в ацетоне, вносят в макроколонку сорбента, которым является силикагель КСС №3 80/120 мкм. Процесс хроматографирования осуществляют, используя двухкомпонентную подвижную фазу гексан-диоксан в соотношении 8:2 по объему. Фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле. Далее проводят определение исследуемого вещества хромато-масс-спектрометрическим методом в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил-95%-метилполисилоксан, при толщине пленки неподвижной фазы 0,25 мкм), используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективным детектором, работающим в режиме электронного удара, где начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70 до 200°С со скоростью 40°С в минуту, а затем от 200 до 290°С со скоростью 12,5°С, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ. Регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество ализируемого вещества, которым является O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат или O-(2,3-дигнщро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамат, по площади хроматографического пика. Использование способа позволяет с высокой точностью определять O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата и O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в биологическом материале. 4 табл. 3 пр.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики гипоксии плода в родах, включающий определение концентрации лактата в амниотической жидкости, отличающийся тем, что образец амниотической жидкости забирают в первом периоде родов вагинальной амниотомией при раскрытии шейки матки 4-5 см посредством иглы для пункции заднего свода влагалища, определяют в амниотической жидкости концентрацию лактата энзиматическим колориметрическим методом и при концентрации лактата в амниотической жидкости менее 5,0 ммоль/л или более 9,5 ммоль/л диагностируют гипоксию плода в родах. Осуществление изобретения обеспечивает сокращение времени диагностики гипоксии плода в родах при высоких показателях чувствительности и специфичности. 3 пр., 4 ил.

Изобретение относится к области медицины. Предложены способы зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающие использование фотоактивируемого химического обесцвечивания для обнаружения множественных мишеней в биологическом образце. Способы включают: связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце, содержащей множественные мишени; обнаружение сигнала от по меньшей мере,одного связанного зонда; приведение образца, содержащего связанный зонд, в контакт с реагентом переноса электрона; облучение образца, связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце; обнаружение сигнала от зонда. Также предложен способ получения серии по меньшей мере двух изображений, показывающих оптически меченные биологические мишени. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

Изобретение относится к диагностике, а именно способу получения модельной системы на основе лецитина из подсолнечника для определения свободно-радикального окисления. Способ получения модельной системы на основе лецитина из подсолнечника для определения свободно-радикального окисления по концентрации малонового диальдегида, включающий получение 10% спиртового раствора лецитина, из 0,25 мл полученного раствора лецитина и 5 мл дистиллированной воды инжекционным способом готовят суспензию липосом, в полученную суспензию липосом добавляют 0,2 мл 0,05 н соляной кислоты и впрыскивают 0,125 мл 3 мМ перекиси водорода, нагревают при температуре 38°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Вышеописанный способ позволяет повысить точность определения свободнорадикального окисления. 1 табл., 1 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2015-09-23 2017-02-28T09:27:59
Наверх