Способ профилактики антракосиликоза при моделировании в эксперименте

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано для профилактики антракосиликоза. Способ включает моделирование заболевания ежедневной затравкой угольно-породной пылью экспериментальных животных с одновременным использованием профилактического препарата. В качестве такого препарата вводят в питание животного биологически активную добавку Цито-Реактор дигидрокверцетин в дозе 3 мг/кг массы тела животного. Продолжительность эксперимента составляет 12 недель. Способ обеспечивает сокращение выраженности дистрофических и склеротических изменений в тканях, нормализацию звеньев липидного обмена, в том числе соотношения липопротеидов крови, а также общего метаболизма за счет удлинения фазы долговременной адаптации. 2 табл.

 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано для профилактики антракосиликоза (АС).

В настоящее время принято считать, что профессиональные заболевания являются частным проявлением болезней адаптации (Безрукова Г.А., Спирин В.Ф. Патофизиологические аспекты развития профессиональных заболеваний и их лабораторная диагностика (обзор литературы). - В ж-ле: Медицина труда и промышленная экология. - 2003. - №11. - С. 7-13) и носят системный характер (Бондарев О.И. Патологоанатомическое и морфометрическое исследование бронхов, респираторной ткани и сосудов малого круга кровообращения при воздействии угольно-породной пыли и при экспериментальном антракосиликозе - дис…канд. мед. наук. - Новосибирск. - 2010. - с. 8). С этой позиции открывается возможность прогнозирования индивидуального риска развития и течения профессиональных заболеваний. Для пылевой патологии легких, к которой относится АС, характерно отсутствие в течение длительного времени ярко выраженных клинических изменений, в то время как результаты исследования патологоанатомических данных свидетельствуют об очень раннем начале кониотического процесса у шахтеров. Данные о преморбидных изменениях при АС немногочисленны и противоречивы (Захаренков В.В., Михайлова Н.Н., Уланова Е.В., Фоменко Д.В., Жукова А.Г. Патогенез профессиональных заболеваний с позиции общего адаптационного синдрома (экспериментальные исследования). В сб. тез.: Naukowa mysl informacyjnej powieki - 2012. - Прага. - 2012. - c. 51), a именно они являются ориентирами для профилактических мероприятий.

Известен способ применения препарата «Янтарь - антитокс» у пациентов с обострением хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) (Санжаровская М.С., Варвянская Н.В., Ямкина Н.С., Печеркина И.Н., Смотрова А.А., Антипов С.И., Рослякова Е.П., Акбашева О.Е., Санжаровская О.П., Хазанов В.А., Черногорюк Г.Э. Влияние регулятора энергетического обмена на хроническое течение и биомаркеры воспаления при лечении обострений тяжелой хронической обструктивной болезни легких. - в ж-ле: Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - №3. - С. 109-116).

Недостатком способа является назначение препарата пациентам с ХОБЛ тяжелой и крайне тяжелой степеней.

Наиболее близким способом профилактики является сочетанное назначение тимогена (интраназально по две капли 0,01% раствора) и токоферола (перорально 1 мг/100 г) в условиях ежедневного воздействия на животных угольно-породной пыли (УПП) угля марки газово-жирный (ГЖ) в концентрации 50 мг/м³ (Золоева П.В. Гигиенические аспекты профессионального антракосиликоза и особенности его формирования в эксперименте. - дис…канд. биол. наук. - Иркутск. - 2009. - С. 35).

Однако и этот способ профилактики имеет ряд недостатков. Сочетанное назначение тимогена и токоферола животным в условиях АС не улучшает липидный профиль плазмы крови: достоверно увеличивается уровень триглицеридов, уровень общего холестерина, при этом уровень ХС_ЛПВП снижается, а уровень ХС_ЛПНП повышается по сравнению с контрольными показателями.

Задача изобретения состоит в том, чтобы повысить эффективность профилактики АС за счет использования биологически активной добавки, которая влияет на энергетические процессы и общий метаболизм организма.

Поставленная задача решается способом профилактики антракосиликоза при моделировании в эксперименте, создаваемого ежедневной затравкой угольно-породной пылью экспериментальных животных с одновременным назначением профилактического препарата. В качестве профилактического препарата вводят в питание биологически активную добавку Цито-Реактор дигидрокверцетин в количестве 3 мг/кг массы тела экспериментального животного. Продолжительность эксперимента 12 недель.

Новизна изобретения состоит в том, что:

- в качестве профилактического препарата вводят в питание биологически активную добавку Цито-Реактор дигидрокверцетин, содержащую дигидрокверцетин, янтарную кислоту и витамин C;

- добавку вводят в количестве 3 мг/кг массы тела экспериментального животного;

- продолжительность эксперимента 12 недель.

Совокупность существенных признаков изобретения позволит получить новый результат, заключающийся в сокращении выраженности дистрофических и склеротических изменений в тканях, нормализации звеньев липидного обмена, в том числе соотношения липопротеидов крови, а также общего метаболизма, за счет удлинения фазы долговременной адаптации, реализации антигипоксантного, антиоксидантного и органопротекторного эффектов. Биологически активная добавка Цито-Реактор дигидрокверцетин может быть рекомендована в качестве одного из профилактических средств развития антракосиликоза.

Профессиональные заболевания пылевой этиологии, к которым относится АС, имеют в своей основе гипоксическую компоненту. Одним из наиболее эффективных путей ограничения развития патологических реакций при гипоксии является непосредственное воздействие на процессы образования энергии в митохондриях при помощи веществ, являющихся естественными метаболитами митохондрий. Среди них особого внимания заслуживает янтарная кислота, которая является энергетическим субстратом цикла Кребса и окисляется митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназой (митохондриальный ферментный комплекс - МФК II). Янтарная кислота обладает адаптогенной активностью и оказывает антитоксическое, антистрессовое и нейротропное действие, нормализует энергетический и пластический обмен, усиливает биохимические и физиологические восстановительные процессы в различных органах при патологии, оказывает регулирующее влияние на процессы тканевого обмена. В отношении дигидрокверцетина показано, что он является модулятором синтеза защитных белков семейства HSP и увеличивает устойчивость организма и отдельных органов (сердце, печень) к действию повреждающих факторов, подавляет и нейтрализует разрушающее действие свободных радикалов, нормализует обмен веществ на клеточном уровне. Витамин-C является мощным антиоксидантом. Витамин-C и дигидрокверцетин усиливают действие друг друга, работают синергично, последний также предохраняет витамин-C от окисления и разрушения. Таким образом, предлагаемая биологически активная добавка является поставщиком комплекса веществ, которые обладают адаптогенным, антиоксидантным и органопротекторным действием.

Биологически активная добавка Цито-Реактор дигидрокверцетин производитель Деметра-продукт НПО (Россия) содержит в одной капсуле: дигидрокверцетина 90 мг, янтарной кислоты 15 мг, аскорбиновой кислоты 10 мг. Добавку принимают по одной капсуле в день в первой половине дня, запивая теплой водой. Рекомендуемая профилактическая доза - 1,5 мг/кг. Данная дозировка была увеличена в 2 раза по сравнению с профилактической в целях получения выраженных эффектов.

Патогенетически обусловленная, проведенная своевременно фармакологическая коррекция в виде назначения биологической добавки Цито-Реактор дигидрокверцетин способствует удлинению фазы долговременной адаптации, реализует антигипоксантный и антиоксидантный эффект; нормализует обмен веществ, снижает выраженность дистрофических и склеротических изменений в тканях, обусловливая, тем самым, органопротекторный эффект и может быть рекомендована в качестве одного из профилактических средств развития антракосиликоза.

Выбор продолжительности эксперимента 12 недель обусловлен формированием к данному сроку патологических изменений, характерных для хронической формы АС, соответствующего стажу работы в шахте свыше 10 лет (Патент RU 2534872, МПК G09B 23/28, опубл. 10.12.2014).

Способ осуществляется следующим образом.

Эффективность способа доказана в экспериментах, проведенных на взрослых нелинейных белых крысах-самцах. АС, развивающийся при вдыхании УПП, моделировали по способу Захаренкова В.В. с соавт. (Способ моделирования антракосиликоза: пат. 2534872 РФ: МПК51 G09B 23/28 / В.В. Захаренков, Н.Н. Михайлова, Л.Г. Горохова, Е.В. Уланова, Д.В. Фоменко, Н.В. Кизиченко, О.И. Бондарев, М.С. Бугаева; заявитель и патентообладатель: ФГБУ НИИ КПГПЗ. - №2013134065/14; заявл. 19.07.2013; опубл. 10.12.2014, Бюл. №34). Животных делили на три группы: 1 - контрольную (группа «контроль»), 2 - крысы, вдыхавшие УПП марки ГЖ, средней концентрации 50 мг/м³ с размером пылевых частиц 5 микрон и меньше в затравочной пылевой камере ежедневно пять раз в неделю по 4 часа в течение 12 недель (группа «УПП»), 3 - крысы, вдыхавшие УПП в вышеуказанной дозе и экспозиции и назначением добавки Цито-Реактор дигидрокверцетин (ЦР) в дозе 3 мг/кг в 1% крахмальном геле перорально индивидуально каждому животному с помощью канюли (группа «УПП+ЦР»). Крахмальный гель приготавливали путем растворения крахмала в горячей воде в соотношении 1:100.

Забор биохимического и гистологического материала производили на 3 сутки, а также 1, 3, 6, 9 и 12 неделях эксперимента. Исследования проводились в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных целей (Страсбург, 1986) и требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ №755 от 12.08.1977 г.).

Биохимические исследования осуществляли по стандартным методикам. Глюкозооксидазным методом на фотометре РМ 750 (Германия) определяли содержание глюкозы в плазме крови (наборы «Новоглюк-К,М» производства «Вектор-Бест», Россия); энзиматическим колориметрическим методом на фотометре 5010 (Германия) определяли содержание общего холестерина (ХС), липопротеинов низкой плотности (ХС_ЛПНП), липопротеинов высокой плотности (ХС_ЛПВП) и триглицеридов (ТГ) с помощью соответствующих наборов фирмы «Ольвекс-Диагностикум» (Россия). Кинетическим УФ-методом определяли активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), альфа-гидроксибутиратдегидрогеназы (ГБДГ), гамма-глутаминтрансферазы (γ-ГТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Колориметрическим методом Райтмана-Френкеля определяли активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) КФК-2МП при помощи наборов «Трансаминаза-АЛТ-НОВО».

Гистологическому исследованию подвергались ткани легких, включая воздухопроводящие и гемодинамические структуры, печени, почек и сердца. В качестве фиксатора использовали 12% раствор формалина. После фиксации кусочки гистологического материала тщательно промывали, подвергали химической обработке тканей при помощи аппарата для гистологической проводки AT 600 М. Из полученного материала на санном микротоме делали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином и пикрофуксином по методу Ван Гизона. Полученные гистологические препараты изучали при помощи микроскопа Микрос - МС-200.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 6,0. Различия между выборками считались достоверными при p≤0,05.

Начало воздействия УПП оказывало влияние на характер всей совокупности метаболических процессов, происходящих в организме животных (группа «УПП»). С первых дней затравки показатели активности некоторых ферментов в сыворотке крови этой группы животных отличались от контрольных значений: в 1,3 раза была снижена активность ЩФ, вместе с этим возрастали показатели γ-ГТ, ЛДГ и ГБДГ, а также глюкозы и превышали нормальные примерно в 1,3 раза. Значения аминотрансфераз не отличались от контрольных (табл. 1, группа «УПП»).

Для 1-й недели было характерно некоторое изменение концентрации изучаемых показателей в сыворотке крови: достоверное снижение уровня АлАТ почти в 2 раза, а также ЩФ, ЛДГ и ГБДГ при сохранении нормальных показателей AcAT и несколько повышенных γ-ГТ. К 3-й неделе наблюдалась некоторая нормализация активности АлАТ, γ-ГТ и ЩФ с приближением к контрольным значениям, более значительно возрастал уровень ЛДГ, превышая контрольный в 1,4 раза. Показатели АсАТ и ГБДГ наоборот, имели тенденцию к снижению. Уровень глюкозы достоверно понизился на первой неделе эксперимента, а к 3-й неделе нормализовался до физиологического значения (табл. 1, группа «УПП»).

С первых дней эксперимента отмечались изменения липидного профиля сыворотки крысы (группа «УПП»): снижались показатели общего ХС, ХС_ЛПВП и ХС_ЛПНП в среднем в 1,2 раза, незначительно повышались значения ХС_ЛПОНП. Вместе с тем коэффициент атерогенности находился в пределах нормальных значений. К 1-й неделе затравки отмечалось некоторое изменение данной динамики, выражавшееся в достоверном снижении по сравнению с контрольными показателями уровней ХС_ЛПВП почти в 2 раза, в меньшей степени ХС_ЛПОНП, ТГ и общего ХС - почти в 1,3 раза, значения последнего к 3-й неделе у контрольных и опытных животных выравнивались. Уровень ХС_ЛПНП, напротив, возрастал и к концу 3-й недели двукратно превышал контрольные значения. В связи с этим уже на ранних этапах воздействия на организм УПП отмечался высокий коэффициент атерогенности, превышавший контрольный показатель к 3 неделе почти в 3 раза (табл. 2, группа «УПП»).

В исследуемых органах животных (группа «УПП») на начальных этапах эксперимента наблюдались изменения в виде стромально-паренхиматозных дистрофий белкового характера в эпителиальном компоненте внутренних органов, а также компенсаторно-приспособительные реакции стромального компонента различной степени выраженности (компенсаторная гипертрофия мышечной ткани части сосудов и мышечного слоя бронхов и волокон сердца). На 3-й неделе исследования данные процессы усиливались, патологические изменения были минимально выражены, развивалась воспалительная инфильтрация иммунного характера, в некоторых органах - слабовыраженные фибропластические изменения, кроме того, включались механизмы длительной адаптации в динамике развития АС. В легких отмечалось активное поглощение частиц УПП макрофагами с начальными признаками формирования гранулем, в сердце резко выраженная гипертрофия мышечных волокон с повышением функциональной активности клеток, в печени - пролиферация клеток Купфера и формирование большого количества двухядерных гепатоцитов, в почках - расширение капсул Шумлянского-Боумена, ярко выраженная пролиферация клеток мезангия.

После 3-й недели эксперимента в сыворотке крови сохранялась тенденция снижения уровня АсАТ и ГБДГ с нормализацией показателей АлАТ и ЩФ (с незначительным превышением контрольных значений). Активность γ-ГТ и ЛДГ на 6-й неделе также была снижена, но возрастала к концу 9-й недели затравки. Уровень глюкозы сохранялся в пределах нормы (табл. 1, группа «УПП»).

Характер нарушений липидного обмена был аналогичен таковому на начальных этапах затравки УПП (табл. 2, группа «УПП»).

Шестая неделя эксперимента характеризовалась развитием в изучаемых органах, наряду с компенсаторными, более выраженных патологических изменений. В легких наблюдалось диффузное распространение склероза, развитие атрофии слизистой бронхов, в сердце - дистрофические и субатрофические изменения мышечных волокон с апоптотической активностью некоторых клеток, в печени - выраженная белковая дистрофия, разрастание фиброзной ткани с коллапсом стромы, в почках - дистрофия нефроэпителия с десквамацией, фибропластические изменения стромального компонента. По мере увеличения сроков затравки изменения прогрессировали.

На 12-й неделе эксперимента отмечалось снижение активности АсАТ в 1,2 раза; γ-ГТ в 1,4 раза; ЛДГ в 1,3 раза; ГБДГ в 2 раза, на фоне сохранения физиологических значений АлАТ и повышенной почти в 1,5 раза активности ЩФ по сравнению с контрольными показателями. Уровень глюкозы в сыворотке крови также несколько возрастал в 1,2 раза по сравнению с нормой (табл. 1). Наблюдалось усугубление дислипидемии. Показатели ХС_ЛПНП были повышены менее значительно, чем на предыдущих сроках (в 1,4 раза). Вместе с тем, отмечалось снижение общего ХС в 1,5 раза; ХС_ЛПОНП и ТГ в 1,3 раза; ХС_ЛПВП в 2,5 раза. Коэффициент атерогенности в 3 раза превышал контрольные значения (табл. 2, группа «УПП»).

К 12-й неделе эксперимента в легких отмечалось развитие выраженного пневмосклероза, атрофии слизистой бронхов, в сердце - диффузного кардиосклероза, дистрофии и атрофии мышечных волокон, в печени - дистрофических и некротических нарушений, а также фиброза портальных трактов, в почках - дистрофических изменений эпителия и нефросклероза. Стенки артерий и вен всех органов были утолщены за счет пролиферации гладкомышечного компонента их структурной основы медии. В большей части сосудов имелись склеротические и дистрофические изменения в стенках и в периваскулярных зонах.

У животных, получавших Цито-Реактор дигидрокверцетин (группа «УПП+ЦТ»), как и в группе без препарата (группа «УПП»), на 3-и сутки вдыхания УПП, в сыворотке крови отмечалось повышение активности ЛДГ и ГБДГ, соответственно в 1,6 и 1,7 раза. Уровень ЩФ был снижен. Остальные показатели находились в пределах нормы (табл. 1, группа «УПП+ЦТ»).

К концу 1-й недели затравки УПП на фоне применения ЦР активность АсАТ в сыворотке крови, крыс третьей группы, в отличие от показателей в группе без препарата, была снижена в 1,3 раза по сравнению с контрольными значениями. Уровень АлАТ на 1-й неделе был в 1,6 раз выше, чем в сравниваемой группе животных, оставаясь несколько сниженным относительно контрольного (в 1,2 раза). К 3-й неделе оба показателя достигали нормальных физиологических значений. На 6-й неделе эксперимента отмечался незначительный содружественный подъем их уровней с дальнейшим понижением до контрольных показателей. Значения ЩФ на 1-й неделе были в 1,3 раза выше, чем в группе без профилактики (группа «УПП»), но оставались ниже контрольных, на 3-й неделе показатели снижались, но при этом не опускались ниже контрольных значений, несколько повышаясь к 12-й неделе. Показатели γ-ГТ практически на всех сроках находились в пределах контрольных значений либо превышая их, незначительно снижаясь только на 6-й неделе. Также отмечалась нормализация уровня ЛДГ на тех сроках, на которых у группы без препарата (группа «УПП») происходило снижение его активности (1, 6 и 12 неделях эксперимента). Значения ГБДГ на 1-3 неделях были ниже контрольных. Подобная тенденция сохранялась до конца 12-й недели эксперимента, но, несмотря на это, показатели примерно в 2 раза превышали таковые в группе без профилактики (группа «УПП»). Уровень глюкозы в сыворотке крови на 1-й неделе эксперимента не отличался от контрольных значений, на остальных сроках в большей или меньшей степени превышал их, а также показатели в группе без препарата (группа «УПП») (табл. 1, группа «УПП+ЦТ»).

Назначение препарата оказало существенное положительное влияние на параметры липидного обмена. Уже на 3-и сутки эксперимента все исследуемые показатели находились в пределах контрольных значений, за исключением ХС_ЛПОНП, уровень которого, как и в группе без профилактики (группа «УПП»), в 1,3 раза превышал нормальный. На 1-й неделе затравки, как и в группе животных без препарата (группа «УПП»), отмечалось снижение в сыворотке крови уровня ХС_ЛПВП более чем в 2 раза, вместе с тем, уже к концу 3-й недели этот показатель возрастал, приближаясь к контрольным значениям и превышая в 1,5 раза значения в группе животных без профилактики (группа «УПП»), держался на этом уровне до окончания эксперимента, на 12-й неделе в 2 раза превышая показатели сравниваемой группы. Уровень ХС_ЛПНП на 1-3 неделях был приближен к контрольному, значительно повышался к 6 неделе в 1,7 раз, после этого срока поступательно снижался и к 12-й неделе не отличался от контрольных значений. Показатели общего ХС, как и в группе без препарата (группа «УПП»), на 1-й неделе были ниже контрольных почти в 1,5 раза, по мере увеличения длительности затравки значения возрастали и приближались к физиологическим, понижались только к концу эксперимента, но оставались в 1,2 раза выше, чем в группе животных без профилактики (группа «УПП»). Уровни ТГ и ХС_ЛПОНП с 1-й и до 9-й недели эксперимента (группа «УПП+ЦТ») значительно не отличались от контрольных показателей, после данного срока, как и в группе без препарата (группа «УПП»), эти значения снижались и были ниже контрольных в 1,4 раз и 1,2 раза, соответственно. В связи с улучшением показателей липидного обмена на фоне применения препарата, высокий коэффициент атерогенности отмечался только на 1-й неделе эксперимента, с 3 по 9 недели оставался повышен, но в гораздо меньшей степени, чем в группе животных без профилактики (группа «УПП»), и имел тенденцию к снижению. К 12-й неделе показатель достиг физиологических значений (табл.2, группа «УПП+ЦТ»).

Положительный эффект апробированной терапии проявился и на морфологическом уровне (группа «УПП+ЦТ»). Изменения в легких характеризовались более поздним (к 9-й неделе), по сравнению с группой животных, вдыхавших УПП, но не получавших препарат, формированием атрофии слизистой бронхов и фибропластических изменений, последние в основном носили только очаговый характер, респираторная поверхность была уменьшена менее значительно. В сердце, печени и почках к 9-й неделе отмечалось снижение выраженности дистрофических изменений соответственно мышечных волокон, гепатоцитов и эпителия канальцев с сохранением этой тенденции до 12-й недели. Кроме того, в печени наблюдалось почти полное исчезновение лимфоцитарной инфильтрации портальных трактов и отсутствие формирования некротических изменений до конца эксперимента.

Перечисленные положительные эффекты свидетельствуют о том, что патогенетически обусловленная, проведенная своевременно фармакологическая коррекция в виде назначения биологической добавки Цито-Реактор дигидрокверцетин, в условиях действия на организм УПП, способствует удлинению фазы долговременной адаптации, реализует антигипоксантный и антиоксидантный эффект; нормализует обмен веществ, снижает выраженность дистрофических и склеротических изменений в тканях, обусловливая, тем самым, органопротекторный эффект и может быть рекомендована в качестве одного из профилактических средств антракосиликоза.

Способ профилактики антракосиликоза при моделировании в эксперименте, создаваемого ежедневной затравкой угольно-породной пылью экспериментальных животных с одновременным назначением профилактического препарата, отличающийся тем, что в качестве профилактического препарата вводят в питание биологически активную добавку Цито-Реактор дигидрокверцетин в количестве 3 мг/кг массы тела экспериментального животного при продолжительности эксперимента 12 недель.