Способ получения молочной кислоты


 


Владельцы патента RU 2612152:

Общество с ограниченной ответственностью "БиоМИХМ" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения молочной кислоты на ферментационных средах предусматривает приготовление посевной, ферментационной и дополнительной сред с углеводной, белковой и солевой, содержащей соли калия, магния, марганца, аммония, частями, культивирование в посевных колбах и ферментере на основной ферментационной среде штамма-продуцента с внесением дополнительной ферментационной среды в ходе процесса культивирования, при поддержании величины pH, температуры культивирования, перемешивания. При этом ферментационную накопительную среду загружают в ферментер, объем которого в 5-10 раз превышает объем основного ферментера, длительность накопительной ферментации 12-24 ч. Накопленную биомассу отделяют в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, ресуспендируют в ферментационной доливной среде, переносят в основной ферментер, где культивируют в течение 2-3 ч с одновременной подачей дополнительной среды с титрующими агентами для поддержания pH аммиачной водой в случае получения лактата аммония или раствора гидроксида натрия в случае получения натрия лактата. Затем полностью сливают все содержимое ферментера и отделяют биомассу продуцента от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000. Биомассу продуцента ресуспендируют со следующей порцией ферментационной доливной среды и культивируют в очередном цикле. Количество циклов в основной ферментации составляет 10-20 циклов, фугат после отделения биомассы продуцента используют для дальнейшей переработки в молочную кислоту или соли молочной кислоты. В качестве штамма-продуцента используют молочнокислые микроорганизмы со скоростью образования молочной кислоты не менее 5 г/л·ч в периодическом процессе культивирования. Накопительная, доливная и дополнительная ферментационные питательные среды содержат в качестве источника углеводов ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полученный из крахмалсодержащего зернового сырья или отрубей влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом с выделением фракционированием крахмала А и В, с их ферментативным гидролизом полностью до глюкозы, в количестве 4-12% в ферментационной накопительной среде, 2-8% в ферментационной доливной среде и не менее 40% в дополнительной среде по глюкозе соответственно. Изобретение обеспечивает высокую скорость сбраживания сахаров и накопление высокой концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости. 1 з.п. ф-лы, 10 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения D-, L-, и DL-молочной кислоты, применяемой в пищевой промышленности в качестве стабилизатора pH и консерванта, в химической промышленности как сырье для получения полилактатов и других соединений, синтезируемых из молочной кислоты.

В настоящее время остро стоит вопрос производства биоразлагаемых упаковочных материалов, пластических масс, биоразлагаемых медицинских пластических материалов. Сырьем для этих производств служит молочная кислота, получаемая в результате сбраживания сахаров молочнокислыми микроорганизмами. От того, насколько быстро и экономично получение молочной кислоты, зависит рентабельность производства биоразлагаемых материалов.

Для того, чтобы обеспечить высокую скорость сбраживания сахаров и низкую себестоимость получаемой молочной кислоты, необходимо наличие возобновляемого дешевого источника сахаров и ростовых веществ и технологии культивирования молочнокислых микроорганизмов, при которой скорость образования молочной кислоты будет не ниже 25 г/л*час, а концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости по окончании процесса не менее 100 г/л.

Известен способ получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза (патент РФ №2306340, 2005 г.), где в качестве источника углеводов используется смесь тростникового сахара-сырца, рафинадной патоки и свекловичной мелассы, в качестве ростового фактора солодовые ростки в количестве 12-15 г/л, обработанные водой, подкисленной молочной кислотой до pH 4,0-5,0 и ферментным препаратом ксилоглюканофоетидином в количестве, соответствующем 200-600 ед./л ксиланазной активности. Среда содержит мел в количестве 60% от общего количества, рассчитанного для нейтрализации молочной кислоты, дрожжевой экстракт и питательные соли. Сбраживание осуществляется молочнокислыми бактериями Lactobacillus delbrueckii штамм Л-3.

Недостатком данного способа является применение в качестве источника углеводов сахара-сырца и рафинадной патоки, а также использование мела для нейтрализации молочной кислоты (что после выделения молочной кислоты приводит к накапливанию в значительных количествах гипса CaSO4), а также низкая скорость сбраживания и невысокая концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости.

Известно много способов культивирования молочнокислых микроорганизмов с возвратом биомассы (рецикл) продуцента молочной кислоты в основной ферментер после отделения от культуральной жидкости, однако при простых рециклах концентрация биомассы молочнокислых микроорганизмов не превышает 20-30 г/л.

Известен способ получения молочной кислоты (патент US 6,475,759 В1) в длительном процессе культивирования с рециклом биомассы продуцента молочной кислоты. Молочную кислоту (не соль молочной кислоты) получают с использованием в качестве штаммов-продуцентов мутантов, толерантных к низким значениям pH. Культивирование осуществляется при pH 2,5-4,5. В качестве источника углеводов используется глюкоза.

К недостаткам данного способа получения молочной кислоты следует отнести высокую стоимость сырья (кристаллической глюкозы) и необходимость использования специализированного ферментера и оборудования по концентрированию молочной кислоты, выдерживающих в течение длительного времени низкие значения pH (гуммированные, эмалированные или фторопластовые покрытия внутренних поверхностей, контактирующих с низким pH).

Наиболее близким к предлагаемому способу является патент WO 2012/140223 А1 (РСТ), где в качестве продуцентов молочной кислоты используется широкий круг молочнокислых микроорганизмов, в качестве источника углеводов указаны зерновые культуры, картофель, маис, в качестве ростовых веществ используются дрожжевой экстракт, пептон. В процессе получения молочной кислоты используется плотная культура продуцента с высокой концентрацией биомассы. Каждые 18-45 минут происходит отъем 2/3 культуральной жидкости из основного ферментера, фильтрация культуральной жидкости мембранными методами (мембранный ферментер или выносная ячейка ультра- или нанофильтрации), возврат биомассы продуцента в основной ферментер со свежей порцией питательной среды. Для снижения роста культуры продуцента и направления биомассы на сбраживание сахаров, а не на рост клеток, в питательную среду и доливную среду вносят антибиотики.

Недостатком данного способа является отсутствие ферментативного гидролиза крахмалсодержащего сырья до глюкозы, т.к многие молочнокислые микроорганизмы не имеют активных экзогенных амилолитических ферментов. Применение для отделения от культуральной жидкости мембранных методов приводит к образованию большого количества стоков, т.к. клетки молочнокислых культур быстро забивают поры фильтрующего материала, скорость фильтрации падает. При мембранных методах отделения биомассы происходит травмирование и частичная гибель клеток культуры-продуцента за счет большой энергии сдвига. Внесение в питательную среду антибиотиков для снижения скорости роста молочнокислых микроорганизмов делает невозможным использование биомассы продуцента в дальнейшем в виде вторичного кормового продукта.

Задачей настоящего изобретения является биосинтез молочной кислоты с высокой скоростью сбраживания сахаров и накоплением высокой концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости в виде соли, доступной для получения молочной кислоты без образования гипса, либо соли, обеспечивающей при дальнейшей обработке полимеризацию молочной кислоты, с возможностью использования биомассы продуцента молочной кислоты для получения вторичного продукта кормового назначения.

Поставленная задача достигается тем, что:

- ферментационную среду загружают в накопительный ферментер, объем которого в 5-10 раз превышает объем основного ферментера, стерилизуют при 120°C в течение 40 мин, охлаждают до температуры культивирования, вносят посевной материал в количестве 15-20% от объема ферментационной среды в накопительном ферментере, длительность накопительной ферментации - 12-24 часа, накопленную биомассу отделяют в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, ресуспендируют в доливной среде, переносят в основной ферментер, где культивируют в течение 2-3 часов с одновременной подачей дополнительной среды (подпитки), содержащей ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полученный из крахмалсодержащего зернового сырья или отрубей влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом по патенту №2586734 с выделением фракционированием крахмала А и В, с двухстадийным ферментативным гидролизом альфа-амилазами и глюко-амилазами полностью до глюкозы (далее ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы), имеющий следующие характеристики: СВ - не менее 44%, концентрация глюкозы - не менее 40%, с титрующими агентами для поддержания pH аммиачной водой в случае получения лактата аммония или раствора гидроксида натрия в случае получения лактата натрия, затем полностью сливают все содержимое ферментера и отделяют биомассу продуцента от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, биомассу продуцента ресуспендируют со следующей порцией доливной среды и культивируют в очередном цикле, количество циклов в основной ферментации - 10-20 циклов, фугат после отделения биомассы продуцента используют для дальнейшей переработки в молочную кислоту или полилактаты; в качестве штамма-продуцента используют молочнокислые микроорганизмы, обладающие средней скоростью образования молочной кислоты не менее 5 г/л*час в периодическом процессе культивирования; ферментационная, доливная и дополнительная питательные среды содержат в качестве источника углеводов ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полученный из крахмалсодержащего зернового сырья или отрубей влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом с выделением фракционированием крахмала А и В, с двухстадийным ферментативным гидролизом альфа-амилазами и глюко-амилазами полностью до глюкозы, в количестве 4-12% в ферментационной среде, 2-8% в доливной среде и не менее 40% в дополнительной среде (подпитке) по глюкозе соответственно; после 10-20-го цикла во всех последующих циклах осуществляется промывка влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов после отделения ее от культуральной жидкости стерильной водопроводной водой в соотношении 1:1 с количеством влажной биомассы, отделение биомассы продуцента от промывной воды в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, возврат биомассы продуцента для проведения последующих циклов ферментации и объединение фугата после промывки биомассы стерильной водопроводной водой с фугатом культуральной жидкости после отделения биомассы продуцента перед стадией выделения молочной кислоты.

Получение изомеров молочной кислоты зависит от свойств выбранного штамма-продуцента молочной кислоты, заложенных генетически. Штаммы-продуценты молочной кислоты, могут сбраживать сахара в рацематную смесь D-, L-молочной кислоты или сбраживать сахара преимущественно в D-молочную кислоту или L-молочную кислоту, тогда содержание преимущественного изомера составляет не менее 90%.

Сущность предлагаемого способа получения молочной кислоты заключается в следующем:

- культуру продуцента молочной кислоты с агаризованной питательной среды переносят в посевную питательную среду, содержащую в качестве источника углеводов ферментолизат крахмала, полученный из крахмалсодержащего зернового сырья или отрубей влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом с выделением фракционированием крахмала А и В, отличающихся строением (амилопектин - крахмал А, и амилоза - крахмал В) и молекулярной массой, затем крахмал А и B в две стадии ферментативного гидролиза ферментами альфа-амилазами и глюко-амилазами полностью гидролизуют до глюкозы (далее ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы), полученный ферментолизат имеет следующие характеристики: СВ - не менее 44%, концентрация глюкозы - не менее 40%; в качестве ростовых веществ - дрожжевой экстракт или упаренный до содержания сухих веществ 50% ферментолизат зернового белка, получаемый ферментативным гидролизом протеазами зернового белка, полученного после отделения зерновых оболочек и крахмала А и В при глубокой переработке зернового сырья влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом, содержащий не менее 50% зернового белка, из которых не менее 10% от общего количества белка составляют аминокислоты (далее ферментолизат зернового белка); соли калия, магния, марганца, аммония и культивируют в колбах на качалке при температуре, оптимальной для данного штамма-продуцента, и числе оборотов качалки, обеспечивающем микроаэробные условия культивирования в течение 20-24 часов;

- полученным посевным материалом в количестве 15-20% засевают накопительный ферментер с ферментационной средой, содержащей в качестве источника углеводов ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы, в качестве ростовых веществ - дрожжевой экстракт или ферментолизат зернового белка, соли калия, магния, марганца, аммония и культивируют в течение 12-24 часов для накопления биомассы молочнокислых микроорганизмов; объем накопительного ферментера должен быть в 5-10 раз больше, чем основного рабочего ферментера;

- полученную культуральную жидкость из накопительного ферментера обрабатывают в асептических условиях в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000 и отделенную биомассу молочнокислых микроорганизмов переносят в рабочий ферментер меньшего объема таким образом, чтобы концентрация биомассы в рабочем ферментере составила не менее 50 г/л сухой биомассы (СБ), биомассу смешивают с доливной средой, содержащей в качестве источника углеводов ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы, в качестве ростовых веществ дрожжевой экстракт или ферментолизат зернового белка, соли калия, магния, марганца, аммония, культивируют в течение 2-3 часов в оптимальных для процесса сбраживания условиях (поддерживая необходимые pH, температуру, число оборотов мешалки), начиная внесение дополнительной питательной среды, состоящей из стерильного ферментолизата крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы, с содержанием РВ не менее 40% сразу после смешения биомассы и доливной среды, ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы задают в течение 1-2 часов цикла;

- после 2-3 часов культивирования в основном аппарате концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости составляет не менее 120 г/л, а средняя скорость синтеза молочной кислоты - не менее 50 г/л*час;

- культуральную жидкость из основного ферментера сливают полностью и обрабатывают в асептических условиях в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, отделенную биомассу молочнокислых микроорганизмов возвращают в основной ферментер, где смешивают со следующей порцией доливной среды и повторяют 2-3 часовой цикл культивирования;

- количество циклов зависит от выбранного штамма - продуцента и составляет 10-20 циклов;

- фильтрат, содержащий соль молочной кислоты, поступает на стадию выделения молочной кислоты или на дальнейшую переработку в полилактат;

- для увеличения количества циклов, которые возможно провести с использованием одной порции биомассы после накопительного ферментера, после проведения 10-20 первых циклов культивирования биомассу продуцента молочной кислоты после каждого отделения смешивают в соотношении 1:1 со стерильной водопроводной водой для дополнительного удаления ингибирующих получение молочной кислоты продуктов метаболизма;

- после промывки биомассу продуцента отделяют в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, биомассу продуцента возвращают в основной ферментер для проведения следующего цикла ферментации;

- промывку (фугат после промывки биомассы) объединяют с фугатом культуральной жидкости, т.к. концентрация молочной кислоты в промывке - не менее 50 г/л, это увеличивает съем молочной кислоты за один цикл на 5-10%;

- по окончании культивирования (при снижении скорости образования молочной кислоты ниже 25 г/л*час) образовавшуюся биомассу продуцента молочной кислоты высушивают и получают вторичный продукт (пробиотик);

Сущность предлагаемой технологии раскрывается, но не исчерпывается в приведенных примерах.

По пункту 1.

Пример №1.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 3,2 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное
pH до стерилизации 6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 20 л с 11,0 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 1,8 л ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованного до глюкозы с содержанием глюкозы 41,3%, 3,2 л посевного материала из колб и культивируют в течение 12 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 40,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,2
MnSO4 0,2
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 12,0%-ной аммиачной водой, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 3000, супернатант с концентрацией соли молочной кислоты 38 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 80,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 15,0
(NH4)2SO4 4.0
KH2PO4 1,5
MgSO4 1,0
MnSO4 1,0
Аммоний лимоннокислый 3,0
Натрий уксуснокислый 1,0
вода водопроводная остальное

Ферментационная дополнительная питательная среда - ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 1,2 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 1,5 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 2 л при температуре 30°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором аммиака (25%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 67 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу дополнительной ферментационной среды - ферментолизата крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованного до глюкозы, с постоянной скоростью 25 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 1,5 часа) цикла прекращают подачу дополнительной ферментационной среды. Через 2 часа ферментации культуральную жидкость сливают полностью, отделяют биомассу в центробежном поле при факторе разделения 3000, биомассу направляют для смешивания с ферментационной доливной средой и культивирования в следующем цикле; культуральная жидкость перед отделением биомассы содержит 120 г/л D-L соли молочной кислоты (при культивировании указанного штамма происходит образование рацематной смеси изомеров молочной кислоты), средняя скорость образования молочной кислоты - 60 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 1,8 л и 216 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

За 20 циклов съем культуральной жидкости составляет 36 л и 4320 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 13 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 23 л раствора лактата аммония с концентрацией лактата аммония 150,3 г/л. Из лактата аммония известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №2.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 0,8 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное
pH до стерилизации 6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 5 л с 2,75 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 0,9 л ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованного до глюкозы, 0,8 л посевного материала из колб и культивируют в течение 24 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 120,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,8
KH2PO4 0,6
MgSO4 0,4
MnSO4 0,4
Аммоний лимоннокислый 4,0
Натрий уксуснокислый 1,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 12,0%-ной аммиачной водой, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 2700, супернатант с концентрацией аммония молочнокислого 110 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 80,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 15,0
(NH4)2SO4 4,0
KH2PO4 1,5
MgSO4 1,0
MnSO4 1,0
Аммоний лимоннокислый 3,0
Натрий уксуснокислый 1,0
вода водопроводная остальное

Ферментационная дополнительная среда - ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 0,6 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 0,75 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 1 л при температуре 30°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором аммиака (25%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 85 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды - ферментолизата крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованного до глюкозы, с постоянной скоростью 75 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 2,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 3 часа ферментации культуральную жидкость сливают полностью, отделяют биомассу в центробежном поле при факторе разделения 2700, биомассу направляют для смешивания с ферментационной доливной средой и культивирования в следующем цикле; культуральная жидкость перед отделением биомассы содержит 198 г/л D-L соли молочной кислоты, средняя скорость образования молочной кислоты - 66 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 0,9 л и 178,2 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

За 10 циклов съем культуральной жидкости составляет 9 л и 1782 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 4,25 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 4,75 л раствора лактата аммония с концентрацией лактата аммония 330,1 г/л. Из лактата аммония известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №3.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 3,2 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ) 25,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное
pH до стерилизации 6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 20 л с 11,0 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 1,8 л ферментолизат крахмала полностью гидролизованного до глюкозы, 3,2 л посевного материала из колб и культивируют в течение 12 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 40,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ) 35,0
(NH4)2SO4 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,2
MnSO4 0,2
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 20% раствором гидроксида натрия, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 3000, супернатант с концентрацией соли молочной кислоты 33 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 80,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ) 25,0
(NH4)2SO4 4.0
KH2PO4 1,5
MgSO4 1,0
MnSO4 1,0
Аммоний лимоннокислый 3,0
Натрий уксуснокислый 1,0
вода водопроводная остальное

Ферментационная дополнительная питательная среда - ферментолизат крахмала, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 1,2 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 1,5 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 2 л при температуре 30°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором гидроксида натрия (40%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 67 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды - ферментолизата крахмала, полностью гидролизованного до глюкозы, с постоянной скоростью 25 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 1,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 2 часа ферментации культуральную жидкость сливают полностью, отделяют биомассу в центробежном поле при факторе разделения 3000, биомассу направляют для смешивания с ферментационной доливной средой и культивирования в следующем цикле; культуральная жидкость перед отделением биомассы содержит 120 г/л D-L соли молочной кислоты, средняя скорость образования молочной кислоты - 60 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 1,8 л и 216 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

За 20 циклов съем культуральной жидкости составляет 36 л и 4320 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 13,4 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 22,6 л раствора лактата натрия с концентрацией лактата натрия 152,9 г/л. Из лактата нватрия известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №4.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 10,8 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ) 25,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное
pH до стерилизации 6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 5 л с 2,75 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 0,45 л ферментолизат крахмала, гидролизованного полностью до глюкозы, 0,8 л посевного материала из колб и культивируют в течение 24 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 120,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ) 35,0
(NH4)2SO4 0,8
KH2PO4 0,6
MgSO4 0,4
MnSO4 0,4
Аммоний лимоннокислый 4,0
Натрий уксуснокислый 1,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 20% раствором гидроксида натрия, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 2700, супернатант с концентрацией натрия молочнокислого 106 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 20,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ) 25,0
(NH4)2SO4 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,2
MnSO4 0,2
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное

Ферментационная дополнительная среда - ферментолизат крахмала, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 0,6 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 0,75 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 1 л при температуре 30°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором гидроксида натрия (40%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 85 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды-ферментолизата крахмала, гидролизованного полностью до глюкозы, с постоянной скоростью 75 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 2,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 3 часа ферментации культуральную жидкость сливают полностью, отделяют биомассу в центробежном поле при факторе разделения 3000, биомассу направляют для смешивания с ферментационной доливной средой и культивирования в следующем цикле; культуральная жидкость перед отделением биомассы содержит 183 г/л D-L соли молочной кислоты, средняя скорость образования молочной кислоты - 61 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 0,9 л и 164,7 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

За 10 циклов съем культуральной жидкости составляет 9 л и 1647,0 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 4,25 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 4,75 л раствора лактата натрия с концентрацией лактата натрия 277,3 г/л. Из лактата натрия известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №5.

Культуру Lactobacillus delbrueckii В-3964 БП-28 с агаризованной среды переносим в 3,2 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе,
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное
pH до стерилизации 6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 40°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 20 л с 11,0 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 40°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 1,8 л ферментолизат крахмала, 3,2 л посевного материала из колб и культивируют в течение 12 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 40,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,2
MnSO4 0,2
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 12,0%-ной аммиачной водой, температура культивирования 40°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 3000, супернатант с концентрацией соли молочной кислоты 35 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 80,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 8,5
(NH4)2SO4 4.0
KH2PO4 1,5
MgSO4 1,0
MnSO4 1,0
Аммоний лимоннокислый 3,0
Натрий уксуснокислый 1,0
вода водопроводная остальное

Ферментационная дополнительная среда - ферментолизат крахмала, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 1,2 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 1,5 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 2 л при температуре 40°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором аммиака (25%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 78 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды - ферментолизата крахмала, гидролизованного полностью до глюкозы, с постоянной скоростью 25 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 1,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 2 часа ферментации культуральная жидкость содержит 132 г/л соли D-молочной кислоты (указанный штамм образует преимущественно D-молочную кислоту, количество которой составляет не менее 85% от общего количества молочной кислоты), средняя скорость образования молочной кислоты - 66 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 1,8 л и 237,6 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

За 20 циклов съем культуральной жидкости составляет 36 л и 4752 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 15,6 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 20,4 л раствора лактата аммония с концентрацией лактата аммония 186,4 г/л. Из лактата аммония известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №6.

Культуру Lactobacillus plantarum В5002 337D с агаризованной среды переносим в 0,8 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ) 25,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное
pH до стерилизации 6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 37°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 5 л с 2,75 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 37°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 0,9 л ферментолизат крахмала, 0,8 л посевного материала из колб и культивируют в течение 24 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 120,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ) 35,0
(NH4)2SO4 0,8
KH2PO4 0,6
MgSO4 0,4
MnSO4 0,4
Аммоний лимоннокислый 4,0
Натрий уксуснокислый 1,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 12,0%-ной аммиачной водой, температура культивирования 37°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 2700, супернатант с концентрацией аммония молочнокислого 115 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 20,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ) 25,0
(NH4)2SO4 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,2
MnSO4 0,2
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное

Ферментационная дополнительная среда - ферментолизат крахмала, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 0,6 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 0,75 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 1 л при температуре 37°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором аммиака (25%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 63 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды - ферментолизата крахмала, гидролизованного полностью до глюкозы, с постоянной скоростью 75 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 2,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 3 часа ферментации культуральная жидкость содержит 155 г/л соли D-молочной кислоты (данный штамм образует преимущественно D-молочную кислоту с содержанием ее не менее 90% от общего количества молочной кислоты), средняя скорость образования молочной кислоты - 52 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 0,9 л и 139,5 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

За 10 циклов съем культуральной жидкости составляет 9 л и 1395 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 3,15 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 5,85 л раствора лактата аммония с концентрацией лактата аммония 190,8 г/л. Из лактата аммония известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №7.

Культуру Lactococcus lactis subsp. В4856-LMO230 rif.r с агаризованной среды переносим в 3,2 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное
pH до стерилизации 7,3-7,4

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 20 л с 11,0 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 7,1, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 1,8 л ферментолизат крахмала, 3,2 л посевного материала из колб и культивируют в течение 12 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 40,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,2
MnSO4 0,2
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 7,1 20% раствором гидроксида натрия, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 3000, супернатант с концентрацией соли молочной кислоты 37 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 80,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 15,0
(NH4)2SO4 4.0
KH2PO4 1,5
MgSO4 1,0
MnSO4 1,0
Аммоний лимоннокислый 3,0
Натрий уксуснокислый 1,0
вода водопроводная остальное

Дополнительная питательная среда - ферментолизат крахмала, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 1,2 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 1,5 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 2 л при температуре 30°C, pH 7,1 поддерживают концентрированным раствором гидроксида натрия (40%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 80 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды-ферментолизата крахмала, гидролизованного полностью до глюкозы, с постоянной скоростью 25 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 1,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 2 часа ферментации культуральная жидкость содержит 135 г/л соли L-молочной кислоты (культура вырабатывает преимущественно L-молочную кислоту с содержанием 95% L-молочной кислоты от общего количества молочной кислоты), средняя скорость образования молочной кислоты - 67,5 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 1,8 л и 243 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

За 20 циклов съем культуральной жидкости составляет 36 л и 4860 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 16,0 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 20,0 л раствора лактата натрия с концентрацией лактата натрия 194,4 г/л. Из лактата натрия известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №8.

Культуру Streptococcus thermophilus В2241-12kc с агаризованной среды переносим в 0,8 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка 15,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное
pH до стерилизации 7,3-7,4

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 40°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 5 л с 2,75 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 40°C, pH 7,1, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 0,45 л ферментолизат крахмала, 0,8 л посевного материала из колб и культивируют в течение 24 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 120,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка 25,0
(NH4)2SO4 0,8
KH2PO4 0,6
MgSO4 0,4
MnSO4 0,4
Аммоний лимоннокислый 4,0
Натрий уксуснокислый 1,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 7,1 20% раствором гидроксида натрия, температура культивирования 40°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 2700, супернатант с концентрацией натрия молочнокислого 112 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 20,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка 15,0
(NH4)2SO4 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,2
MnSO4 0,2
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное

Ферментационная дополнительная среда - ферментолизат крахмала, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 0,6 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 0,75 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 1 л при температуре 40°C, pH 7,1 поддерживают концентрированным раствором гидроксида натрия (40%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 95 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды-ферментолизата крахмала, гидролизованного полностью до глюкоз, с постоянной скоростью 75 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 2,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 3 часа ферментации культуральная жидкость содержит 191 г/л соли L-молочной кислоты (культура вырабатывает преимущественно L-молочную кислоту с содержанием 90% L-молочной кислоты от общего количества молочной кислоты), средняя скорость образования молочной кислоты - 63,7 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 0,9 л и 171,9 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

За 10 циклов съем культуральной жидкости составляет 9 л и 1719 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 4,75 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 4,25 л раствора лактата натрия с концентрацией лактата натрия 311,8 г/л. Из лактата натрия известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

По пункту 2.

Пример №1.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 3,2 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная - остальное
pH до стерилизации 6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 20 л с 11,0 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5ати с выдержкой 30 мин 1,8 л ферментолизат крахмала, 3,2 л посевного материала из колб и культивируют в течение 12 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 40,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,2
MnSO4 0,2
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 12,0%-ной аммиачной водой, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин. По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 3000, супернатант с концентрацией соли молочной кислоты 38 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 80,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 25,0
(NH4)2SO4 4.0
KH2PO4 1,5
MgSO4 1,0
MnSO4 1,0
Аммоний лимоннокислый 3,0
Натрий уксуснокислый 1,0
вода водопроводная остальное

Дополнительная питательная среда - ферментолизат крахмала, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 1,2 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 1,5 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 2 л при температуре 30°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором аммиака (25%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 67 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды - ферментолизата крахмала, гидролизованного полностью до глюкозы, с постоянной скоростью 25 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%).

За полчаса до окончания (через 1,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 2 часа ферментации культуральная жидкость содержит 120 г/л соли D-L молочной кислоты, средняя скорость образования молочной кислоты - 60 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 1,8 л и 216 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

За 20 циклов съем культуральной жидкости составляет 36 л и 4320 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

После двадцатого цикла влажную биомассу продуцента смешивают со стерильной водопроводной водой в соотношении 1:1, затем центрифугируют при факторе разделения 3000 в асептических условиях. Полученный фугат в количестве 300 мл с концентрацией молочной кислоты 55 г/л объединяют с фугатом культуральной жидкости.

Съем культуральной жидкости за двадцать первый цикл составляет 2,21 л и 232 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Осуществляют аналогично 130 циклов ферментации. Суммарный съем за 150 циклов составляет 323,3 л и 34,48 кг аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 120,3 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 203,0 л раствора лактата аммония с концентрацией лактата аммония 169,8 г/л. Из лактата аммония известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №2.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 0,8 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 15,0 по глюкозе,
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,2
KH2PO4 0,15
MgSO4 0,1
MnSO4 0,1
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная остальное
pH до стерилизации 6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 5 л с 2,75 л ферментационной накопительной среды без углеродной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 0,9 л ферментолизат крахмала, 0,8 л посевного материала из колб и культивируют в течение 24 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 120,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,8
KH2PO4 0,6
MgSO4 0,4
MnSO4 0,4
Аммоний лимоннокислый 4,0
Натрий уксуснокислый 1,5
вода водопроводная остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 12,0%-ной аммиачной водой, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин. По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 2700, супернатант с концентрацией аммония молочнокислого 110 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы 20,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт 35,0
(NH4)2SO4 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,2
MnSO4 0,2
Аммоний лимоннокислый 2,0
Натрий уксуснокислый 0,5
вода водопроводная - остальное

Ферментационная дополнительная среда - ферментолизат крахмала, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 0,6 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 0,75 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 1 л при температуре 30°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором аммиака (25%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 85 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды - ферментолизата крахмала, гидролизованного полностью до глюкозы, с постоянной скоростью 75 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 2,5 часа) цикла прекращают подачу подпитки. Через 3 часа ферментации культуральная жидкость содержит 150 г/л соли D-L молочной кислоты, средняя скорость образования молочной кислоты - 60 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 0,9 л и 135 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

За 10 циклов съем культуральной жидкости составляет 9 л и 1350 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

После десятого цикла влажную биомассу продуцента смешивают со стерильной водопроводной водой в соотношении 1:1, затем центрифугируют при факторе разделения 2700 в асептических условиях. Полученный фугат в количестве 150 мл с концентрацией молочной кислоты 65 г/л объединяют с фугатом культуральной жидкости. Съем культуральной жидкости за одиннадцатый цикл составляет 1,05 л и 144,7 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Осуществляют аналогично 40 циклов ферментации. Суммарный съем за 50 циклов составляет 51 л и 7,14 кг аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 24,1 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 27,0 л раствора лактата аммония с концентрацией лактата аммония 211,6 г/л. Из лактата аммония известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

1. Способ получения молочной кислоты на ферментационных средах, предусматривающий приготовление посевной, ферментационной и дополнительной сред с углеводной, белковой и солевой, содержащей соли калия, магния, марганца, аммония, частями, культивирование в посевных колбах и ферментере на основной ферментационной среде штамма-продуцента с внесением дополнительной ферментационной среды в ходе процесса культивирования, при поддержании величины pH, температуры культивирования, перемешивания, отличающийся тем, что ферментационную накопительную среду загружают в ферментер, объем которого в 5-10 раз превышает объем основного ферментера, длительность накопительной ферментации - 12-24 часа, накопленную биомассу отделяют в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, ресуспендируют в ферментационной доливной среде, переносят в основной ферментер, где культивируют в течение 2-3 часов с одновременной подачей дополнительной среды, содержащей ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы, с титрующими агентами для поддержания pH аммиачной водой в случае получения лактата аммония или раствора гидроксида натрия в случае получения натрия лактата, затем полностью сливают все содержимое ферментера и отделяют биомассу продуцента от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, биомассу продуцента ресуспендируют со следующей порцией ферментационной доливной среды и культивируют в очередном цикле, количество циклов в основной ферментации - 10-20 циклов, фугат после отделения биомассы продуцента используют для дальнейшей переработки в молочную кислоту или полилактаты; в качестве штамма-продуцента используют молочнокислые микроорганизмы, обладающие средней скоростью образования молочной кислоты не менее 5 г/л·ч в периодическом процессе культивирования; накопительная, доливная и дополнительная ферментационные питательные среды содержат в качестве источника углеводов ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полученный из крахмалсодержащего зернового сырья или отрубей влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом с выделением фракционированием крахмала А и В, с их ферментативным гидролизом полностью до глюкозы, в количестве 4-12% в ферментационной накопительной среде, 2-8% в ферментационной доливной среде и не менее 40% в дополнительной среде по глюкозе соответственно.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после 10-20-го цикла во всех последующих циклах осуществляется промывка влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов после отделения ее от культуральной жидкости стерильной водопроводной водой в соотношении 1:1 с количеством влажной биомассы, отделение биомассы продуцента от промывной воды проводят в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, возвращают биомассу продуцента для проведения последующих циклов ферментации и объединяют промывной фугат с фугатом культуральной жидкости перед стадией выделения молочной кислоты.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом(ами) путем непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом(ами) посредством непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом (микроорганизмами) путем непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ превращения лигноцеллюлозы в органическую кислоту.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы получения молочной кислоты, получения лактида и получения полимолочной кислоты.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен полипептид D-лактатдегидрогеназы, который содержит полипептид с аминокислотной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне не менее 80% с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, раскрытые в описании, где указанный полипептид обладает D-лактатдегидрогеназной активностью.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041, являющийся продуцентом молочной кислоты.

Изобретение относится к биотехнологии пищевых продуктов и может быть использовано при переработке растворов брожения с получением молочной кислоты. Способ извлечения молочной кислоты из растворов брожения включает экстракцию молочной кислоты солью четвертичного аммониевого основания в разбавителе и реэкстракцию кислоты, причем экстракцию ведут солью четвертичного аммониевого основания в сульфатной форме [(R4N)2SO4], где R представляет собой алкильный или арильный радикал, в присутствии п-третичных алкилфенолов при молярном соотношении (R4N)2SO4 : п-третичные алкилфенолы, равном соответственно 1:2, при значении рН раствора 5,0-7,0, реэкстракцию кислоты проводят растворами гидроксида натрия, а регенерацию экстрагента осуществляют его обработкой стехиометрическим количеством серной кислоты.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения высококонцентрированных очищенных лактатсодержащих растворов, в частности высококонцентрированных очищенных растворов молочной кислоты и ее солей, на основе культуральной жидкости, полученной в результате культивирования клеток микроорганизмов.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза. .

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии. Штамм микромицета Penicillium vulpinum, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером F-1523.

Предложена композиция инокулята для усиления роста растения, подходящая для покрытия семян. Указанная композиция содержит агрономически приемлемый носитель и по меньшей мере один штамм Bradyrhizobia japonicum.

Предложен способ первичной идентификации микобактерий комплекса М. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий.

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и медицины, в частности к способу получения рекомбинантного противоопухолевого токсина - химерного бифункционального белка, состоящего из адресного полипептида Darpin 9-29, специфичного к гистохимическому маркеру HER2/neu, и высокоактивной бактериальной рибонуклеазы барназы, соединенных гибким пептидным линкером.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, в частности к биопрепаратам и микробным композициям для деградации органических отходов, и может быть использовано для быстрой, эффективной переработки органических отходов быта человека, животноводства и птицеводства в качественное органическое удобрение.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молочной промышленности, медицине и ветеринарии. Предложенный штамм бактерий Lactobacillus acidophilus ЛИА-Т-193 обладает высокой кислотообразующей активностью.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Штамм Lactobacillus paracasei 1 обладает высокой антагонистической активностью, высоким уровнем кислотообразования, повышенными адгезивными свойствами, устойчивостью к ряду антибиотических препаратов и высокой скоростью накопления биомассы.

Изобретения относятся к области биохимии. Предложен способ обнаружения присутствия термостойких микроорганизмов в пищевом продукте, а также способ обнаружения присутствия в пищевом продукте термостойких микроорганизмов и общего количества микроорганизмов для их сравнения.
Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение при улучшении плодородия почв в биологическом земледелии. Смешивают остатки содержимого рубца убойного скота жвачных животных, содержащего микроорганизмы и патоку в соотношении 1:10.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus paracasei MCC1849, обладающий высокой стимулирующей продуцирование IL-12 активностью.

Группа изобретений относится к композиции для применения в качестве активатора брожения, способу ее получения и активатору брожения типа стартера. Предложенная композиция содержит равномерно покрытую биомассой штамма бактерии Lactobacillus casei CNCM MA43/6V подложку, представляющую собой дрожжи Saf-Instant с содержанием 95,5% сухого вещества. Причем биомасса штамма бактерии Lactobacillus casei CNCM MA43/6V составляет от 10 до 30% в сухом веществе от общего содержания сухого вещества покрытой подложки. Способ получения композиции предусматривает введение указанной подложки в смеситель, через который проходит восходящий поток нагретого воздуха, нанесение на подложку путем распыления суспензии биомассы штамма бактерии Lactobacillus casei CNCM МА43/6 V, содержащей более 5% сухого вещества бактерий, высушивание потоком нагретого воздуха, температуру и расход которого устанавливают таким образом, чтобы температура указанной суспензии не превышала 40°С, с получением указанной композиции. Предложен также активатор брожения типа стартера, содержащий указанную композицию. Группа изобретений обеспечивает получение композиции с процентом смертности бактерий, ниже или равном 0,5 log КОЕ/г, после хранения в течение одного года при 20°С в вакууме и/или после хранения в течение одного года при 4°С в присутствии воздуха. После хранения в вакууме в течение одного года при 20°С в ходе испытания на подкисление в среде с мальтозой по истечении 3 ч композиция характеризуется снижением рН от 6,5 до 5,7. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 3 пр.
Наверх