Жидкие композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа


 


Владельцы патента RU 2613905:

ХАНМИ САЙЕНС КО., ЛТД. (KR)

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается жидкой композиции (варианты), в которой длительно действующий конъюгат INFα и Fc-фрагмента иммуноглобулина ковалентно связаны посредством непептидного полимера, и включает стабилизатор, содержащий буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство, при этом не содержит человеческого альбумина сыворотки и других потенциальных факторов, вредных для организма. Заявлен также способ получения жидкой композиции и стабилизатор. Группа изобретений обеспечивает превосходную стабильность при хранении длительно действующих конъюгатов INFα, который обладает улучшенной длительностью и стабильностью in vivo, можно стабильно хранить в течение длительного периода времени. 7 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 пр., 12 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к жидкой композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа, включающей фармацевтически эффективное количество конъюгата интерферона альфа, и стабилизатор без альбумина, содержащий буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интерферон был открыт Isaacs и Lindenmann, которые обнаружили фактор, влияющий на вирус гриппа A, при инфицировании вирусом цыпленка, в 1957 (Isaacs, K. and Lindenmann, J., Proc. R. Soc. Lond., B147, 258-267 (1957)). Человеческие интерфероны представляют собой белки, известные как цитокины, которые осуществляют коммуникацию между клетками, посредством чего могут запускаться защитные силы иммунной системы, которая убивает патогенные микроорганизмы, такие как вирусы. В зависимости от типов клеток, которые их высвобождают, интерфероны классифицируют на интерферон альфа, интерферон бета и интерферон гамма (Kirchner, H., et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41, 89-93(1981): Stanton, G. J., et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41, 84-88(1981)). То есть интерферон альфа высвобождается из B лимфоцитов, интерферон бета из обычных лимфоцитов и макрофагов и интерферон гамма из T лимфоцитов с помощью макрофагов.

Сообщалось, что интерфероны проявляют противовирусную активность, противораковую активность, активируют клетки NK (натуральные киллеры), и синергически ингибируют рост миелоцитов (Klimpel, et al., J. Immunol., 129, 76-78(1982); Fleischmann, W. R., et al., J. Natl. Cancer Inst., 65, 863-966(1980); Weigent., et al., Infec. Immun., 40, 35-38(1980)). С того времени в большом количестве исследований было обнаружено, что в добавление к проявлению противовирусных эффектов, интерфероны действуют как регуляторные факторы экспрессии, структуры и функции генов в клетках, особенно с непосредственным антипролиферативным действием. Кроме того, функцией интерферонов является борьба с различными заболеваниями, вызываемыми инфекциями, и различными опухолями.

Интерферон альфа образуется в клетках лейкоцитах после воздействия митогенов, вирусов или опухолевых клеток. К сегодняшнему дню обнаружено мультигенное семейство из, по меньшей мере, 20 генов интерферона альфа и известно, что они кодируют полипептиды, большинство из которых состоит из 165 или 166 аминокислот.

Клинические исследования продемонстрировали, что рекомбинантный человеческий интерферон альфа является эффективным в лечении различных солидных раков. В частности, известно, что интерферон альфа обладает эффективным терапевтическим эффектом при раке мочевого пузыря, раке почки и ассоциированной с ВИЧ саркоме Капоши (Torti, F.M., J. Clin. Oncol., 6, 476-483(1988); Vugrin, D., et al., Cancer Treat. Rep., 69, 817-820(1985); Rios, A., et al., J. Clin. Oncol., 3, 506-512(1985)). Кроме того в недавних отчетах сообщают, что интерферон альфа является терапевтически применимым в лечении гепатита типа С (Davis, G. G., et al., N. Engl. J. Med., 321, 1501-1506(1989)). На основании таких новых открытий, терапевтическая область интерферона альфа становится шире.

Полипептиды, такие как интерферон альфа, имеют тенденцию к легкой денатурации из-за их низкой стабильности, разлагаются протеолитическими ферментами в крови и легко проходят через почки или печень. Следовательно, белковые лекарственные средства, включая полипептиды, в качестве фармацевтически эффективных компонентов, необходимо часто вводить пациентам для поддержания желаемого уровня концентрации и титров в крови. Однако такое частое введение белковых лекарственных средств, большинство из которых представлены в инъекционной форме, вызывает у пациентов боль.

Для решения вышеуказанных проблем было предпринято множество попыток для улучшения стабильности белковых лекарственных средств в сыворотке и сохранения уровня лекарственных средств в крови на высоком уровне в течение длительного периода времени для максимального увеличения фармацевтической эффективности лекарственных средств. Для применения в качестве длительно действующих препаратов, белковые лекарственные средства необходимо рецептировать с высокой стабильностью и титрами, поддерживаемыми на достаточно высоком уровне, без развития иммунных ответов у пациентов.

Обычным подходом для стабилизации белков и предотвращения ферментативного разложения и расщепления почками является химическая модификация поверхности белкового лекарственного средства с помощью полимера, имеющего высокую растворимость, такого как полиэтиленгликоль (PEG). При связывании со специфическими или различными участками целевого белка, PEG стабилизирует белок и предотвращает гидролиз, не вызывая серьезных побочных эффектов (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139). Однако, несмотря на его способность усиливать стабильность белка, PEGилирование имеет проблемы, такие как значительное снижение титров физиологически активных белков. Кроме того, существует снижение выхода при увеличении молекулярной массы PEG из-за сниженной реакционной способности белков.

Другой альтернативной стратегией улучшения стабильности физиологически активных белков in vivo является связь гена физиологически активного белка с геном, кодирующим белок, имеющий высокую стабильность в сыворотке, с помощью генетической рекомбинантной технологии, и культивирование клеток, трансфицированных рекомбинантным геном для получения сшитого белка. Например, сшитый белок может быть получен путем конъюгации альбумина, белка, известного как наиболее эффективный в усилении стабильности белка, или его фрагмента, с физиологически активным интересующим белком путем генетической рекомбинации (PCT публикации №№ WO 93/15199 и WO 93/15200, Европейская патентная публикация № 413622).

Другим методом является использование иммуноглобулина, как описано в патенте США № 5045312, где человеческий гормон роста конъюгирован с бычьим альбумином сыворотки или мышиным иммуноглобулином с использованием сшивающего агента. Конъюгаты имеют усиленную активность по сравнению с немодифицированным гормоном роста. Карбодиимид или глютаральдегид используются в качестве сшивающего вещества. Неспецифическое связывание таких низкомолекулярных сшивающих агентов с пептидами, однако, не обещает образования гомогенных конъюгатов, и in vivo они являются даже токсичными. Кроме того, усиление активности, к которому относится этот патент, имеет место только из-за химического связывания с фактором роста. Способ по этому патенту не может гарантировать усиленной активности для различных типов полипептидных лекарственных средств, поскольку в патенте не представлены даже факторы, связанные со стабильностью белка, такие как длительность, период полужизни в крови и др.

По существу, требуются длительно действующие композиции белковых лекарственных средств с улучшенной продолжительностью действия и стабильностью in vivo. Для применения в длительно действующей лекарственной композиции, конъюгаты белков, в которых физиологически активный полипептид ковалентно связан с неполипептидным полимером и Fc фрагментом иммуноглобулина, недавно были предложены в Корейских патентах №№ 10-0567902 (Physiologically active polypeptide conjugate having improved in vivo durability) и 10-0725315 (Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof).

Для применения длительно действующих конъюгатов интерферона альфа в лекарственных продуктах необходимо поддерживать их фармацевтическую эффективность in vivo при ограничении физико-химических изменений, таких как разложение, индуцированное светом, теплом или добавками, агрегация, адсорбция или гидролиз во время хранения и транспортировки. Длительно действующие конъюгаты интерферона альфа труднее стабилизировать, чем полипептид интерферона альфа как таковой, так как они имеют больший объем и молекулярную массу.

В целом, белки имеют очень короткий период полужизни и, при воздействии неподходящих температур, границ раздела вода-воздух, высокого давления, физического/механического стресса, органических растворителей, микробной контаминации и др. они подвергаются разложению в форме агрегации мономеров, осаждения из-за агрегации и адсорбции на поверхности контейнеров. При разложении белки теряют их присущие физико-химические свойства и физиологическую активность. После разложения белки практически не могут восстановить свои оригинальные свойства, так как дегенерация является необратимой. Особенно в случае белков, вводимых в дозе, настолько низкой, как сотни микрограмм на инъекцию, например, интерферон альфа, когда они теряют стабильность и, следовательно, абсорбируются на поверхности контейнера, возникает относительно высокая степень нарушения. Кроме того, абсорбированные белки легко агрегируют во время процесса дегенерации и агрегаты дегенерированных белков при введении в организм действуют как антигены, а не как белки, синтезируемые in vivo. Следовательно, белки необходимо вводить в достаточно стабильной форме.

Множество методов исследовали для предотвращения дегенерации белков в растворах (John Geigert, J. Parenteral Sci. Tech., 43(5): 220-224, 1989; David Wong, Pharm. Tech., October, 34-48, 1997; Wei Wang., Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999; Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25: 267-340, 1986; Michelle et. al., Int. J. Pharm. 120: 179-188, 1995).

Для достижения целевой стабильности некоторые белковые лекарственные средства подвергают лиофилизации. Однако лиофилизированные продукты являются неудобными, так как для применения их необходимо заново растворять в воде для инъекций. Кроме того, они требуют крупных капиталовложений в большегрузные сублимационные установки, так как лиофилизация включается в процесс их получения. Также предполагают сжатие белков при использовании лиофилизатора. Однако указанный метод является экономически неблагоприятным из-за низкого выхода продукта. Кроме того, процесс сублимационной сушки подвергает белки высокой температуре, таким образом оказывая негативное влияние на стабильность белков.

В качестве альтернативы для преодоления ограничений появились стабилизаторы, которые, при добавлении к белкам в растворе, могут восстанавливать фихикохимические изменения белковых лекарственных препаратов и поддерживать фармацевтическую эффективность in vivo даже при хранении в течение длительного периода времени. Среди них можно отметить углеводы, аминокислоты, белки, поверхностно-активные вещества, полимеры и соли. Между прочим, человеческий альбумин сыворотки широко используют для стабилизации различных белковых лекарственных средств, и его применение в таком отношении доказано (Edward Tarelli et al., Biologicals, 26: 331-346).

Типичный процесс очистки человеческого альбумина сыворотки включает инактивацию биологических загрязнителей, таких как микоплазмы, прионы, бактерии и вирусы, или скрининг или оценку наличия одного или более биологических загрязнителей или патогенов. Однако всегда существует риск воздействия на пациентов биологических загрязнителей, так как их полностью не удалили или не инактивировали. Например, человеческую кровь от доноров скринируют для оценки, не содержит ли она определенные вирусы. Однако, этот процесс не всегда надежный. В частности, определенные вирусы, существующие в очень небольшом количестве, невозможно определить.

Кроме того, различные белки могут постепенно инактивироваться из-за химических различий, тогда как их подвергают различным соотношениям и условиям во время хранения. Эффект стабилизатора на срок хранения белков отличается от одного белка к другому. То есть различные стабилизаторы могут быть использованы в различных соотношениях в зависимости от физико-химических свойств интересующих белков. При одновременном использовании различные стабилизаторы могут давать побочные эффекты из-за конкуренции и некорректной обработки. Комбинация различных стабилизаторов также проявляет различные эффекты, так как они вызывают изменения характеристик или концентрации белков во время хранения. Так как пригодность стабилизирующей активности каждого стабилизатора связана с заданным диапазоном концентраций, необходимо аккуратно производить комбинацию различных видов и концентраций различных стабилизаторов.

В частности, что касается длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, которые имеют улучшенную длительность и стабильность in vivo, их молекулярные массы и объемы существенно отличаются от таковых обычного интерферона альфа, так как они состоят из физиологически активного пептида интерферона альфа, непептидных полимеров и Fc фрагмента иммуноглобулина. Более того, физиологически активный пептид интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина должны быть стабилизированы одновременно, так как оба они являются пептидами или белками.

Как указано выше, различные белки могут постепенно инактивироваться из-за химических различий, когда их подвергают различным соотношениям и условиям во время хранения. Кроме того, различные стабилизаторы, подходящие для соответствующих пептидов или белков, при одновременном использовании, скорее могут вызывать нежелательные эффекты, чем желательные эффекты, из-за конкуренции и ошибочной обработки.

Соответственно, трудно установить композиции стабилизатора для длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, которые созданы для одновременной стабилизации и интерферона альфа и Fc фрагмента иммуноглобулина.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

Приводя к настоящему изобретению, обширные и тщательные исследования для разработки стабильной жидкой композиции длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, способной сохранять фармацевтическую эффективность в течение длительного периода времени без вирусной инфекции, способствовали открытию, что композиция стабилизатора без альбумина, включающая буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство, дает длительно действующие конъюгаты интерферона альфа с улучшенной стабильностью.

Решение задачи

Следовательно, задачей настоящего изобретения является получение жидкой композиции, включающей фармацевтически эффективное количество длительно действующего конъюгата интерферона альфа, в которой интерферон альфа ковалентно связан с Fc фрагментом иммуноглобулина, и стабилизатор без альбумина, состоящий из буфера, сахарного спирта, неионного поверхностно-активного вещества и изотонического средства.

Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа получения жидкой композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа, включающего a) создание длительно действующего конъюгата интерферона альфа; и b) смешивание длительно действующего конъюгата интерферона альфа стадии a) со стабилизатором без альбумина, содержащим буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство.

Дополнительной задачей настоящего изобретения является получение стабилизатора для длительно действующего конъюгата интерферона альфа с интерфероном альфа, конъюгированным с участком иммуноглобулина Fc, где стабилизатор включает буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество, изотоническое средство и не содержит альбумин.

Еще одной задачей настоящего изобретения является разработка способа стабилизации длительно действующего конъюгата интерферона альфа с помощью стабилизатора, где стабилизатор включает буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство и не содержит альбумин, и длительно действующий конъюгат интерферона альфа включает интерферон альфа, ковалентно связанный с Fc фрагментом иммуноглобулина.

ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Не содержащая человеческого альбумина сыворотки и других потенциальных факторов, вредных для организма, жидкая композиция длительно действующих конъюгатов интерферона альфа в соответствии с настоящим изобретением не имеет проблем вирусных инфекций. Также жидкая композиция гарантирует превосходную стабильность при хранении длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, в которых связаны интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина, и которые имеют большую молекулярную массу и более длительную продолжительность действия, чем натуральные формы интерферона альфа, таким образом, являясь более экономически полезными, чем другие стабилизаторы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой график, показывающий стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа в жидкой композиции, pH 5,5, представленной в примере 6, когда ее анализировали с использованием ОФ-ВЭЖХ в отношении длительности хранения при 4°С в течение 6 месяцев.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с его аспектами, настоящее изобретение относится к жидкой композиции, включающей фармацевтически эффективное количество длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, в которой интерферон альфа ковалентно связан с Fc фрагментом иммуноглобулина, и стабилизатор без альбумина, состоящий из буфера, сахарного спирта, неионного поверхностно-активного вещества и изотонического средства.

В соответствии с другими аспектами, настоящее изобретение относится к стабилизатору для длительно действующего конъюгата интерферона альфа с интерфероном альфа, конъюгированным с Fc фрагментом иммуноглобулина, который включает буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство и не содержит альбумина.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу стабилизации длительно действующего конъюгата интерферона альфа с помощью стабилизатора, где стабилизатор включает буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство, и не содержит альбумина, и длительно действующий конъюгат интерферона альфа включает интерферон альфа, ковалентно связанный с Fc фрагментом иммуноглобулина.

Термин “длительно действующий конъюгат интерферона альфа”, как используется в настоящем описании, может быть предназначен для обозначения белкового конструкта, включающего физиологически активный олигопептид, такой как интерферон альфа (IFNα), по меньшей мере один непептидный полимер с функциональной группой на обоих концах, и по меньшей мере один Fc фрагмент иммуноглобулина, в котором составляющие ковалентно связаны друг с другом посредством ковалентных связей.

Следовательно, термин “длительно действующий”, в рамках настоящего описания, относится к пролонгированному периоду действия по сравнению с интерфероном альфа натуральной формы. Термин “конъюгат” относится к конструкту, в котором интерферон альфа ковалентно связан с Fc фрагментом иммуноглобулина посредством непептидного полимера.

Длительно действующий конъюгат интерферона альфа представляет собой модифицированное белковое лекарственное средство, которое создано для минимизации потери присущей физиологической активности и для максимального увеличения продолжительности действия in vivo. Для использования в настоящем изобретении интерферон альфа ассоциирован с Fc фрагментом иммуноглобулина.

Интерфероном альфа, пригодным для использования в настоящем изобретении, предпочтительно может быть человеческий интерферон альфа. Также, интерфероном альфа может быть нативный IFNα, производное нативного IFNα или полипептид, имеющий активность, сходную с таковой нативного IFNα. То есть интерферон альфа по настоящему изобретению может включать последовательность аминокислот интерферона альфа дикого типа или последовательность аминокислот его мутанта. Термин “мутантная последовательность аминокислот”, как используется в настоящем описании, относится к последовательности аминокислот, которая отличается от дикого типа в результате делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены одного или более остатков аминокислот или их комбинации.

Интерфероном альфа может быть нативный интерферон альфа от людей или животных или может быть рекомбинантный интерферон альфа из трансформированных клеток. Предпочтительным является рекомбинантный человеческий интерферон альфа (HuIFNα), полученный с использованием трансформированных E. coli. Если их биологическая активность существенно не отличается от дикого типа, мутантов, образованных путем замены, делеции или вставки аминокислот, также включают в рамки интерферона альфа.

В рамках настоящего описания термин “Fc фрагмент иммуноглобулина” относится к фрагменту иммуноглобулина, который лишен вариабельных участков легких и тяжелых цепей, постоянного участка 1 тяжелой цепи (CH1), и постоянного участка легкой цепи (CL1), то есть фрагмент, состоящий из постоянных участков 2 и 3 тяжелой цепи (CH2 и CH3). Необязательно Fc фрагмент иммуноглобулина может дополнительно включать петлевой участок. Также, Fc фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может быть удлиненным Fc фрагментом, который включает часть или весь постоянный участок 1 тяжелой цепи (CH1) и/или постоянный участок 1 легкой цепи (CL1) в добавление к постоянным участкам 2 и 3 тяжелой цепи (CH2 и CH3), пока он обладает эффектами, по существу идентичными или превышающими таковые классического Fc фрагмента. Кроме того, Fc фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может состоять из CH2 и/или CH3, которые не содержат значительной части последовательности аминокислот.

Следовательно, Fc фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может состоять из 1) CH1 домена, CH2 домена, CH3 домена и CH4 домена, 2) CH1 домена и CH2 домена, 3) CH1 домена и CH3 домена, 4) CH2 домена и CH3 домена, 5) комбинации одного или более постоянных участков и петлевого участка иммуноглобулина (или частично петлевого участка), или 6) димера каждого постоянного домена тяжелой цепи и постоянного участка легкой цепи.

Кроме того, мутантная последовательность аминокислот Fc дикого типа может быть включена в рамки Fc фрагмента иммуноглобулина по настоящему изобретению. Термин “мутантная последовательность аминокислот” в настоящем описании, относится к последовательности аминокислот, которая отличается от дикого типа в результате делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены одного или более остатков аминокислот, или их комбинации. Например, остатки аминокислот в положениях 214-238, 297-299, 318-322, или 327-331 в IgG Fc, известные как важные для связи, могут быть использованы в участках, подходящих для модификации.

Различные производные, такие как полученные путем удаления участков дисульфидных связей, удаления нескольких N-концевых аминокислот из нативного Fc, или добавления метионина к N-концу нативного Fc, могут быть использованы в настоящем изобретении. Кроме того, участки фиксации комплемента, например, участки фиксации C1q, или участки ADCC, могут быть удалены для устранения эффекторной функции нативного Fc фрагмента. Методики получения мутантных последовательностей аминокислот Fc фрагмента иммуноглобулина описаны в Международной патентной заявке №№ WO 97/34631 и WO 96/32478.

Замены аминокислот в молекуле белка или пептида, которые не влияют на активность молекулы, хорошо известны в области техники (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее частые замены формируются между остатками аминокислот Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, и Asp/Gly. Необязательно, аминокислоты могут быть модифицированы посредством фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования и амидирования.

Вышеописанные производные Fc проявляют такую же биологическую активность, как таковая дикого типа, но улучшенную структурную стабильность относительно тепла и рН.

Fc фрагмент иммуноглобулина, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть гликозилирован в такой же степени или в большей или меньшей степени, чем нативная форма, или может быть дегликозилирован или агликозилирован. Повышенное или сниженное гликозилирование или дегликозилирование участка иммуноглобулина может быть достигнуто обычными способами, например, с использованием химического метода, ферментативного метода или генно-инженерного метода. В настоящем описании при дегликозилировании Fc фрагмент иммуноглобулина имеет достоверно сниженную силу связывания комплемента (C1q) и сниженную или отсутствующую цитотоксичность или комплемент-зависимую цитотоксичность, не вызывая нежелательного иммунного ответа in vivo. В таком контексте, дегликозилированные или агликозилированные Fc фрагменты иммуноглобулина в большей степени соответствуют цели носителей лекарственных средств.

Термин “дегликозилирование” в настоящем описании обозначает ферментативное удаление сахаров из Fc фрагмента. Термин “агликозилирование”, при использовании в сочетании с Fc фрагментом, обозначает Fc фрагмент без сахаров, экспрессируемый эукариотами, предпочтительно E. coli.

Для использования в настоящем изобретении Fc фрагмент иммуноглобулина имеет последовательность аминокислот Fc фрагмента человеческого иммуноглобулина или его тесно связанных аналогов. Fc фрагменты могут быть получены из нативных форм, выделенных от животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок. Кроме того, Fc фрагментом иммуноглобулина может быть Fc фрагмент, который получают из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, или таковой, полученный путем комбинации их или их гибридов. Предпочтительно, их получают из IgG или IgM, которые являются белками, наиболее обильно встречающимися в человеческой крови, и наиболее предпочтительно из IgG, который известен как увеличивающий период полужизни лиганд-связывающих белков в сыворотке. В настоящем описании, Fc иммуноглобулина может быть получен из нативного иммуноглобулина путем выделения целого иммуноглобулина из организма человека или животных и его обработки протеолитическими ферментами, или он может быть рекомбинантом или их производным, полученным из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. Предпочтительно им является рекомбинантный человеческий Fc, продуцируемый трансформированными E. coli.

Термин “комбинация” в настоящем описании, обозначает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные Fc фрагменты иммуноглобулина одного происхождения, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с формированием димера или мультимера. То есть, димер или мультимер могут быть образованы из двух или более фрагментов, выбираемых из группы, состоящей из Fc фрагментов IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, и IgE.

Термин “гибрид” в настоящем описании обозначает, что последовательности, кодирующие два или более Fc фрагмента иммуноглобулина различного происхождения, присутствуют в одноцепочечном Fc фрагменте иммуноглобулина. В настоящем изобретении возможны любые гибриды. То есть, домены гибридов могут состоять из одного-четырех доменов, выбираемых из группы, состоящей из CH1, CH2, CH3 и CH4 IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc и IgD Fc, и могут включать петлевой участок.

С другой стороны, IgG подразделяют на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение включает их комбинации и гибриды. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4, и наиболее предпочтительным является Fc фрагмент IgG4, редко имеющий эффекторную функцию, такую как CDC (комплемент-зависимая цитотоксичность). В качестве носителя лекарственного средства по настоящему изобретению наиболее предпочтительным Fc фрагментом является негликозилированный Fc фрагмент человеческого IgG4.

Человеческий Fc фрагмент является более предпочтительным, чем нечеловеческий Fc фрагмент, который может действовать как антиген в человеческом организме и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как продукция новых антител к антигену.

Длительно действующий конъюгат интерферона альфа, который может быть использован в настоящем изобретении, получают путем связывания интерферона альфа и Fc фрагмента вместе. В этом отношении интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина могут быть сшиты посредством непептидного полимера или могут быть преобразованы в сшитый белок с использованием рекомбинантной методики.

Длительно действующий конъюгат интерферона альфа, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть получен с использованием генно-инженерной методики, как описано в корейской патентной заявке No. 10-0725315.

Непептидный полимер для применения в сшивке может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, таких как PLA (полимолочная кислота) и PLGA (полимолочная-гликолевая кислота), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций. Наиболее предпочтительным является полиэтиленгликоль. Также их производные хорошо известны в области техники и могут быть легко получены в рамках области техники, включенных в рамки настоящего изобретения.

Жидкая композиция длительно действующего конъюгата интерферона альфа по настоящему изобретению включает длительно действующий конъюгат интерферона альфа в фармацевтически приемлемом количестве.

Термин “фармацевтически эффективное количество” в настоящем описании предназначен для обозначения достаточного количества фармацевтической композиции для лечения заболевания, в приемлемом соотношении польза/риск, применимом к любому медицинскому лечению. Эффективное количество может варьировать в зависимости от различных факторов, включая тяжесть и тип заболевания, подвергаемого лечению, возраст и пол пациента, активность лекарственного средства, чувствительность к лекарственным средствам, время введения, путь введения, скорость экскреции, продолжительность периода лечения, совместное введение с другими лекарственными средствами и другие параметры, хорошо известные в области медицины и фармацевтики. Обычно фармацевтически эффективное количество интерферона альфа варьируется от приблизительно 30 до 200 мкг на флакон для разового применения. Концентрация длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, используемых в настоящем изобретении, имеет порядок 0,1-50 мг/мл и предпочтительно порядок от 0,1 до 5,0 мг/мл.

В частности молекулярные массы и объемы длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, которые имеют улучшенную продолжительность действия и стабильность in vivo, существенно отличаются от таковых обычного интерферона альфа, так как они состоят из интерферона альфа и Fc фрагмента иммуноглобулина. Более того, физиологически активный пептид интерферона альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина должны быть стабилизированы одновременно, так как оба являются пептидами или белками.

Для соответствия таким требованиям в соответствии с настоящим изобретением используют стабилизатор. В настоящем описании термин “стабилизатор” обозначает вещество, которое допускает безопасное хранение длительно действующего конъюгата интерферона альфа. Термин “стабилизация” обозначает потерю активного ингредиента до заранее определенной степени, обычно до 10%, в течение определенного периода времени в условиях хранения. Когда длительно действующий конъюгат интерферона альфа сохраняет 90% или более его исходной активности и предпочтительно 95% или больше исходной активности после хранения при 5±3°С в течение 2 лет, при 25±2°С в течение 6 месяцев или при 40±2°С в течение одной-двух недель, понимают, что он стабилен.

Относительно белков, таких как длительно действующий конъюгат интерферона альфа, их стабильность при хранении является важной в отношении потенциального образования интерферон альфа-подобных антигенных веществ, а также гарантии введения точного количества. Во время хранения, около 10% потери активности интерферона альфа можно понимать как допускаемые для введения, если только длительно действующий конъюгат интерферона альфа в композиции не агрегирует и не фрагментируется, образуя антигенные материалы.

Стабилизатор, подходящий для наделения длительно действующего конъюгата интерферона альфа стабильностью, включает буфер, сахарный спирт, изотоническое средство и неионное поверхностно-активное вещество и необязательно дополнительно метионин.

Буфер в стабилизаторе играет роль поддержания pH жидкой композиции постоянным для предотвращения колебаний pH, таким образом стабилизируя длительно действующий конъюгат интерферона альфа. Буфер, применимый в настоящем изобретении, может включать фармацевтически приемлемые рН-буферные средства, включая щелочные соли (фосфат натрия или калия, их кислые или дикислые соли), цитрат натрия/лимонную кислоту, ацетат натрия/уксусную кислоту и их комбинации.

Со ссылками на раздел Примеров, стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа, варьируется в зависимости от значений pH буфера. Наибольшую стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа определяли при pH 5,5 в цитратном буфере (Пример 2).

Подходящим для использования в настоящем изобретении является фосфатный буфер или цитратный буфер, последний является существенно более предпочтительным.

Фосфат в цитратном буфере варьирует в концентрации предпочтительно от 5 до 100 мМ и более предпочтительно от 10 до 50 мМ.

Буфер имеет предпочтительно pH от 4,0 до 7,0, более предпочтительно pH от 5,0 до 7,0, еще более предпочтительно pH от 5,2 до 7,0, и наиболее предпочтительно pH от 5,2 до 6,0.

Сахарный спирт является производной формой углевода, чья карбонильная группа (=CO) была восстановлена до гидроксильной группы (-OH). В настоящем изобретении сахарный спирт участвует в стабильности длительно действующего конъюгата интерферона альфа.

В жидкой композиции сахарный спирт используют предпочтительно в концентрации от 1 до 10% (масс/об), и более предпочтительно в концентрации 5% (масс/об).

Сахарный спирт может быть выбран из группы, состоящей из эритрита, галактита, арабита, ксилита, сорбита, рибита, мальтита, сорбита, лактита и маннита, с предпочтением для маннита, сорбита или их комбинации.

Со ссылками на раздел Примеры, было обнаружено, что маннит в большей степени участвует в стабильности длительно действующего конъюгата интерферона альфа в условиях обычного буферного раствора (Пример 1).

Изотоническое средство действует не только поддерживая подходящее осмотическое давление, когда длительно действующему конъюгату интерферона альфа позволяют поступать в организм, но дополнительно стабилизирует длительно действующий конъюгат интерферона альфа в жидкой композиции. Примеры изотонического средства включают водорастворимые неорганические соли. Предпочтительно характерным среди них является хлорид натрия.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения использование хлорида натрия в качестве изотонического средства увеличивает стабильность при хранении длительно действующего конъюгата интерферона альфа в присутствии буфера, сахарного спирта и неионного поверхностно-активного вещества. Из указанных данных понимают, что хлорид натрия в качестве изотонического средства обладает синергическим эффектом вместе с буфером, сахарным спиртом и неионным поверхностно-активным веществом на стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа.

Предпочтительно концентрация изотонического средства имеет порядок от 5 до 200 мМ и более предпочтительно порядок 150 мМ. В таком диапазоне концентрация изотонического средства может быть отрегулирована в соответствии с видами и количествами компонентов, так чтобы жидкая композиция была изотоничной.

Далее возвращаясь к неионному поверхностно-активному веществу, оно понижает поверхностное натяжение раствора белка для предотвращения адсорбции белка или агрегации на гидрофобных поверхностях. Неионные поверхностно-активные вещества типа полисорбата и полоксамера являются особо предпочтительными для применения в настоящем изобретении. Их можно использовать отдельно или в комбинации. Более предпочтительными являются неионные поверхностно-активные вещества типа полисорбата. Среди них полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 и полисорбат 80, с более предпочтительным полисорбатом 80.

Со ссылками на раздел Примеров, наблюдали, что жидкая композиция длительно действующего конъюгата интерферона альфа, содержащая полисорбат 80, является сходной или более стабильной относительно жидкой композиции, содержащей полоксамер 188. Также, более высокую стабильность определяли в жидкой композиции, содержащей 0,02% полисорбата 80, чем 0,005% полисорбата 80 (Пример 3).

Не рекомендуется использовать неионное поверхностно-активное вещество в высокой концентрации, так как неионное поверхностно-активное вещество, если присутствует в высокой концентрации, оказывает влияние на анализ белка, такой как УФ-спектрометрия или изо-фокусирование, затрудняя точную оценку концентрации или стабильности белка.

Следовательно, жидкая композиция по настоящему изобретению может включать неионное поверхностно-активное вещество предпочтительно в концентрации 0,1% (масс/об) или меньше, более предпочтительно в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс/об), и наиболее предпочтительно в концентрации 0,02% (масс/об).

Стабилизатор по настоящему изобретению может дополнительно включать метионин. Действуя предотвращая образование примесей в растворе из-за окисления белков, метионин может дополнительно стабилизировать интересующие белки. Метионин можно предпочтительно использовать в концентрации от 0,05 до 0,1% (масс/об) на основании общего объема композиции и более предпочтительно в концентрации от 0,01 до 0,1% (масс/об).

Со ссылкой на раздел Примеры, обнаружили, что содержание окисленных длительно действующих конъюгатов интерферона альфа, увеличивается с течением времени в отсутствии метионина, но остается относительно постоянным в присутствии 0,01% метионина, показывая, что жидкая композиция, содержащая метионин, может дополнительно стабилизировать длительно действующий конъюгат интерферона альфа (Пример 5).

Кроме того, стабилизатор по настоящему изобретению предпочтительно не содержит альбумина. Так как его получают из человеческой крови, человеческий альбумин сыворотки, доступный в качестве стабилизатора белков, может быть загрязнен человеческими патогенными вирусами. Желатин или альбумин бычьей сыворотки у некоторых пациентов могут вызывать заболевания или индуцировать аллергическую реакцию. Не содержащие альбумин, полученный из сыворотки человека или животных, или гетерогенные белки, такие как очищенный желатин, не имеют проблем вирусной инфекции для стабилизатора по настоящему изобретению.

Кроме того, стабилизатор по настоящему изобретению может дополнительно включать сахар или многоатомный спирт. Предпочтительные примеры сахара, который может дополнительно содержаться для увеличения стабильности при хранении длительно действующего конъюгата интерферона альфа, включают моносахариды, такие как манноза, глюкоза, фруктоза и ксилоза, и полисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза, раффиноза и декстран. Примеры многоатомных спиртов, применимых в настоящем изобретении, включают пропиленгликоль, низкомолекулярный полиэтиленгликоль, глицерин и низкомолекулярный полипропиленгликоль. Они могут быть использованы отдельно или в комбинации.

В добавление к вышеупомянутым компонентам, включающим буфер, изотоническое средство, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и метионин, жидкая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать другие компоненты, известные в области техники, пока они не нарушают действие настоящего изобретения.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение обеспечивает способ для получения жидкой композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа, включающий a) создание длительно действующего конъюгата интерферона альфа; и b) смешивание длительно действующего конъюгата интерферона альфа по стадии a) со стабилизатором, включающим буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство.

Вышеуказанную стадию a) получения длительно действующего конъюгата интерферона альфа можно проводить путем сшивки интерферона альфа с Fc фрагментом иммуноглобулина посредством непептидного полимера или сшивки интерферона альфа с участком иммуноглобулина Fc посредством рекомбинантных методик.

Сшивка интерферона альфа с Fc фрагментом иммуноглобулина посредством непептидного полимера включает реакцию непептидного полимера, имеющего функциональную группу на каждом конце, с интерфероном альфа и Fc фрагментом иммуноглобулина для получения конъюгата, в котором непептидный полимер ковалентно связывается на одном конце с интерфероном альфа и на другом конце с Fc фрагментом иммуноглобулина; и выделение конъюгата.

Ковалентные связи между тремя компонентами могут образовываться последовательно или одновременно. Например, когда интерферон альфа и иммуноглобулин соответственно связываются с противоположными концами непептидного полимера, или интерферон альфа или иммуноглобулин могут сначала связываться с непептидным полимером, с последующим связыванием с полимером оставшегося. Последовательное образование ковалентных связей является преимущественным для получения целевого конъюгата с минимальным количеством побочных продуктов.

Длительно действующий конъюгат интерферона альфа, созданный на стадии a), смешивают со стабилизатором, включающим буфер, сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство для получения жидкой композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительно в стабилизаторе в качестве изотонического средства используют хлорид натрия, и он может дополнительно включать компонент, состоящий из метионина, сахаров, многоатомных спиртов и их комбинации.

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Лучшее понимание настоящего изобретения может быть получено посредством следующих примеров, которые представлены для иллюстрации, но не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение.

[ПРИМЕР ПОЛУЧЕНИЯ 1] Получение длительно действующего конъюгата интерферона альфа

<1-1> Получение Fc фрагмента иммуноглобулина с использованием иммуноглобулина

Для получения Fc фрагмента иммуноглобулина, раствор 200 мг 150 кДа иммуноглобулина G (IgG, GreenCross, Korea) в 10 мМ фосфатном буфере обрабатывали 2 мг папаина (Sigma) при 37°С в течение 2 часов при медленном перемешивании. После ферментативной реакции Fc фрагмент иммуноглобулина, полученный таким образом, выделяли с использованием колоночной хроматографии с колонкой Superdex, колонки белка A, и катионобменной колонки. Подробно, реакционную смесь по каплям нагружали на колонку Superdex 200 (Pharmacia) уравновешенную 10 мМ PBS (pH 7,3), с последующей элюцией тем же буфером со скоростью тока 1 мл/мин. Непрореагировавший иммуноглобулин (IgG) и F(ab’)2 элюировали раньше Fc фрагментов иммуноглобулина и их удаляли, так как оба из них больше по молекулярной массе, чем Fc фрагмент иммуноглобулина. Fab, который имеет молекулярную массу, сходную с таковой Fc фрагмента иммуноглобулина, фильтровали с использованием колоночной хроматографии белка A. В этом контексте фракцию Fc фрагмента иммуноглобулина, элюируемую из колонки Superdex 200, нагружали со скоростью тока 5 мл/мин на колонку белка A (Pharmacia) уравновешенную с помощью 20 мМ PBS (pH 7,0), и колонку затем промывали достаточным количеством того же буфера для удаления несвязанных белков. 100 мМ буфера цитрата натрия (Na цитрат, pH 3,0) позволяли протекать через колонку для элюции чистого Fc фрагмента иммуноглобулина. Наконец, полученную фракцию Fc, элюировавшую из колонки белка A, дополнительно очищали на катионобменной колонке (polyCAT, PolyLC) с использованием линейного градиента (NaCl 0,15 M → 0,4 M) 10 нМ ацетатного буфера (pH 4,5).

<1-2> Получение комплекса IFNα-PEG

ALD-PEG-ALD (Shearwater), 3,4-кДа полиэтиленгликоля, имеющего альдегидную реакционноспособную группу на обоих концах, смешивали с 5 мг/мл раствора человеческого интерферона альфа-2b (hIFNα-2b, Мм 20 кДа) в 100 мМ фосфатного буфера в молярном соотношении IFNα:PEG 1:1, 1:2.5, 1:5, 1:10 или 1:20. К полученной смеси добавляли восстанавливающее вещество, цианоборогидрид натрия (NaCNBH3, Sigma), в конечной концентрации 20 мМ, и позволяли реагировать при 4°С в течение 3 ч при аккуратном перемешивании. Для получения комплекса 1:1 IFNα-PEG, в котором PEG селективно связывался с аминоконцом IFNα, реакционную смесь подвергали эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superdex® (Pharmacia). Комплекс IFNα-PEG элюировали из колонки с использованием 10 мМ буфера фосфата калия (pH 6,0) в качестве элюента, тогда как IFNα, не связанный с PEG, непрореагировавший PEG, и димерные побочные продукты, где PEG был связан с двумя молекулами IFNα, удаляли. Очищенный комплекс IFNα-PEG концентрировали до 5 мг/мл. Оптимальные реакционные молярные соотношения IFNα:PEG, которые проявляли наиболее эффективную реакционную способность с минимальным образованием побочных продуктов, таких как димеры, идентифицировали как варьирующиеся от 1:2,5 до 1:5.

<1-3> Создание конъюгата IFNα-PEG-Fc

Комплекс IFNα-PEG, полученный в <1-2>, сшивали с N-концом Fc фрагмента иммуноглобулина. Так, Fc фрагмент иммуноглобулина (около 53 кДа), полученный в <1-1>, растворяли в 10 мМ фосфатного буфера и смешивали с комплексом IFNα-PEG в молярном соотношении IFNα-PEG комплекс:Fc 1:1, 1:2, 1:4 или 1:8. После того как концентрацию фосфатного буфера реакционного раствора доводили до 100 мМ, восстанавливающее средство NaCNBH3 добавляли к реакционному раствору в конечной концентрации 20 мМ и позволяли реагировать при 4°С в течение 20 ч при аккуратном перемешивании. Оптимальное реакционное молярное соотношение IFNα-PEG комплекса:Fc, которое проявляло наиболее эффективную реакционную способность с минимальным образованием побочных продуктов, таких как димеры, идентифицировали как 1:2.

<1-4> Выделение и очистка конъюгата IFNα-PEG-Fc

После реакции связывания <1-3>, проводили эксклюзионную хроматографию Superdex для удаления непрореагировавших веществ и побочных продуктов из реакционной смеси для очистки конъюгата IFNα-PEG-Fc. Реакционную смесь концентрировали и позволяли проходить через колонку со скоростью тока 2,5 мл/мин, вместе с 10 мМ PBS (pH 7,3) для удаления несвязанного Fc и непрореагировавшего вещества для элюирования фракции конъюгата IFNα-PEG-Fc. Так как небольшое количество примесей, включая непрореагировавший Fc и димеры IFNα, также совместно существовали во фракции конъюгата IFNα-PEG-Fc, для их удаления далее проводили катионообменную хроматографию. Фракцию конъюгата IFNα-PEG-Fc нагружали на колонку PolyCAT LP (PolyLC), уравновешенную с помощью 10 мМ ацетата натрия (pH 4,5), с последующей элюцией с помощью 10 мМ буфера ацетата натрия (pH 4,5), содержащего 1 M NaCl в линейном градиенте (NaCl 0 M → 0,5 M). Впоследствии анионообменную колонку использовали для получения чистого конъюгата IFNα-PEG-Fc.

Полученный конъюгат дополнительно очищали с использованием колонки PolyWAX LP (PolyLC). Фракцию нагружали на колонку, уравновешенную 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5), и элюировали 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5), содержащим 1 M NaCl в линейном градиенте (NaCl 0M → 0,3 M) для получения конъюгата IFNα-PEG-Fc высокой чистоты.

[ПРИМЕР 1]: Анализ стабильности длительно действующих конъюгатов интерферона альфа в соответствии с различными стабилизаторами

В присутствии фосфатного буфера различные стабилизирующие средства, включая сахара, сахарные спирты и аминокислоты, оценивали в отношении их способности стабилизировать длительно действующий конъюгат IFNα.

Для этого анализа раствор цитрата (Na-цитрат) (pH 5,5) использовали в качестве буфера, маннит в качестве сахарного спирта, аргинин или глицин в качестве аминокислоты и сахарозу в качестве сахара.

После хранения при 40°С в течение одной недели в композициях, перечисленных в таблице 1, проводили анализы ОФ-ВЭЖХ и Э-ВЭЖХ. Результаты суммированы в таблице 2, ниже. В таблице 2, колонки ОФ-ВЭЖХ(%) и Э-ВЭЖХ(%) показывают уровень удержания длительно действующего конъюгата IFNα по сравнению с исходным значением, которое выражали как % площади (/% исходной площади).

Таблица 1
IFN Буфер Стабилизирующее средство
1 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрат, рН 5,5 5% маннита
2 360 мкг/мл 10 мМ Na-цитрат, рН 5,5 5% сахарозы
3 360 мкг/мл 10 мМ Na-цитрат, рН 5,5 5% маннита
25 мМ L-аргинин-HCl
4 360 мкг/мл 10 мМ Na-цитрат, рН 5,5 5% маннита
1% глицина

Таблица 2
ОФ-ВЭЖХ (% площади/% исходной площади) Э-ВЭЖХ (% площади/% исходной площади)
Неделя 0 Неделя 1 Неделя 0 Неделя 1
1 100 95,3 100 99,1
2 100 92,4 100 98,5
3 100 92,3 100 98,3
4 100 91,8 100 98,2

Как очевидно из данных таблицы 2, применение маннита в качестве стабилизирующего средства делает длительно действующий конъюгат IFNα наиболее стабильным.

[ПРИМЕР 2]: Анализ стабильности длительно действующих конъюгатов интерферона альфа в соответствии с рН стабилизаторов

Стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа измеряли в буфере при различных значениях рН.

После хранения при 40°С в течение двух недель с композициями таблицы 3, используемыми в качестве буфера, для анализа проводили хроматографию с обращенной фазой. Для исследования ОФ-ВЭЖХ и Э-ВЭЖХ, маннит и полисорбат 80 использовали в качестве стабилизирующего средства и поверхностно-активного вещества, соответственно. Результаты суммированы в таблице 4, ниже. Уровень удержания длительно действующего конъюгата IFNα по сравнению с исходным значением выражают как % площади (/% исходной площади) в колонках ОФ-ВЭЖХ(%) и Э-ВЭЖХ(%).

Таблица 3
IFN Буфер Изотоническое средство Стабилизирующее средство Поверхностно-активное вещество
1 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрат, рН 5,2 150 мМ NaCl 5% маннита 0,005% полисорбата 80
2 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрат, рН 5,5 150 мМ NaCl 5% маннита 0,005% полисорбата 80
3 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрат, рН 6,0 150 мМ NaCl 5% маннита 0,005% полисорбата 80

Таблица 4
ОФ-ВЭЖХ
(% площади/% исходной площади)
Э-ВЭЖХ
(% площади/% исходной площади)
Неделя 0 Неделя 1 Неделя 2 Неделя 0 Неделя 1 Неделя 2
1 100 агрегировал агрегировал 100 агрегировал агрегировал
2 100 95,6 91,2 100 98,5 94,4
3 100 93,1 87,5 100 93,1 87,5

Как может быть видно в таблицах 3 и 4, осадки образовывались при pH 5,2 после хранения в течение одной недели и стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа увеличивалась в цитратном буфере при pH 5,5, по сравнению с pH 6,0.

Из данных может быть заключено, что длительно действующий конъюгат интерферона альфа по настоящему изобретению стабилизируется в различной степени в зависимости от значений рН используемых буферов и проявляет более высокую стабильность при тех же значениях pH.

[ПРИМЕР 3]: Анализ стабильности длительно действующих конъюгатов интерферона альфа в зависимости от неионного поверхностно-активного вещества

В присутствии цитратного буфера оценивали способность различных неионных поверхностно-активных веществ стабилизировать длительно действующий конъюгат IFNα, как указано далее.

Для анализа полисорбат 80 и полоксамер 188 использовали в качестве поверхностно-активного вещества, и другие средства, показавшие себя, как обеспечивающие стабильность длительно действующего конъюгата IFNα в примере 1, включая маннит, использовали в соответствующей комбинации.

В таких же условиях стабилизатора, когда IFNα устанавливали на уровне 360 мкг/мл в 20 мМ Na-цитратном буфере (pH 5,5), длительно действующий конъюгат IFNα по настоящему изобретению хранили при 25±2°С в течение четырех недель в композициях, перечисленных в Таблице 5, с последующим анализом ОФ-ВЭЖХ и Э-ВЭЖХ. Результаты суммированы в Таблице 5, ниже. Уровень удержания длительно действующего конъюгата IFNα по сравнению с исходным значением выражали как % площади (/% исходной площади) в колонках ОФ-ВЭЖХ (%) и Э-ВЭЖХ (%).

Таблица 5
IFN Буфер Поверхностно-активное вещество Сахарный спирт Изотоническое средство
1 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрат (рН 5,5) 0,005%
полисорбата 80
5% маннита 150 мМ NaCl
2 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрат (рН 5,5) 0,02%
полисорбата 80
5% маннита 150 мМ NaCl
3 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрат (рН 5,5) 0,3% полоксамера 188 5% маннита 150 мМ NaCl

Таблица 6
Поверхностно-активное вещество ОФ-ВЭЖХ (% площади/% исходной площади) Э-ВЭЖХ (% площади/% исходной площади)
1 0,005% полисорбата 80 100,0 99,6 99,2 97,1 100,0 98,9 99,9 98,7
2 0,02% полисорбата 80 100,0 99,8 99,6 97,7 100,0 99,2 99,8 98,7
3 0,3% полоксамера 188 100,0 99,9 99,3 97,5 100,0 100,1 100 98,7

В Таблицах 5 и 6 стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа только немного колебалась независимо от типов и концентраций поверхностно-активного вещества, что измеряли посредством ОФ-ВЭЖХ, но было обнаружено, что он был таким же или более стабильным с полисорбатом 80, чем с полоксамером 188, что оценивали посредством ОФ-ВЭЖХ. Также длительно действующий конъюгат интерферона альфа был более стабильным в жидкой композиции, дополненной 0,02% полисорбата 80, чем с 0,005% полисорбата 80.

[ПРИМЕР 4]: Сравнение стабильности при хранении длительно действующих конъюгатов IFNα в жидкой композиции по изобретению и коммерчески доступной композиции

Для подтверждения стабильности жидкие композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа, включающие цитратный буфер pH 5,5, NaCl, маннит и полисорбат 80, все с доказанной стабильностью в исследованиях примеров 1-3, сравнивали с коммерчески доступной жидкой композицией интерферона альфа (INF α2a, Pegasys®).

Как показано в Таблице 7 ниже, получали жидкую композицию длительно действующего конъюгата интерферона альфа (жидкая композиция #1) и длительно действующий конъюгат интерферона альфа вносили в коммерческое лекарственное средство (IFN α2a, Pegasys®) для получения жидкой композиции (жидкая композиция #2). Их хранили при 25±2°С в течение двух недель, с последующим анализом ОФ-ВЭЖХ. В Таблице 8, уровень удержания длительно действующего конъюгата интерферона альфа, сравниваемый с исходным значением, выражали как ОФ-ВЭЖХ (%).

Таблица 7
IFNα Буфер Поверхностно-активное вещество Сахарный спирт или другие Изотоническое средство
1 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрат (рН 5,5) 0,02% полисорбата 80 5% маннита 150 мМ NaCl
2 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрат (рН 6,0) 0,005% полисорбата 80 - 136,9 мМ NaCl

Таблица 8
ОФ-ВЭЖХ (% площади/% исходной площади)
Неделя 0 Неделя 1 Неделя 2
1 100,0 99,7 99,3
2 100,0 99,3 98,7

Как может быть видно из данных Таблицы 8, жидкая композиция в соответствии с настоящим изобретением может гарантировать более высокую стабильность длительно действующему конъюгату интерферона альфа, чем коммерчески доступная жидкая композиция интерферона альфа (IFN α2a, Pegasys®).

[ПРИМЕР 5]: Анализ стабильности метионин-дополненной жидкой композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа

Для исследования улучшенной стабильности жидкую композицию, полученную из стабилизатора, включающего метионин в добавление к цитратному буферу (pH 5,5), хлориду натрия, манниту и полисорбату 80, все гарантирующие наилучшую стабильность при хранении в предшествующих примерах, хранили при 25±2°С в течение 4 недель, в течение которых анализировали стабильность длительно действующего конъюгата IFNα.

Жидкие композиции длительно действующего конъюгата интерферона альфа получали, как показано в Таблице 9, ниже, и анализировали в отношении стабильности. В Таблицах 10 и 11, ОФ-ВЭЖХ (%) и Э-ВЭЖХ (%) представляют собой содержание длительно действующего конъюгата интерферона альфа и примесей в каждый момент времени. Результаты ОФ-ВЭЖХ и Э-ВЭЖХ в отношении анализа улучшенной стабильности (25±2°С) суммированы в Таблицах 10 и 11, соответственно, где примесь #6 представляет собой окисленный длительно действующий конъюгат интерферона альфа. Было только небольшое различие в молекулярной массе между окисленной и неокисленной формами длительно действующего конъюгата интерферона альфа. Следовательно, Э-ВЭЖХ, способ, использующий молекулярную массу образцов для анализа, не может быть использован для отделения окисленного длительно действующего конъюгата интерферона альфа.

Таблица 9
IFNα Буфер Поверхностно-активное вещество Сахарный спирт и стабилизирующее средство Изотоническое средство
1 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрата (рН 5,5) 0,02% полисорбата 80 5% маннита 150 мМ NaCl
2 360 мкг/мл 20 мМ Na-цитрата (рН 5,5) 0,02% полисорбата 80 5% маннита
0,01% метионина
150 мМ NaCl

Таблица 10
Срок хранения Содержание конъюгата и примесей (% площади)
#1 #2 #3 #4 #5 #6 Конъюгат #7 #8 #9 #10
1 0 неделя 0,06 0,07 0,09 0,19 0,40 1,24 96,61 0,43 0,62 0,30 0,0
1 неделя 0,09 0,06 0,28 0,19 0,41 1,62 95,85 0,56 0,63 0,31 0,0
2 недели 0,14 0,04 0,60 0,14 0,38 1,92 95,41 0,45 0,66 0,27 0,0
4 недели 0,20 0,04 0,17 0,22 0,58 1,43 93,18 0,63 0,91 0,47 0,16
2 0 неделя 0,08 0,04 0,16 0,17 0,37 1,40 96,58 0,47 0,65 0,07 0,0
1 неделя 0,12 0,07 0,46 0,23 0,40 1,28 96,14 0,58 0,51 0,20 0,0
2 недели 0,15 0,08 0,75 0,22 0,47 1,35 95,28 0,69 0,81 0,35 0,0
4 недели 0,21 0,07 0,40 0,27 0,53 1,46 94,09 0,68 0,91 0,35 0,04

Таблица 11
Срок хранения Содержание конъюгата и примесей (% площади)
#1 #2 Конъюгат #3 #4 #5
1 0 неделя 0,28 0,21 99,35 0,0 0,0 0,16
1 неделя 0,48 0,0 98,92 0,0 0,38 0,22
2 недели 0,47 0,0 98,26 0,0 0,78 0,49
4 недели 0,51 0,0 96,90 1,79 0,43 0,37
2 0 неделя 0,0 0,06 99,12 0,0 0,73 0,10
1 неделя 0,0 0,13 98,59 0,0 1,07 0,22
2 недели 0,0 0,10 98,04 0,0 1,49 0,36
4 недели 0,0 0,22 96,88 0,0 1,81 1,09

Как понимают из анализа улучшенной стабильности, содержание окисленного длительно действующего конъюгата интерферона альфа (примесь #6 в ОФ-ВЭЖХ) было повышено в жидкой композиции без метионина, но не повышено в жидкой композиции, дополненной 0,01% метионина.

Полученные результаты показывают, что метионин обеспечивает дополнительную стабильность длительно действующего конъюгата интерферона альфа.

[ПРИМЕР 6]: Анализ жидкой композиции в отношении длительной стабильности при хранении длительно действующего конъюгата IFNα

Жидкую композицию, содержащую цитратный буфер, pH 5,5, NaCl, маннит, полисорбат 80 и метионин, которые все доказали свою стабилизирующую активность в предшествующих примерах, оценивали в отношении способности стабилизировать длительно действующий конъюгат IFNα в течение длительного периода времени. В этом контексте стабильность длительно действующего конъюгата IFNα в жидкой композиции оценивали после хранения при 5±3°С в течение шести месяцев. Результаты показаны на Фиг.1 и суммированы в Таблице 12. Уровень удержания длительно действующего конъюгата INFα по сравнению с его исходным значением выражали как ОФ-ВЭЖХ(%), Э-ВЭЖХ(%), и содержание белка (%).

Таблица 12
Тест на длительную стабильность (хранение при 5±3º)
Срок хранения Свойство рН Тест подтверждения Тест чистоты Тест на содержание белка Тест на биологическую неактивность
ОФ-ВЭЖХ Вестерн-блоттинг SDS-PAGE ОФ-ВЭЖХ (%) Э-ВЭЖХ (%)
Начало Бесцветный, прозрачный 5,5 соответствующий подходящий подходящий 100,0 100,0 100,0 Подходящий
Месяц 1 Бесцветный, прозрачный 5,5 соответствующий подходящий подходящий 99,7 99,8 101,0 NA
Месяц 3 Бесцветный, прозрачный 5,5 соответствующий подходящий подходящий 99,7 99,6 100,5 NA
Месяц 6 Бесцветный, прозрачный 5,5 соответствующий подходящий подходящий 99,7 99,5 101,2 Подходящий

Как может быть видно из данных, длительно действующий конъюгат интерферона альфа в жидкой композиции по настоящему изобретению может храниться стабильным в течение 6 месяцев или дольше.

Вышеуказанное подробное описание вариантов осуществления изобретения не предназначено быть исчерпывающим или ограничивать изобретение до единственной формы, описанной выше. Тогда как специфические варианты осуществления и примеры изобретения описаны выше с целью иллюстрации, в рамках изобретения возможны различные эквивалентные модификации, понятные специалисту в связанной области техники. Указанные и другие изменения изобретения могут быть осуществлены в свете подробного описания.

1. Жидкая композиция, включающая фармацевтически эффективное количество длительно действующего конъюгата интерферона альфа, в котором интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина ковалентно связаны вместе посредством непептидного полимера, и стабилизатор без альбумина, состоящий из буфера, сахарного спирта в концентрации от 1 до 10% (мас./об.), неионного поверхностно-активного вещества в концентрации от 0,001 до 0,05% (мас./об.) и изотонического средства в концентрации от 5 до 200 мМ на основании общего объема жидкой композиции;

где непептидный полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации; и

где буфер представляет собой цитратный буферный раствор;

сахарный спирт представляет собой маннит;

неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер или полисорбат; и

изотоническое средство представляет собой хлорид натрия.

2. Жидкая композиция по п. 1, где интерфероном альфа является нативный IFNα, производное нативного IFNα или полипептид, имеющий активность, сходную с таковой нативного IFNα.

3. Жидкая композиция по п. 1, где Fc фрагмент иммуноглобулина получают из иммуноглобулина, выбираемого из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.

4. Жидкая композиция по п. 3, где Fc фрагмент иммуноглобулина представляет собой гибрид двух или более доменов, выбираемых из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE, и IgM, причем указанные домены имеют различное происхождение.

5. Жидкая композиция по п. 3, где Fc фрагмент иммуноглобулина представляет собой димер или мультимер одноцепочечного иммуноглобулина, состоящий из доменов одинакового происхождения.

6. Жидкая композиция по п. 3, где Fc фрагментом иммуноглобулина является Fc фрагмент IgG4.

7. Жидкая композиция по п. 6, где Fc фрагментом иммуноглобулина является агликозилированный Fc фрагмент IgG4.

8. Жидкая композиция по п. 1, где буфер варьирует по pH от 4 до 7.

9. Жидкая композиция по п. 1, где буфер варьирует по pH от 5,2 до 7.

10. Жидкая композиция по п. 1, где неионным поверхностно-активным веществом является полисорбат 80.

11. Жидкая композиция, включающая фармацевтически эффективное количество длительно действующего конъюгата интерферона альфа, в котором интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина ковалентно связаны вместе посредством непептидного полимера, и стабилизатор без альбумина, состоящий из буфера, сахарного спирта в концентрации от 1 до 10% (мас./об.), неионного поверхностно-активного вещества в концентрации от 0,001 до 0,05% (мас./об.), изотонического средства в концентрации от 5 до 200 мМ на основании общего объема жидкой композиции и метионина;

где непептидный полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации; и

где буфер представляет собой цитратный буферный раствор;

сахарный спирт представляет собой маннит;

неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер или полисорбат; и

изотоническое средство представляет собой хлорид натрия.

12. Жидкая композиция по п. 11, где метионин варьирует в концентрации от 0,005 до 0,1% (мас./об.) на основании общего объема жидкой композиции.

13. Жидкая композиция, включающая фармацевтически эффективное количество длительно действующего конъюгата интерферона альфа, в котором интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина ковалентно связаны вместе посредством непептидного полимера, и стабилизатор без альбумина, состоящий из буфера, сахарного спирта в концентрации от 1 до 10% (мас./об.), неионного поверхностно-активного вещества в концентрации от 0,001 до 0,05% (мас./об.), изотонического средства в концентрации от 5 до 200 мМ на основании общего объема жидкой композиции и компонента, выбранного из группы, состоящей из сахаров, многоатомных спиртов и их комбинаций;

где непептидный полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации; и

где буфер представляет собой цитратный буферный раствор;

сахарный спирт представляет собой маннит;

неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер или полисорбат; и

изотоническое средство представляет собой хлорид натрия.

14. Жидкая композиция, включающая фармацевтически эффективное количество длительно действующего конъюгата интерферона альфа, в котором интерферон альфа ковалентно связан с Fc фрагментом иммуноглобулина посредством полиэтиленгликоля, и стабилизатор, содержащий цитратный буферный раствор, маннит в концентрации от 1 до 10% (мас./об.), полисорбат 80 в концентрации от 0,001 до 0,05% (мас./об.), хлорид натрия в концентрации от 5 до 200 мМ на основании общего объема жидкой композиции и метионин.

15. Способ получения жидкой композиции по любому из пп. 1-13, включающий:

смешивание длительно действующего конъюгата интерферона альфа, в котором интерферон альфа и Fc фрагмент иммуноглобулина ковалентно связаны вместе посредством непептидного полимера, со стабилизатором без альбумина, содержащим сахарный спирт, неионное поверхностно-активное вещество и изотоническое средство;

где непептидный полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации; и

где буфер представляет собой цитратный буферный раствор;

сахарный спирт представляет собой маннит;

неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер или полисорбат; и

изотоническое средство представляет собой хлорид натрия.

16. Стабилизатор для стабилизации длительно действующего конъюгата интерферона альфа, где стабилизатор состоит из буфера, сахарного спирта в концентрации от 1 до 10% (мас./об.), неионного поверхностно-активного вещества в концентрации от 0,001 до 0,05% (мас./об.), изотонического средства в концентрации от 5 до 200 мМ на основании общего объема стабилизатора и не содержит альбумина, причем указанный длительно действующий конъюгат интерферона альфа содержит интерферон альфа, ковалентно связанный с Fc фрагментом иммуноглобулина посредством непептидного полимера;

где непептидный полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации; и

где буфер представляет собой цитратный буферный раствор;

сахарный спирт представляет собой маннит;

неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер или полисорбат; и

изотоническое средство представляет собой хлорид натрия.

17. Способ стабилизации длительно действующего конъюгата интерферона альфа с помощью стабилизатора, где стабилизатор состоит из буфера, сахарного спирта в концентрации от 1 до 10% (мас./об.), неионного поверхностно-активного вещества в концентрации от 0,001 до 0,05% (мас./об.), изотонического средства в концентрации от 5 до 200 мМ на основании общего объема стабилизатора и не содержит альбумина, и длительно действующий конъюгат интерферона альфа содержит интерферон альфа, ковалентно связанный с Fc фрагментом иммуноглобулина посредством непептидного полимера;

где непептидный полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации; и

где буфер представляет собой цитратный буферный раствор;

сахарный спирт представляет собой маннит;

неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер или полисорбат; и

изотоническое средство представляет собой хлорид натрия.



 

Похожие патенты:
Группа изобретений относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности, а именно к фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций, содержащей в качестве активного начала глибенкламид в количестве 0,0004-0,004 г на мл раствора и в качестве вспомогательных веществ гидроксиэтилкрахмал 200/0,5 в количестве 0,025-0,075 г на мл раствора и воду для инъекций (остальное), а также к способу получения такой фармацевтической композиции, согласно которому в воду для инъекций, предварительно нагретую до 85-90°C, добавляют гидроксиэтилкрахмал 200/0,5 и перемешивают до полного растворения, добавляют порошок глибенкламида и перемешивают при температуре 75-85°C до полного растворения, добавляют воду для инъекций до получения конечного объема раствора и снова перемешивают, полученный раствор выдерживают в течение 35-40 минут при температуре 75-85°C, охлаждают до 20-30°C, стерилизуют методом фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и фасуют в ампулы, которые дополнительно стерилизуют в течение 8 минут при температуре 120°C.

Изобретение относится к фармацевтике, в частности к набору сухого концентрата для получения медицинского раствора, применению набора для получения медицинского раствора, а также к способу получения медицинского раствора на основе набора сухого концентрата.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначена для лечения аллергического конъюнктивита глаз. Офтальмологическая композиция для лечения аллергического конъюнктивита глаз содержит по меньшей мере 0,67% масс./об., но не больше чем 1,0% масс./об.

Изобретение относится к фармацевтической композиции на основе соединения палладия. Указанная композиция содержит ацидокомплекс палладия формулы: (С5Н12NO)2[PdCI4] в концентрации 0,2% в 0,9% водном растворе хлорида натрия.
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и медицине и описывает способ получения композиции для парентерального введения, содержащей (мас.%): 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат как активный компонент - 4,0-6,0; стабилизатор - натрия метабисульфит - 0,015-0,045 и воду как растворитель - до 100.
Изобретение относится к области медицины, именно способу производства инъекционной формы препарата хондроитина сульфата. Способ производства инъекционной формы препарата хондроитина сульфата (ХС), включающий растворение ХС, бензилового спирта в инъекционной воде, процесс ведут с использованием азота, растворение компонентов препарата проводят последовательно в одном реакторе, при этом субстанцию ХС растворяют в инъекционной воде с температурой 25±5°С, затем прибавляют бензиловый спирт, устанавливают рН в интервале значений от 6,0 до 7,5 и доводят объем инъекционной водой так, чтобы конечный раствор содержал 90-110 мг/мл хондроитина сульфата и 8-11 мг/мл бензилового спирта, полученную смесь подвергают стерилизующей фильтрации, разливают в ампулы и запаивают.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лекарственным средствам для лечения артрологических заболеваний. Средство включает Na-соль хондроитина сульфата с характеристической вязкостью (η), равной 0,01-0,05 м3/кг, в количестве 4-12 мас.%, бензиловый спирт в качестве консерванта в количестве 0,8-1,2 мас.% и воду остальное.

Настоящая группа изобретений относится к области фармацевтики. Описан биодоступный состав в форме спрея для перорального введения для лечения легочной артериальной гипертензии и/или индуцированной селективными ингибиторами обратного захвата серотонина (СИОЗС-индуцированной) сексуальной дисфункции.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ применения водных растворов уксусной кислоты в концентрациях от 3 до 15 процентов для лечения полипов в пазухах носа и для предотвращения от их повторных нарастаний, заключающийся в приготовлении 3-15-процентного водного раствора уксусной кислоты, где пары уксусной кислоты вдыхают сначала через одну из ноздрей так, чтобы эти пары проникли строго лишь в зону расположения полипа, затем зажимают эту ноздрю пальцем, далее таким же образом вдыхают пары уксусной кислоты второй ноздрей, зажимают и ее другим пальцем, после задерживают дыхание на 0,5-2 минуты или в течение того же промежутка времени производят дыхание через рот, после чего выдыхают пары уксусной кислоты и осуществляют указанные действия 3-5 раз в сутки в течение 1-2 недель.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтике, и может быть использовано при лечении воспалительных и дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата, вызванных отложением кальция.

Изобретение относится к области медицины, а именно к ветеринарии и иммунологии, и может быть использовано для получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки. Для этого проводят иммунизацию кроликов разовой дозой штамма В.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлено антитело к BLyS.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения содержащей IgM композиции иммуноглобулинов из фракции плазмы.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения местнораспространенного нерезектабельного рака пищевода. Для этого больным в условиях процедурного кабинета после обработки кожи передней грудной стенки раствором антисептика вводят внутрикожно по 0,3 мл аутологичной дендритно-клеточной вакцины по две инъекции с каждой стороны грудины примерно между III и IV, IV и V ребрами.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его фрагменту, где антитело или его фрагмент специфически связывается с белком CAPRIN-1, ДНК, его кодирующему, а также к конъюгату указанного антитела или его фрагмента с противоопухолевым средством.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложены выделенные полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепи антитела против человеческого EGFR; анти-EGFR антитело и фрагмент антитела; а также вектор, клетка-хозяин и способ получения анти-EGFR антитела или его фрагмента.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описано блокирующее AGR2 моноклональное антитело и, в частности, гуманизированное моноклональное антитело для блокирования AGR2.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложено гуманизированное антитело и его антиген-связывающий фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором фолиевой кислоты 1 (FOLR1) человека и охарактеризованные аминокислотными последовательностями участков, определяющих комплементарность с антигеном (CDR).

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описаны антитела, специфично связывающиеся с CD37 человека и CD37 макаки.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой cпособ лечения ожирения, никотиновой зависимости и снижения тревоги при отмене курения путем введения в организм лекарственного средства центрального и периферического действия на основе активированной-потенцированной формы антител.
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии – аллергологии, и может быть использовано для лечения детей, страдающих частыми эпизодами острых респираторных инфекций на фоне вторичной иммунной недостаточности.
Наверх