Способ определения генотоксичности химических веществ

Изобретение относится к способу определения генотоксичности химических веществ. Способ предусматривает добавление рибофлавина до конечной концентрации 1⋅10-7 мг/мл - 1⋅10-5 мг/мл в культуру Escherichia coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri или Photorabdus luminescens поставлен под контроль промотора pColD. Осуществляют добавление тестируемого вещества и определение интенсивности люминесценции полученной суспензии и контроля. О повреждающем действии тестируемого вещества судят по отклонению интенсивности люминесценции суспензии от контроля. Изобретение обеспечивает увеличение фактора индукции. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к определению генотоксичности химических веществ, то есть к определению повреждения генетической информации химическими веществами, в результате которого микрофлора в организме пациента может в результате действия подпороговых концентраций генотоксических препаратов приобрести ряд мутаций, повышающих ее патогенность либо увеличивающих резистентность. Изобретение может быть использовано для оценки побочных эффектов лекарственных препаратов и других химических веществ.

Известны способы определения генотоксичности химических веществ на основе биосенсоров (культур клеток бактерий, в которых присутствуют гены, обеспечивающие свечение бактериальной клетки), свечение которых усиливается или подавляется под действием определенных химических веществ (патент RU №2179581, МПК C12Q 1/02, C12Q 1/66, 2002 г.; патент RU №2297450, МПК C12N 1/21, 2007 г.; патент RU №2355760, МПК C12N 1/21, 2009 г.; патент RU №2179581, МПК C12Q 1/02, 2002 г.).

Наиболее близким по выполнению является способ определения генотоксичности химических веществ, включающий инкубацию тестируемого химического вещества с рекомбинантным штаммом Е. coli, несущим плазмиду, в которой lux оперон находится под контролем SOS-lux-промотора, измерение интенсивности биолюминесценции контрольных культур и содержащих тестируемое химическое вещество и определение генотоксичности по фактору индукции I=Lc/Lk, где I - фактор индукции; Lc - интенсивность свечения суспензии SOS-lux штамма, содержащего тестируемое химическое вещество; Lк - интенсивность свечения контрольной суспензии SOS-lux штамма (Анализ SOS-ответа клеток E. coli с помощью бактериальной люминесценции. Всесоюз. конф. "Генетические исследования действия биологических, химических и физических факторов окружающей среды", по проблеме "Человек и Биосфера ", Киев, 1988, с. 95).

Недостатком данного способа является недостаточно высокий фактор индукции (усиление биолюминесценции анализируемой пробы по сравнению с биолюминесценцией контрольной пробы).

Техническим результатом изобретения является увеличение фактора индукции.

Технический результат достигается тем, что способ определения генотоксичности химических веществ, характеризуется тем, что в культуру Escherichia coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi, Vibriofischeri или Photorabdusluminescens поставлен под контроль промотора pColD, добавляют рибофлавин до конечной концентрации 1⋅10-7 мг/мл - 1⋅10-5 мг/мл, добавляют тестируемое вещество в концентрации, не подавляющей жизнедеятельность Escherichia coli (определяемую экспериментально) и определяют интенсивность люминесценции полученной суспензии и контроля, а о повреждающем действии тестируемого вещества судят по отклонению интенсивности люминесценции суспензии от контроля (повреждающее действие отсутствует, если нет отклонения от контроля).

Культуру предварительно выращивают предпочтительно на жидкой питательной полноценной среде Луриа-Бертани.

Культуру после выращивания доводят предпочтительно до плотности 0,01-0,1 единица Мак-Фарланда и концентрации 3⋅107-3⋅106 клеток/мл.

Контроль содержит в качестве вещества сравнения (контрольного вещества) предпочтительно деионизированную воду в эквивалентном объеме.

Отличием предлагаемого способа является добавление в культуру клеток Е. coli, несущей плазмиду pColD-lux, в которой lux оперон поставлен под контроль промотора pColD, рибофлавина в концентрации 1⋅10-7 мг/мл - 1⋅10-5 мг/мл.

Рибофлавин известен в качестве кофактора фермента люциферазы, моноонсигеназы КФ 144413 (J.W. Hastings. 1983. "Biological diversity, chemical mechanisms, and the evolutionary origins of bioluminescent systems." Journal of Molecular Evolution, v. 19: p.309-321). Однако не известен характер влияния рибофлавина (усиление или ослабление люминесценции) и не известны пределы концентраций, способствующие увеличению фактора индукции в отношении бактерий Escherichia coli К12 MG1655, содержащей плазмиду pColD-lux, с опероном Photobacterium leiognathi, Vibriofischeri или Photorabdusluminescens.

Ниже приведены примеры осуществления способа.

Пример 1. Определение генотоксичности диоксидина по способу прототипа.

В качестве тестируемого вещества взято генотоксическое вещество диоксидин в концентрации 2,25⋅10-5 М (Фонштейн Л.М., Ревазова Ю.А., Золотарева Г.Н. и др. Изучение мутагенной активности диоксидина // Генетика. 1985. Т. 21. №5. С. 11-19).

Культуру Е. coli выращивают на среде LBP (пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлористый натрий - 10 г на 1 л раствора; pH 7.0) в присутствии 50 мкг/мл ампициллина. В 50 мл среды вносят 0,1 мл ночной культуры Е. coli С 600 и инкубируют в термостате в течение одного часа при t=37°C. Затем добавляют среду LBP до достижения оптической плотности культуры 0,1 (550 нм). Аликвоты этой культуры по 1 мл переносят в стерильные пробирки и добавляют в них по 10 мкл тестируемого химического вещества. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Пробирки помещают на 1 час в термостат при t=37°C. В процессе инкубации пробирки несколько раз встряхивают.

По окончании инкубации культуры охлаждают до комнатной температуры. На люминометре LM-01T (Immunotech, Чехия) измеряют интенсивности биолюминесценции контрольных культур и содержащих анализируемое химическое вещество. Получают следующие данные. Интенсивность люминесценции для диоксидина составляет 118158,6 у.е., для контроля 311,6 у.е.. То есть, фактор индукции равен 379,2.

Пример 2.

В качестве тестируемого вещества взято генотоксическое вещество диоксидин (Фонштейн Л.М., Ревазова Ю.А., Золотарева Г.Н. и др. Изучение мутагенной активности диоксидина // Генетика. 1985. Т. 21. №5. С. 11-19).

Культуру клеток Е. coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон (оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi) поставлен под контроль промотора pColD, растят на жидкой питательной полноценной среде Луриа-Бертани (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. // М., Мир, 1984, 480 с.) при постоянной аэрации на круговой качалке при 37°C. В среду добавляют антибиотик ампициллин (100 мкг/мл). Ночную культуру разбавляют свежей средой до плотности 0,01 - единица Мак-Фарланда (концентрация 3⋅107 клеток/мл), и добавляют рибофлавин до конечной концентрации 1⋅10-6 мг/мл. Аликвоты этой культуры (по 90 мкл) переносят в ячейки (стрипы) планшета и добавляют в них по 10 мкл диоксидина концентрацией 2,25⋅10-5 М (указанная концентрация меньше, чем терапевтическая [Приказ Минздрава СССР от 29.06.1976 № 647 О разрешении к медицинскому применению новых лекарственных средств]). В контрольные ячейки добавляют 10 мкл деионизированной воды.

После обработки планшет с пробами помещают в люминометр, инкубируют при 30°C и измеряют интенсивность биолюминесценции (Люминесценцию измеряли на люминометре LM-01T (Immunotech, Чехия). Интенсивность люминесценции для пробы с диоксидином составляет 191895,3 у.е., а для контроля 328,0 у.е.. То есть, фактор индукции как их соотношение равен 585,0. Интенсивность люминесценции пробы с диоксидином без добавления рибофлавина (положительный контроль) составляет 135284,1 у.е. То есть, фактор индукции равен 412,5.

Аналогично ночную культуру разбавляют свежей средой до плотности 0,1 единица Мак-Фарланда (концентрация 3⋅106 клеток/мл).

Аналогично в качестве lux оперона используют оперон биолюминесценции морских фотобактерий Vibriofischeri и Photorabdusluminescens.

Результаты по показателям интенсивности свечения аналогичны. На рис. 1 приведены значения фактора индукции анализируемого вещества - диоксидина - в концентрации 2,25⋅10-5 М при различных концентрациях рибофлавина и без добавления рибофлавина к культуре. Как видно из рис. 1, при заявляемых концентрациях (1⋅10-7-1⋅10-5 мг/мл) фактор индукции превышает таковой без добавления рибофлавина. То есть, добавление рибофлавина в концентрациях 1⋅10-7-1⋅10-5 мг/мл позволяет увеличить интенсивность свечения тестируемой пробы.

Таким образом, способ позволяет увеличить фактор индукции по сравнению со способом прототипа (для которого фактор индукции в соответствии с примером 1 составляет 379,2) и может быть использован для определения генотоксичности химических веществ (в частности, диоксидина).

1. Способ определения генотоксичности химических веществ, характеризующийся тем, что в культуру Escherichia coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri или Photorabdus luminescens поставлен под контроль промотора pColD, добавляют рибофлавин до конечной концентрации 1⋅10-7-1⋅10-5 мг/мл, добавляют тестируемое вещество и определяют интенсивность люминесценции полученной суспензии и контроля, а о повреждающем действии тестируемого вещества судят по отклонению интенсивности люминесценции суспензии от контроля.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культуру предварительно выращивают на жидкой питательной полноценной среде Луриа-Бертани.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культуру после предварительного выращивания доводят до плотности 0,01-0,1 единица Мак-Фарланда и концентрации 3⋅107-3⋅106 клеток/мл.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что контроль в качестве вещества сравнения содержит деионизированную воду в эквивалентном объеме.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен метод выявления люциферазы в биологических образцах с использованием 3-гидроксигиспидина или 3-гидроксибиснориангонина в качестве люциферина.

Группа изобретений относится к области генной инженерии, в целом к трансгенным конструкциям, трансгенным животным, отличным от человека, способам количественного анализа активации GPCR лигандов неинвазивно в интактных животных, тканевых срезах или в нативных клетках, используя трансгенную модель, содержащую систему биолюминесцентного трансгена-репортера, которая является чувствительной к модуляции путей после связывания лиганда с рецепторами GPCR.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к реагенту для определения аденозин-5'-трифосфата. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использован в химии, биохимии, медицине, микробиологии, экологии и сельском хозяйстве для анализа веществ биолюминесцентным методом.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биокатализаторам на основе иммобилизованных клеток бактерий, и может быть использовано для получения иммобилизованного биокатализатора, предназначенного для определения различных токсикантов.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в различных аналитических системах, основанных на явлении биолюминесценции. .

Изобретение относится к области биохимии. .
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине, экологии, фармацевтике и пищевой промышленности. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах, которые имеют широкое распространение в природе: в воздухе, почве, водоемах, составе естественной микрофлоры высших организмов и среди контаминантов, вызывающих порчу различных объектов.

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химии, биохимии, медицине, гистологии, микробиологии, экологии и сельском хозяйстве для анализа веществ биолюминесцентным методом.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к штамму Escherichia coli BL21(DE3)GoldpETCYPopti. Настоящий штамм является продуцентом рекомбинантного циклофилина А человека.

Группа изобретений относится к рекомбинантному микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему способностью продуцировать путресцин, и способу получения путресцина. В указанном рекомбинантном микроорганизме гидролазная активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 19, удалена.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой модифицированный полинуклеотид, кодирующий аспартаткиназу (LysC), где инициирующий кодон полинуклеотида заменен на ATG.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и касается набора lux-биосенсоров для определения генотоксичных продуктов неполного окисления НДМГ в окружающей среде.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному варианту сериновой протеазы, содержащему, по меньшей мере, от пяти до восьми аминокислотных замен в положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 12, 14, 15, 16, 24, 35, 36, 39, 49, 54, 61, 63, 64, 65, 67, 69, 75, 76, 78, 79, 81, 86, 92, 93, 99, 109, 112, 121, 123, 125, 127, 143, 159, 179, 181, 184, 189, где заменяющая аминокислота в указанном положении выбрана из группы, состоящей из F, G, L, V, I, S, A, Y, K, W, M, P, N, Q, T, E, H, R, C, N и D, где указанные замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69 В4, а также к молекуле нуклеиновой кислоты, ее кодирующей.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма Escherichia coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA - продуцента рекомбинантного циклофилина А человека. Охарактеризованный штамм получен путем трансформации клеток штамма BL21(DE3)Gold плазмидой pETmin-CypA.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен полипептид D-лактатдегидрогеназы, который содержит полипептид с аминокислотной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне не менее 80% с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, раскрытые в описании, где указанный полипептид обладает D-лактатдегидрогеназной активностью.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен трансформированный микроорганизм - дрожжи Saccharomyces для получения этанола, где упомянутый микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу, и указанный микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилулокиназу, или указанный микроорганизм трансформирован промотором, способным повышать экспрессию эндогенной ксилулокиназы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена нуклеиновая кислота, кодирующая белок, обладающий ацетил-СоА- карбоксилазной активностью, компенсирующей недостаток ацетил-СоА-карбоксилазной активности в дрожжах, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность: (a) кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (b) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, комплементарной SEQ ID NO:1; (c) SEQ ID NO:1; и (d) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок SEQ ID NO:2; где SEQ ID NO:1 и 2 раскрыты в описании.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ММР9-1562 C>Т (rs3918242).

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий активностью изопренсинтазы.

Изобретение относится к способу определения генотоксичности химических веществ. Способ предусматривает добавление рибофлавина до конечной концентрации 1⋅10-7 мгмл - 1⋅10-5 мгмл в культуру Escherichia coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri или Photorabdus luminescens поставлен под контроль промотора pColD. Осуществляют добавление тестируемого вещества и определение интенсивности люминесценции полученной суспензии и контроля. О повреждающем действии тестируемого вещества судят по отклонению интенсивности люминесценции суспензии от контроля. Изобретение обеспечивает увеличение фактора индукции. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

Наверх