Способ выявления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для выявления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера. Женщинам двукратно с интервалом в один месяц на 5-9 день менструального цикла внутрикожно вводят партнерские лимфоциты в однократной дозе 50 млн клеток в 10-12 точек ладонной части предплечья. Затем через две недели получают сыворотку крови, в которую добавляют в соотношении 1:1 выделенные из цельной периферической венозной крови лимфоциты (CD3⁺) партнера, полученные в градиенте плотности фиколл-верографин 1,077 г/см³ в течение 10 минут при 1600 g в соотношении 500 мкл фиколла к 1000 мкл крови, разведенной в 2 раза фосфатно-солевым раствором. Далее инактивированную женскую сыворотку с полученными лимфоцитами партнера инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°С, после чего добавляют антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина G в разведении 1:4 с фосфатно-солевым раствором в объеме 1:1 суспензии лимфоцитов и инкубируют в течение 30 минут при температуре 4°С. Методом проточной цитометрии определяют процент партнерских лимфоцитов (CD3⁺), покрытых антителами к Fc-фрагменту иммуноглобулина G партнера, которые соответствуют уровню антиотцовских антител в сыворотке женщин. Изобретение позволяет отразить динамику появления антиотцовских антилейкоцитарных антител после иммунизации указанных женщин. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области клинико-лабораторной диагностики патологии беременности и касается оценки состояния иммунной системы во время предгестационной подготовки женщин с идиопатическим привычным выкидышем.

В качестве одной из причин, приводящих к развитию патологии раннего гестационного периода, заключающейся в нарушении процессов имплантации и плацентации, рассматривается слабая аллогенная стимуляция иммунной системы матери антигенами плода отцовского происхождения. В частности, наличие у супругов совпадающих аллелей генов системы гистосовместимости человека HLA, уменьшающее взаимную аллогенную стимуляцию, обсуждалось в качестве аллоиммунного фактора, приводящего к нарушению нормального протекания беременности /1, 2/. В настоящее время развитие иммунного ответа на отцовские аллоантигены признается необходимым условием нормальных взаимоотношений матери и развивающегося плода /3/.

Для усиления специфического ответа лимфоцитов женщины на аллоантигены партнера в период предгестационной подготовки в супружеских парах с привычным выкидышем используется иммуноцитотерапия (ИЦТ) - иммунизация женщин лимфоцитами полового партнера /4, 5/. Эта процедура проводится в парах с привычным выкидышем неясного генеза, то есть с идиопатическим привычным выкидышем. Данный диагноз ставится при исключении генетических, анатомических, эндокринных, инфекционных и аутоиммунных причин выкидыша. При наличии аллоиммунных факторов нарушения гестационного процесса, таких как совместимость супругов по HLA-антигенам или высокий уровень натуральных киллерных клеток с фенотипом CD56⁺ у женщины, ставят диагноз идиопатического привычного выкидыша аллоиммунного генеза.

Один из показателей формирования ответа иммунной системы женщины на введение аллогенных клеток - появление в сыворотке крови антител к HLA-антигенам лейкоцитов партнера, или антиотцовских антител (АОАТ). Однако мнения о возможности использования АОАТ в качестве маркера эффективности иммунизации привычного невынашивания беременности противоречивы /1, 6/. Во-первых, потому, что для регистрации АОАТ используются разные методы /7/. Во-вторых, потому, что отсутствие АОАТ у первобеременных с физиологическим течением беременности в первом триместре гестации /8/ можно считать признаком необязательности их наличия для нормального развития беременности и, соответственно, их обнаружение может не быть признаком нормальной иммунной реакции матери на аллоантигены плода на ранних сроках. В-третьих, в иммунизации привычного выкидыша используются лимфоциты и полового партнера, и доноров в разных дозах (от 50 до 400 млн клеток в процедуре), при разных способах иммунизации (подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной) с разным количеством иммунизации (от одной до девяти) с помощью контроля разных иммунологических показателей (блокирующие антитела, цитотоксические антитела, определение доли натуральных киллерных клеток) /9/. Известно, что продукция антител при последовательных иммунизациях - это динамичный процесс, развивающийся в течение нескольких месяцев, и выбор оптимального срока тестирования также становится ключевым фактором в оценке последствий иммунизации с помощью выявления уровня АОАТ.

Выявление аллогенных антител в сыворотке реципиента, способных связываться с поверхностными антигенами лимфоцитов донора, с помощью проточной цитофлуорометрии (ПЦМ) широко используется в трансплантологии для выявления предсуществующих антител, являющихся фактором риска при пересадке органов /10/. В отличие от трансплантологии появление определенного уровня антител к аллоантигенам плода в процессе иммунизации может быть признаком нормализации иммунного ответа матери, который после иммунизации будет способствовать пролонгированию беременности. С этой точки зрения отсутствие АОАТ у первобеременных не означает, что чувствительные к появлению отцовских антигенов системы материнского организма, ответственные за нормальное взаимодействие с развивающимся плодом, не стимулированы. Это означает, что АОАТ, регистрируемые таким способом, не отражают природы стимуляции материнской иммунной системы аллоантигенами плода в условиях нормально развивающейся беременности.

Метод определения АОАТ с помощью ПЦМ заключается в определении связывания флуоресцентно-меченых антител к иммуноглобулину G (IgG) женщины с антителами IgG-класса на поверхности лимфоцитов партнера. Развитие многоцветной флуорометрии привело к усовершенствованию метода и определило возможность выявления антител на определенных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток /11/. Об использовании этих подходов для выявления АОАТ сообщалось лишь в единичных работах /12, 13/. Модификации метода ПЦМ заключаются в использовании разного времени и температуры инкубирования сыворотки реципиента с клетками донора, а также различных разведений тестируемых сывороток и различных концентраций клеток /14/.

Наиболее близок патентуемому метод /13/.

Задача настоящего изобретения - предложить метод определения антиотцовских антилейкоцитарных антител, отражающий динамику их появления после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера.

Цель настоящего изобретения - создание способа оценки появления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем во время подготовки к беременности.

Поставленная цель достигается двукратным внутрикожным введением женщинам с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитов полового партнера с интервалом в один месяц;

инкубированием лимфоцитов полового партнера in vitro с сывороткой пациентки после предгестационной иммунизации;

использованием прямых меченных фикоэритрином (РЕ) антител к CD3⁺-лимфоцитам;

использованием прямых меченных флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) антител к Fc-фрагменту иммуноглобулина G (IgG);

регистрацией СD3⁺-лимфоцитов, несущих на своей поверхности антитела к HLA-антигенам с помощью проточной цитометрии. Уровень АОАТ в сыворотке женщины соответствует доле мужских лимфоцитов, покрытых антителами к Fc-фрагменту IgG.

Кровь у партнеров для анализа забирают натощак из локтевой вены.

У женщин кровь забирают на 18-22 день менструального цикла. Сыворотку крови женщин получают после образования в течение 30 минут при комнатной температуре кровяного сгустка, который осаждают центрифугированием при 900g в течение 10 минут. Перед проведением анализа сыворотку инактивируют нагреванием в течение 30 минут при 56°С.

Лимфоциты из цельной крови партнеров выделяют стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием смеси фиколл-верографин плотностью 1,077 /15/.

Для определения АОАТ лимфоциты партнера инкубируют с сывороткой крови женщины. В качестве контроля неспецифического связывания используют инактивированную пулированную АВ-сыворотку (Sigma, США). Определяют долю CD3⁺-лимфоцитов, покрытых антителами (Beckman Coulter, США). Анализ проводят на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Beckton Dickinson, США).

Пример

Определение АОAT проводили у пациентки X. 32 лет с идиопатическим привычным выкидышем. В анамнезе у пациентки было 4 беременности, две из которых закончились самопроизвольным выкидышем на малом сроке и две неразвивающиеся беременности на сроке 7-6 недель.

АОАТ определяли до иммунизации лимфоцитами партнера и через две недели после 2-й процедуры иммунизации (иммунизацию проводили двукратно в течение двух менструальных циклов подряд на 5-9 день цикла).

Кровь для анализа у пациентки X. и ее партнера брали натощак из локтевой вены, у женщины - в пробирку с факторами свертывания крови, у партнера - в пробирку с антикоагулянтом (гепарином).

Процедура определения АОАТ

1. Сыворотку крови женщины инактивировали нагреванием на водяной бане в течение 30 минут при 56°С.

2. Выделяли из периферической крови мужчины лимфоциты стандартным способом в градиенте плотности фиколл-верографин 1,077 г/см³ в пробирках типа Эппендорф в течение 30 минут при 900 g (500 мкл фиколла + 500 мкл крови + 500 мкл фосфатносолевого раствора (ФСР)).

3. Отмывали клетки однократно раствором ФСР при 23°С с 1% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) в течение 10 минут при 600 g.

4. Добавляли 500 мкл ФСР с 1% ФБС.

5. В камере Горяева подсчитали количество выделенных лимфоцитов партнера. Концентрация клеток для реакции должна быть 10⁶ кл/мл.

6. Приготовили две конические центрифужные пробирки объемом 14 мл, в каждую добавили по 25 мкл лимфоцитов партнера из готовой клеточной суспензии.

7. Добавили в одну пробирку 25 мкл сыворотки крови женщины, в другую - 25 мкл пулированной АВ-сыворотки.

8. Инкубировали 30 минут при температуре 37°С на водяной бане.

9. Отмыли три раза по 4 мл ФСР с 1% ФБС при 23°С в течение 10 минут при 600 g. После последней отмывки объем клеточной суспензии должен быть не менее 25 мкл.

10. Добавили претитрованные антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина человека (анти-Human-IgG F9512 фирмы Sigma, США) в объеме 25 мкл на 25 мкл суспензии клеток (общее разведение F9512 - 1:4, т.е. 1,25 мкл исходных AT и 23,75 мкл ФСР 4°С).

11. Инкубировали 30 минут в защищенном от света месте при 4°С.

12. Отмыли однократно ФСР с 1% ФБС объемом 4 мл в течение 10 минут при 600 g при 4°С.

13. Добавили 100 мкл ФСР с 1% ФБС.

14. Перенесли содержимое в пробирки для накопления на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Beckton Dickinson, США). Пример цитограмм для анализа представлен на рис. 1.

Результаты определения АОAT у женщин с привычным выкидышем (ПВ) во время предгестационной подготовки после разного количества иммунизации представлены на рис. 2.

Всего обследовано 112 пациенток с ПВ.

Наглядно демонстрируется низкий уровень АОАТ у женщин с ПВ до назначения лечения. Проведение процедуры иммунизации приводит к постепенному значимому повышению уровня АОАТ по сравнению с исходным. Уровень АОАТ, достигнутый после второй процедуры ИЦТ, не изменяется после 2, 3 и 4 иммунизаций.

На рис. 3 представлена динамика АОАТ у пациенток с ПВ после двукратной иммунизации в предгестационной подготовке и в первом триместре наступившей беременности (n=53).

Как видно из рис. 3, до назначения иммунизации уровень АОАТ у женщин с привычным выкидышем был низким.

Не обнаружено различий в уровне АОАТ у женщин с привычным выкидышем до назначения лечения и в группе фертильных здоровых женщин, имеющих от одного до трех здоровых детей в анамнезе (16,6±3,5, n=53 и 24,2±6,7, n=20).

Во время предгестационной подготовки уровень АОАТ в сыворотке пациенток с ПВ постепенно повышался до максимального от процедуры к процедуре. Уровень АОАТ, достигнутый после второй процедуры ИЦТ, сохранялся стабильным у забеременевших в дальнейшем женщин на протяжении всего первого триместра. Отличий уровня АОАТ после последней иммунизации вне беременности от уровней АОАТ на разных сроках первого триместра не выявлено. Во время наступившей беременности уровень АОАТ сохраняется на максимуме (93,2±2,1%).

Также нами выявлено, что сходная динамика и неотличающиеся уровни АОАТ были как у женщин с состоявшимся самопроизвольным выкидышем, так и у женщин с пролонгированной беременностью (табл. 1), но различий в СИФ позитивных клетках в этих группах не обнаружено.

На основании изложенных результатов по анализу АОАТ после 2-кратной и 4-кратной аллоиммунизации женщин с ПВ в предгестационной подготовке можно сделать заключение о достаточности двух таких процедур для стимуляции иммунной системы женщины HLA-антигенами супруга, регистрируемой по уровню АОАТ.

Список источников

1. Nielsen H.S., Witvliet M.D., Steffensen R. et al. //J.Reprod.Immunol. - 2010. - V. 87, №1. - 2. - P. 67-73.

2. Ober C., Hyslop T., Elias S. et al. //Hum. Reprod. - 1998. - V. 13, №1. - P. 33-8.

3. Druckmann R., Druckmann M.A. Progesterone and the immunology of pregnancy. J Steroid Biochem Mol Biol. 2005 Dec; 97(5):389-96.

4. Говалло В.И., Сидельникова В.М. «Иммунизация беременных женщин аллогенными лимфоцитами мужа как метод профилактики самопроизвольных выкидышей». Акушерство и гинекология, №12, с. 25-27, 1983 г.

5. Сидельникова В.М. Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием: Метод. пособия и клин. рекомендации. - М: МЕДпресс-информ, 2011. - 224 с.

6. Bartel G., Walch K., Wahrmann М., Pils S., L., Polterauer S., Tempfer C., G.A. Prevalence and qualitative properties of circulating anti-human leukocyte antigen alloantibodies after pregnancy: no association with unexplained recurrent miscarriage. Hum Immunol. 2011 Feb; 72(2): 187-92.

7. Lashley E.E., Meuleman T., Claas F.H. Beneficial or Harmful Effect of Antipaternal Human Leukocyte Antibodies on Pregnancy Outcome? A Systematic Review and Meta-Analysis. Am J Reprod Immunol. 2013 Mar 18.

8. Кречетова Л.В., Хачатрян Н.А., Тетруашвили Н.К., Вторушина В.В., Степанова Е.О., Голубева Е.Л., Николаева М.А., Сухих Г.Т. Динамика выработки антилейкоцитарных антител к отцовским антигенам при иммунизации аллогенными клетками женщин с привычным выкидышем. Акушерство и гинекология 2015, №3, 16-20.

9. Early Pregnancy Edited by Roy G. Farquharson, Mary D. Stephenson Cambridge University Press, 2012/ Cambridge Books Online http://ebooks.cambridge.org/ Book DOI: http://dx.doi.org/10.1017/CBO9780511777851.

10. Garovoy M.R., Rheinschmidt M.A., Bigos M., Perkins H., Colombe В., Feduska N., Salvatierra O. (1983)//Transplant. Proc., v. 15, p. 1939.

11. Cook D.J., Terasaki P.I., Iwahi G.Y., Terashita G.Y., Lau M. The flow cytometry crossmatch in kidney transplantation (1987). Clin. Transplant, v. 1, p. 253.

12. Maruyama T., Makino Т., Sugi T. et al. Flow cytometric crossmatch and early pregnancy loss in women with a history of recurrent spontaneous abortions who underwent paternal leukocyte immunotherapy. //Am. J. Obstet. Gynecol. - 1993. - V. 168, №5. - P. 1528-36.

13. Ormerod M.G. Flow cytometry: a practical approach.-Oxford: University Press. - 3rd ed., 2000. - 276p.

14. L.V. Krechetova, M.A. Nikolaeva, L.V. Van'ko, M.M. Ziganshina, E.L. Golubeva, E.O. Stepanova, G.T. Sukhikh Optimal detection of serum antipaternal antileukocytic antibodies after injection of allogenic lymphocytes in woman with habitual abortions// Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012, - V. 153, №5. - P. 726-729.

15. Меньшиков B.B., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

Рис. 1 - Пример цитограмм для анализа появления АОАТ

Рис. 2 - Влияние количества аллоиммунизаций на выявление АОАТ в женской сыворотке (n - количество обследованных женщин)

Рис. 3 - Доля позитивных мужских лимфоцитов с фенотипом CD3+, покрытых АОАТ, после их инкубации с сывороткой женщин с привычным выкидышем

Примечание: n - количество обследованных женщин.

Способ выявления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера, при котором женщинам двукратно с интервалом в один месяц на 5-9 день менструального цикла внутрикожно вводят партнерские лимфоциты в однократной дозе 50 млн клеток в 10-12 точек ладонной части предплечья, затем через две недели получают сыворотку крови, в которую добавляют в соотношении 1:1 выделенные из цельной периферической венозной крови лимфоциты (CD3⁺) партнера, полученные в градиенте плотности фиколл-верографин 1,077 г/см³ в течение 10 минут при 1600 g в соотношении 500 мкл фиколла к 1000 мкл крови, разведенной в 2 раза фосфатно-солевым раствором; далее инактивированную женскую сыворотку с полученными лимфоцитами партнера инкубируют в течение 30 минут при температуре 37 С, после чего добавляют антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина G в разведении 1:4 с фосфатно-солевым раствором в объеме 1:1 суспензии лимфоцитов и инкубируют в течение 30 минут при температуре 4°С; затем методом проточной цитометрии определяют процент партнерских лимфоцитов (CD3⁺), покрытых антителами к Fc-фрагменту иммуноглобулина G партнера, которые соответствуют уровню антиотцовских антител в сыворотке женщин.