Способ определения клеточного состава атеросклеротических бляшек



Способ определения клеточного состава атеросклеротических бляшек
Способ определения клеточного состава атеросклеротических бляшек
Способ определения клеточного состава атеросклеротических бляшек
Способ определения клеточного состава атеросклеротических бляшек

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2616243:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной и молекулярной технологии, и может быть использовано в медицинских исследованиях в кардиологии для изучения клеточного состава в атеросклеротических бляшках с целью выявления иммунологических механизмов их созревания и разрыва. Способ заключается в заборе операционного материала, измельчении бляшки, ее ферментативной обработке, фильтрации, окрашивании клеточной суспензии для определения живых/мертвых клеток, затем в окрашивании моноклональными антителами, проведении проточной цитометрии, при приготовлении клеточной суспензии используют нейлоновый фильтр с размером пор 40 мкм. Применение изобретения обеспечивает повышение эффективности выделения и точности определения популяции живых клеток, необходимых для исследования состава иммунных клеток из атеросклеротических бляшек на различных моделях проточного цитометра. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной и молекулярной технологии, и может быть использовано в медицинских исследованиях в кардиологии для изучения клеточного состава в атеросклеротических бляшках с целью выявления иммунологических механизмов их созревания и разрыва.

Сложность строения атеросклеротических бляшек известна со времен Вирхова [Вирхов Р. Целлюлярная патология, в применении к микроскопической анатомии нормальных и ненормальных: пер. с нем. Чт. 16. - М, В типографии Каткова и К., 1859. - С. 480], когда было выяснено, что в их состав входят различные клеточные компоненты, в том числе большое количество иммунных и гладкомышечных клеток. При этом общепринятая теория о том, что развитие атеросклеротической бляшки происходит при отложении в сосудистой стенке инородной субстанции - модифицированных липопротеинов, не могла объяснить клеточную гетерогенность бляшек. В связи с этим была сформулирована альтернативная гипотеза R. Ross и L. Harker [Faggiotto A, Ross R, Harker L. Studies of hypercholesterolemia in the nonhuman primate. I. Changes that lead to fatty streak formation. Arteriosclerosis. - 1984. - №4. - P. 323-340; Ross R, Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. - 1976. - №193. - P. 1094-1100] о том, что пусковым фактором атеросклероза является повреждение эндотелия, сопровождающееся адгезией к его поверхности лейкоцитов и тромбоцитов. Моноциты проходят через эндотелиальную выстилку и превращаются в макрофаги. Параллельно происходит миграция гладкомышечных клеток из медии в субэндотелий и изменение их фенотипа (дедифференцировка). Предполагается, что вначале иммунная система пытается уничтожить чужеродный объект, в частности путем его фагоцитоза макрофагами [Kruth HS Sequestration of aggregated low-density lipoproteins by macrophages. Curr Opin Lipidol. - 2002. - №13. - P. 483-488]. Макрофаги поглощают липопротеиды, однако это приводит к гибели самих фагоцитов и формированию очага некроза [Geng YJ, Libby Р Progression of atheroma: A struggle between death and procreation. Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2002. - №22. - P. 1370-1380], сопровождаемого образованием капсулы. Дальнейшее развитие атеросклеротической бляшки определяется активностью иммунного ответа, в частности воспалением.

Вклад воспаления в развитие атеросклероза обсуждается со времен Рудольфа Вирхова, однако его решающая роль в росте и разрушении бляшек стала признаваться сравнительно недавно. Воспаление - это сложное явление, включающее миграцию реактивных клеток, в частности лимфоцитов и моноцитов, и их многоступенчатую активацию с последующим выбросом различных цитокинов.

Известно, что содержание многих провоспалительных цитокинов в крови коррелирует со смертностью у больных коронарной болезнью сердца [Libby Р, Okamoto Y, Rocha VZ, Folco E. Inflammation in atherosclerosis: transition from theory to practice. Circ J. - 2010. - №74. - P. 213-220; Stefanadi E, Tousoulis D, Papageorgiou N, Briasoulis A, Stefanadis C. Inflammatory biomarkers predicting events in atherosclerosis. Curr Med Chem. - 2010. - №17. - P. 1690-1707]. Так, было показано, что повышение содержания определенной группы лимфоцитов в крови связано с увеличением частоты сердечнососудистых событий у пациентов с ИБС, ревматоидным артритом, сахарным диабетом и хронической почечной недостаточностью [Libby P. Role of inflammation in atherosclerosis associated with rheumatoid arthritis. Am J Med. - 2008. - №121. - P. S21-S31; Liuzzo G, Biasucci LM, Trotta G, Brugaletta S, Pinnelli M, Digianuario G, Rizzello V, Rebuzzi AG, Rumi C, Maseri A, Crea F. Unusual CD4_CD28null T lymphocytes and recurrence of acute coronary events. J Am Coll Cardiol. - 2007. - №50. - P. 1450-1458; Giubilato S, Liuzzo G, Brugaletta S, Pitocco D, Graziani F, Smaldone C, Montone RA, Pazzano V, Pedicino D, Biasucci LM, Ghirlanda G, Crea F. Expansion of CD4+CD28null T-lymphocytes in diabetic patients: exploring new pathogenetic mechanisms of increased cardiovascular risk in diabetes mellitus. Eur Heart J. - 2011. - №32. - P. 1214-1226]. He только системное воспаление, но и локальный удаленный воспалительный процесс влияет на состояние атеросклеротических бляшек. Например, была выявлена связь заболеваемости периодонтитом и коронарным атеросклерозом [Humphrey LL, Fu R, Buckley DI, Freeman M, Helfand M. Periodontal disease and coronary heart disease incidence: a systematic review and meta-analysis. J Gen Intern Med. - 2008. - №23. - P. 2079-2086]. Еще более важен тот факт, что воспаление в бляшке может вызывать ее рост и разрыв покрышки, приводя к таким клиническим проявлениям, как нестабильная стенокардия или острый инфаркт миокарда.

Как и воспаление любой другой локализации, воспаление в бляшке характеризуется инфильтрацией и активацией клеток иммунной системы [Naruko Т, Ueda М, Haze К, van der Wal AC, van der Loos CM, Itoh A, Komatsu R, Ikura Y, Ogami M, Shimada Y, Ehara S, Yoshiyama M, Takeuchi K, Yoshikawa J, Becker AE. Neutrophil infiltration of culprit lesions in acute coronary syndromes. Circulation. - 2002. - №106. - P. 2894-2900; Taleb S, Tedgui A, Mallat Z. Regulatory T-cell immunity and its relevance to atherosclerosis. J Intern Med. - 2008. - №263. - Р. 489-199]. Однако детальный анализ состояния отдельных клеток в бляшках до настоящего времени не был проведен за исключением традиционного иммуногистохимического анализа. Гистохимический анализ выявил, что в осложненных бляшках, полученных в ходе каротидной эндартерэктомии, содержится больше лимфоцитов [Rossmann A, Henderson В, Heidecker В, Seiler R, Fraedrich G, Singh M, Parson W, Keller M, Grubeck-Loebenstein B, Wick G. T-cells from advanced atherosclerotic lesions recognize hHSP60 and have a restricted T-cell receptor repertoire. Exp Gerontol. - 2008. - №43. - P. 229-237] и дендритных клеток [Erbel С, Sato К, Meyer FB, Kopecky SL, Frye RL, Goronzy JJ, Weyand CM. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. - 2007. - №102. - P. 123-132], чем в контрольных образцах артерий.

Несмотря на большое количество клинических и экспериментальных данных об образовании, созревании и разрыве атеросклеротических бляшек, механизмы этих явлений остаются во многом неизвестными. Показано, что системное воспаление играет важную роль в этом процессе [Tahara N, Imaizumi Т, Virmani R, Narula J. Clinical feasibility of molecular imaging of plaque inflammation in atherosclerosis. J Nucl Med. - 2009. - №50. - P. 331-334].

Гистохимический анализ [Gewaltig J, Kummer M, Koella C, Cathomas G, Biedermann ВС.Requirements for CD8 T-cell migration into the human arterial wall. Hum Pathol. - 2008. - №39. - P. 1756-1762] и полимеразная цепная реакция с ДНК, выделенной из атеросклеротических бляшек [De Palma R, Del Galdo F, Abbate G, Chiariello M, Calabro R, Forte L, Cimmino G, Papa MF, Russo MG, Ambrosio G, Giombolini C, Tritto I, Notaristefano S, Berrino L, Rossi F, Golino P. Patients with acute coronary syndrome show oligoclonal T-cell recruitment within unstable plaque: evidence for a local, intracoronary immunologic mechanism. Circulation. - 2006. - №113. - P. 640-646], выявили активацию Т-клеток в нестабильной бляшке, что значительно расширило наше знание факторов, связанных с нестабильностью бляшек.

Однако этих знаний недостаточно, поскольку полимеразная цепная реакция дает возможность выявить лишь общие характеристики Т-лимфоцитов, а при помощи иммуногистохимии можно определять только один-два клеточных антигена.

Для более полной характеристики лимфоцитов и их роли в иммунологических механизмах созревания и разрыва бляшки необходимо проанализировать лимфоцитарные фенотипы и их распределение в отдельных бляшках. Единственная современная технология, позволяющая выполнить эти задачи - это многоцветная проточная цитометрия. Одним из основных препятствий к использованию современной технологии многоцветной проточной цитометрии для всестороннего изучения параметров клеток, содержащихся в бляшке, является сложность выделения клеток из бляшки без повреждения поверхностных клеточных маркеров, определяющих фенотип клеток.

Известен способ выделения лимфоцитов из ткани атеросклеротических бляшек сонных артерий. В способе использовался метод разделения ткани на мелкие блоки, которые в дальнейшем помещались в культивационную среду на 4-6 часов с различными активаторами миграции лимфоцитов. Далее отдельные лимфоциты, мигрировавшие за время культивирования из ткани в среду, собирались, окрашивались на поверхностные маркеры CD4 и CD8 и подвергались исследованию с помощью проточной цитометрии [Curry MP, Norris S, Golden-Mason L, Doherty DG, Deignan T, Collins C, Traynor O, McEntee GP, Hegarty JE, O’Farrelly C. Isolation of lymphocytes from normal adult human liver suitable for phenotypic and functional characterization. J Immunol Methods. - 2000. - №242 (1-2). - Р. 21-31]. В данном способе не проводился ферментативный гидролиз тканей и фильтрация клеток, анализировались только клетки, мигрировавшие в культуральную среду. Это давало возможность не отрабатывать методику выделения живых клеток и отделения их тканевого дебриса, так как проводился анализ только клеток из жидкостной среды, а не из самой ткани образца. Кроме того в способе рассматривались поверхностные маркеры лишь двух указанных типов. Поэтому данный способ не дает возможности оценить полный клеточный состав атеросклеротических бляшек, так как исследовались только отдельные CD4 и CD8 лимфоциты, которые самостоятельно мигрировали в культивационную среду.

Кроме того, известен способ выделения лимфоцитов из ткани миндалин и цервико-вагинального тракта [Saba Е, Grivel JC, Vanpouille С, Brichacek В, Fitzgerald W, Margolis L, Lisco A. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. - 2010. - №3 (3). - P. 280-290], где участки лимфоидной ткани, препарированные на мелкие блоки, подвергались обработке коллагеназой IV типа в концентрации 5 мг/мл в течение 30-90 мин. Далее суспензия клеток окрашивалась различными комбинациями флуоресцентно-меченых антител для определения всех типов клеток, выделенных из лимфоидной ткани, после чего проводился анализ клеточного состава с помощью проточной цитометрии. Однако в данном способе клетки выделялись из образцов тканей солидных иммунных органов, которые имели малую плотность и малую гетерогенность, в связи с чем дополнительная обработка высококонцентрированными ферментами и фильтрация образцов исследователям не требовалась. Однако подобный метод не позволит провести выделение всех типов клеток из высоко гетерогенной и плотно структурированной ткани атеросклеротических бляшек.

Описан также способ определения состава иммунных клеток, которые выделялись из ткани тонкой кишки свиней. В способе проводилась ферментативная обработка коллагеназой крупных участков тонкой кишки без ее дополнительного препарирования. В дальнейшем проводился анализ с помощью проточной цитометрии лимфоцитов, выделяющихся только из внутреннего гомогенного слоя клеток кишки [Solano-Aguilar GI, Vengroski KG, Beshah E, Lunney JK. Isolation and purification of lymphocyte subsets from gut-associated lymphoid tissue in neonatal swine. - 2000. - №241 (1-2). - P. 185-199]. Так же, как и в предыдущем способе, выделение клеток в данном исследовании проводилось из внутреннего гомогенного слоя мягкотканной структуры кишки, что позволило применять смесь ферментов в низких концентрациях и не проводить дополнительной фильтрации образцов. Однако как и предыдущий, описанный метод не позволит провести выделение всех типов клеток из высоко гетерогенной и плотно структурированной ткани атеросклеротических бляшек.

Таким образом, по данным литературы существующие на сегодняшний день методы анализа клеточного состава тканей с помощью проточной цитометрии позволяют либо анализировать небольшое количество клеток, которые были выделены не из тканей, а из культуральной среды при кратковременном культивировании ткани; либо проводить выделение с помощью малоактивных ферментов без дополнительной фильтрации и анализировать клетки из мягкотканных гомогенных структур, таких как лимфоидные органы кишки, лимфатические узлы. Однако важно отметить, что структура атеросклеротических бляшек крайне гетерогенна, бляшки содержат не только различные клеточные компоненты, но и большое число внеклеточных структур (кристаллы солей кальция, холестериновые кислоты, некротические массы). В связи с этим выделение всех клеток из данных структур требует отработки этапов фильтрации образцов для увеличения точности анализа всех клеток бляшек с помощью проточной цитометрии.

Описан способ определения клеточного состава атеросклеротических бляшек сонных артерий человека с помощью проточной цитометрии [Bonanno Е, Mauriello A, Partenzi A, Anemona L, Spagnoli LG. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry. - 2000. - №39 (2). - Р. 158-165]. В данном способе в качестве материала для определения клеточного состава атеросклеротических бляшек использовали операционный материал, полученный при проведении операции каротидной эндартеректомии (атеросклеротические бляшки). Бляшки нарезали на кусочки и затем подвергали ферментативной обработке коллагеназой I (250 ед/мл) в течение ночи при 37°C. Суспензию клеток фильтровали через 150 мкм нейлоновый фильтр и окрашивали для проточной цитометрии моноклональными антителами к ассоциированным с цитоплазматической мембраной антигенам в течение 30 минут при 4°C, после чего проводили проточную цитометрию. Недостаток данного способа заключается в том, что после препарирования ткани атеросклеротических бляшек и ферментативной обработки проводилась фильтрация клеточной суспензии с помощью 150 мкм нейлонового фильтра, что не позволит достоверно разделять отдельные типы иммунных клеток при анализе с высокой эффективностью, а также использовать современные проточные цитометры с ограничением диаметра сортировочного сопла.

Известен способ определения иммунных клеток из атеросклеротических бляшек человека с помощью проточной цитометрии [Новый метод анализа клеточного состава атеросклеротических бляшек / Гривель Ж.-Ш. [и др.] // Креативная кардиология - 2012. - №1. - С. 26-40], заключающийся в том, что в качестве материала для определения клеточного состава атеросклеротических бляшек используют операционный материал, полученный при проведении операции каротидной эндартеректомии (атеросклеротические бляшки), который транспортируют в культуральной среде RPMI 1640 при комнатной температуре в течение не более 2 часов. От атеросклеротической бляшки отделяют фрагмент размером 2 мм, который фиксируют в 2% формалине. Остаток ткани нарезают на блоки размером 2 мм и подвергают ферментативной обработке. Кусочки бляшки лизируют коллагеназой IV (1,25 мг/мл) в присутствии 0,2 мг/мл ДНКазы I в течение 1 часа при 37°C при постоянном перемешивании. Суспензию клеток фильтруют через 100 мкм нейлоновый фильтр и отмывают в растворе PBS.

Из полученной клеточной суспензии берут 100 мкл для постановки негативного контроля. Для отделения живых клеток от мертвых остальные клетки ресуспензируют в растворе PBS и окрашивают специальным красителем в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре, затем отмывают раствором PBS с 2% содержанием нормальной мышиной сыворотки. Затем суспензию клеток делят на необходимое количество пробирок, оставляя часть для анализа на живые/мертвые клетки, и окрашивают моноклональными для определения CD4 и CD8 Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, NK-клеток, а также степени дифференцировки и активации Т-лимфоцитов, в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. После окраски клетки отмывают раствором PBS, фиксируют в 1% растворе формальдегида в PBS, и анализируют на проточном цитометре (типа FACS Canto II, BD Biosciences, San Jose, CA). Ставятся одноцветные реакции компенсации для каждой окраски в каждом эксперименте, используя сферические микрочастицы. В качестве контроля для установки области анализа и подтверждения специфичности окраски используются те же комбинации антител, что и в эксперименте, но за вычетом одного из антител. При окончательном анализе используется перекрытие спектров различных флуорофоров с учетом аутофлуоресценции сигналов. Этот способ был выбран за прототип.

Недостаток данного способа заключается в сниженной точности отделения фракции живых клеток от мертвых, приводящей к снижению эффективности определения клеточного состава атеросклеротических бляшек. Применение при фильтрации нейлонового фильтра с размером пор 100 мкм не обеспечивает достаточно эффективного удаления фрагментов и агрегатов мертвых клеток, а также агрегатов липидных клеток и солей кальция, что приводит к очень высокой интенсивности аутофлуоресценции сигнала от большинства лазеров в образцах, которая мешает проведению анализа данных с помощью проточной цитометрии и снижает точность оценки клеточного состава атеросклеротических бляшек.

Кроме того, применение нейлонового фильтра с размером пор 100 мкм при подготовке суспензии клеток приводит к формированию крупных клеточных агрегатов, в связи с чем использование данной суспензии для анализа на проточных цитометрах современного поколения, имеющих диаметр сортировочного сопла для фокусировки потока жидкости менее 100 мкм, становится не возможным.

Задачей изобретения является повышение эффективности оценки состава иммунных клеток атеросклеротических бляшек.

Технический результат заключается в повышении эффективности выделения и точности определения популяции живых клеток, необходимых для исследования состава иммунных клеток из атеросклеротических бляшек на различных моделях проточного цитометра.

Это достигается за счет того, что при приготовлении клеточной суспензии используют нейлоновый фильтр с размером пор 40 мкм.

При прохождении через поры нейлонового фильтра с размером пор 40 мкм агрегаты клеток разбиваются на более мелкие структуры, чем при использовании фильтра с размерами пор 100 мкм, при этом через 40 мкм пору не проходят агрегаты фрагментов умерших клеток, а также солей кальция или жировой ткани адвентиции атеросклеротических бляшек. Уменьшение размера структур в суспензии делает возможным использование последнего поколения проточных цитометров-сортеров, обладающих сортировочным соплом с диаметром 70-100 мкм (Рис. 1, а - изображение потока жидкости проточного цитометра-сортера при анализе клеточной суспензии, фильтрованной с помощью 100 мкм нейлонового фильтра; рис. 1, б - изображение потока жидкости проточного цитометра-сортера при анализе клеточной суспензии, фильтрованной с помощью 40 мкм нейлонового фильтра). Как видно на рис. 1, а, при анализе клеточной суспензии, фильтрованной через 100 мкм фильтр, возникают моменты блокировки потока жидкости проточного цитометра клеточными агрегатами. При анализе клеточной суспензии, фильтрованной через 40 мкм фильтр, выделен фрагмент возможной остановки потока, однако при большем разрешении определено, что блокировка потока жидкости не происходит (Рис. 1, б).

Кроме того, удаление перечисленных структур из образцов клеток приводит к значительному уменьшению интенсивности аутофлуоресценции в спектре флуорохромов, сцепленных с анализируемыми антителами и их изотипами. При этом уровень флуоресценции изотипических контролей снижается до 5% от флуореценции позитивного сигнала (Табл. 1).

Как видно из табл. 1, уровень аутофлуоресценции снижается при использовании 40 мкм фильтра по всем каналам флуоресценции проточного цитометра. Таким образом, гораздо более высокой становится точность отделения по интенсивности флуоресцентного сигнала негативных событий от позитивных и более точная оценка количества живых клеток, несущих исследуемые поверхностные маркеры (Табл. 2).

Как видно из табл. 2, количество агрегатов клеток, мертвых клеток, а также дуплетных событий становится значительно ниже при использовании 40 мкм фильтра по сравнению со 100 мкм фильтром.

Рисунки, поясняющие сущность изобретения:

рис. 1, а и б - изображение моментов остановки потока жидкости проточного цитометра-сортера при анализе клеточной суспензии.

Способ осуществляется следующим образом:

В качестве материала для выделения иммунных клеток из атеросклеротических бляшек используют операционный материал, полученный при проведении операции эндартерэктомии (атеросклеротические бляшки), которые транспортируют в среде RPMI 1640 при комнатной температуре в течение не более 2 часов. От атеросклеротической бляшки отделяют фрагмент размером 2 мм, который фиксируют в 2% формалине. Остаток ткани нарезают на блоки размером 2 мм и затем подвергают ферментативной обработке. Кусочки бляшки лизируют коллагеназой IV (1,25 мг/мл) в присутствии 0,2 мг/мл ДНКазы I в течение 1 часа при 37°C при постоянном перемешивании. Суспензию клеток фильтруют через 100 мкм нейлоновый фильтр и отмывают в растворе PBS. Из полученной клеточной суспензии берут 100 мкл для постановки негативного контроля. Для отделения живых клеток от мертвых остальные клетки ресуспензируют в растворе PBS и окрашивают специальным красителем в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре, затем отмывают раствором PBS с 2% содержанием нормальной мышиной сыворотки. Затем суспензию клеток делят на необходимое количество пробирок, оставляя часть для анализа на живые/мертвые клетки, и окрашивают моноклональными для определения CD4 и CD8 Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, NK-клеток, а также степени дифференцировки и активации Т-лимфоцитов, в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. После окраски клетки отмывают раствором PBS, фиксируют в 1% растворе формальдегида в PBS, и анализируют на любом типе проточного цитометра (например, прибор FACS Aria II, BD Biosciences, San Jose, СА). Ставятся одноцветные реакции компенсации для каждой окраски в каждом эксперименте, используя сферические микрочастицы. В качестве контроля для установки области анализа и подтверждения специфичности окраски используются те же комбинации антител, что и в эксперименте, но за вычетом одного из антител. При окончательном анализе используется перекрытие спектров различных флуорофоров с учетом аутофлуоресценции сигналов.

Пример

В качестве источника исследуемого материала была взята атеросклеротическая бляшка из правой внутренней сонной артерии при операции эндартерэктомии у пациента мужского пола 69 лет. Бляшка была помещена в транспортную среду RPMI 1640. Образцы в течение 1,5 часов были доставлены в лабораторию. В лаборатории образец бляшки был помещен в чашку Петри, осмотрен и описан макроскопически, сфотографирован и в стерильных условиях порезан на блоки размером 2 мм. 1 кусочек был залит раствором 2% формалина для дальнейшего гистологического исследования. Остальные кусочки бляшки поместили в пробирки типа эппендорф, содержащие раствор коллагеназы IV (1,25 мг/мл) в присутствии 0,2 мг/мл ДНКазы I, инкубировали в течение 1 часа при 37°C при постоянном перемешивании. После этого клетки были профильтрованы через 40 мкм нейлоновый фильтр и отмыты в растворе PBS. Из полученной клеточной суспензии взято 100 мкл для негативного контроля. Остальные клетки ресуспензированы в растворе PBS и окрашены красителем Pacific Orange с реактивной аминогруппой (Invitrogen, Carlsbad, СА) в течение 15 минут в темноте, отмыты раствором PBS с 2% содержанием нормальной мышиной сыворотки. Клетки были поделены по 50 мкл для окраски комбинациями антител и для анализа на живые/мертвые клетки. Для окраски использовались следующие комбинации моноклональных антител, разведенных до оптимального титра: (1) CD45 Cy7-РЕ, CD3 Cy5.5-PerCp, CD4 eFluor780-APC, CD28 РЕ, CD27 FITC, CD197 АРС и CD45RA eFluor 450 для выявления популяций Т-клеток памяти и наивных Т-клеток; (2) CD45 Cy7-РЕ, CD3 Cy5.5-PerCp, CD4 eFluor780-APC, CD25 РЕ, CD146 FITC, CD38 АРС и HLA-DR Pacific blue для определения Т-клеточной активации; а также, (3) CD45 Cy7-РЕ, CD3 Cy5.5-PerCp, CD4 eFluor780-APC, CD 19 РЕ, CD16 FITC, CD56 АРС, CD8 eFluor450 для анализа Т-клеток, В-клеток и натуральных киллеров (NK). Окраска проводилась в 5 мл пробирках в течение 15 минут в темноте, затем клетки отмывались раствором PBS и фиксировались 1% раствором формалина. Также ставились одноцветные реакции компенсации для каждой окраски в каждом эксперименте, используя сферические микрочастицы CompBeads (Becton Dickinson). В качестве контроля для установки области анализа и подтверждения специфичности окраски использовались те же комбинации антител, что и в эксперименте, но за вычетом одного из антител. При окончательном анализе использовалось перекрытие спектров различных флуорофоров с учетом аутофлуоресценции сигналов.

При проведении фильтрации с 40 мкм порами общий фон аутофлуоресценции изотипических контролей составил менее 5% от флуоресценции позитивных событий.

При анализе с помощью проточной цитометрии живых клеток, выделенных их бляшки, были получены следующие результаты:

Количество лейкоцитов (CD45+ клеток): 457500 клеток на 1 мг ткани бляшки: гранулоциты - 17.10%, моноциты - 2.63%, лимфоциты - 31.50%.

Количество лимфоцитов: 144 113 клеток на 1 мг ткани бляшки:

Т-лимфоциты - 76.40% (110 102 клетки);

В-лимфоциты - 2.00% (288 клетки);

Натуральные киллеры - 17.80% (25 652 клетки): активированные - 10.10%, зрелые - 0.62%, незрелые - 0.00%);

NKT-клетки - 0.25% (358 клеток): CD4+% - 0.00%, CD8dim - 55.60%, CD8+% - 11.10%, NK-подобные Т-клетки - 33.30%).

При анализе дифференцировки Т-лимфоцитов:

наивные клетки: CD8 Naive - 0.89%, CD4 Naive - 2.15%;

клетки памяти:

центральные клетки памяти: CD8 Tcm - 25.90%, CD4 Tcm - 36.20%;

эффекторные клетки памяти:

CD8 Tem - 60.90% (Early differentiated - 33.80%, Terminally differentiated - 37.50%, Intermediate differentiated - 28.70%);

CD4 Tem - 30.30% (Early differentiated - 29.60%, Terminally differentiated - 7.99%, Intermediate differentiated - 62.41%).

При анализе активации Т-лимфоцитов:

CD8 CD25 - 16.00%, CD8 CD38 - 47.30% и CD8 HLA-DR - 66.00%;

CD4 CD25 - 30.10%, CD4 CD38 - 33.00% и CD4 HLA-DR - 52.20%.

Таким образом, нами была успешно исследована степень дифференцировки и активации всей популяции иммунных клеток, выделенных из ткани атеросклеротической бляшки.

Способ определения клеточного состава атеросклеротических бляшек, заключающийся в заборе операционного материала, измельчении бляшки, ее ферментативной обработке, фильтрации, окрашивании клеточной суспензии для определения живых/мертвых клеток, затем в окрашивании моноклональными антителами и проведении проточной цитометрии, отличающийся тем, что при приготовлении клеточной суспензии используют нейлоновый фильтр с размером пор 40 мкм.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и касается способа иммунологического анализа, включающего адсорбцию биоспецифических лигандов на поверхность частиц коллоидных растворов гексацианферрата железа (II) (III), последующее их соединение с подлежащим тестированию биоматериалом в разведенном водном солевом растворе, где в качестве водного солевого раствора используют или водный раствор хлорида рубидия, или водный раствор хлорида цезия.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан 3D in vitro двухфазный костно-хрящевой «органоид», содержащий слой искусственной хрящевой ткани/агрегатов хондрогенных клеток и слой искусственной костной ткани, где искусственная костная ткань содержит придающий структуру каркас и структуру костного мозга; где структура костного мозга в искусственной костной ткани получена путем посева мезенхимальных стволовых клеток на придающий структуру каркас и где слой искусственной хрящевой ткани/агрегатов хондрогенных клеток контактирует по меньшей мере с одной поверхностью слоя искусственной костной ткани, и способы его получения и применения.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования устойчивости к инотропной терапии у новорожденных с артериальной гипотензией. Из образцов периферической крови выделяют ДНК.

Изобретение относится к медицине и предназначено для дифференциальной диагностики различных типов холестазов при хронических болезнях печени у детей. Проводят гепатобилисцинграфию с использованием радиофармпрепарата Бромезида 99Тm 38, вводимая активность препарата из расчета 1,7-2,0 мБк на 1 кг массы пациента внутривенно, лучевая нагрузка 7,0 мГр (700 мрад) и оценивают: время максимального накопления (Тmах) радиофармпрепарата (РФП), время его полувыведения (Т1/2), время поступления его в кишечник (Ткиш).

Изобретение относится к медицине, а именно урологии, и может быть использовано для определения степени активности обострения хронического обструктивного пиелонефрита.

Изобретение относится к области медицины, а именно к разделу терапевтической стоматологии - заболеваниям слизистой оболочки рта, и может быть использовано для определения степени тяжести изменений микробиоты полости рта, тонкой и толстой кишки у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта с гепатобилиарными расстройствами, исключая гепатиты, обострения заболеваний гепатобилиарной системы и поджелудочной железы.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для профилактики заболевания животных кетозом. Способ прогнозирования субклинического кетоза у коров включает отбор пробы крови и определение глюкозы в крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований щитовидной железы.

Изобретение относится к области медицины и описывает способ количественного определения суммарного содержания серусодержащих соединений в сыворотке крови человека методом анодной вольтамперометрии.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и касается прогнозирования в первом триместре беременности у женщин угрозы невынашивания при гриппе A(H3N2). Сущность способа: в первом триместре гестации при гриппе A(H3N2) в период разгара заболевания определяют величину титра противовирусных антител в первой сыворотке (А), оценивают уровень серомукоида (ед.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития миоматозных узлов больших размеров у пациенток с миомой матки. У уроженок Центрального Черноземья России русской национальности осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ полиморфных вариантов генов rs2107538 RANTES, rs1801157 SDF1 и rs16944 IL-1β методом полимеразной цепной реакции. В случае выявления сочетания генотипов GG SDF1, CC IL-1β и АА RANTES прогнозируют повышенный риск развития миоматозных узлов больших размеров. Изобретение обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития миоматозных узлов больших размеров более 4 см на основе данных о генотипах. 4 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска кальцификации биологических протезов клапанов сердца, имплантированных в митральную позицию. Анализируют генетический профиль пациента по генам VDR и IL6R, осуществляют построение прогностической модели с использованием балльной оценки факторов риска, таких как мужской пол, наличие в сыворотке крови пациента полиморфизмов генов VDR rs2228570 и rs731236 и IL6R rs2229238, при этом каждому из критериев присваивают оценочный балл. На основании суммарного значения показателей оценивают вероятный риск кальцификации биологического протеза. При сумме баллов от 0 до 1,5 прогнозируют минимальный риск кальцификации, от 1,5 до 3,0 баллов - средний риск, от 3,0 до 6,0 - высокий риск. Изобретение обеспечивает эффективное прогнозирование риска кальцификации биопротезов клапанов сердца, установленных в митральную позицию, за счет определения полиморфизмов генов-кандидатов и расчета суммарного риска по оценочной шкале. 7 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, к оториноларингологии, а именно к способам лабораторной диагностики токсического действия формальдегида, в виде проявления заболеваний аллергического ринита у детей, проживающих в условиях техногенной нагрузки среды обитания. Сущность способа: производят отбор пробы крови у ребенка и устанавливают в ней содержание формальдегида, при его концентрации в крови в 2 и более раз выше фонового уровня выполняют риноманометрию по установлению суммарного объемного потока и суммарного сопротивления. Также проводят лабораторное обследование для установления следующих лабораторных диагностических показателей: эозинофильно-лимфоцитарный индекс; уровень иммуноглобулина Е IgE; уровень IgE специфического к формальдегиду; уровень иммуноглобулина A IgA; фагоцитарное число; фагоцитарный индекс; уровень гидроперекиси липидов; уровень малонового диальдегида МДА в плазме крови; антиоксидантная активность сыворотки АОА крови. При установлении у ребенка увеличения по сравнению с нормой суммарного объемного потока на 50% и снижения суммарного сопротивления на 25%, при одновременном наличии следующих отклонений в лабораторных диагностических показателях, а именно: превышение относительно физиологической возрастной нормы эозинофильно-лимфоцитарного индекса более чем в 1,3 раза; уровня IgE более чем 1,5 раза; фагоцитарного числа более чем в 1,3 раза; гидроперекиси липидов более чем в 1,2 раза; уровня МДА в 1,2 и более раз, и снижение относительно физиологической возрастной нормы уровня IgA на 15% и более; фагоцитарного индекса более чем в 1,2 раза; уровня АОА более чем в 1,3 раза, при одновременном наличии IgE специфического к формальдегиду, диагностируют у ребенка аллергический ринит, ассоциированный с токсическим действием формальдегида техногенного происхождения, причем диагностируют в том случае, если указанные отклонения результатов риноманометрии и лабораторных диагностических показателей присутствуют у ребенка в количестве не менее 2/3 вышеуказанных отклонений. Технический результат заключается в создании информативного и доказательного способа диагностики у детей аллергического ринита, ассоциированного с токсическим внешнесредовым воздействием формальдегида техногенного происхождения, позволяющего в последующем назначить адекватную терапию и предупредить развитие осложнений. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для оценки эффективности химиотерапевтического лечения больных местно-распространенным раком молочной железы. Способ включает определение количества циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови. Проводят 6 курсов полихимиотерапии (ПХТ), при этом за сутки до первого курса ПХТ I линии определяют количество циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в периферической крови, проводят 2 курса ПХТ I линии, затем за сутки до 3 курса повторно определяют количество ЦОК в периферической крови. При сохранении этого показателя на исходном уровне или при его увеличении проведенное лечение оценивают как неэффективное и меняют схему ПХТ I линии на схему ПХТ II линии, при снижении количества циркулирующих опухолевых клеток, по сравнению с исходным значением, проведенное лечение считают эффективным и продолжают химиотерапию по прежней схеме. Использование изобретения позволяет определить эффективность проводимой химиотерапии у больных местно-распространенным раком молочной железы, улучшить качество лечения путем подбора индивидуальной схемы лечения. 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается прогнозирования эффективности терапии эверолимусом у больных с метастатическим раком почки. Для этого определяют phospho-m-TOR и дополнительно на дооперативном этапе лечения определяют содержание фактора, индуцированного гипоксией HIF-1α, сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF и его рецептора VEGFR2. При значениях HIF-1α, VEGF, VEGFR2 в лунке более 16,2 УЕ/ мг белка в лунке; 100,5 и 82,2 пг/мг белка соответственно а также уровне phospho-m-TOR менее 5,5 пг/мг белка прогнозируют высокую эффективность терапии эверолимусом. При значениях HIF-1α, VEGF, VEGFR2 менее 16,2 УЕ/ мг белка в лунке, 100,5 и 82,2 пг/мг белка соответственно и уровне phospho-m-TOR более 5,5 пг/мг белка прогнозируют низкую эффективность терапии эверолимусом. Способ обеспечивает высокую точность прогнозирования эффективности терапии эверолимусом, что, в свою очередь, позволяет выбрать адекватную терапию. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ персонифицированного назначения стандартного или комбинированного режимов поддержки лютеиновой фазы (ЛФ) в программе ЭКО. Из образцов тканей пациентки с трубно-перитонеальным фактором бесплодия выделяют ДНК, определяют генотип по локусам LHCGR: 872 A>G(Asn291Ser) [rs12470652]; PGR: 38 T>C [rs484389] с применением ПЦР в режиме реального времени. В случае наличия генотипов риска 38 Т/С или 38 С/С для гена PGR или 872 T/C для гена LHCGR, то рекомендуют стандартный режим поддержки ЛФ - микронизированным прогестероном (Р). Если генотипы риска отсутствуют, то рекомендуют комбинированный режим поддержки ЛФ - микронизированным Р+а-ГнРГ. Предложенный способ повышает эффективность программ ЭКО у женщин с бесплодием. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к количественной гистохимической оценке адаптации организма к воздействию низкой температуры окружающей среды. Для этого устанавливают холодовую анестезию у экспериментального животного путем количественной цитохимической оценки хромаффинной реакции эритроцитов крыс при общем охлаждении организма. Способ включает охлаждение крыс, забор у них крови из легочной вены после ее флеботомии в воротах левого легкого. Изготавливают мазок крови на предметном стекле, окрашивают сначала 5% спиртовым раствором ализарина красного С, затем 5% раствором бихроматом калия. Под микроскопом подсчитывают количество различно окрашенных эритроцитов в группе от 300 клеток. После этого рассчитывают средний цитохимический коэффициент СЦК по формуле: в которой 1 балл - эритроциты не окрашены; 2 балла - гранулярная окраска периферии эритроцита, центральная часть клетки не окрашена; 3 балла - эритроциты целиком гранулярно окрашены. И при СЦК менее 2,4 устанавливают эффективную холодовую анестезию. Способ обеспечивает объективизацию оценки холодовой анестезии у животного, что позволяет проводить вивисекцию без использования наркосодержащих фармакологических средств. 1 пр., 1 табл.

Изобретение относится к клинической медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и касается прогнозирования репродуктивных нарушений у женщин репродуктивного возраста с дисфункцией гипоталамуса. Сущность предлагаемого способа заключается в одновременном определении провоспалительного TNF-α и противовоспалительного IL-10 цитокинов в аспирате из полости матки, поскольку они являются информативными критериями прогнозирования репродуктивных нарушений, и при неблагоприятном прогнозе на беременность TNF-α>20,2 пг/мл, IL-10<4,78 пг/мл; при неблагоприятном прогнозе на вынашивание беременности TNF-α 18,9-20,1 пг/мл, IL-10 6,05-4,79 пг/мл, при благоприятном - TNF-α 15,0-18,8 пг/мл, IL-10 6,06-11,07 пг/мл. Изобретение обеспечивает раннее прогнозирование репродуктивных нарушений у женщин репродуктивного возраста с дисфункцией гипоталамуса на этапе прегравидарной подготовки (до наступления беременности), дает возможность своевременного проведения коррекции нарушений, что позволит предупредить репродуктивные потери, ускорить реализацию генеративной функции и уменьшить материальные затраты на терапию, направленную на сохранения беременности и лечение осложнений. 3 пр., 3 ил.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития раннего тромбоза зоны реконструкции после реконструктивных операций на брюшной аорте и артериях нижних конечностей. У пациента осуществляют забор крови, выделение ДНК и анализ полиморфизмов генов 677 С/Т MTHFR и 455 G/A FGB. В крови определяют уровень Д-димера, гомоцистеина, фибриногена, антитромбина III, ЛПВП, ЛПВП и количество тромбоцитов. Полученные значения включают в формулы расчета y1 и y2. Риск формирования тромбоза зоны реконструкции прогнозируют в случае, если y1 больше y2. Изобретение позволяет формировать группы риска по развитию осложнений после реконструктивных операций на брюшной аорте и артериях нижних конечностей, что будет способствовать более эффективной реализации лечебно-профилактических мероприятий по предупреждению развития тромбоза зоны реконструкции. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к клинической медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и касается прогнозирования репродуктивных нарушений у женщин репродуктивного возраста с избыточной массой тела и ожирением. Сущность предлагаемого способа заключается в том, что в аспирате из полости матки определяют активность NF-kB и при неблагоприятном прогнозе на беременность - NF-kB>6,86 пг/мл; при неблагоприятном прогнозе на вынашивание беременности - NF-kB - 5,21-6,86 пг/мл; при благоприятном - NF-kB 4,93-5,20 пг/мл. Изобретение обеспечивает раннее прогнозирование репродуктивных нарушений у женщин с избыточной массой тела и ожирением на этапе прегравидарной подготовки (до наступления беременности), дает возможность своевременного проведения коррекции нарушений, что позволяет предупредить репродуктивные потери, ускорить реализацию генеративной функции и уменьшить материальные затраты на терапию, направленную на сохранение беременности и лечение осложнений. 1 ил., 3 пр..
Наверх