Способ экспресс-диагностики инфекции кровотока

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследования, экспресс-методу диагностики инфекционного заболевания, сопровождающегося наличием микроорганизмов в крови. Способ экспресс-метода диагностики инфекции кровотока включает выявление микроорганизмов в крови методом микроскопии мазка крови с иммерсией и увеличением ×1000, при этом мазок готовят из лейкоцитарного слоя венозной крови, используя технику «двух стекол». После высушивания наливают на мазок дистиллированную воду, покрывая всю его площадь, через 3-5 с разрушенные эритроциты смывают и мазок высушивают. После фиксации над пламенем горелки и окрашивания по Граму выполняют микроскопию полученного мазка путем обеспечения бесцветного фона мазка крови. Изобретение обеспечивает повышение эффективности диагностики инфекции кровотока за счет возможности выявления грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов при сохранении простоты, доступности диагностики. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследования, экспресс-методу диагностики инфекционного заболевания, сопровождающегося наличием микроорганизмов - его возбудителей - в крови.

Микроскопическое исследование биологического материала (моча, кал, мокрота, отделяемое гнойно-воспалительных очагов) является обязательным этапом клинического исследования материала в клинической лаборатории.

В микробиологической лаборатории также проводят микроскопическое исследование биологического материала (мокрота, спинномозговая жидкость, отделяемое ран, пунктаты и т.д.) при определенных инфекциях, но микроскопия мазка периферической крови не нашла широкого применения при диагностике инфекции в крови, несмотря на то, что практически применяется с 1906 года, когда диагностировали менингококкцемию по обнаружению менингококков в мазке периферической крови.

Метод микроскопии биологического материала, включая кровь, относится к ускоренным методам обнаружения микроорганизма, так как клиницист имеет информацию через 1-1,5 часа после поступления материала в лабораторию. В окрашенных мазках выявляют бактерии и грибы на основании морфологических и тинкториальных признаков. В дальнейшем микроскопия крови стала применяться для диагностики угрожающих жизни инфекционных заболеваний, так как она позволяла обнаружить возбудитель в течение 1-1,5 часов.

Исторически диагнозы многих заболеваний ставили на основании результатов микроскопии.

Первое сообщение об обнаружении бактерий в периферической крови микроскопическим методом было сделано Raver и Davaine в 1850 году. Они увидели маленькие тельца в крови овцы, которые были искусственно введены от овцы, умершей от сибирской язвы. В 1906 году F.W. Andrews обнаружил менингококки в мазке периферической крови до получения гемокультуры [1].

В 1915 году Coze и Feltz докладывали о наличии бактерий в крови у пациентов, страдающих тифоидной лихорадкой [2]. В 1918 году W.W. King исследовал каплю крови, взятой из мочки уха у больных цереброспинальным менингитом, и обнаружил грамположительные и грамотрицательные кокки, которые в дальнейшем были выделены и идентифицированы как Staphylococcus aureus и Neisseria meningitidis [3].

Микроскопический метод исследования крови нашел широкое применение при диагностике паразитарных заболеваний, которые имели высокий уровень летальности. Babesia microti была впервые диагностирована в 1888 году как причина смерти крупного рогатого скота и собак. Anderson и соавт. опубликовали случай бабезиоза у человека после укуса клещей. При микроскопии крови паразиты были выявлены в эритроцитах в виде бактерий, делящихся на две и более дочерних клеток [4]. Исследуемым материалом служила капля крови.

Техника приготовления мазка крови претерпевала изменения.

Первоначально для микроскопического исследования крови готовили препарат «толстая капля» [5]. Таким образом, была введена диагностика малярии на основании микроскопии толстой капли крови, которая широко используется и по настоящее время.

С момента внедрения в клиническую лабораторную практику микроскопии тонкого мазка крови с использованием техники «двух стекол» началась эпоха диагностики более широкого спектра микроорганизмов, включая возбудителей угрожающих жизни заболеваний (менингококк). Усовершенствование техники приготовления мазка крови способствовало диагностическому расширению спектра возбудителей, включая бактерии и грибы.

В 1944 году A. Humphrey разработал методику получения лейкоцитарного концентрата из пробы периферической крови и описал технику приготовления мазка периферической крови из данного слоя крови. Мазки готовили техникой «двух стекол» [6, 7, 8]. Автору удалось диагностировать бактериемию до получения гемокультуры. Преимущество этого метода заключалось в том, что элементы крови при определенном режиме центрифугирования распределялись в соответствии с их силой тяжести. Тяжелые эритроциты оседали на дно, легкая плазма находилась наверху, и под плазмой на эритроцитах лежал тонкий белый слой, представляющий собой смесь лейкоцитов, тромбоцитов и склеенных с ними микроорганизмов. Часть микроорганизмов находилась внутри нейтрофилов в виду их фагоцитирования, а часть микроорганизмов была склеена тромбоцитами. Внеклеточные микроорганизмы поднимались тромбоцитами через среду до лейкоцитарного слоя. Стафилококки и менингококки располагались вне- и внутриклеточно в мазках крови. Вариант окрашивания мазков крови по Райту и Граму позволял быстро обнаруживать стафилококки, стрептококки и менингококки у больных септицемией.

Мазки крови были тонкие, клеточные элементы крови располагались в один слой и хорошо просматривались. При просмотре в световом микроскопе хорошо выявлялись грамположительные микроорганизмы и с большим трудом обнаруживали грамотрицательные, так как они были одного цвета с эритроцитами, образующими фон мазка.

Сравнение двух методов (микроскопия и посев) при диагностике бактериемии и фунгемии показало преимущество микроскопии перед посевом. Это объясняется тем, что культуральный метод выделения возбудителя из крови требует применения высокопитательных сред (сердечно-мозговых), анаэробных условий культивирования, закрытых гемокультуральных систем и определенного времени на рост микроорганизма. К сожалению, в России не выпускают промышленным способом сердечно-мозговые среды для культивирования крови, анаэробные условия культивирования применяются только в лабораториях крупных медицинских центров. В настоящее время с целью диагностики бактериемии используются зарубежные дорогостоящие закрытые системы лишь отдельными крупными лечебными учреждениями. Для выделения грибов требуются отдельные специальные среды.

Микроскопический метод исследования крови позволяет обнаруживать бактерии и грибы, диагностировать бактериемию и фунгемию за короткий период времени. На основании морфологии и тинкториальных свойств обнаруженных микроорганизмов возможно назначать эмпирическую антимикробную терапию уже через 1-1,5 часа с момента поступления крови в лабораторию.

Метод микроскопии применяется для диагностики бактериальных и грибковых инфекций.

Молниеносная форма менингококкцемии была диагностирована микроскопией мазка крови по обнаружению грамотрицательных диплококков в полиморфонуклеарных клетках. Кроме фагоцитируемых были и внеклеточные диплококки [26]. Ранее, в 1935 году Boone и Hall [27] и в 1943 году Thomas [28] диагностировали случаи менингококкцемии на основании микроскопических результатов исследования мазка периферической крови.

Микроскопия мазков лейкоцитарного слоя пробы периферической крови была применена при диагностике диссеминированной инфекции, вызванной Mycobacterium avium complex у пациента с синдромом иммунодефицита. У всех пациентов позже были получены гемокультуры данного возбудителя. Чувствительность микроскопического метода составляла 35%, специфичность и степень предположения данных возбудителей - 100%. Авторы показали, что микроскопия мазка лейкоцитарного слоя при микобактериальной инфекции является быстрым, простым и специфическим методом диагностики диссеминированной инфекции [29].

В мазках крови возможно обнаружение кислотоустойчивых бактерий при циркуляции их в кровотоке в количестве 20-180 КОЕ/мл крови у больных без соответствующей терапии и от 800 КОЕ/мл крови и более у больных на фоне терапии [29].

Graham и соавт. обнаруживали кислотоустойчивые бактерии в мазках лейкоцитарного слоя при окрашивании методом Киньона при наличии бактерий в кровотоке в количестве 150.000 КОЕ/мл крови у больных со СПИДом и диссеминированной инфекцией [30]. Авторы утверждали, что чувствительность метода микроскопии мазка лейкоцитарного слоя зависит от количества микобактерий в крови. У больных СПИДом прогрессивно нарастала микобактериемия и диагностика была возможна при микроскопическом исследовании крови.

Микроскопическое исследование мазка крови позволило определить диссеминированную форму токсоплазмоза [31].

Пневмококковая бактериемия была диагностирована микроскопией мазка периферической крови больного с миеломой. Мазок крови был окрашен по Райту и диплококки располагались внеклеточно. В гемокультуре и посеве ликвора был получен пневмококк [32].

При микроскопии мазков крови больного септицемией на фоне хондросаркомы были обнаружены споры Cl. perfringens внутри лейкоцитов. Мазки были выполнены из лейкоцитарного слоя пробы крови и окрашены по Райту. Полученные гемокультуры спорообразующего микроорганизма подтвердили ранее обнаруженного возбудителя в мазках [33].

Диагноз системного кандидоза был поставлен по результатам микроскопии «тонких» мазков и мазков лейкоцитарного слоя пробы периферической крови.

В 1945 году Parsons и Zarafonetis обнаружили бластоспоры Histoplasma capsulatum внутри нейтрофилов в «тонком» мазке периферической крови [34]. Другими авторами была описана фунгемия, вызванная Histoplasma capsulatum, которая была диагностирована микроскопически до получения гемокультуры. Мазок был выполнен из лейкоцитарного слоя и окрашен по Райту-Гимза. В мазках просматривались маленькие контрастные тельца, которые находились внеклеточно. Позднее была получена гемокультура [35].

В 1948 году Portnoy описал два случая обнаружения С. albicans в «тонких» мазках периферической крови до получения гемокультуры [36]. Anderson в 1972 году описал обнаружение дрожжевых клеток в марках периферической крови при системном кандидозе. Диагноз был поставлен по факту наличия дрожжевых клеток и псевдогиф в мазке крови [37]. В 1973 году Silverman диагностировал системный кандидоз по результатам микроскопии мазков лейкоцитарного слоя крови [38]. Большинство из обнаруженных микроорганизмов представляли собой бластоспоры в виде маленьких базофильных овальных телец, окруженных четкой зоной. Большинство из них находились в цитоплазме нейтрофилов. Мазки окрашивали по Райту и метенаминовым серебром [38]. При окраске методом PAS (Periodic Acid-Schiff) дрожжевые клетки и псевдогифы окрашиваются в ярко-красный цвет. Автор предложил использовать метод микроскопии лейкоцитарного слоя для подтверждения ожидаемой кандидемии [38]. K. Kobza продемонстрировал обнаружение бластоспор и псевдогиф в свободном и фагоцитированном лейкоцитами состояниях в мазках лейкоцитарного слоя пробы периферической крови и получение роста S. aureus и С. albicans в гемокультуре, которая подтвердила микроорганизмы, обнаруженные ранее в мазках крови [39].

Грибковые элементы, включая бластоспоры, псевдогифы были обнаружены у пациентки после хирургической операции. Дрожжевые клетки располагались как внутриклеточно, так и вне клеток. Спустя два дня после диагноза, поставленного микроскопически, была получена гемокультура С. albicans, что подтвердило первоначальные микроскопические находки [40].

В 1986 году был опубликован первый случай диагностики Candida parapsilosis микроскопическим исследованием крови. Дрожжевые клетки располагались внутри моноцитов и нейтрофилов. Больной страдал хронической лимфотической лейкемией [41]. При микроскопии мазков периферической крови в нейтрофилах наблюдали фагоцитоз клеток грибов Rhodotorula rubra и Candida guilliermondii у больных нейтропенией.

Гемолиз эритроцитов случается при разрушении оболочки эритроцитов. Разрушение может возникать в кровотоке и вне организма, т.е. в пробирке. При попадании эритроцита в воду он начинает поглощать ее. Вода, вследствие резкой разницы в осмотическом давлении внутри и вне эритроцита, быстро диффундирует внутрь эритроцита, вызывает его набухание и разрыв оболочки. Так как осмотическое давление воды меньше, чем давление внутри эритроцита, поэтому вода поступает внутрь эритроцита, увеличивая его объем и давление внутри. Эритроцит набухает, и его оболочка разрывается и свертывается [42]. В опытах было показана скорость гемолиза. Каждые 30 секунд гемолизу подвергаются 30% эритроцитов. В патенте «Способ определения осмотической резистентности эритроцитов» оценивали степень гемолиза эритроцитов в различных растворах. Оказалось, что в дистиллированной воде гемолиз происходит в 100% случаев [42].

В качестве прототипа изобретения взят способ приготовления мазка крови из лейкоцитарного слоя венозной крови, описанный в методических рекомендациях «Микробиологические методы диагностики инфекции кровотока», 2010 год, утвержденных Комитетом по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга [43]. Приведенный прототип изобретения предусматривает технологию приготовления мазка, которая заключается в следующем.

Кровь отбирается в пробирку, содержащую антикоагулянт, после центрифугирования удаляют верхний светлый слой - плазму и собирают тонкий белый слой, лежащий на эритроцитах, который представляет собой лейкоцитарный слой. Капли этого слоя наносят на предметные стекла и шлифовальным стеклом техникой «двух стекол» делают тонкий мазок. Мазок высушивают, фиксируют, окрашивают по Граму и смотрят в световом микроскопе с иммерсией. Мазок представляет собой расположенные в один слой эритроциты, создающие красный фон, и расположенные между ними лейкоциты с окрашенными в синий цвет ядрами и микроорганизмами разной формы и цвета окрашивания (красные и синие). При микроскопии грамположительные микроорганизмы синего цвета хорошо просматриваются на красном фоне, а грамотрицательные красного цвета сливаются с фоном и просматриваются с трудом. Поэтому при этиологической диагностике инфекции кровотока в большинстве случаев выявляли грамположительные микроорганизмы, включая бактерии и грибы.

Нами поставлена задача разработать доступный универсальный способ экспресс-метода диагностики инфекции кровотока, позволяющий выявлять как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы в крови пациента.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении эффективности диагностики инфекции кровотока за счет дополнительной возможности выявления грамотрицательных микроорганизмов путем обеспечения бесцветного фона мазка крови при сохранении простоты, доступности диагностики.

Нами предложено для повышения диагностических возможностей способа выявления инфекции кровотока устранять розовый фон мазка крови путем разрушения эритроцитов. Таким образом, обработка мазка крови дистиллированной водой разрушает и удаляет эритроциты из мазка крови, что обеспечивает дополнительное выявление грамотрицательных (красных) микроорганизмов на бесцветном фоне мазка крови при микроскопии.

Предлагаемый способ позволяет гарантированно обнаруживать все имеющиеся микроорганизмы в мазке крови, как грамположительные, так и грамотрицательные, так как все окрашенные формы бактерий и грибов лежат на прозрачном фоне мазка крови.

Таким образом, чувствительность метода повышается за счет обнаружения грамотрицательных микроорганизмов. Если грамположительные микроорганизмы составляют около 50-60% в этиологии бактериемии, то на грамотрицательные микроорганизмы приходится около 20%, поэтому обнаружение грамотрицательных микроорганизмов позволяет повысить эффективность диагностики на 20%, тем самым повысить ценность метода и возможности подбора антимикробной терапии.

Кроме того, обнаружение грамотрицательных микроорганизмов важно для диагностики госпитальной инфекции и вторичного инфекционного эндокардита (после операции по поводу протезирования клапанов сердца). В этиологии бактериемий у амбулаторных пациентов преобладают грамположительные микроорганизмы, а при госпитальной инфекции - грамотрицательные. Расшифровка этиологии госпитальных инфекций - ключ профилактики госпитальной инфекции в каждой конкретной клинике.

При сравнении процента обнаружения микроорганизмов в крови и процента их выделения при посеве крови оказалось, что микроскопический метод эффективнее культурального в несколько раз. Разница в процентах указывает, что даже самая богатая питательная среда (сердечно-мозговая) с гемолизированной кровью и витаминными добавками не может воссоздать полный набор необходимых питательных компонентов для жизнедеятельности микроорганизмов, которым обладает кровь. Кроме того, при микроскопии могут быть обнаружены как живые, так и погибшие клетки микроорганизмов, а при посеве крови получаем рост только живых микроорганизмов.

По обнаруженным микроорганизмам в мазке крови назначается эмпирическая антимикробная терапия. От момента приготовления мазка до назначения терапии требуется 1-1,5 часа. Этот метод диагностики инфекции в крови относится к экспресс-методу.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Способ экспресс-метода диагностики инфекции кровотока предполагает выявление микроорганизмов в крови методом микроскопии мазка крови с иммерсией и увеличением ×1000. При этом мазок готовят из лейкоцитарного слоя венозной крови, используя технику «двух стекол». После высушивания наливают на мазок дистиллированную воду, покрывая всю его площадь. Через 3-5 секунд смывают разрушенные эритроциты и мазок высушивают. После фиксации над пламенем горелки и окрашивания по Граму выполняют микроскопию полученного маска.

Способ осуществляется следующим образом.

Кровь пациента отбирают в «шприц-пробирки» с антикоагулянтом (лимонно-кислый натрий) в объеме 5 мл или 10 мл путем венопункции. После удаления шприца из вены удаляют иглу, отламывают поршень и полученную пробирку из шприца переворачивают не менее 3-х раз для хорошего смешивания крови с антикоагулянтом. После доставки в лабораторию пробирку с кровью центрифугируют при режиме 1000-1500 оборотов в минуту в течение 15-20 минут. Пастеровской пипеткой удаляют плазму. Лейкоцитарный слой лежит на эритроцитах в виде тонкого светлого слоя высотой 0,5-1,0 мм. Капилляром Панченкова или одноразовой пипеткой с широким плоским концом собирают этот слой и каплями наносят на предметные стекла. Погружают шлифовальный конец предметного стекла в каплю, ждут, когда капля растечется по ребру шлифовального стекла и, слегка нажимая на стекло для мазка, распределяют каплю лейкоцитарного слоя по поверхности предметного стекла техникой «двух стекол» для получения тонкого мазка крови. Техника «двух стекол» осуществляется в клинических лабораториях для приготовления тонких клинических мазков крови. Мазок крови высушивают на воздухе. Мазок имеет розовую окраску. Затем на мазок наливают дистиллированную воду и смывают разрушенные в течение нескольких секунд эритроциты. Мазок приобретает вид прозрачного стекла. Мазок снова высушивают. Затем его фиксируют над пламенем горелки и окрашивают по Граму по общепринятой методике. Мазок крови просматривают под иммерсионным маслом с увеличением ×1000. При микроскопии мазка, обработанного дистиллированной водой, на белом фоне хорошо просматриваются морфологические формы микроорганизмов, окрашенных как грамположительно, так и грамотрицательно. Микроорганизмы, окрашенные грамотрицательно в слабо-розовый цвет, хорошо просматриваются на прозрачном фоне стекла.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1

Исследовались мазки крови, приготовленные из лейкоцитарного слоя пробы периферической крови, микроскопическим методом больного Г., 37 лет, с клиническим диагнозом инфекционного эндокардита. Было приготовлено два мазка крови для окрашивания по Граму с предварительной обработкой дистиллированной водой (по предлагаемому способу) и без обработки. При микроскопии мазка крови без обработки дистиллированной водой были обнаружены грамположительные дрожжевые клетки синего цвета на плотном ярко-розовом фоне эритроцитов с небольшим количеством лейкоцитов. При микроскопии мазка крови с предварительной обработкой дистиллированной водой были обнаружены грамотрицательные палочки розового цвета, грамположительные дрожжевые клетки синего цвета и лейкоциты с окрашенными в синий цвет ядрами внутри них в небольшом количестве. Все формы хорошо просматривались на белом прозрачном фоне стекла. При посеве крови была получена гемокультура E. coli, которая подтвердила наличие кишечной палочки в мазке, но увиденной только на прозрачном фоне, т.е. без эритроцитов.

Пример 2

Таким же образом были приготовлены мазки больной И., 50 лет, с диагнозом хроническое воспалительное заболевание верхних дыхательных путей. При микроскопии мазка без обработки дистиллированной водой были обнаружены грамположительные кокки в небольшом количестве и лейкоциты в значительном количестве. В мазке крови, который подвергался обработке дистиллированной водой (по предлагаемому способу), на прозрачном фоне были видны грамотрицательные палочки и грамположительные кокки в небольшом количестве, большое количество лейкоцитов. В посеве крови была получена полимикробная гемокультура, содержавшая в себе штаммы Staphylococcus epidermidis и Enterobacter aerogenes.

В таблице представлены результаты обнаружения грамотрицательных палочек при микроскопии мазка крови при разных условиях приготовления мазка крови (результаты параллельных микроскопий мазков крови).

Предлагаемый способ технически прост по методике и используемому реактиву, эффективен для улучшения выявления микроорганизмов и доступен для микробиологической лаборатории при микробиологическом исследовании крови при инфекции в крови.

Литература

1. Andrews F.W., Case of Acute meningococcal septicaemia, Lancet, 1906, 1, 1172-1174.

2. Bulloch W. The History of bacteriology. New York, Oxford University Press, 1938, 141, 179.

3. King W.W., Early diagnosis of cerebrospinal meningitis by the examination of stained blood films, J.A.M.A., 1918, v. 71, 2048-2050.

4. Anderson A.E., Cassaday P.B., Healy G.R. Babesiosis in man. Am. J. of Clin. Pathl., 1974, v. 62, 5, 612-619.

5. Иванов В.П., Постовит B.A., Бойцов А.Г., Гранстрем К.О., Клиническая и лабораторная диагностика инфекционного процесса, Монография, Санкт-Петербург, 1996, с. 102.

6. King W.W. Early diagnosis of cerebrospinal meningitis by the examination of stained blood films. J.A.M.A., 1918, v. 71, 2048-2050.

7. Humphrey A.A., Use of the buffy layer in the rapid diagnosis of septicaemia, Am. J. Clin. Pathol., 1944, v. 14, 4, 358-362.

8. Humphrey A.A. Use of the buffy layer in the rapid diagnosis of septicemia. Am. J. Clin. Pathol., 1944, v. 14, 4. 358-362.

9. Carison B.E., Andersen B.R. Value of granulocyte examination for bacteria. JAMA, 1976, v. 235, 14, 1465-1466.

10. Powers D.L., Mandell G.L. Intraleukocytic bacteria in endocarditis patients. JAMA, 1974, 227, 312-313.

11. Kronvall G., Myhre E., Differential staining of bacteria in clinical specimens using acridine orange byffered at a low pH, Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1977, v. 85, 2, 249-254.

12. Hanes C.V.E., Luoia H.L., Acridine orange as a Screen for organisms in clinical specimens and comparison with Grams Stain, Arch. Pathol. Lab. Med., 1988, v. 112, 5, 529-532.

13. Lquer B.A., Reller L.B., Mirrett S., Comparison of Acridine Orange and Gram Stains for Detection of Microorganisms in Cerebrospinal Fluid and other Clinical Specimens, J. of Clin. Microb., 1981, v. 14, 2, 201-205.

14. Lipsky B.A., Plorde J.L., Tenover F.C. et al., Comparison of the Automicrobic system, acridine orange-atained smears, and Gram-stained smears in detecting bacteriuria, J. Clin. Microb., 1985, v. 22, 2, 176-181.

15. Feldman W.E., Relation of concentrations of bacteria and bacterial antigen in cerebrospinal fluid to prognosis in patients with bacterial meningitis, N. Engl. J. med., 1977, 296, 433-435.

16. Kass E.H., Asymptomatic infections of the urinary tract. Trans. Assoc. Am. Physicians., 1956, 69, 56-64.

17. Reik H., Rubin S.J. Evaluation of the buffy-coat for rapid detection of bacteremia. JAMA, 1981, 245, 357-359.

18. Brooks G.F., Pribble A.H., Beatty H.N. Early diagnosis of bacteremia by buffy-coat examination. Arch. Intern. Med., 1973, 132, 673-675.

19. Faden H.S. Early diagnosis of neonatal bacteremia by buffy-coat examination. J. Pediatr., 1976, 88, 1032-1034.

20. Stratton Ch.W. Detection of bacteremia and fungemia: microscopic examination of peripheral blood smears. Infection Control, 1984, v. 5, 9, 448-452.

21. Smith H. Leucocytes containing bacteriain plain blood films from patients with septicemia. Aust. Ann. Med., 1966, 15, 210-221.

22. Carlson B.E., Anderson B.R. Value of granulocyte examination for bacteria. JAMA, 1976, 235, 1465-1466.

23. Storm W. Early detection of bacteremia by peripheral blood smears in critically ill newborns. Acta Pediatr. Scand., 1981, 70, 415-416.

24. Boyle R.J., Chandler B.D., Stonestreet B.S. et al. Early identification of sepsis in infants with respiratory distress. Pediatrics, 1978, 62, 744-750.

25. Torres J., Bisno A.L., Hyposplenism and Pneumococcemia visualization of Diolococcus pneumonia in the peripheral blood smear., Am. J. Med., 1973, 55, 851-855

26. Boger W.P., Fulminating meningococcemia demonstration of intracellular and extracellular meningococci in direct smears of the blood, N. Eng. J. of Med., 1944, 231, 11, 385-387.

27. Boone J.T., Hall W.W., Meningococcal septicemia with report of case showing organism in direct blood smear, U.S. Nav. M. Bull., 1935, 33, 446-451.

28. Thomas J.M.Jr., Meningococci meningitis and septicemia report of outbreak in fourth service command during winter and spring of 1942-43, J.A.M.A., 1943, 123, 264-272.

29. Nussbaum J.M., Dealist C, Lewis W. et al., Rapid diagnosis by buffy coat smear of disseminated mycobacterium avium complex infection in patients with acquired immunodeficiency syndrome, 1990, 28, 3, 631-632,

30. Graham B.S., Hinson M.V., Benett S.R. et al., Acid-fast bacilli on buffy coat smears in the acquired immunodeficiency syndrome: a lessonfrom Hansen s bacillus, South Med. J., 1984, 77, 246-248.

31. Albrecht H., Sobottka J., Stellbrink H.J., van Lunzen J., Greten H. Diagnosis of disseminated toxoplasmosis using a peripheral blood smear (letter). AIDS, 1996, 10 (7), 799-800.

32. Posner M.R., Berk S.L., Rice P.A., Pneumococcal bacteremia diagnosed by peripheral blood smear in multiple myeloma, Arch. Intern. Med., 1978, 138, 1720-21.

33. Kuberski T.T., Intraleucocitic spore formation and leukocytic vacuolization during Clostridium perfringens septicemia, Am. J. Clin. Pathol., 1977, 68, 794-796.

34. Parsons R.J., Zarafonetis C.J.D., Histoplasmosis in man, Arch. Intern. Med., 1945, 75, 23, 1.

35. Snider H.L., Fungemia in chronic cavitary pulmonary histoplasmosis, J. of InfDis., 1981, 143, 4, 633.

36. Portnoy J., Wolf, Webb M., et al., Candida blastospores and pseudohyphae in blood smears, New. Eng J. of Med., 1971, 285, 16, 1010-11.

37. Anderson A.O., Yardley J.M. Demonstration of Candida in blood smears, N. Eng. J. Med., 1972, 286, 108-9.

38. Silverman E.M., Norman L.E., Goldman R.T. et al., Diagnosis of systemic candidiasis in smears of venous blood stained with Wrights stain, Am. J. of Clin. Pathology, 1973, 60, 473-75.

39. Kobza K., Demonstration of Candida in blood smears, British. Med. J., 1977, I, 1640-41.

40. Berrouane Y., Bisiau H., le Baron F., et al., Candida albicans blastoconidia in oeriphetal blood smears from non-neutropenic surgical patients, J. Clin. Pathol., 1998, 51 (7), 537-8.

41. Monihan J.M., Jewell T.W., Weir G.T. Candida parapsilosis diagnosed by peripheral blood smear. Arch. Pathol. Lab. Med., 1986, 110 (12), 1180-1181.

42. Горшкова M.A., Миллер Д.А., Егорова E.H., Федотова Т.А. Патент РФ №2328741. Способ определения осмотической резистентности эритроцитов, 2008.

43. Каргальцева Н.М., Кочеровец В.И., Кафтырева Л.А., Пастушенков В.Л., Колосовская Е.Н., Кучеренко Е.В., Сатосова Н.В. Микробиологические методы диагностики инфекции кровотока, Санкт-Петербург, 2010, 41 с.

Способ экспресс-диагностики инфекции кровотока, включающий выявление микроорганизмов в крови методом микроскопии мазка крови с иммерсией и увеличением ×1000, отличающийся тем, что мазок готовят из лейкоцитарного слоя крови, используя технику «двух стекол», после высушивания наливают на мазок дистиллированную воду, покрывая всю его площадь, через 3-5 с смывают разрушенные эритроциты, мазок высушивают, далее после фиксации над пламенем горелки и окрашивания по Граму выполняют микроскопию полученного мазка.