Способ оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro


 


Владельцы патента RU 2616498:

Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия (ФГБОУ ВПО НГСХА) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтике для определения степени апоптоза эритроцитов in vitro. Для этого эритроциты отмывают в 10-кратном объеме физиологического раствора, а полученный супернатант инкубируют с хлористым гадолинием до конечной концентрации 400-600 мкМ. После интенсивного перемешивания смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. В полученном осадке, содержащем микрочастицы, определяют активность ацетилхолинэстеразы. По активности ацетилхолинэстеразы судят о степени апоптоза эритроцитов. Изобретение обеспечивает простой и быстрый способ определения степени апоптоза эритроцитов при скрининге лекарственный препаратов. 3 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине и может использоваться в опытах in vitro для оценки степени апоптоза эритроцитов.

Важнейшим признаком апоптоза эритроцитов является образование микрочастиц, несущих на своей поверхности большое количество фосфатидилсерина (Lang K.S et al. Mechanisms of suicidal erythrocyte death. Cell Physiol. Biochem. 2005. Vol. 15. P. 195-202). По появлению микрочастиц в инкубационной среде судят об апоптозе эритроцитов.

В качестве прототипа выбран способ оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro по образованию количества микрочастиц, включающий отмывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, ультрацентрифугирование супернатанта и определение в осадке количества микрочастиц (Vader P. et al. Taxol - induced phosphatidylserine exposure and microvesicle formation in red blood cells is mediated by its vehicle cremophor. Nanomedicine. 2013. Vol. 8. P. 1127-1135).

Однако способ требует длительного ультрацентрифугирования супернатанта при 100000 g в течение 60 мин и дорогого специального оборудования (анализатор микрочастиц).

Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.

Технический результат - упрощение и ускорение способа оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro.

Принцип метода основан на том, что трехвалентный катион гадолиний избирательно взаимодействует с отрицательно заряженным фосфатидилсерином микрочастиц. В результате этого происходит агрегация микрочастиц и последующее выпадение их в осадок. В осадке, содержащем микрочастицы, определяют активность маркерного фермента микрочастиц ацетилхолинэстеразы (Greenwalt T.J. Tranfusion. - 2005. - V. 46. - P. 143-152).Чем выше активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц, тем выше степень апоптоза эритроцитов.

Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белых клеток крови центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. После инкубации эритроциты центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляют хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, получают осадок, содержащий микрочастицы, и в нем определяют ацетилхолинэстеразную активность, по активности ацетилхолинэстеразы микрочастиц судят о степени апоптоза эритроцитов.

Пример 1. Отмытые эритроциты инкубировали в среде, содержащей 1 мкМ ионофора А 23187 и 1 мМ кальция, в течение 3 ч. После инкубации эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц. Активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц составила 6.2±0.5 мкмоль/мин/мг белка.

Пример 2. Отмытые эритроциты инкубировали в среде, содержащей 400 мМ сахарозы и 1 мМ кальция, при 37°C в течение 24 ч. После инкубации эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц. Активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц составила 36.31±1.82 мкмоль/мин/мг белка.

Пример 3. Отмытые эритроциты инкубировали в среде, содержащей 5 мкМ хлористого лантана, при 37°C в течение 24 ч. После инкубации эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц. Активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц составила 29.7±1.14 мкмоль/мин/мг белка.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа можно выяснить степень апоптоза эритроцитов in vitro. Так наибольшая степень апоптоза эритроцитов наблюдается в опытах с сахарозой.

Преимуществом предлагаемого способа является быстрота, простота, доступность, отсутствие необходимости в сложном дорогостоящем оборудовании. Способ позволяет проводить скрининг лекарственных препаратов на апоптоз эритроцитов.

Способ оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro, включающий отмывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, отличающийся тем, что к супернатанту добавляют хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, получают осадок, содержащий микрочастицы, и в нем определяют активность ацетилхолинэстеразы, по активности ацетилхолинэстеразы микрочастиц судят о степени апоптоза эритроцитов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для ранней дифференциальной диагностики острого аппендицита и острой кишечной инфекции.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда при гиподинамии. Способ определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда при гиподинамии, включающий определение ацетола (гидрооксиацетона C3H6O2 GAS116-09-6) в выдыхаемом воздухе испытуемого методом хроматомасс-спектрометрии, до начала гиподинами и в процессе её воздействия и при достоверном уменьшении ацетола в выдыхаемом воздухе диагностируют тканевую гипоксию скелетных мышц и миокарда при гиподинамии.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и иммунологии, в частности к лабораторной диагностике рассеянного склероза. Предложено исследование лимфоцитов проводить методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В.

Изобретение относится к области медицины, а именно к оториноларингологии. Для прогнозирования абсцесса при остром тонзиллите проводят определение балльного индекса по результатам суммирования баллов.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может использоваться для автоматического подсчета количества ретикулоцитов на анализаторах мазков крови.

Изобретение относится к области медицины, в частности к области онкологии и урологии, и касается способа выбора отделов предстательной железы для пункции при диагностике рака предстательной железы.

Группа изобретений относится к устройствам (вариантам) для разделения фракций с более низкой и более высокой плотностями пробы текучей среды. Узел содержит контейнер для пробы, запорный элемент, разделитель.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения гомоаргинина (гАрг) в плазме крови и других биологических жидкостях человека.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу прогнозирования развития гнойных осложнений панкреонекроза. Способ прогнозирования развития гнойных осложнений панкреонекроза заключается в том, что у пациента со стерильным панкреонекрозом, начиная с пятых суток от начала заболевания, определяют активность альфа-амилазы в крови, содержание в крови общего белка, лимфоцитов, моноцитов, отношение альбуминов и глобулинов в сыворотке крови, тяжесть состояния пациента по следующим шкалам SAPS, SOFA, SIRS, наличие парапанкреатического инфильтрата, пареза желудочно-кишечного тракта, острого скопления жидкости в сальниковой сумке или забрюшинной клетчатке и вычисляют индекс инфицирования панкреонекроза (ИИПН) по формуле.

Группа изобретений относится к определению концентрации аналита в биологической жидкости на основании полученных зависимостей величины тока от времени. Способ определения концентрации аналита в физиологической жидкости включает размещение реактива для взаимодействия с аналитом в физиологической жидкости между первым электродом и вторым электродом, нанесение физиологической жидкости на реактив, трансформацию аналита в физиологической жидкости и возбуждение нестационарного тока от каждого из первого и второго электродов, определение пика нестационарного тока для каждого из первого и второго электродов, измерение значения нестационарного тока при заданном временном смещении от пика каждого нестационарного тока от каждого из первого и второго электродов, при этом временное смещение для первого электрода содержит первое смещение по времени от пика нестационарного тока первого электрода, а временное смещение от пика нестационарного тока второго электрода содержит второе смещение по времени, отличное от первого смещения по времени, и вычисление концентрации аналита на основе измеренных значений тока первого и второго электродов на этапе измерения.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой кристалломорфологический способ диагностики опухолевых заболеваний поджелудочной железы, включающий введение в пробу мочи пациента нингидрина с добавкой тинктуры болиголова и горечавки, высушивание смеси методом испарения, произвольный выбор 3 фракталов, для которых подсчитывают среднее значение фрактального масштаба F=P/S1/2, где P - периметр, S - площадь фрактала, и при значении F от 4,0 до 5,5 делают вывод об отсутствии опухоли или наличии медленно растущей опухоли, при значении F от 5,6 до 7.5 делают вывод о наличии доброкачественной или перерождающейся в злокачественную опухоли, при значении F от 7,6 до 9,0 делают вывод о наличии злокачественной опухоли, а при значении F более 9,0 делают вывод о наличии злокачественной опухоли и появлении метастазов. Изобретение обеспечивает диагностику опухолевого заболевания и стадии заболевания. 2 ил., 2 пр.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу определения формирования гемолитической анемии у беременных в третьем триместре гестации при обострении хронической цитомегаловирусной инфекции. Способ определения формирования гемолитической анемии у беременных в третьем триместре гестации при обострении хронической цитомегаловирусной инфекции включает определение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу, определение в эритроцитах телец Гейнца, определение содержания глутатионредуктазы и оксигемоглобина, и при увеличении титра антител к цитомегаловирусу до титра 1:1600, снижении в эритроцитах глутатионредуктазы до 3,95±0,06 Ед/гHb, появлении в эритроцитах телец Гейнца от 2 до 5 на каждый эритроцит и снижении оксигемоглобина до 84,0±2,9% формируется у беременной гемолитическая анемия. Вышеописанный способ позволяет эффективно выявить формирование гемолитической анемии у беременных в третьем триместре гестации при обострении хронической цитомегаловирусной инфекции. 1 ил.
Наверх