Способ оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro

Авторы патента:

Крылов Василий Николаевич (RU)

Рогозин Метхун Мадибронович (RU)

Успенский Александр Николаевич (RU)

Левин Григорий Яковлевич (RU)

Шереметьев Юрий Александрович (RU)

G01N33/49 - крови

Владельцы патента RU 2616498:

Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия (ФГБОУ ВПО НГСХА) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтике для определения степени апоптоза эритроцитов in vitro. Для этого эритроциты отмывают в 10-кратном объеме физиологического раствора, а полученный супернатант инкубируют с хлористым гадолинием до конечной концентрации 400-600 мкМ. После интенсивного перемешивания смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. В полученном осадке, содержащем микрочастицы, определяют активность ацетилхолинэстеразы. По активности ацетилхолинэстеразы судят о степени апоптоза эритроцитов. Изобретение обеспечивает простой и быстрый способ определения степени апоптоза эритроцитов при скрининге лекарственный препаратов. 3 пр.

Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине и может использоваться в опытах in vitro для оценки степени апоптоза эритроцитов.

Важнейшим признаком апоптоза эритроцитов является образование микрочастиц, несущих на своей поверхности большое количество фосфатидилсерина (Lang K.S et al. Mechanisms of suicidal erythrocyte death. Cell Physiol. Biochem. 2005. Vol. 15. P. 195-202). По появлению микрочастиц в инкубационной среде судят об апоптозе эритроцитов.

В качестве прототипа выбран способ оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro по образованию количества микрочастиц, включающий отмывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, ультрацентрифугирование супернатанта и определение в осадке количества микрочастиц (Vader P. et al. Taxol - induced phosphatidylserine exposure and microvesicle formation in red blood cells is mediated by its vehicle cremophor. Nanomedicine. 2013. Vol. 8. P. 1127-1135).

Однако способ требует длительного ультрацентрифугирования супернатанта при 100000 g в течение 60 мин и дорогого специального оборудования (анализатор микрочастиц).

Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.

Технический результат - упрощение и ускорение способа оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro.

Принцип метода основан на том, что трехвалентный катион гадолиний избирательно взаимодействует с отрицательно заряженным фосфатидилсерином микрочастиц. В результате этого происходит агрегация микрочастиц и последующее выпадение их в осадок. В осадке, содержащем микрочастицы, определяют активность маркерного фермента микрочастиц ацетилхолинэстеразы (Greenwalt T.J. Tranfusion. - 2005. - V. 46. - P. 143-152).Чем выше активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц, тем выше степень апоптоза эритроцитов.

Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белых клеток крови центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. После инкубации эритроциты центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляют хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, получают осадок, содержащий микрочастицы, и в нем определяют ацетилхолинэстеразную активность, по активности ацетилхолинэстеразы микрочастиц судят о степени апоптоза эритроцитов.

Пример 1. Отмытые эритроциты инкубировали в среде, содержащей 1 мкМ ионофора А 23187 и 1 мМ кальция, в течение 3 ч. После инкубации эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц. Активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц составила 6.2±0.5 мкмоль/мин/мг белка.

Пример 2. Отмытые эритроциты инкубировали в среде, содержащей 400 мМ сахарозы и 1 мМ кальция, при 37°C в течение 24 ч. После инкубации эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц. Активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц составила 36.31±1.82 мкмоль/мин/мг белка.

Пример 3. Отмытые эритроциты инкубировали в среде, содержащей 5 мкМ хлористого лантана, при 37°C в течение 24 ч. После инкубации эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц. Активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц составила 29.7±1.14 мкмоль/мин/мг белка.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа можно выяснить степень апоптоза эритроцитов in vitro. Так наибольшая степень апоптоза эритроцитов наблюдается в опытах с сахарозой.

Преимуществом предлагаемого способа является быстрота, простота, доступность, отсутствие необходимости в сложном дорогостоящем оборудовании. Способ позволяет проводить скрининг лекарственных препаратов на апоптоз эритроцитов.

Способ оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro, включающий отмывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, отличающийся тем, что к супернатанту добавляют хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, получают осадок, содержащий микрочастицы, и в нем определяют активность ацетилхолинэстеразы, по активности ацетилхолинэстеразы микрочастиц судят о степени апоптоза эритроцитов.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для ранней дифференциальной диагностики острого аппендицита и острой кишечной инфекции.

Способ определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда при гиподинамии // 2613910

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда при гиподинамии. Способ определения тканевой гипоксии скелетных мышц и миокарда при гиподинамии, включающий определение ацетола (гидрооксиацетона C3H6O2 GAS116-09-6) в выдыхаемом воздухе испытуемого методом хроматомасс-спектрометрии, до начала гиподинами и в процессе её воздействия и при достоверном уменьшении ацетола в выдыхаемом воздухе диагностируют тканевую гипоксию скелетных мышц и миокарда при гиподинамии.

Способ определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом // 2613908

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и иммунологии, в частности к лабораторной диагностике рассеянного склероза. Предложено исследование лимфоцитов проводить методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В.

Способ прогнозирования абсцесса при остром тонзиллите // 2613081

Изобретение относится к области медицины, а именно к оториноларингологии. Для прогнозирования абсцесса при остром тонзиллите проводят определение балльного индекса по результатам суммирования баллов.

Способ подготовки мазков крови для подсчета ретикулоцитов // 2612018

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может использоваться для автоматического подсчета количества ретикулоцитов на анализаторах мазков крови.

Способ выбора отделов предстательной железы для пункции при диагностике рака предстательной железы // 2611405

Изобретение относится к области медицины, в частности к области онкологии и урологии, и касается способа выбора отделов предстательной железы для пункции при диагностике рака предстательной железы.

Узел для разделения жидкости на фазы с разными плотностями (варианты) // 2610591

Группа изобретений относится к устройствам (вариантам) для разделения фракций с более низкой и более высокой плотностями пробы текучей среды. Узел содержит контейнер для пробы, запорный элемент, разделитель.

Способ определения содержания гомоаргинина в плазме крови и других биологических жидкостях человека // 2609873

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения гомоаргинина (гАрг) в плазме крови и других биологических жидкостях человека.

Способ прогнозирования развития гнойных осложнений панкреонекроза на ранних сроках заболевания // 2605851

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу прогнозирования развития гнойных осложнений панкреонекроза. Способ прогнозирования развития гнойных осложнений панкреонекроза заключается в том, что у пациента со стерильным панкреонекрозом, начиная с пятых суток от начала заболевания, определяют активность альфа-амилазы в крови, содержание в крови общего белка, лимфоцитов, моноцитов, отношение альбуминов и глобулинов в сыворотке крови, тяжесть состояния пациента по следующим шкалам SAPS, SOFA, SIRS, наличие парапанкреатического инфильтрата, пареза желудочно-кишечного тракта, острого скопления жидкости в сальниковой сумке или забрюшинной клетчатке и вычисляют индекс инфицирования панкреонекроза (ИИПН) по формуле.

Коррекция способом смещения по времени от пика для тест-полоски, используемой для измерения содержания аналита // 2605292

Группа изобретений относится к определению концентрации аналита в биологической жидкости на основании полученных зависимостей величины тока от времени. Способ определения концентрации аналита в физиологической жидкости включает размещение реактива для взаимодействия с аналитом в физиологической жидкости между первым электродом и вторым электродом, нанесение физиологической жидкости на реактив, трансформацию аналита в физиологической жидкости и возбуждение нестационарного тока от каждого из первого и второго электродов, определение пика нестационарного тока для каждого из первого и второго электродов, измерение значения нестационарного тока при заданном временном смещении от пика каждого нестационарного тока от каждого из первого и второго электродов, при этом временное смещение для первого электрода содержит первое смещение по времени от пика нестационарного тока первого электрода, а временное смещение от пика нестационарного тока второго электрода содержит второе смещение по времени, отличное от первого смещения по времени, и вычисление концентрации аналита на основе измеренных значений тока первого и второго электродов на этапе измерения.

Кристалломорфологический способ диагностики и профилактики опухолевых заболеваний поджелудочной железы // 2616900

Изобретение относится к области медицины и представляет собой кристалломорфологический способ диагностики опухолевых заболеваний поджелудочной железы, включающий введение в пробу мочи пациента нингидрина с добавкой тинктуры болиголова и горечавки, высушивание смеси методом испарения, произвольный выбор 3 фракталов, для которых подсчитывают среднее значение фрактального масштаба F=P/S1/2, где P - периметр, S - площадь фрактала, и при значении F от 4,0 до 5,5 делают вывод об отсутствии опухоли или наличии медленно растущей опухоли, при значении F от 5,6 до 7.5 делают вывод о наличии доброкачественной или перерождающейся в злокачественную опухоли, при значении F от 7,6 до 9,0 делают вывод о наличии злокачественной опухоли, а при значении F более 9,0 делают вывод о наличии злокачественной опухоли и появлении метастазов. Изобретение обеспечивает диагностику опухолевого заболевания и стадии заболевания. 2 ил., 2 пр.

Способ оценки снижения оксигемоглобина при индуцирующем действии цитомегаловирусной инфекции на структуру гемоглобина эритроцитов, приводящем к формированию телец гейнца // 2617534

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу определения формирования гемолитической анемии у беременных в третьем триместре гестации при обострении хронической цитомегаловирусной инфекции. Способ определения формирования гемолитической анемии у беременных в третьем триместре гестации при обострении хронической цитомегаловирусной инфекции включает определение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу, определение в эритроцитах телец Гейнца, определение содержания глутатионредуктазы и оксигемоглобина, и при увеличении титра антител к цитомегаловирусу до титра 1:1600, снижении в эритроцитах глутатионредуктазы до 3,95±0,06 Ед/гHb, появлении в эритроцитах телец Гейнца от 2 до 5 на каждый эритроцит и снижении оксигемоглобина до 84,0±2,9% формируется у беременной гемолитическая анемия. Вышеописанный способ позволяет эффективно выявить формирование гемолитической анемии у беременных в третьем триместре гестации при обострении хронической цитомегаловирусной инфекции. 1 ил.

Средство для защиты биомолекул плазмы крови от воздействия этанола // 2618394

Изобретение относится к медицине, а именно к наркологии и фармакологии, может быть использовано для защиты белков и липидов плазмы крови при воздействии этанола. Применяют аскорбат лития терапевтической концентрации 0,11 мг/мл. Использование изобретения позволяет защитить белки и липиды плазмы крови от повреждающего действия этанола. 1 табл., 1 пр.

Способ подбора режима иммуносупрессии детям раннего возраста в отдаленном периоде после трансплантации печени // 2619216

Изобретение относится к медицине, в частности к способу проведения иммуносупрессивной терапии после трансплантации печени детям раннего возраста в отдаленном периоде, характеризующийся тем, что через один год после трансплантации в сыворотке крови у реципиентов печени определяют содержание инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1) и растворимого CD30 (sCD30) и дозу такролимуса подбирают с учетом определенной концентрации IGF-1 и sCD30, суточную дозу такролимуса определяют по формуле D=1,3764+0,0081×G-0,0026×С, где D - суточная доза такролимуса, мг; G - содержание IGF-1 в сыворотке крови, нг/мл; С - содержание sCD30 в сыворотке крови, нг/мл. Использование данного способа позволяет провести эффективную профилактику осложнений у детей раннего возраста после трансплантации печени по поводу врожденных заболеваний гепатобилиарной системы в отдаленном периоде за счет индивидуального подбора концентрации такролимуса через один год после трансплантации печени. 5 пр.

Кювета для автоматического химического или биологического анализатора // 2619260

Группа изобретений относится к проведению реакций для автоматического химического или биологического анализатора. Представлена кювета для проведения реакций для автоматического химического или биологического анализатора, имеющая открытый верхний конец и содержащая приспособление для перемешивания текучей среды, верхний конец кюветы имеет соединительный элемент для зацепления с таким же соединительным элементом другой кюветы такого же типа, причем соединительный элемент содержит раму, содержащую по меньшей мере два параллельных выступа, проходящих наружу в продолжение ее коротких сторон, внутренняя вертикальная сторона каждого выступа оснащена полусферическим углублением для приема полусферического выступа, выполненного на раме соединительного элемента другой кюветы при соединении кювет друг с другом, а соединительный элемент прикреплен эластичным зажимом или защелкой на верхнем конце кюветы. Также описаны варианты узла кювет для проведения реакций и способ сборки кювет для проведения реакций. Достигается упрощение и повышение надежности анализа. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 17 ил.

Способ прогнозирования риска развития хронической ртутной интоксикации // 2619552

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования риска развития хронической ртутной интоксикации. Сущность способа заключается в том, что выделяют ДНК из периферической венозной крови, проводят полимеразную цепную реакцию и рестрикцию продуктов амплификации для анализа полиморфного локуса 1267A/G гена HSPA1B, принадлежащего к семейству генов белков теплового шока 70. При выявлении генотипа GG прогнозируют повышенный риск развития хронической ртутной интоксикации. Использование способа позволяет с высокой точностью оценить риск развития хронической ртутной интоксикации. 2 табл., 3 пр.

Способ определения пуринов и пиримидинов в биологических жидкостях человека // 2620155

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа определения пуринов и пиримидинов в сыворотке крови человека. Сущность способа заключается в том, что проводят приготовление стандартного раствора биомаркеров метаболизма пуринов и пиримидинов. Затем получают образцы сыворотки крови с разведением дистиллированной водой с последующим получением фракции путем центрифугирования и фильтрации. Далее к полученной фракции добавляют буферный раствор, содержащий ион-парный реагент - тетрабутиламмоний сульфат - и известное количество стандартного раствора, проводят хроматографическое разделение и строят калибровочные графики. Концентрацию веществ метаболизма пуринов и пиримидинов в анализируемых пробах вычисляют согласно полученным калибровочным кривым. Использование способа позволяет с высокой точностью определять пурины и пиримидины в сыворотке крови. 5 з.п. ф-лы, 2 ил.

Способ прогнозирования тяжести течения гастроэзофагеальной рефлюксной болезни // 2620546

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования течения гастроэзофагеальной рефлюксной болезни. Сущность способа заключается в том, что у больного в форменных элементах крови и ротовой жидкости определяют свободную и связанную воду. Если при выявлении связанной воды в составе биомакромолекул форменных элементов крови меньше 19,43, а в ротовой жидкости - больше 10,26, то прогнозируют развитие тяжелой формы ГЭРБ. Использование способа позволяет с высокой точностью прогнозировать развитие тяжелой формы ГЭРБ. 1 табл., 2 пр.

Способ исследования синтеза липопротеидов // 2620553

Изобретение относится к медицине и касается способа исследования синтеза липопротеидов. При исследовании синтеза липопротеидов вечером перед сном и утром натощак в плазме крови определяют содержание триглицеридов, липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП), гематокрита и объема циркулирующей крови, после чего рассчитывают коэффициент (К), позволяющий оценить состояние синтеза липопротеидов по формуле: гдеК - коэффициент состояния синтеза липопротеидов, ТГутр - содержание триглицеридов в плазме утром, ТГвеч - содержание триглицеридов в плазме вечером, ЛПВПутр - содержание липопротеидов высокой плотности в плазме крови утром, ЛПНПутр - содержание липопротеидов низкой плотности в плазме крови утром, ЛПОНПутр - содержание липопротеидов очень низкой плотности в плазме крови утром, ЛПВПвеч - содержание липопротеидов высокой плотности в плазме крови вечером, ЛПНПвеч - содержание липопротеидов низкой плотности в плазме крови вечером, ЛПОНПвеч - содержание липопротеидов очень низкой плотности в плазме крови вечером, ОЦКутр - объем циркулирующей крови утром, Htyтp - гематокрит, отражающий удельный вес форменных элементов в крови утром, ОЦКвеч - объем циркулирующей крови вечером, Htвeч - гематокрит, отражающий удельный вес форменных элементов в крови вечером. При выявлении К у мужчин ниже нормальных показателей 0,93-1.07, у женщин ниже нормальных 0,87-1.02 оценивают как снижение синтеза липопротеидов высокой и очень высокой плотности. Использование способа позволяет с высокой точностью оценить синтез липопротеидов. 1 пр.

Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота // 2620558

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих. При этом ППД-туберкулин для млекопитающих разводят 10% раствором левамизола из расчета 20 мл на 1 млн. ME. Использование заявленного изобретения обеспечивает повышение чувствительности серологического способа диагностики лейкоза с применением РИД благодаря повышению уровня вирусспецифических антител. 3 табл., 3 пр.