Способ получения препаратов изолированных клеток дермы


 


Владельцы патента RU 2617237:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к цитологии, дерматологии и касается способа получения препаратов изолированных клеток дермы, что может быть использовано для получения препаратов изолированных клеток дермы с целью цитометрии и фенотипирования. Способ осуществляют следующим образом: после фиксации в формалине кусочков кожи нарезают их при температуре 18-20°С микротомным ножом, обрабатывают 50% гидроксидом калия в течение 15 часов, гомогенизируют клеточный материал струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, не менее пяти раз проводят цикл гомогенизации и центрифугирования клеточного материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, готовят мазки из полученной суспензии. Изобретение обеспечивает уменьшение затрат при выделении изолированных клеток дермы, возможность получения более качественных клеточных изолятов за счет более высокой концентрации клеток.

 

Изобретение относится к цитологии, дерматологии и может быть использовано для получения изолированных клеток дермы с целью цитометрии и фенотипирования.

Известны способы получения изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей [1, 2]. Прототипом заявленного изобретения является способ получения препаратов изолированных клеток [3], включающий в себя длительную (14-20 суток) фиксацию ткани в 10% формалине, с последующим замораживанием кусочка ткани хлорэтилом, приготовление срезов препарата на микротоме, окрашивание гематоксилин-эозином, диссоциацию в 50% водном растворе гидроксида калия в течение 2,5-3 часов, отмывание дистиллированной водой, при температуре 18-20°С пятикратно, по 5 минут, гомогенизацию материала струей воды из микропипетки, приготовление мазков из полученной суспензии по общепринятой методике. Описанный способ позволяет приготовить суспензию изолированных клеток для последующего изучения. Однако недостатками описанного способа являются необходимость использования в процессе приготовления суспензии хлорэтила, необходимость выполнения срезов замороженного материала на микротоме и получение суспензии с низкой концентрацией клеток за счет потери клеточного материала на этапе отмывания. Задача предлагаемого изобретения: получение более концентрированных препаратов клеток, содержащихся в дерме. Технический результат предлагаемого изобретения: уменьшение затрат в процессе выделения изолированных клеток дермы, возможность получения более качественных клеточных изолятов за счет более высокой их концентрации.

Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что фиксированные в формалине кусочки кожи нарезают микротомным ножом при температуре 18-20°С мелкими фрагментами, заливают 1 мл 50% гидроксида калия на 15 часов при температуре 18-20°С, промывают дистиллированной водой пятикратно при температуре 18-20°С, гомогенизируют клеточный материал струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, не менее пяти раз проводят цикл гомогенизации и центрифугирования клеточного материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, готовят мазки из полученной суспензии.

Указанный способ осуществляется следующим образом. Фиксированный в течение 14 суток в гистологическом забуференном 10% нейтральном формалине кусочек кожи без предварительной заморозки нарезают микротомным ножом (или микротомным лезвием) на мелкие фрагменты толщиной до 3 мм, помещают полученные фрагменты в центрифужную градуированную пробирку. Заливают фрагменты 1 мл 50% водного раствора гидроксида калия на 15 часов, после чего удаляют из пробирки раствор щелочи путем аспирации пипеткой Пастера и наливают дистиллированную воду при температуре 18-20°С в объеме 5 мл. Гомогенизируют материал при помощи струи воды из пипетки Пастера объемом 2 мл в течение 2-3 минут, доводят объем воды в пробирке до 10 мл и центрифугируют в течение 5 минут при 1500 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют воду из пробирки таким образом, чтобы клеточный осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, измеряют рН при помощи универсальной индикаторной бумаги, добавляют дистиллированную воду до объема 5 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Цикл гомогенизации и центрифугирования повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, но не менее 5 раз. После достижения целевого уровня рН 4,0-5,0 в надосадочной жидкости суспендируют полученный клеточный материал путем многократного пассажа содержимого пробирки пипеткой Пастера, полученную суспензию клеток наносят на предметное стекло, готовят мазки по общепринятой методике.

Способ позволяет расширить возможности получения концентрированных клеточных суспензий для выделения и последующего изучения клеток дермы. Заявленный способ является менее затратным по сравнению с описанными ранее способами, позволяет выполнять приготовление материала без использования заморозки хлорэтилом или другим методом, не требует применения микротома и окрашивания среза гематоксилин-эозином. Кроме того, применение в заявленном способе этапа центрифугирования материала позволяет достичь более высокой концентрации изолированных клеток в суспензии и предотвратить потерю клеток во время гомогенизации.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Белов Л.Н., Коган М.Е., Леонтьева Т.А. и др. Получение изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей. Цитология, 1975, Т. 12, №11, стр. 1332-1338.

2. Коган М.Е., Белов Л.Н., Леонтьева Т.А. Определение количества клеток в различных органах и тканях после щелочной диссоциации. Архив патологии, 1976, Т. 38, №1, стр. 77-80 (прототип).

3. Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., Лисишников Л.В. Способ получения препаратов изолированных клеток. Патент РФ 2104524, заявка 94018751/14, 23.05.1994.

Способ получения препаратов изолированных клеток дермы, заключающийся в обработке фиксированных в формалине кусочков кожи 50% гидроксидом калия, гомогенизации клеточного материала струей воды из пипетки Пастера, с последующим суспендированием, отличающийся тем, что фиксированные кусочки при температуре 18-20°C нарезают микротомным ножом, не менее пяти раз проводят цикл гомогенизации и центрифугирования клеточного материала при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут до достижения уровня рН надосадочной жидкости 4,0-5,0, готовят мазки из полученной суспензии.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к клеточной технологии. Описано применение полученных из жировой ткани стромальных стволовых клеток в производстве фармацевтической композиции для лечения свища у субъекта, где указанные полученные из жировой ткани стромальные стволовые клетки являются аллогенными по отношению к субъекту, которого предстоит лечить.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения биологически активного экстракта из продукции пантового оленеводства. Способ получения биологически активного экстракта из продукции пантового оленеводства включает совместную водную экстракцию измельченных до состояния фарша хвостов, половых органов самцов, маток с плодами и околоплодной жидкостью, сухожилий, кожи пантов и мяса под действием ультразвуковых колебаний в присутствии фермента пепсина, при этом процесс экстрагирования начинают с экстракции сухожилий при последующем поэтапном вводе в экстрагируемую массу через час от начала процесса - кожи пантов, через два часа - хвостов и половых органов самцов, через четыре часа - маток с плодами и околоплодной жидкостью и через шесть часов - мяса, при этом каждый вид сырья перед вводом в процесс экстрагирования смешивается с водой и с ферментом пепсином, а по истечении 12 часов от начала процесса производят фильтрацию экстракта при определенных условиях.

Изобретение относится к медицине, а именно к области биотехнологий, и может быть использовано для лечения повреждений кожи. Для этого применяют тканеинженерную конструкцию на основе аутологичных фибробластов на биоразлагаемой матрице и ее наложение на рану.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и реконструктивно-пластической хирургии. Выполняют подкожную мастэктомию и лимфаденэктомию с одномоментной реконструкцией силиконовым имплантатом.
Изобретение относится к медицине, косметологии, касается клеточных технологий и может быть использовано для омолаживающих процедур, устранения дефектов кожи, таких как рубцовые изменения, раны, ожоги.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения пациентов с онкологическими заболеваниями кожи, такими как меланома, базально-клеточный рак, плоскоклеточный рак.
Группа изобретений относится к области фармацевтики и касается способа получения трансплантата из дермы животного, предпочтительно из дермы свиньи, включающего в себя следующие стадии: a) подготовка дермы животного; b) обработка дермы животного водным щелочным раствором, содержащим от 0,01 до 1,5% масс.

Изобретение относится к медицине и касается способа коррекции патологических состояний кожи человека, связанных со старением, включающего использование аутогенных фибробластов пациента с дальнейшим введением их пациенту, где производят отбор материала и выращивание клеток с последующим выделением культуры фибробластов пациента, производят генетические исследования культуры фибробластов путем определения последовательности ДНК и активности генов, выбранных из группы, включающей TGFB1, TGFBR2, COL1A1, COL1A2, SOD1, SOD2, GPX1, GPX3, CLCA2, после чего производят сопоставительный анализ полученных результатов с нормальными последовательностями ДНК и данными нормального уровня экспрессии соответствующих генов, создают генетические конструкции, содержащие кДНК тех генов, активность которых у пациента изменена или в структуре ДНК которых у пациента имеются отклонения, и внедряют эти генетические конструкции в культуру фибробластов пациента, затем вводят пациенту эти модифицированные аутогенные фибробласты.
Изобретение относится к медицине, а именно к спортивной медицине и фармакологии, и касается повышения общей физической работоспособности спортсменов сложно-координационных видов спорта.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть применено для регенерации тканей мезодермального происхождения с использованием фибробластов взрослого организма.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактического лечения при развитии неопластических процессов кожной ткани, таких как меланома, базально-клеточный рак, плоскоклеточный рак. Для этого используют фармацевтический препарат, включающий в качестве активного действующего вещества белково-полипептидный комплекс (БПК) в виде косметических композиций, таких как дневные или ночные кремы, гели, самостоятельно или в липосомальной форме, а также в виде фотоактивных или фотозащитных композиций, ежедневно в концентрации его 0,001-0,05 мг/мл 1-2 раза в сутки с курсовой дозой 10-20 дней не менее 4 курсов в год. При этом в качестве активного действующего вещества используют БПК, полученный из гомогената эмбриональной нервной и кожной тканей копытных сельскохозяйственных животных и содержащий отрицательно заряженные слабокислые и нейтральные белки и полипетиды с молекулярной массой от 5 до 200 кДа и с содержанием фракции со средней молекулярной массой в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, общей концентрацией белка 0,2-4,2 мг/мл, с максимумом поглощения ультрафиолетового спектра раствора при длине волны 280±5 нм, наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра, наличием специфических полос в интервале значений от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле. Изобретение обеспечивает профилактику развития неопластических заболеваний кожи. 2 ил., 6 пр.
Наверх