Способ диагностики наследственной оптической нейропатии лебера

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для диагностики наследственной оптической нейропатии Лебера. В культуру фибробластов плотностью 2-5×103 клеток в объеме 100 мкл добавляют паракват в концентрации 0,25-1,0 мМ и выдерживают 48 часов или в концентрации 5 мМ и выдерживают 24 часа, затем окрашивают красителем резазурином, определяют количество живых фибробластов по изменению флуоресцентного сигнала резазурина и при наличии 50% и более количества живых фибробластов по сравнению с фибробластами здоровых людей диагностируют наследственную оптическую нейропатию Лебера. Способ обеспечивает повышение точности диагностики заболевания для осуществления корректного лечения, прогнозирования течения заболевания у пробанда, прогноза для родственников и потомства пробанда, а также упрощение и удешевление способа, ускорение процесса диагностики и возможность использования метода на большом количестве клеточных линий. 4 ил., 3 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для диагностики наследственной оптической нейропатии Лебера (НОНЛ) с целью последующего прогнозирования течения заболевания у пробанда и назначения корректной терапии.

Уровень техники

При НОНЛ развивается значительное двустороннее безболезненное снижение зрения у лиц молодого и среднего возраста вследствие гибели ганглиозных клеток сетчатки и последующей атрофии зрительного нерва. Клиническая картина НОНЛ имеет свои характерные особенности, однако подобные изменения могут встречаться при оптических нейропатиях другого генеза. В то же время определение этиологии заболевания глаз важно не только для офтальмологического, но терапевтического и неврологического прогноза, так как НОНЛ может сопровождаться неврологической и системной патологией. Кроме того, диагностика заболеваний важна для осуществления корректного лечения, последующего прогнозирования течения заболевания зрительного нерва и определения прогноза для потомства.

Патогенез НОНЛ базируется на дисфункции митохондрий, обусловленной мутациями мтДНК. В митохондриях нарушается выработка энергии в форме молекул АТФ, повышается продукция активных форм кислорода, изменяются процессы митофагии. Все это приводит к апоптозу ганглиозных клеток сетчатки и, как следствие, выраженному снижению зрения.

Комплекс I (НАДН-дегидрогеназа) - самый крупный компонент дыхательной цепи митохондрий (КДЦМ), он представлен 45 белковыми субъединицами, 38 из которых кодируются ядерным, а 7 - митохондриальным геномом (Carroll J., Fearnley I.M., Skehel J.M., et al. Bovine Complex I Is a Complex of 45 Different Subunits. J. Biol. Chem. 2006 Sep 5; 281(43):32724-7). I КДЦМ участвует в передаче электронов от НАДН к убихинону (коэнзим Q) и в поддержании мембранного потенциала митохондрий за счет прокачивания протонов из матрикса в межмембранное пространство. Ранее был доказан дефект I КДЦМ у больных с НОНЛ (Baracca A., Solaini G., Sgarbi G., et al. Severe Impairment of Complex I-Driven Adenosine Triphosphate Synthesis in Leber Hereditary Optic Neuropathy Cybrids. Arch Neurol. 2005 May 1; 62(5):730).

Для выявления и дифференциальной диагностики НОНЛ способ исследования должен быть максимально безопасным для пациента и обладать высокой степенью информативности.

Известен способ диагностики НОНЛ с помощью компьютерной статической периметрии с выявлением центральных и центро-цекальных скотом. Однако таким способом выявляются изменения поля зрения, свойственные оптическим нейропатиям различной этиологии (Kedar S., Ghate D., Corbett J.J. Visual fields in neuro-ophthalmology. // Indian J. Ophthalmol., 2011. - Vol. 59. - P. 103-109).

Известен способ диагностики НОНЛ с помощью электрофизиологических методов с определением зрительных вызванных потенциалов (ЗВП). Однако это исследование также не позволяет идентифицировать этиологию заболевания (Holder G.E. Electrophysiological assessment of optic nerve disease // Eye. - 2004. - Vol. 18. - P. 1133-1143).

Известен способ выявления НОНЛ с помощью обнаружения классических симптомов и семейного анамнеза (Newman N.J., Biousse V. Hereditary optic neuropathies. // Eye. - 2004. - Vol. 18. - P. 1144-1160). Однако наследственный характер заболевания часто не представляется возможным подтвердить, так как реконструкция расширенных родословных у пациентов зачастую затруднена, а заболевание отличается неполной пенетрантностью. Это приводит к тому, что большой процент НОНЛ представлен спорадическими случаями.

Известен способ молекулярно-генетической диагностики НОНЛ, в основе которой лежат мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией и полимеразная цепная реакция. Однако данный способ позволяет выявить лишь основные мутации, регистрируемые при НОНЛ. Расширенные исследования митохондриальной ДНК - дорогостоящие методы, выполняются на высокотехнологичном оборудовании специалистами, которые должны обладать большим опытом, навыками и знаниями (Man P.Y.W., Turnbull D. М., Chinnery P. F. Leber hereditary optic neuropathy. // J. Med. Genet., 2002. - Vol. 39. - P. 162-169).

НОНЛ может быть заподозрена на основании анамнеза заболевания и наследственного анамнеза: внезапно возникшее двустороннее снижение остроты зрения, наличие родственников пробанда с частичной атрофией зрительного нерва. Дополнительные методы исследования помогают выявить характерные для наследственного заболевания зрительного нерва признаки. Исследование цветового зрения по таблицам Рабкина (Ишихара) выявляет различной степени дисхроматопсию; поле зрения характеризуется наличием центральных или центроцекальных скотом. Электрофизиологические методы исследования показывают снижение лабильности аксиального пучка зрительного нерва и увеличение латентности P100 ЗВКП на вспышку или паттерн. Оптическая когерентная томография (ОКТ) демонстрирует истончение слоя нервных волокон сетчатки (СНВС) различной степени выраженности, преимущественно с височной стороны. Ряд дополнительных методов позволяет исключить другую, не наследственную этиологию ОН. Для подтверждения наследственной природы возможно проведение молекулярно-генетического исследования - мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией и полимеразной цепной реакции. Однако при этом выявляют лишь основные мутации, регистрируемые при НОНЛ.

Таким образом, существующие способы диагностики НОНЛ требуют совершенствования, так как не позволяют во всех случаях выявить этиологию заболевания.

Известен способ того же назначения, включающий биохимические исследования на культуре фибробластов кожи пациентов для определения нарушения функционирования отдельных компонентов дыхательной цепи митохондрий (Ye, F. and Hoppel, C.L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts // Anal. Biochem., 2013. - Vol. 437, №1. - P. 52-58).

Однако этот способ диагностики митохондриальных нарушений является технически сложно выполнимым, дорогостоящим, зависящим от уровня подготовки персонала и качества используемых реагентов.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ диагностики НОНЛ, включающий клинические и цитологические исследования и получение из кожи пациента культуры фибробластов плотностью 5000-10000 клеток на см2, окрашивание митохондриальным потенциалзависимым флюоресцентным красителем TMRE до конечной концентрации 25 нМ, измерение в культуре интенсивности флюоресценции митохондрий до и через 30 мин после добавления олигомицина до конечной концентрации 10 мкМ. При увеличении интенсивности флюоресценции митохондрий не более чем на 7% или снижении диагностируют НОН (2566271, 20.10.2015). Однако этот способ диагностики митохондриальных нарушений является технически непростым, зависящим от уровня подготовки персонала и оснащенности лаборатории.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является детекция активности I КДЦМ, основанная на особенностях токсического действия параквата, для подтверждения наследственной этиологии оптической нейропатии.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности диагностики заболевания для осуществления корректного лечения, прогнозирования течения заболевания у пробанда, прогноза для родственников и потомства пробанда, а также упрощение и удешевление способа, ускорение процесса диагностики и возможность использования метода на большом количестве клеточных линий.

Технический результат достигается за счет токсического действия параквата (N,N'-диметил-4,4'-дипиридилия дихлорида), гербицида, широко применяемого в научных исследованиях для индукции окислительного стресса в клетках.

У млекопитающих токсичное действие напрямую связано с активностью комплекса I, за счет которого дикатион параквата PQ2+ восстанавливается в митохондриях в монокатион-радикал PQ+ и приобретает способность взаимодействовать с кислородом с образованием супероксида водорода (Fukushima Т., Yamada K., Isobe A., et al. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. I. NADH oxidation and paraquat radical formation via complex I. Exp. Toxicol. Pathol. 1993 Oct; 45(5-6):345-9; Cochemé H.M., Murphy M.P. Complex I is the major site of mitochondrial superoxide production by paraquat. J. Biol. Chem. 2008 Jan 25; 283(4): 1786-98). Постоянное поддержание окислительного стресса в присутствии параквата происходит за счет того, что при восстановлении параквата НАД(Ф)Н-дегидрогеназным комплексом образуется радикал PQ+ , который немедленно вступает в реакцию с кислородом, в результате получается супероксид и PQ2+, способный вновь восстанавливаться с образованием PQ+.. При дисфункции I КДЦМ у пациентов с НОНЛ восстановление параквата до его радикальной формы происходит в гораздо меньших объемах, что проявляется в более высокой устойчивости фибробластов пациентов к цитотоксическому действию параквата по сравнению с фибробластами здорового контроля. В предлагаемом способе при исследовании культуры фибробластов пациентов, в отличие от ближайшего аналога, не проводят затратное по времени и количеству используемых реагентов изучение мембранного потенциала.

Функции митохондрий были исследованы новым способом, позволяющим обнаружить отклонения показателей от контрольных значений у пациентов с НОНЛ, а также в группе пациентов с неверифицированным генетическим дефектом.

Для флуориметрического определения клеточной гибели использовали реагент CellTiterBlue® (Promega), который содержит краситель резазурин, проникающий внутрь клеток и восстанавливающийся внутри живых метаболически активных клеток, в флуоресцентный резоруфин. В результате восстановления цвет красителя меняется. Для определения количества живых клеток CellTiterBlue® добавляли в клеточную культуру и инкубировали при 37°C в течение 5 часов (время инкубации было подобрано экспериментально и связано с низкой метаболической активностью фибробластов), после чего измеряли флуоресцентный сигнал резоруфина (флуоресценцию резофурина измеряли при λex=560 нм, λem=590 нм) (FluoroskanAscent, Thermo).

В качестве модели для изучения клеточных процессов использовали фибробласты кожи (Robinson В.Н., Petrova-Benedict R., Buncic J.R., Wallace D.C. Nonviability of Cells with Oxidative Defects in Galactose Medium: A Screening Test for Affected Patient Fibroblasts // Biochem. Med. Metab. Biol. - 1992. - Vol. 48. - P. 122-126). Нарушение функции митохондрий при НОНЛ имеют место не только в нейронах, но и в других тканях, при этом клетки кожи наиболее удобны для забора и последующего изучения, они могут быть относительно легко рекультивированы в случае необходимости.

Материалом для исследования служили фибробласты кожи пациентов с неверифицированным диагнозом (Пример 1), пациентов с НОНЛ (Примеры 2 и 3), а также здоровых людей группы контроля.

При анализе полученных данных выявлено различие в окрашивании клеток здоровых людей и клеток пациентов с НОНЛ.

Отличие в окрашивании отражает количество живых фибробластов в клеточной культуре, которое достоверно выше у пациентов с клиническим диагнозом НОНЛ, т.к. из-за дефекта I КДЦМ токсическое действие параквата не реализуется. Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для диагностики НОНЛ.

Способ осуществляют следующим образом. У больного, у которого заподозрена НОНЛ на основании совокупности клинических данных, осуществляют биопсию кожи.

Для забора биопсии кожи проводят обработку небольшого участка кожи, например, с внутренней стороны предплечья (примерно 3 см в диаметре) анестезирующей мазью («ЭМЛА»). Через 20 мин после местной анестезии обрабатывают участок спиртовой салфеткой (или спиртом). При помощи стерильного офтальмологического пинцета проводят зажим кожи. Одноразовым скальпелем срезают участок кожи (размером, примерно, с булавочную головку, диаметр ~ 0,5 см).

Полученный биоптат кожи помещают в питательную среду, содержащую DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Биолот», Россия). Далее производят ферментативную обработку коллагеназой (0,4 мкг на 1 мл среды) и инкубируют в термостате на 37°C 16 часов. После ресуспензирования пипеткой промывают средой (для отделения коллагена). Далее полученный субстрат помещают на культуральный матрас с питательной средой (DMEM с глютамином, 20% сыворотка крупного рогатого скота, пенициллин 100 мкг/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин), клетки выращивают по стандартной методике для адгезивных клеток (Hayflick L., Moorhead P. The serial cultivation of human diploid cell strains // Exp. Cell Res. - 1961. - Vol. 25. - P. 585-621).

Культуры инкубируют в термостате при 37°C в течение двух-трех недель до полного заполнения клетками площади матраса, периодически сменяя культуральную среду.

Для снятия клеток с подложки при пересаживании в течение 2-3 минут обрабатывают культуру раствором, содержащим 0,68 мМ Na-ЭДТА и 0,125% трипсина в PBS (8,1 мМ Na2HPO4; 1,45 мМ KH2PO4; 0,11 М NaCl; 3,42 мМ KCl, pH 7,4), после чего добавляют 5 мл стерильной среды DMEM. Клетки суспендируют пипетированием. Около 1-2 мл суспензии клеток переносят в чашки Петри с 3-4 мл среды DMEM. Для экспериментов клетки выращивают на стерильных покровных стеклах в течение суток. Клетки плотностью 5000 -10000 клеток на 1 см2 (всего 50000-100000 клеток на площади 10 см2) инкубируют при температуре 37°C во влажной атмосфере с 5%-ным содержанием CO2. Для приготовления растворов и сред используют дистиллированную воду, очищенную на системе Milli-Q (Millipore, США).

Клетки рассаживают на 96-луночный планшет, в зависимости от количества изучаемых линий может быть использовано несколько планшетов, на каждом из которых 20 лунок занято клетками контроля. В каждую лунку помещают 100 мкл суспензии фибробластов (2-5×103 клеток). На следующий день к клеткам добавляют паракват в концентрации 0,25; 0,5; 0,75 и 1 мМ (по 4 лунки на каждую концентрацию для всех тестируемых культур клеток) или 5 мМ (по 6 повторов для каждой культуры клеток). Для получения статистически значимого результата и минимизации технических ошибок на каждую концентрацию отводят 4 или, соответственно, 6 лунок, в том числе в 4, соответственно, в 6 лунок, паракват не добавляют. Таким образом, на каждую клеточную линию отводится 24, соответственно, 12 лунок. Через 48 часов для концентрации параквата 0,25; 0,5; 0,75 и 1 мМ и через 24 часа для концентрации параквата 5 мМ, в течение которых проявляется цитотоксическое действие параквата, определяют количество выживших клеток в культурах. Клеточную гибель можно определять различными способами, например, с помощью реагента CellTiterBlue® (Promega), который содержит краситель резазурин, превращающийся при попадании в живые клетки в резоруфин. Через 5 часов инкубации при температуре 37°C измеряют флуоресцентный сигнал резоруфина (λex=560 нм; λcm=590 нм) (FluoroskanAscent, Thermo), оценивая тем самым количество живых фибробластов. Результаты, полученные в форме таблицы MicrosoftExcel, усредняют по 4 лункам. Для каждой из исследуемых культур результаты нормируют на значения флуоресценции в лунках, не обработанных паракватом (Пример 1, 2).

Для определения устойчивости клеточных культур к действию параквата для каждой культуры рассчитывают IC50, т.е. определяют концентрацию параквата, при которой происходит гибель 50% клеток (Пример 2). Увеличение значения IC50 для тестируемой культуры, по сравнению с контрольной более чем в 2 раза, дает основание для установления диагноза НОНЛ.

Выживаемость культуры пациента сравнивают с выживаемостью фибробластов здоровых людей. В случае более высокой устойчивости исследуемой культуры по сравнению с нормой (отличие более чем на 50% при любой использованной концентрации параквата) диагностируют НОНЛ.

Цитотоксичность различных соединений зависит от плотности клеточной культуры. Для параквата эта зависимость сравнительно слабо выражена, однако в случае использования концентрации параквата 5 мМ плотность сравниваемых культур необходимо тщательно контролировать (что является дополнительной сложностью при тестировании большого количества различных культур клеток). Использование нескольких концентраций параквата более надежно, так как позволяет снизить влияние плотности клеток на результаты тестирования.

Пример 1

Пациент С, 19 лет, обратился с жалобами на резкое двустороннее безболезненное снижение зрения, которое возникло 2 месяца назад. Со слов пациента, у родственников похожих заболеваний не было, также он отрицал наличие острых и хронических заболеваний, возможность токсического воздействия алкоголя, курения или лекарственных средств.

На момент осмотра острота зрения составила OD - 0,04, OS - 0,04; на глазном дне: OD - диск зрительного нерва (ДЗН) монотонный, границы четкие, а:в=1,5:2, OS - ДЗН бледно-розовый, границы четкие, а:в=1,5:2, OU - в макулярной зоне и на периферии без особенностей. На обоих глазах выявлена выраженная дисхроматопсия, центро-цекальная скотома по данным компьютерной периметрии. По данным ОКТ имело место увеличение толщины перипапиллярного СНВС в верхне-височном квадранте и истончение комплекса ганглиозных клеток (КГК) сетчатки макулярной зоны, что характерно для ранней стадии НОНЛ. Выявлено изменение электрофизиологических показателей в виде увеличения латентности пика P100 (ЗВП на вспышку) и значительного снижения проводимости зрительного нерва, а также снижение уровня критической частоты слияния мельканий (КЧСМ). Патологических изменений на МРТ головного мозга и орбит не обнаружено.

У пациента была заподозрена НОНЛ, он был направлен на генетическое исследование.

Поиск трех наиболее частых мутаций мтДНК, характерных для НОНЛ (m.11778G>A, m.3460G>A, m.14484Т>С), не выявил их наличия. В результате расширенного анализа с полным секвенированием мтДНК была обнаружена нуклеотидная замена тимина на цитозин в позиции 3472 мтДНК в гомоплазмическом состоянии, которая ранее не была отнесена к первичным или кандидатным мутациям, приводящим к развитию НОНЛ. На генетическое исследование была отправлена сестра пациента, которая не имеет каких-либо клинических или субклинических признаков заболевания. У нее также была найдена замена мтДНК в позиции 3472.

Для подтверждения или исключения митохондриальной природы было проведено биохимическое исследование фибробластов кожи пробанда и его сестры. Было выявлено, что клетки с заменой m.3472Т>С значительно более устойчивы к действию параквата (клетки окрашивались флюоресцентным красителем), что указывает на сниженную активность комплекса I, характерную для митохондриальной патологии (Фиг. 1. Цитотоксическое действие параквата на фибробласты, полученные из биопсии кожи здорового контроля, а также пробанда и его сестры (N=3, *р<0.05). Каждая из исследуемых линий клеток нормируется на свой контроль, принятый за 100% (т.е. на интенсивность флуоресценции резоруфина в лунках с клетками, не обработанных паракватом).

Данное исследование подтверждает наследственную природу заболевания пациента С. и патологический характер замены m.3472Т>С.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики посредством биохимического исследования позволил подтвердить наследственный генез заболевания.

Согласно выявленному заболеванию пациенту назначено соответствующее лечение, включающее антиоксидантные, нейропротекторные препараты, препараты, стимулирующие метаболические процессы, рекомендовано периодическое наблюдение офтальмолога, а также, учитывая возможность возникновения неврологической симптоматики при НОНЛ, указано на необходимость консультации у невролога. Пациенту даны рекомендации по изменению образа жизни и ограничению влияния некоторых лекарственных препаратов и других провоцирующих факторов на усугубление течения наследственного заболевания.

Пример 2

Женщина Ц., 25 лет, из контрольной группы, соматически здорова. Данные офтальмологического обследования соответствуют норме. Было проведено цитологическое исследование фибробластов кожи, в результате которого была выявлена низкая устойчивость культуры клеток к параквату, добавленному в концентрации от 0,1 до 1 мМ, что характерно для нормы (Фиг. 2. Цитотоксическое действие параквата на фибробласты, полученные из биопсии кожи здорового контроля, а также пациента с НОНЛ (m.3460G>A), Фиг. 3. Цитотоксическое действие параквата на фибробласты, полученные из биопсии кожи здорового контроля, а также пациента с НОНЛ. Каждая из исследуемых линий клеток нормируется на свой контроль принятый за 100% (т.е. на интенсивность флуоресценции резоруфина в лунках с клетками, не обработанных паракватом). На основании полученных кривых рассчитали концентрации параквата, вызывающие гибель 50% клеток (IC50). Для контрольной культуры IC50=125 мкМ, для исследуемого пациента IC50=120 мкМ, для пациента с верифицированной мутацией мтДНК m.3460G>A IC50=500 мкМ.

Как видно из фиг. 2 и 3, устойчивость исследуемой культуры фибробластов не отличалась от контрольной группы и значительно отличалась от культуры пациента с НОНЛ и с установленной мутацией (m.3460G>A).

Пример 3

Пациент Т., 31 год, направлен из Клиники Нервных болезней для консультации по поводу двустороннего безболезненного снижения зрения, возникшего полгода назад. За полгода до снижения зрения появились жалобы на чувство жжения и кожного зуда в нижних конечностях. На МРТ головного мозга структурной патологии не выявлено.

На момент осмотра острота зрения составила OD - 0,015 н/к, OS - 0,01 н/к, на глазном дне: OU - ДЗН бледный за счет височной половины, границы четкие, а:в=1,5:2, в макулярной зоне и на периферии без особенностей. На обоих глазах выявлена выраженная дисхроматопсия, центроцекальная скотома по данным компьютерной периметрии. По данным ОКТ имело место увеличение толщины перипапиллярного СНВС в верхневисочном квадранте и истончение КГК сетчатки макулярной зоны, что характерно для ранней стадии НОНЛ. Выявлено изменение электрофизиологических показателей в виде увеличения латентности пика P100 (ЗВП на вспышку) и значительного снижения проводимости зрительного нерва, а также снижение уровня КЧСМ.

У пациента была заподозрена НОНЛ, он был направлен на генетическое исследование.

В ходе молекулярно-генетического анализа была обнаружена самая частая мутация мтДНК, характерная для НОНЛ (m.11778G>A). Так как патогенность мутации не вызывает сомнений, было проведено биохимическое исследование фибробластов кожи пациента более быстрым способом с использованием высокой концентрации параквата (5 мМ). Клетки пациента продемонстрировали большую устойчивость к действию параквата, нежели контрольные культуры, что указывает на сниженную активность комплекса I, характерную для митохондриальной патологии (Фиг. 4. Цитотоксическое действие 5 мМ параквата (время инкубации с паракватом 24 часа) на фибробласты, полученные из биопсии кожи здоровых контролей, а также пациентов с НОНЛ (в скобках указана позиция в мтДНК, в которой была обнаружена мутация). Каждая из исследуемых линий клеток нормируется на свой контроль, принятый за 100% (т.е. на интенсивность флуоресценции резоруфина клетками в лунках без добавления параквата).

Таким образом, предлагаемый способ диагностики с помощью параквата позволил подтвердить наследственный генез заболевания в более короткие сроки.

Предложенный способ дифференциальной диагностики идентифицирует НОНЛ, что способствует более точному прогнозу течения заболевания зрительного нерва и позволяет рекомендовать пациенту адекватные способы лечения. Кроме того, основываясь на наследственном характере заболевания, детям и родственникам пациента по материнской линии дается рекомендация пройти молекулярно-генетическое обследование с целью выявления наличия соответствующей мутации и прибегнуть к медико-генетическому консультированию с целью прогнозирования заболевания у будущего потомства. Данный способ диагностики позволяет определять наличие митохондриальной патологии у потомства пробанда до начала клинических проявлений заболевания с дальнейшей постановкой на учет к офтальмологу для периодического диспансерного наблюдения, лечения, проведения разъяснительных мероприятий с рекомендациями по изменению образа жизни и ограничению влияния провоцирующих факторов на возникновение наследственного заболевания.

Способ диагностики наследственной оптической нейропатии Лебера, включающий клинические и цитологические исследования с культурой фибробластов кожи пациента, отличающийся тем, что в культуру фибробластов плотностью 2-5×103 клеток в объеме 100 мкл добавляют паракват в концентрации 0,25-1,0 мМ и выдерживают 48 часов или в концентрации 5 мМ и выдерживают 24 часа, затем окрашивают красителем резазурином, определяют количество живых фибробластов по изменению флуоресцентного сигнала резазурина и при наличии 50% и более количества живых фибробластов по сравнению с фибробластами здоровых людей диагностируют наследственную оптическую нейропатию Лебера.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к функциональной диагностике, гериатрии и геронтологии и может быть использовано для определения биологического возраста у женщин.

Изобретение относится к медицинской технике и может быть использовано при выполнении различных медицинских процедур. Функциональная структура фиксатора корпуса хирургических и диагностических устройств в тороидальной хирургической робототехнической системе с выдвижной крышкой включает вертикальный цилиндрический или многогранный корпус инструментального стола с возможностью подъема и возвратно-поступательного разворота посредством привода с редуктором и шестеренки.

Настоящее изобретение относится к средствам для отображения данных о состоянии здоровья. Технический результат – обеспечение безопасности данных о здоровье пользователя.
Изобретение относится к медицине, а именно к функциональной диагностике, гериатрии и геронтологии, и может быть использовано для определения биологического возраста у мужчин.

Изобретение относится к медицине, а именно к количественной гистохимической оценке адаптации организма к воздействию низкой температуры окружающей среды. Для этого устанавливают холодовую анестезию у экспериментального животного путем количественной цитохимической оценки хромаффинной реакции эритроцитов крыс при общем охлаждении организма.

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатобилиарной хирургии и онкологии, и может быть использовано для прогнозирования общей выживаемости у больных опухолью Клатскина после хирургического лечения.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования уровня внутриглазного давления (ВГД) у пациентов с глазными проявлениями псевдоэксфолиативного синдрома (ПЭС).

Изобретение относится к области медицины, а именно к челюстно-лицевой хирургии. Для определения тактики лечения больных с флегмонами околоушно-жевательной области в послеоперационном периоде оценивают следующие критерии: возрастная группа: моложе 30 лет - 1 балл, от 30 до 40 лет - 2 балла, от 41 до 50 лет - 3 балла, старше 50 лет - 4 балла; длительность очищения гнойной раны по показателю: микробной контаминации 105 на 1 г ткани: на 4 день - 1 балл, на 5 день - 2 балла, на 6 день - 3 балла, более 6 дней - 4 балла; величина амплитуды биопотенциалов действия жевательной мышцы на стороне операции: более 300 мкв - 0 баллов, от 300 до 250 мкв - 1 балл, от 249 до 200 мкв - 2 балла, от 199 до 100 мкв - 3 балла, менее 100 мкв - 4 балла; уровень тканевого давления: менее 100 мм рт.ст - 0 баллов, от 10 до 15 мм рт.ст.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для ранней диагностики эндометриоза органов малого таза. При одновременном сочетании у пациентки: ультразвуковых данных о наличии свободной жидкости в позадиматочном пространстве брюшной полости, диспареунии, полиморфных кожных высыпаний на лице (папулы, пустулы, комедоны), диагностируют эндометриоз органов малого таза.

Группа изобретений относится к медицине. Предложен постоянный машиночитаемый носитель данных, на котором хранится совокупность команд, исполняемых процессором, при этом совокупность команд приводится в действие для того, чтобы: принимать совокупность данных рассматриваемого пациента, относящихся к рассматриваемому пациенту; сопоставлять совокупность данных рассматриваемого пациента с множеством совокупностей данных предшествующих пациентов, при этом каждая из совокупностей данных предшествующих пациентов соответствует предшествующему пациенту, причем совокупность данных рассматриваемого пациента и множество совокупностей данных предшествующих пациентов представлены в виде совокупности признаков, причем каждый признак представляет собой индивидуальную характеристику, соответствующую каждому пациенту, и качественные признаки представлены на шкале от 0 до 1; выбирать множество совокупностей данных предшествующих пациентов на основе уровня сходства между выбранным множеством совокупностей данных предшествующих пациентов и совокупностью данных рассматриваемого пациента; предоставлять множество выбранных совокупностей данных предшествующих пациентов пользователю; генерировать план лечения на основе соответствующих планов лечения из множества выбранных совокупностей данных предшествующих пациентов; оснащать весовыми коэффициентами каждый из соответствующих планов лечения на основе сходства каждого пациента из множества выбранных предшествующих пациентов с рассматриваемым пациентом; и представлять пользователю посредством устройства отображения графическое сопоставление между совокупностью данных рассматриваемого пациента и каждой из множества совокупностей данных предшествующих пациентов, причем сопоставление содержит указание на степень сходства между признаками рассматриваемого пациента и каждым из множества признаков предшествующих пациентов.

Изобретение относится к медицине, а именно к спортивной медицине, и может быть использовано для коррекции предстартовых неврозов. Для этого предварительно проводят психофизическое тестирование, регистрацию электроэнцефалограммы с выявлением альфа-, тета- и бета-ритмов для подтверждения невроза, а также клинический анализ крови. После этого пациентам осуществляют массаж шейно-воротниковой зоны и мануальную терапию в области шейного отдела для снятия функциональных блоков и улучшения линейной скорости кровотока по брахиоцефальным сосудам. В биологически активные зоны головы под апоневроз вводят препарат «церебрум композитум» в дозе 2,2 мл дважды в неделю на курс по пять уколов. При снижении гемоглобина дополнительно вводят в биологически активные точки меридиана печени и в область крестца препарат «гепар композитум» в дозе 2,2 мл дважды в неделю на курс по пять уколов. Способ обеспечивает повышение стрессоустойчивости и стабильности выступлений спортсменов на соревнованиях. 1 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к реаниматологии и интенсивной терапии. Для оценки гиповолемии у больных с травматическим шоком II и III степени тяжести определяют комплекс показателей, изменение которых характеризует абсолютную и относительную гиповолемии. По изменению показателей частоты сердечных сокращений, ударного объема сердца, минутного объема крови, сердечного индекса, общего периферического сопротивления сосудов, объема циркулирующей крови, объема циркулирующей плазмы, объема циркулирующих эритроцитов определяют абсолютную гиповолемию. По изменению показателей эндотелина-1 и фактора Виллебранда определяют относительную гиповолемию. Способ позволяет проводить целенаправленную инфузионно-трансфузионную терапию для адекватной коррекции гиповолемии с целью уменьшения выраженности недостаточности сердечно-сосудистой системы и снижения летальности за счет объективной оценки всех компонентов гиповолемии. 1 пр.

Изобретение относится к сенсорному устройству. Сенсорное устройство содержит ремешок, включающий в себя по меньшей мере один датчик для измерения физиологического параметра на внутренней стороне запястья тела человека или животного и блок обработки сигналов для обработки выходных данных измерения, полученного от упомянутого по меньшей мере одного датчика. Упомянутый ремешок выполнен с возможностью обеспечения регулируемого прикрепления к упомянутому блоку обработки сигналов на обоих концах упомянутого ремешка. В результате обеспечивается точное расположение датчика на внутренней стороне запястья тела человека или животного. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования числа эпизодов угрозы прерывания беременности у беременных с аномалиями расположения хориона. Сущность способа: у беременных регистрируют: расстояние от внутреннего зева матки до нижнего края хориона в сантиметрах на первом скрининге, возраст беременной в годах, возраст начала половой жизни, наличие в анамнезе миомы матки, аденомиоза, вариант локализации хориона в матке – преимущественно по передней или по задней стенке, наличие бактериального вагиноза, хламидийной и герпетической инфекции, уровень гемоглобина, эритроцитов, тромбина, эозинофилов, палочкоядерных нейтрофилов, тромбиновое время. Затем вычисляют индивидуальный коэффициент прогнозирования вероятности угрозы прерывания беременности (Кпр) по формуле. Если значение Кпр менее или равно 0,48 – у пациенки отсутствуют угрозы прерывания беременности во втором триместе; если значение Кпр лежит в диапазоне от 0,49 до 0,87, прогнозируют один эпизод угрозы прерывания беременности; в диапазоне от 0,88 до 1,42 – два эпизода; более 1,43 – три эпизода. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, лучевой диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития атеросклеротических изменений сосудов у хакасов. При выполнении компьютерной томографии измеряют площадь висцеральной жировой ткани в квадратных сантиметрах. Выполняют биохимическое исследование крови натощак с определением уровня триглицеридов (ммоль/л) и уровня глюкозы (ммоль/л). Каждому из учитываемых признаков присваивают баллы. Рассчитывают сумму баллов. При сумме баллов 1,37 и выше регистрируют высокий риск развития атеросклеротических изменений сосудов у хакасов. Способ позволяет точно, информативно, доступно и просто провести прогнозирование риска развития атеросклеротических изменений за счет комплексной оценки наиболее значимых показателей. 4 ил., 8 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для оценки вероятностей возникновения переломов проксимального отдела бедренной кости у женщин пожилого возраста. Определяют соматометрические показатели обследуемой (Х0): массу тела (X1, кг); рост; межакромиальный диаметр; гребневой диаметр таза (Х2, см); обхват средней трети плеча (Х3, см); обхват верхней трети предплечья (Х4, см); обхват грудной клетки; обхват живота на уровне пупка (Х5, см); обхват бедра (Х6, см); обхват голени (Х7, см); толщину кожно-жировой складки на задней поверхности плеча (Х8, мм); толщину кожно-жировой складки на передней поверхности плеча (Х9, мм); толщину кожно-жировой складки на предплечье (Х10, мм); толщину кожно-жировой складки на спине; толщину кожно-жировой складки на груди; толщину кожно-жировой складки на животе; толщину кожно-жировой складки на бедре; толщину кожно-жировой складки на голени; индекс относительной ширины таза (X11, %); тазово-плечевой указатель (X12, %); индекс массы тела A. Quetelet (Х13, кг/м2); абсолютную мышечную массу (X14, кг); относительную мышечную массу (X15, %); среднее значение радиусов плеча, предплечья, бедра, голени без подкожного жира и кожи (X16, см); отношение обхвата грудной клетки к обхвату живота (X17, %). Определяют принадлежность соматометрических показателей обследуемой к одному из пяти кластеров телосложения (Хк, I-V), для чего рассчитывают значения дистанций (ДК) путем определения разницы соматометрических показателей обследуемой от центров каждого из пяти кластеров телосложения согласно таблице 1 описания по формуле. Получают в результате расчетов пять значений ДК. Меньшее из полученных значений соответствует кластерной принадлежности показателей обследуемой. Оценивают вероятность возникновения переломов проксимального отдела бедренной кости как высокую при принадлежности показателей обследуемой к третьему и четвертому кластерам и как низкую при принадлежности показателей обследуемой к первому, второму и пятому кластерам. Способ позволяет точно оценить вероятности возникновения переломов проксимального отдела бедренной кости у женщин пожилого возраста за счет оценки наиболее оптимального комплекса соматометрических показателей. 4 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике. Для диагностики у детей функциональных расстройств желудка и 12-перстной кишки, ассоциированных с воздействием хрома, никеля, марганца и хлорорганических соединений: хлороформа и тетрахлорметана, производят отбор пробы крови и устанавливают в ней содержание хрома, никеля, марганца и наличие хлороформа и тетрахлорметана. Выявляют нарушения функционального состояния вегетативной регуляции, биллиарного тракта, печени, желудка и 12-перстной кишки. Определяют в сыворотке крови уровень пепсиногена-1, пепсиногена-II, дофамина, серотонина, кортизола и тиреотропного гормона ТТГ. При повышении уровня пепсиногена-II на 20%, уровня кортизола на 10-15%, уровня ТТГ на 10% и снижении уровня пепсиногена-I на 15%, дофамина на 20%, серотонина на 15% диагностируют наличие функциональных расстройств желудка и 12-перстной кишки, ассоциированных с воздействием хрома, никеля, марганца, хлороформа и тетрахлорметана, техногенного происхождения. Способ позволяет диагностировать у детей функциональные расстройства желудка и 12-перстной кишки, ассоциированные с воздействием хрома, никеля, марганца, хлороформа и тетрахлорметана, техногенного происхождения. 4 табл.

Изобретения относятся к области медицинской техники. В соответствии с предложенным способом посредством ростомера (2) измеряют высоту расположенного на сиденье (3) напротив цифровой зеркальной фотокамеры (1) пациента (4) и расстояние между кончиком его носа и горизонтальной планкой (5) и обеспечивают те же значения этих величин при всех фотоссесиях с данным пациентом (4), соблюдая неизменными и другие условия фотосъемки. В качестве основной проекции выбирают фронтальную и дополнительно проводят фотосъемки в по меньшей мере одной из двух боковых проекциях лица, оси которых составляют острый угол, преимущественно от 21° до 25°, относительно оси фронтальной проекции. При этом обеспечивают горизонтальное и вертикальное размещение цифровой зеркальной фотокамеры (1) неизменным. В результате компьютерной обработки получают по меньшей мере один дополнительный количественный параметр, основанный на подсчете темных пикселей. Устройство содержит снабженный сиденьем (3) ростомер (2), к горизонтальной планке которого прикреплена вертикальная линейка (6). Ростомер (2) и сиденье (3) расположены вместе со стационарной вертикальной опорой (7) с цифровой зеркальной фотокамерой (1) на общем основании (8). Цифровая зеркальная фотокамера (1) размещена на фигурной горизонтальной планке (9), выполненной преимущественно в виде слайдера, так, что она может быть зафиксирована в середине фигурной горизонтальной планки (9) для фотосъемки во фронтальной проекции и в двух ее ветвях для фотосъемки в боковых проекциях лица пациента (4), оси которых составляют острый угол по отношению к оси фронтальной проекции. Способ и устройство обеспечивают повышение объективности контроля изменений дефектов кожи лица до и после проведения процедур по исправлению дефектов. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил.
Изобретение относится к медицине, неврологии, психофизиологии, наркологии и офтальмологии и может быть использовано для исследования вегетативной реактивности (ВР). Вначале испытуемому натощак в положении лежа определяют методом ультразвукового исследования (УЗИ) объем желчного пузыря, затем вызывают глазожелчнопузырный рефлекс - изменение объема желчного пузыря при надавливании на латеральные поверхности глазных яблок. При этом в течение 20 сек после начала давления, не прекращая давления, методом УЗИ измеряют изменение объема желчного пузыря и по его уменьшению на 5-10 процентов оценивают ВР как нормальную, а при уменьшении объема желчного пузыря менее чем на 5 процентов или более чем на 10 процентов от исходного во время давления на глазные яблоки оценивают ВР как нарушенную. При уменьшении объема желчного пузыря более чем на 10 процентов оценивают ВР как повышенную. При уменьшении объема желчного пузыря менее чем на 5 процентов оценивают ВР как пониженную. Способ обеспечивает контроль ВР при одновременном повышении точности и дифференцированности исследования, расширяет арсенал средств для исследования ВР, не требует много времени. 2 з.п. ф-лы, 3 пр.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в оториноларингологии при планировании операции стапедопластики у пациентов с кондуктивной и смешанной формами отосклероза. Перед операцией в комплексе определяют воздушное звукопроведение в тональной пороговой аудиометрии при частоте звука 0,5 кГц, костное звукопроведение в тональной пороговой аудиометрии при частоте звука 2 кГц, среднее костное звукопроведение в тональной пороговой аудиометрии при частотах звука 0,5, 1, 2 и 4 кГц, показатели речевой пороговой аудиометрии, тест распознавания паузы при чистом тоне, тест распознавания паузы при широкополосном шуме. Учитывают пол, возраст, продолжительность заболевания, форму отосклероза: кондуктивная или смешанная, наличие слуховой стимуляции через три месяца после операции, локализация поражения. Затем вычисляют значение дискриминантного показателя по математической формуле. В зависимости от полученного значения прогнозируют хороший отдаленный результат стапедопластики. Способ позволяет улучшить качество лечения больных за счет проведения пороговой аудиометрии и учета формы отосклероза. 6 табл., 6 пр.
Наверх