Способ клонального размножения растений в автотрофных условиях на гидропонике


 


Владельцы патента RU 2617948:

Открытое акционерное общество научно-производственный центр "Продкартофель" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Изобретение представляет собой способ клонального размножения растений в автотрофных условиях на гидропонике, в котором клональное размножение растений осуществляют путем черенкования регенерантов и укоренения черенков на питательной среде, где укоренение черенков проводят в автотрофных условиях на гидропонике с использованием жидких питательных сред, содержащих только минеральные элементы, культивирование растений осуществляют при нормальных, либо повышенных концентрация СО2 в посеве, при интенсивности облучения посева не менее 60 Вт ФАР/м2, орошение и аэрация оснований черенков и корневой системы растений производят путем периодического подтопления их питательным раствором. Изобретение позволяет достигнуть стабильности воспроизводства исходного генотипа, высокой скорости размножения растений-регенерантов, а также их быстрой адаптации при высадке в грунт или гидропонику. 3 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к растениеводству, и может быть использовано для клонального размножения растений в автотрофных условиях культивирования на гидропонике.

Клональное микроразмножение широко используется для размножения новых сортов и трансгенных растений, а также для размножения существующих сортов с целью массового получения оздоровленного посадочного материала. Эффективность клонального размножения определяется стабильностью воспроизводства исходного генотипа, скоростью роста и развития растений-регенерантов, а также их способностью адаптироваться к последующим условиям культивирования.

Известен способ клонального микроразмножения растений (Пузанков О.П., Гришанович А.К. и др. Методические указания по оздоровлению семенного картофеля. Минск, Урожай, 1988, с. 29), основанный на активации уже существующих у растения меристем путем снятия апикального доминирования за счет удаления верхушечной части стебля и последующего микрочеренкования in vitro с добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие пазушных побегов. Недостатком способа являются низкие скорости размножения, нестабильное воспроизводство исходного генотипа, длительный адаптационный период при высадке растений в грунт, высокая трудоемкость.

Наиболее близким способом к заявляемому изобретению является способ клонального микроразмножения растений (Патент РФ №2080780, МПК А01Н 4/00, опубл. 10.06.1997 г.), в котором клональное микроразмножение растений осуществляется в культуре in vitro путем микрочеренкования регенерантов и укоренения черенков на питательной среде, в которой в качестве источника углерода для укоренения используют фруктозу или смесь фруктозы с сахарозой.

Недостатком способа является то, что культивирование черенков осуществляют в преимущественно гетеротрофных условиях, что обуславливает существенно более низкие скорости роста и развития растений-регенерантов в сравнение с автотрофными условиями культивирования. Это следует из того, что фотосинтетический рост растений-регенерантов в культуре in vitro ограничен низкой концентрацией СО2 внутри пробирки, так как поступление углекислого газа из окружающего воздуха через изолирующую от внешней среды пробку незначительно из-за отсутствия достаточной разницы парциальных давлений. Для обеспечения высокой скорости фотосинтетического роста необходимо поступление в пробирку 400 мг (200 мл) СО2 за световой период, т.е. диффузия через пробку должна быть, по крайней мере, на порядок более интенсивной (Цоглин Л.Н. и др. Газообмен и фотосинтез растений картофеля в условиях in vitro // Доклады Академии Наук СССР, т. 316, №.4, 1991).

Важнейшим условием реализации фотосинтетического роста также является светообеспечение растений. Для фотоавтотрофного роста растений в естественных условиях характерны высокие (150÷200 Вт ФАР/м2) значения интенсивности света. Однако культивирование растений в пробирках при таких уровнях облучения практически невозможно из-за их перегрева в условиях естественного конвективного теплосъема. Поэтому в светокультуре растений культивирование in vitro осуществляют при интенсивностях света не выше 20÷30 Вт ФАР/м2.

Таким образом в культуре in vitro имеет место преимущественно гетеротрофный рост растений-регенерантов, для обеспечения которого питательная среда должна содержать достаточное количество углеродсодержащих органических соединений, витаминов, гормонов и микроэлементов. Такие питательные среды являются также хорошим субстратом и для широкого спектра грибов и микроорганизмов, что определяет высокие требования к стерильности культивирования.

Биологически активные компоненты питательных сред способны вызывать генетические изменения в клетках, что приводит к генетической вариабельности получаемых регенерантов. В процессе размножения в культуре in vitro генетические изменения накапливаются, увеличивается количество регенерантов со значительным морфофизиологическим разнообразием и утратой ценных хозяйственных признаков, а также снижением фотосинтетического потенциала (Леонова Н.С. "Использование метода культуры ткани в селекции картофеля". Сибирский вестник с/х науки, 1986, N3, с. 18-26; Grout B.W. et. al. Transplanting of Cauliflower Plants Regenerated from Meristem Culture. Carbon Dioxide Fixation and the Development of Photosynthetic Ability // Hort. Res. 1978. V. 17. №2. P. 65; Sutter E.G. et. al. Morphological Adaptation of Leaves of Strawberry Plants groun in vitro after Removal from Culture // Tissue Cult. Forest. and Agr. Proc. 3-rd Tenn. Symp. Plant Cell and Tissue Cult. Knoxville, Tenn. (9-13 Sept. 1984) N. Y.; L., 1985, p. 358). Причиной этого является не только биологически активные компоненты питательных сред, но и гетеротрофный рост в культуре in vitro и селекция по гетеротрофному признаку в процессе размножения при многократном пассировании растений (оператор отбирает лучшие растения для черенкования, т.е. наилучшим образом адаптированные именно к гетеротрофным условиям роста). Таким образом направленность автоселекционного процесса в популяции идет в сторону, обеспечивающую максиальную реализацию условий роста и развития, которую предоставляет именно гетеротрофный способ культивирования.

В рассматриваемом прототипе разработан способ, предусматривающий снижение отрицательного воздействия компонентов питательных сред на клетки и на стабильность воспроизведения исходного генотипа в процессе клонального микроразмножения растений. Для этого предлагается модифицировать питательную среду путем использования в качестве источника углерода фруктозы в количестве 10000-20000 мг/л или смеси фруктозы и сахарозы в соотношении 0,5-1:1. По сути это является борьбой со следствием, но никак не с причиной, что собственно и подтверждают авторы, претендуя лишь на «увеличение выхода регенерантов с исходным генотипом».

При культивировании растений в культуре in vitro как на жидких, так и на твердых питательных средах аэрация корневой системы существенным образом затруднена, что препятствует нормальному развитию корневой системы растений-регенерантов. Слабо развитые фотосинтетический аппарат и корневая система растений-регенерантов, размноженных в культуре in vitro, обуславливают длительный адаптационный период и плохую приживаемость растений при высадке в грунт или гидропонику (вследствие светового шока, отмирания старой корневой системы и образования новой).

Массовое производство (от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч) растений-регенерантов в культуре in vitro к заданному сроку для высадки в грунт или гидропонику сопряжено со значительными трудозатратами. Трудозатраты определяются, главным образом, множественностью ручных операций по подготовке тысяч пробирок: мытье, сушка, розлив в каждую пробирку заданного количества питательной среды, стерилизация пробирок, пробок и сред, фиксация черенка в пробирке и т.д. В себестоимость пробирочных растений вносит заметный вклад и достаточно высокая стоимость используемых органических питательных сред.

В основу изобретения положена задача, заключающаяся в создании способа клонального размножения растений, в котором при низких трудоемкости и затратах обеспечивается стабильность воспроизводства исходного генотипа, высокая скорость размножения растений-регенерантов, а также способность их к быстрой адаптации при высадке в грунт или гидропонику.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе клонального микроразмножения растений, осуществляемом путем микрочеренкования регенерантов и укоренения черенков на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода фруктозу в количестве 10000-20000 мг/л или смесь фруктозы и сахарозы в соотношении 0,5-1:1, согласно изобретению укоренение черенков производят в гидропонной установке на жидких питательных средах, содержащих только минеральные элементы, путем периодического орошения оснований черенков, а в дальнейшем и корневой системы растений при нормальных либо повышенных концентрация СО2 в атмосфере и интенсивности облучения посева не менее 60 Вт ФАР/м2.

Введение в известный способ совокупности существенных отличительных признаков позволяют реализовать фотоавтотрофные условия для культивирования растений-регенерантов и черенков.

Скорость фотосинтетического роста растений значительно выше гетеротрофного. Адаптированные к условиям роста in vivo (при нормальных или повышенных концентрациях CO2) растения-регенеранты способны увеличивать свою биомассу на 200 мг в сутки, а при росте in vitro - не более чем на 50 мг (Цоглин Л.Н. и др. Газообмен и фотосинтез растений картофеля в условиях in vitro II Доклады Академии Наук СССР, т. 316, №.4, 1991). В отличие от гетеротрофно выращенных растений, растения-регенеранты, выращенные в фотоавтотрофных условиях, имеют больший вес и большую площадь листовой поверхности, а их фотосинтетический аппарат хорошо развит, что обуславливает отсутствие адаптационного периода и практически 100% приживаемость при высадке в грунт или гидропонику. При клональном микроразмножении автотрофное культивирование растений-регенерантов определяет направленность автоселекционного процесса в популяции в сторону максимальной реализации условий фотосинтетического роста, т.е. в сторону улучшения хозяйственных качеств растений (Цоглин Л.Н., Габель Б.В. Селекционные процессы при гетератрофном и фототрофном микроклональном размножении растений // Доклады Академии Наук РФ, т. 334, №4, с. 533-534, 1994 г.; Tsoglin, L., Gabel, В., Satilo, V. Autoselection during plant micropropagation: potato phototrophic micropropagation in vitro. Conference on "PROGRESS IN PLANT SCIENCES from Plant Breeding to Growth Regulation" (17-19 June 1996), Mosonmagyarovar - Hungary, 1996, p. 11-13).

При автотрофном росте и развитии отпадает необходимость использования органических соединений в питательном растворе. Достаточно лишь обеспечить нелимитированное минеральное питание растений. Отсутствие биологически активных компонентов в питательной среде исключает вероятность генетических изменений в клетках и, соответственно, генетическую вариабельность регенерантов. Использование жидких питательных растворов на минеральной основе позволяет радикально снизить требования к стерильности условий культивирования. Это, в свою очередь, позволяет отказаться от необходимости размещения каждого черенка в изолированном от внешней среды объеме (пробирке), существенно упростить технологические процессы и снизить трудозатраты. Кроме этого использование жидких питательных растворов позволяет с помощью простых технических решений обеспечить эффективную аэрацию корневой системы растений и реализовать размножение растений на промышленной основе в гидропонных установках (Патент РФ №2049384, МПК A01G 31/02, опубл. 10.12.1995 г.,), существенно снизив при этом себестоимость растений в сравнение с традиционной технологией культивирования in vitro.

Предлагаемый способ клонального размножения растений е автотрофных условиях на гидропонике реализуется следующим образом. Черенкование исходных растений проводят в ламинар-боксе. Удаляют верхушечную меристему стебля и затем черенкуют побег в соответствии с количеством междоузлий таким образом, чтобы на каждом черенке остался один лист, а длина стебля ниже пазушной почки составляла 0.5-1.0 см. Черенки высаживают вдоль кассеты (Авторское свидетельство СССР №1287795, МПК A01G 31/02, опубл. 08.10.1986 г.) между ее вертикальными стенками и упругим вкладышем в шахматном порядке с шагом вдоль каждой 7

стороны, например, для картофеля и стевии 4 см, а для топинамбура - 5 см. При этом основание черенка заглубляют в кассету так, чтобы пазушная почка располагалась на уровне сопряжения упругого вкладыша со стенкой кассеты. Затем кассету с черенками размещают в вегетационной ванне гидропонной установки (Патент РФ на промышленный образец №42795, опуб. 16.09.1996 г.), которая периодически заполняется питательным раствором до уровня сопряжения упругого вкладыша со стенкой кассеты. В паузах между подтоплениями происходит аэрация корневой системы растений. Гидропонную установку размещают в чистом помещение, удовлетворяющем фитосанитарным требованиям. Культивирование растений в установке осуществляют до образования 4-0 междоузлей, например, для картофеля, стевии и тапинабура - 14-18 суток (в культуре in vitro - 27-34 дня). Затем растения можно опять отчеренковать и, высадив черенки в кассету, продолжить размножение в установке. Размноженные таким образом растения высаживают в грунт. В процессе размножения растений поддерживают следующие параметры культивирования: интенсивность облучения посева не менее 60 Вт ФАР/м2; концентрация СО2 в посеве - 0,04 до 0,4%; фотопериод - 16÷48 час./сут.; время наполнения ванны раствором - 5 мин, время аэрации корневой системы - 20 мин.; температура воздуха в режиме «День» - 21-23°С; температура воздуха в режиме «Ночь» -18-20°С; температура питательного раствора в баке 16-20°С; относительная влажность воздуха в помещение - 75-85% (круглосуточно).

Композицию питательного раствора для каждого вида растений подбирают в соответствие с характерным для них выносом минеральных макро- и микроэлементов. Например, для картофеля это питательный раствор на основе среды Пилгремма с половинной концентрацией состава минеральных элементов, а для стевии и топинамбура питательный раствор на основе среды Кнопа.

8

Клональное размножение в автотрофных условиях культивирования в сравнение с размножением в гетеротрофных условиях обладает следующими преимуществами:

- более высокой скоростью роста и развития растений и, соответственно, большей скоростью размножения;

- направленностью автоселекционных процессов в сторону отбора растений с лучшими фотосинтетическими свойствами;

- надежностью воспроизводства исходного генотипа растений;

- практически 100% приживаемостью растений при высадке в грунт или гидропонику и отсутствием адаптационного периода;

- использованием простых жидких питательных сред без органических соединений;

- существенно более низкими требованием к стерильности процессов микрочеренкования и культивирования;

- низкими затратами на питательные среды

- низкой трудоемкостью.

1. Способ клонального размножения растений в автотрофных условиях на гидропонике, в котором клональное размножение растений осуществляют путем черенкования регенерантов и укоренения черенков на питательной среде, отличающийся тем, что укоренение черенков проводят в автотрофных условиях на гидропонике с использованием жидких питательных сред, содержащих только минеральные элементы.

2. Способ клонального размножения растений в автотрофных условиях на гидропонике по п. 1, отличающийся тем, что культивирование растений осуществляют при нормальных либо повышенных концентрациях СО2 в посеве.

3. Способ клонального размножения растений в автотрофных условиях на гидропонике по п. 1, отличающийся тем, что культивирование растений осуществляют при интенсивности облучения посева не менее 60 Вт ФАР/м2.

4. Способ клонального размножения растений в автотрофных условиях на гидропонике по п. 1, отличающийся тем, что орошение и аэрация оснований черенков и корневой системы растений производят путем периодического подтопления их питательным раствором.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области растениеводства. Изобретение представляет собой средство для защиты луковиц ирисов, гиацинтов и нарциссов от грибковых заболеваний, включающее фосфит калия и воду, дополнительно содержащее Гигасепт ФФ (новый), липосентол гидро и пажитник мелкодисперсный при следующем содержании компонентов в мас.
Изобретение относится к сельскому хозяйству. Изобретение представляет собой способ размножения растений ирги зелеными черенками в условиях искусственного тумана с применением подогрева субстрата, включающий нарезку черенков, предварительную обработку и укоренение, где предварительно, за 2 дня до черенкования, проводят обильный полив маточных растений, нарезают черенки с боковых побегов длиной 10-15 см, с последующей обработкой их водным раствором регулятора роста «Корнерост П» 2 г на литр воды, с экспозицией обработки 16 ч - в полной темноте, а укоренение проводят при относительной влажности воздуха 85%, температуре воздуха 21-24°C и температуре субстрата выше температуры воздуха на 5°C в кассетах с ячейками, наполненными субстратом, который состоит из нейтрального торфа и песка в соотношении 2:1, причем каждый обработанный черенок помещают в отдельную ячейку на глубину 3,5-4,5 см, после высадки проводят двукратную обработку черенков Фитоспорином-М, ПС.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии для получения солеустойчивых растений. .

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, включающий выделение почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2.0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового и помещение их на агаризованную питательную среду Гамборга В5, где вначале отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывают в проточной водопроводной воде (10 мин) и после поверхностной стерилизации при встряхивании отделенные пазушные почки культивируют на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями являются растения-регенеранты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ адаптации растений-регенерантов земляники, включающий этап адаптации, где растения-регенеранты земляники крупноплодной в период адаптации увлажняют трижды за период через равные промежутки времени свежеприготовленной водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая, приготовленной путем перемешивания кремнийсодержащего механокомпозита и воды комнатной температуры в концентрации 3 г/л и последующего настаивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а в промежутках увлажняют дистиллированной водой.

Изобретение относится к области биотехнологии и репродуктивной биологии растений. Изобретение представляет собой способ регенерации растений Бобовника анагировидного in vitro, включающий предварительную обработку сухих семян, поверхностную стерилизацию и культивирование на питательной среде для проращивания, отличающийся тем, что в качестве предварительной обработки семена Бобовника анагировидного заливают горячей водой при температуре от 90-100°С и оставляют на 20-30 минут до остывания воды, поверхностную стерилизацию осуществляют, помещая семена в 1%-ный водный раствор синтетического моющего средства на 15 минут при постоянном помешивании, а затем промывая проточной водой в течение 15-20 минут, культивирование осуществляют в течение 3-4 недель, после чего развившиеся проростки высаживают в стаканчики с почвенным субстратом и помещают в микропарник на 4-6 недель для адаптации к нестерильным условиям, где питательная среда содержит минеральные соли и витамины по MS, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, дополнительно содержит 2.2 μМ БАП, в качестве питательной среды выбрана среда WPM с добавлением 2.2 μМ БАП.
Способ получения растений-регенерантов из репродуктивных органов Brassica oleracea L. in vitro относится к области биотехнологии предназначен для культивирования in vitro пыльников и завязей Brassica oleracea L.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности. Способ предусматривает бактериальную трансформацию экспланта корня ювенильного растения Silene linicola агробактериальным штаммом R-1601 A.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению трансгенных растений лесных древесных пород в качестве биологических моделей при прогнозировании круговоротов азота и углерода в лесных экосистемах.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Меристемные растения опрыскивают 0,1% раствором ПАБК, куда вводят 0,1% биопрепарата Фитолавина при температуре 20-25°С, а при повторном опрыскивании в фазе 3-4 листьев в раствор дополнительно добавляют 0,2-0,3% гумата калия.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая), включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах, где через 7-10 дней после культивирования в стандартных условиях побеги помещают в условия с температурой 4-8°С и уровнем освещенности 500-1000 люкс на срок до 8 (лимонник китайский, береза повислая) или до 12 месяцев (рододендрон, сирень).
Изобретение относится к области декоративного садоводства. Изобретение представляет собой способ размножения растений фритиллярий методом in vitro, включающий стерилизацию эксплантов, разделение их на части, посадку на питательную среду Данстена и Шорта, отделение микролуковиц от эксплантов, их укоренение и адаптацию, отличающийся тем, что после разделения эксплантов их помещают на питательную среду Данстена и Шорта, содержащую 6 г/л агара с добавлением - 5 мкМ 6-бензиламинопурина и 2 мкМ α-нафтилуксусной кислоты, после культивирования на данной среде микролуковицы размножают на безгормональной среде Данстена и Шорта в течение 4 недель при освещении 3 клк 16 ч свет/ 8 ч темнота при температуре 24°C, укореняют и адаптируют в контейнерах со сфагновым мхом, в темноте, при температуре 7°C, в течение 2 месяцев.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования лимона in vitro, заключающийся в том, что стерильные пазушные почки предварительно культивируют до появления микропобегов на питательной среде МС с добавлением БАП 0,1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, агар 0,7%, затем вычленяют из них меристемы размером 0,4-0,6 мм с 2-3 примордиями и прививают их на подвой, выращенный in vitro на среде WPM, дополненной БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 0,7%, микропривитые растения культивируют на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) в условиях in vitro путем введения в культуру клеток семян с целью каллусообразования и последующей регенерации растений, заключающийся в том, что стерилизованные семена помещают на питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 0,7% агар-агара, 1 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-1 мг/л индолил-3-уксусной кислоты, доведенную до 1 л стерильной дистиллированной водой, культивируют в течение одного пассажа до появления каллуса, не более 26 суток, затем каллусы пересаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга с половинной концентрацией всех компонентов и 0,7% агар-агара, добавляют 0,2-1 мг/л 6-бензиламинопурина и культивируют 2-4 пассажа до появления растений-регенерантов. Изобретение позволяет достигнуть высокого процента регенерации растений хризантемы килеватой. 2 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности культивирования in vitro березы повислой, лимонника китайского, рододендрона и сирени, включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах в течение трех недель в сочетании с микрочеренкованием побегов, допуская на экспланте не более двух пазушных почек. Изобретение позволяет повысить частоту мультипликации, частоты укоренения в условиях in vitro и ex vitro и эффективность адаптации. 3 табл.
Наверх