Суспензионный штамм культивируемых клеток растения якорцы стелющиеся (tribulus terrestris l.) под обозначением tter8 n81 в условиях in vitro - продуцент стероидных гликозидов

Авторы патента:

Носов Александр Михайлович (RU)

Ханды Мария Терентьевна (RU)

Суханова Елена Сергеевна (RU)

C12N5/14 - клетки растений

A01H5/00 - Цветковые, например покрытосеменные растения

Владельцы патента RU 2617956:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии наук (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение суспензионного штамма культивируемых клеток растения якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) в условиях in vitro, депонированного в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук под обозначением Tter8 №81 - продуцент стероидных гликозидов. Изобретение позволяет получить суспензионную культуру клеток якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) со стабильными ростовыми параметрами и синтезирующую протодиосцин независимо от сезона. 1 ил., 1 табл.

Область применения

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения якорцев стелющихся, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - стероидных гликозидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности.

Уровень техники

Биологическая активность якорцев стелющихся обусловлена в основном за счет содержания стероидных гликозидов. На основе гликозидов якорцев стелющихся созданы многие медицинские препараты "Tribestane" и "Vitanone", которые используют для лечения импотенции, а также "Tribusaponins" и "Xin-CAK Shutong" - для лечения сердечнососудистых заболеваний. Показано, что экстракты растения якорцы стелющиеся являются безопасным и эффективным средством при лечении женской сексуальной дисфункции (Gama C.R., Lasmar R., Gama G.F., Abreu C.S., Nunes C.P., Geller M., Oliveira L., Santos A. Clinical Assessment of Tribulns terrestris Extract in the Treatment of Female Sexual Dysfunction / Clinical Medicine Insights: Women's Health. - 2014. - № 7. - P. 45-50). Также экстракт используется в качестве афродизйака для мужчин (Singh S. Nair V., Gupta Y.K. Evaluation of the aphrodisiac activity of Tribulus terrestris Linn, in sexually sluggish male albino rats / S. Singh, // Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. - 2013. - V. 3. - P. 43-47). Водный экстракт якорцев Tribulus terrestris L. при наружном применении обладает ранозаживляющими свойствами (Wesley J. J., Christina M., Chidambaranathan N., Ravikumar K. Wound healing activity of the leaves of Tribulus terrestris (Linn) aqueous extract in rats // Journal of Pharmacy Research. - 2009. - V.2. - № 5. - P. 841-843). Во многих работах сказано о противоопухолевой активности компонентов якорцев стелющихся - в частности, водный экстракт растения блокирует пролиферацию и индуцирует апоптоз раковых клеток печени человека через ингибирование передачи сигналов NF-kB.

Растение якорцы стелющиеся распространены в умеренном климате в сухих степях и полупустынях Средней Азии, в Южной Европе и северной Австралии.

Растение якорцы стелющиеся содержит большой спектр стероидных гликозидов - протодиосцин, прототрибестин, диосцин, трибестин, трибулозин, неопротодиосцин, и каждый год выдяляются все новые стероидные гликозиды из якорцев. Наибольшее содержание стероидных гликозидов обнаружено в семенах якорцев. Широкий спектр синтезируемых гликозидов делает это растение перспективным для биотехнологического производства.

Однако авторы не обнаружили в литературе данных о получении суспензионной культуры клеток in vitro якорцев стелющихся.

Задача изобретения

Задача изобретения - получение суспензионного штамма якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) продуцента стероидных гликозидов со стабильными ростовыми параметрами, синтезом стероидных гликозидов и отсутствием сезонной зависимости их получения.

Решение задачи

Эта задача была решена получением суспензионного штамма культивируемых клеток растения якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) в условиях in vitro, депонированного в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук под обозначением Tter8 №81 - продуцент стероидных гликозидов.

Новизна изобретения

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен штамм суспензионной культуры клеток растения якорцев стелющихся - продуцент стероидных гликозидов.

Сущность изобретения

По мнению авторов, предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу взят штамм каллусной культуры клеток растения якорцев стелющихся, которые помещают в жидкую питательную среду в качестве экспланта. В результате был получен суспензионный штамм - продуцент стероидных гликозидов.

Реализация изобретения

Культуру клеток якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) получили путем перевода каллусной культуры в жидкую питательную среду. Для получения каллусной культуры в качестве эксплантов используют зрелые семена якорцев. Семена промывают детергентом и стерилизуют 0,1% водным раствором сулемы (HgCl₂) в течение 5 мин. После стерилизации материал ополаскивают, а затем 3-кратно отмывают в течение 20 мин в дистиллированной стерильной воде. Стерильные семена помещают на твердую питательную среду.

Для экспериментов используют твердую питательную среду следующего состава:

NH₄NO₃	1650,000±2,0000 мг
KNO₃	1900,000±2,0000 мг
MgSO₄×7H₂O	370,000±1,0000 мг
КН₂РO₄	170,000±0,1000 мг
СаС1₂×2Н₂O	440,000±0,5000 мг
Н₃ВО₃	6,200±0,0100 мг
MnSO₄×4H₂O	22,300±0,0200 мг
ZnSO₄×7H₂O	8,600±0,0100 мг
KI	0,830±0,0010 мг
Na₂MoO₄×2H₂O	0,250±0,0010 мг
CuSO₄×5H₂O	0,025±0,0001 мг
СоС1₂×6Н₂O	0,025±0,0001 мг
FeS0₄×7H₂O	2,785±0,001 мг
Na-ЭДТА	3,725±0,001 мг
Гидролизат казеина	500,000±0,1000 мг
Мезо-инозит	100,000±0,0500 мг
Тиамин	0,100±0,0010 мг
Пиридоксин	0,100±0,0010 мг
Никотиновая кислота	0,500±0,0010 мг
6-бензиламинопурин	1,000±0,0010 мг
2,4-дихлорфеноскиуксусная	2,000±0,0010 мг
кислота
Сахароза	30000,000±100,0000 мг
Вода	1000 мл
Агар	5000 мг

Полученную в результате каллусную культуру помещают в жидкую питательную среду аналогичного состава, но без добавления агара.

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, на качалке (100±10 об/мин), в колбах объемом 250 мл (30-40 мл суспензии в колбе). Цикл субкультивирования составляет 2 недели. При пересеве на 1 объем инокулюма вносят 6 частей свежей среды.

Полученные суспензионные культуры клеток выращивают в течение более тридцати циклов. В процессе культивирования определяют ростовые и биосинтетические характеристики.

Штамм якорцев стелющихся Tter8 №81 обладает следующими признаками: Культуральные признаки: биомасса клеток гомогенная, светло-желтой окраски, культуральная жидкость прозрачная.

Описание визуальных и цитологических наблюдений: культура представлена меристемоподобными клетками, собранными в компактные агрегаты, одиночными паренхимоподобными и удлиненными клетками.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по числу клеток, по сырому и сухому весу биомассы. Число клеток подсчитывают в камере Фукса-Розенталя после мацерации суспензии в 20% растворе хромовой кислоты при 60°±1С в течение 15-20 минут, в зависимости от возраста суспензии. Для определения веса сырой биомассы клетки отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах на вакуумном насосе, промывают водой и взвешивают. Сухую биомассу клеток получают после лиофильной сушки.

Жизнеспособность оценивают по проценту неокрашенных клеток в 0,1% растворе феносафранина.

В результате постоянного мониторинга состояния культур установлено, что жизнеспособность суспензионных культур стабильно держится на 90-100%. Ростовые характеристики культуры клеток якорцев стелющихся представлены на фиг.1.

При анализе представленных кривых роста следует отметить отсутствие лаг-фазы, при начальной плотности культуры клеток 1,5 г/л по сухому весу. Замедление роста на 14 сутки культивирования позволяет использовать 2-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в табл.1.

Для высокоэффективного жидкостного хроматографического (ВЭЖХ) анализа 100 мг лиофильно высушенной биомассы культур клеток трижды экстрагируют 70% этиловым спиртом (соотношение биомасса/растворитель 1/40 масса/объем) на ультразвуке (3 раза по 30 минут при комнатной температуре). Объединенный спиртовой экстракт упаривают досуха под вакуумом (при 55°С) и растворяют в воде. Затем последовательно чистят через обратнофазные силикогелевые трубки Supelclean™ ENVI™-18 SPE (Германия). Полученный спиртовой экстракт упаривают досуха и растворяют в этаноле. Осадок растворяют в смеси ацетонитрил:вода (24:76, по объему) и фильтруют через нейлоновой фильтр с порами 0,2 мкм (Acrodisc, Германия).

ВЭЖХ проводят на приборе Agilent 1200 Series. Пробу в объеме 20 мкл наносят на колонку Pecosphere 3CR С18 (83×4,6 мм, 3 мкм). Скорость подвижной фазы: 0-1 минута 0,6 мл/мин, 1-25 мин - 0,4 мл/мин. Детекция по поглощению при 203 нм. В качестве компонентов подвижной фазы используют ацетонитрил и воду. Элюирование осуществляют в изократическом режиме при соотношении ацетонитрил: вода (24:76, по объему). Количественное содержание фуростанолового гликозида определяют по стандарту R-протодиосцина чистотой 98%.

Перечень иллюстративных материалов

Фигура 1. Ростовые характеристики культуры клеток якорцев стелющихся.

Таблица 1. Ростовые параметры культуры клеток якорцев стелющихся.

Результаты изобретения

Как видно из таблицы 1, штамм обладает высокой жизнеспособностью - около 95% при стабильных ростовых характеристиках. В штамме Tter8 №81 культуры клеток якорцев стелющихся был обнаружен фуростаноловый гликозид - протодиосцин.

В результате изобретения был показан способ получения суспензионной культуры клеток из семян через каллусные культуры клеток. Таким образом была получена суспензионная культура клеток якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) со стабильными ростовыми параметрами и синтезирующая протодиосцин. Удобство такого способа получения этого соединений состоит в отсутствии сезонной зависимости их производства.

Суспензионный штамм культивируемых клеток растения якорцев стелющихся Tribulus terrestris L. в условиях in vitro, депонированный в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук под обозначением Tter8 №81 - продуцент стероидных гликозидов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению гена, кодирующего белок, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO.2, для получения трансгенного риса с длинными, большими и многочисленными зернами и увеличенной урожайностью, увеличенным количеством зерен в метелке и скрученными листьями.

Улучшенный способ мутагенеза с использованием полиэтиленгликоль-опосредованного введения мутагенных нуклеиновых оснований в растительные протопласты // 2515110

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам направленного изменения дуплексной акцепторной ДНК-последовательности и улучшения эффективности направленного мутагенеза в растительных протопластах.

Гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение // 2497830

Группа изобретений относится к области белковой инженерии, молекулярной биологии растений и борьбы с вредителями и касается гибридного инсектицидного белка и его применений.

Способы повышения толерантности к абиотическому стрессу и/или биомассы у растений и получаемые таким образом растения // 2350653

Способ получения непрерывной клеточной линии и ее применение // 2329060

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. .

Способ определения стволовых клеток молочной железы животных in vitro // 2295565

Изобретение относится к клеточной инженерии. .

Растение, устойчивое к насекомым // 2617955

Изобретение относится к области биохимии, в частности к семени растения, предназначенному для получения культивируемого растения Capsicum annuum, устойчивого к Bemisia и содержащего геном, включающий локусы количественного признака QTL, который способствует устойчивости к Bemisia, а также к устойчивому к Bemisia плоду культивируемого растения Capsicum annuum, содержащему геном, включающий локусы количественного признака QTL, который способствует устойчивости к Bemisia.

Способ адаптации растений-регенерантов земляники // 2614261

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ адаптации растений-регенерантов земляники, включающий этап адаптации, где растения-регенеранты земляники крупноплодной в период адаптации увлажняют трижды за период через равные промежутки времени свежеприготовленной водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая, приготовленной путем перемешивания кремнийсодержащего механокомпозита и воды комнатной температуры в концентрации 3 г/л и последующего настаивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а в промежутках увлажняют дистиллированной водой.

Событие das-40278-9 aad-1, родственные линии трансгенной кукурузы и их событие-специфическая идентификация // 2614120

Изобретение относится к области биохимии, в частности к растению трансгенной кукурузы, которое является устойчивым к гербицидам 2,4-D и хизалофопу, его семени и части.

Инсектицидные белки // 2613778

Изобретение относится к области биохимии, в частности к сконструированному инсектицидному белку Cry1Ba, активному в отношении кукурузного мотылька, нуклеиновой кислоте, его кодирующей, конструкции, содержащей вышеуказанную нуклеиновую кислоту, а также к инсектицидной композиции, содержащей вышеуказанный белок.

Штаммы agrobacterium, модифицированные для увеличения частоты трансформации растений // 2611188

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу трансформации растения, включающему контактирование клетки растения с клеткой Agrobacterium, которая имеет недостаточность функции RecA, а также к растению, экспрессирующему экзогенный ген, полученному вышеуказанным способом.

Способы борьбы с сорняками с использованием растений aad-1 и предпосевного и/или довсходового внесения гербицидов // 2610664

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с сорняками, включающему посев семян на определенной площади и внесение арилоксиалканоатного гербицида на указанной площади за 30 дней до посева семян на указанной площади, причем указанные семена содержат белок арилоксиалканоатдиоксигеназу AAD-1, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 29.

Пакетированное событие 8264.44.06.1 с устойчивостью к гербицидам, связанные трансгенные линии сои и их детектирование // 2608650

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенной растительной клетке сои, семени и растению сои, которые предназначены для получения растения, имеющего устойчивость к гербициду, выбранному из группы, состоящей из 2,4-D, глифосата, глюфосината и их комбинаций.

Комбинированное применение vip3ab и cry1ab для регулирования устойчивых насекомых // 2608500

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к насекомым Helicoverpa zea, включающему ДНК, кодирующую Vip3Ab1, и ДНК, кодирующую Cry1Ab, его семени и клетке, а также к способу задержки или предотвращения развития устойчивости у насекомых Helicoverpa zea к белкам Cry1Ab и Vip3Ab1 с его использованием.

Комбинированное применение белков vip3ab и cry1fa для вырабатывания резистентности к насекомым // 2607666

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к совке травяной (FAW; Spodoptera frugiperda), содержащее ДНК, кодирующую Vip3Ab, ДНК, кодирующую Cry1Fa, и ДНК, кодирующую третий белок, выбранный из группы, состоящей из CrylC, CrylD и CrylE, его семени, а также к способу предотвращения вырабатывания у совки травяной резистентности к белкам Vip3Ab и Cry1Fa с его использованием.

Растения, экспрессирующие ферменты, деградирующие клеточную стенку, и векторы экспрессии // 2606766

Изобретение относится к области биохимии, в частности к векторам для экспрессии белков в растениях. Представлены варианты трансгенного растения, предназначенного для экспрессии фермента, деградирующего клеточную стенку.

Ген и вариации, связанные с фенотипом bm1, молекулярные маркеры и их применение // 2617958

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, имеющему сниженное количество лигнина по сравнению с диким растением того же вида, где растение включает полинуклеотид, кодирующий мутантный белок циннамилалкогольдегидрогеназы 2 (CAD2), а также к способу его идентификации. Также раскрыт способ получения генетически сконструированного растения с фенотипом коричневой жилки, включающий введение в растение нуклеотидной последовательности, кодирующей мутантный белок CAD2, способ откорма животного, питающегося силосом, включающий откорм животного силосом на основе кукурузы, имеющей сниженное количество лигнина, а также способ введения в растение гена мутантного белка CAD2 кукурузы. Изобретение также относится к конечному рациону для мясных пород домашних быков, включающему силос на основе кукурузы, имеющей сниженное количество лигнина. Изобретение позволяет эффективно получать трансгенное растение, имеющее сниженное количество лигнина по сравнению с диким растением того же вида. 7 н. и 15 з.п. ф-лы, 10 ил., 6 табл., 4 пр.

Способ получения растений хризантемы килеватой (chrysanthemum carinatum schousb.) в условиях in vitro // 2619052

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) в условиях in vitro путем введения в культуру клеток семян с целью каллусообразования и последующей регенерации растений, заключающийся в том, что стерилизованные семена помещают на питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 0,7% агар-агара, 1 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-1 мг/л индолил-3-уксусной кислоты, доведенную до 1 л стерильной дистиллированной водой, культивируют в течение одного пассажа до появления каллуса, не более 26 суток, затем каллусы пересаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга с половинной концентрацией всех компонентов и 0,7% агар-агара, добавляют 0,2-1 мг/л 6-бензиламинопурина и культивируют 2-4 пассажа до появления растений-регенерантов. Изобретение позволяет достигнуть высокого процента регенерации растений хризантемы килеватой. 2 табл., 6 пр.

Трансгенное растение березы с ранним цветением // 2619173

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению березы со способностью раннего цветения в срок до шести лет включительно с момента высадки из условий in vitro в нестерильные или посадки различных частей растения в условия защищенного или открытого грунта по сравнению с аналогом дикого типа, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую глутаминсинтетазу. Изобретение позволяет эффективно получать трансгенное растение березы со способностью раннего цветения. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 пр.

Способ повышения эффективности культивирования in vitro березы повислой, лимонника китайского, рододендрона и сирени // 2619177

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности культивирования in vitro березы повислой, лимонника китайского, рододендрона и сирени, включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах в течение трех недель в сочетании с микрочеренкованием побегов, допуская на экспланте не более двух пазушных почек. Изобретение позволяет повысить частоту мультипликации, частоты укоренения в условиях in vitro и ex vitro и эффективность адаптации. 3 табл.

Конструкт и способ для экспрессии трансгенов с использованием двунаправленного конститутивного промотора brassica // 2619178

Изобретение относится к области биохимии, в частности к конструкту нуклеиновой кислоты для экспрессии множественных генов в клетках и тканях растений, а также к способу получения трансгенного растения и способу получения трансгенной клетки с его использованием. Также раскрыты клетка растения, трансгенное растение, трансгенное семя для экспрессии конструкта нуклеиновой кислоты, содержащие вышеуказанный конструкт нуклеиновой кислоты. Изобретение также относится к бинарному вектору для Agrobacterium-опосредуемой трансформации растения, содержащему вышеуказанный конструкт нуклеиновой кислоты, а также к применению двунаправленного промотора для производства трансгенных семян. Изобретение позволяет эффективно осуществлять экспрессию множественных генов в клетках и тканях растений. 9 н. и 19 з.п. ф-лы, 14 ил., 3 табл., 5 пр.