Капиллярный титрационный нанокалориметр для исследования митохондрий



Капиллярный титрационный нанокалориметр для исследования митохондрий
Капиллярный титрационный нанокалориметр для исследования митохондрий

 


Владельцы патента RU 2618670:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологического приборостроения с опытным производством Российской Академии Наук (ИБП РАН) (RU)

Изобретение относится к измерениям тепловой мощности в процессах трансформации и диссипации энергии в суспензиях живых митохондрий в исследованиях в области митохондриальной термодинамики, направленных на создание новых фармсредств и перспективных биотехнологий. Предложенный нанокалориметр для исследования митохондрий содержит средство, обеспечивающее соосность шприцов и калориметрических камер, выполненное в виде подвижной платформы, на которой установлен объединяющий шприцы корпус с установленными на нем датчиком температуры и исполнительным органом регулятора температуры в виде термоэлектрического преобразователя Пельтье, который снабжен теплообменником, включенным в контур охлаждения термостатирующей оболочки. Технический результат - улучшение эксплуатационных характеристик нанокалориметра за счет исключения трудоемких операций по перезаправке дозирующего шприца при многократном введении добавки митохондрий в калориметрическую камеру. 1 ил.

 

Изобретение относится к измерениям тепловой мощности в процессах трансформации и диссипации энергии в суспензиях живых митохондрий в исследованиях в области митохондриальной термодинамики, направленных на создание новых фармсредств и перспективных биотехнологий. Калориметр предназначен для исследований митохондрий, белков и других объектов, исследуемых на современных его аналогах.

Современные аналоги, например, описанные в работах [1, 2], Omega [3], VP-ITC, iTC200, Auto iTC200 (MicroCal, USA), не предназначены для измерения тепловой мощности в процессах трансформации и диссипации энергии в митохондриях из-за гибели в них митохондрий в процессах длительного, более 10 минут, выравнивания температуры добавки в них до температуры исследуемого образца. В научной практике указанные исследования проводятся при температуре 26°C.

В работе [4] описан первый капиллярный титрационный калориметр, в котором предусматривается использование дозирующих шприцов емкостью 10 мкл. Из-за возникновения пузырей при заполнении шприцов приходится делать многократные попытки. Добиться отсутствия пузырей воздуха в дозируемом объеме шприца трудно. Этот прибор очень сложен в эксплуатации из-за наличия трудоемких операций по заправке и очистке дозирующих шприцов. В связи с отмеченными низкими эксплуатационными характеристиками в практической работе прибор не нашел широкого применения, а также не использовался для измерений тепловой мощности в процессах трансформации и диссипации энергии в митохондриях и был заменен на другую модель, использующую дозирующие шприцы большего объема, например 50 мкл [5].

Ближайшим аналогом является капиллярный титрационный калориметр для изучения трансформации и диссипации энергии в митохондриях [5]. Данный калориметр имеет современную систему термостатирования калориметрических камер, снабженную автономным циркуляционным термостатом, включенным в систему регулирования температуры термостатирующей оболочки калориметрических камер, что исключает необходимость использования проточной водопроводной воды в системы охлаждения калориметра. В данном прототипе используется очевидное решение, направленное на облегчение операции установки корпуса, объединяющего дозирующие шприцы, в калориметр, тем не менее это позволяет вводить только один раз добавку митохондрий после очередной перезаправки дозирующего шприца для рабочей калориметрической камеры свежим материалом добавки вместо потерявшего жизнеспособность, так как для каждой последующей добавки требуется жизнеспособный материал, хранившийся при +2°C. Данная операция предусматривает непроизводительные затраты времени в связи с необходимостью извлекать из калориметра корпус, объединяющий дозирующие шприцы, отмывать дозирующий шприц для рабочей калориметрической камеры от материала предыдущей добавки и заполнять его материалом новой добавки. Выполнение этих трудоемких сопутствующих экспериментальным работам операций затрудняет выполнение работ на приборе, снижая его эксплуатационные характеристики.

Задача изобретения - улучшение эксплуатационных характеристик нанокалориметра за счет исключения трудоемких операций по перезаправке дозирующего шприца при многократном введении добавки митохондрий в калориметрическую камеру.

Краткое описание существа изобретения

Нанокалориметр для исследования митохондрий, содержащий рабочую и эталонную калориметрические камеры в виде прямых капилляров, корпус, объединяющий дозирующие шприцы, снабженные дозирующими иглами, при этом корпус установлен на средстве, обеспечивающем соосность шприцов и калориметрических камер и возможность перемещения корпуса, объединяющего шприцы, таким образом, что дозирующие иглы перемещаются соосно калориметрическим камерам на всю длину калориметрических камер, циркуляционный термостат, подключенный к термостатирующей оболочке калориметрических камер, средство измерения тепловой мощности, управляющий компьютер, при этом средство, обеспечивающее соосность шприцов и калориметрических камер, выполнено в виде подвижной платформы, на которой установлен объединяющий шприцы корпус с установленными на нем датчиком температуры и исполнительным органом регулятора температуры в виде термоэлектрического преобразователя Пельтье, который снабжен теплообменником, включенным в контур охлаждения термостатирующей оболочки.

Предложенное решение предусматривает неочевидный подход к решению задачи введения добавки митохондрий в рабочую калориметрическую камеру, исключающий операцию по перезаправке дозирующего шприца для рабочей калориметрической камеры, которая в прототипе предусматривает многократную трудоемкую отмывку шприца для рабочей калориметрической камеры от следов предыдущей добавки, потерявшей жизнеспособность, и заправку данного шприца жизнеспособным материалом добавки. Перезаправка дозирующего шприца ведет к непроизводительным затратам времени при эксплуатации калориметра. Предложенное изобретение обеспечивает сохранение жизнеспособности вводимых в виде добавки митохондрий при нахождении их в дозирующем шприце благодаря поддержанию его температуры +2°C. Это позволяет вводить в рабочую калориметрическую камеру добавку жизнеспособных митохондрий без перезаправки шприца для рабочей камеры, что упрощает работу, например, при оценке воспроизводимости результатов измерений, при скрининговых исследованиях и др.

На прилагаемом чертеже представлена функциональная схема калориметра для исследований митохондрий. На основании калориметра 1 установлены калориметрический блок 2 с центрующим фланцем 3, расположенным вертикально, и титрационный узел 4. Калориметрический блок 2 содержит рабочую 5 и эталонную 6 камеры, которые установлены перпендикулярно центрующему фланцу 3, с размещенными на них тепловыми шунтами: активным 7 и пассивным 8, термостатирующую оболочку, состоящую из экранов: первого термостатирующего 9, второго термостатирующего 10, охлаждающего 11 и защитного корпуса 12 калориметрического блока. Титрационный узел 4 состоит из дозирующих шприцов, заключенных в общий держатель 13, на котором установлены датчик температуры 14 держателя и элемент Пельтье 15 с теплообменником 16 для охлаждения горячих спаев. Указанный держатель установлен на подвижной платформе 17, которая служит для перемещения держателя шприцов 13 по направляющей 18. При этом направляющая 18 выполнена в виде уголка, который закреплен на центрующем фланце 3 перпендикулярно его плоскости в положении, при котором обеспечивается надежный прижим подшипников подвижной платформы 17 к направляющим плоскостям уголка благодаря действию сил, равнодействующей которых является сила веса подвижной платформы 17. Указанное расположение элементов обеспечивает требуемые условия для перемещения держателя шприцов 13. при котором дозирующие иглы 19 могут опускаться соосно калориметрическим камерам 5 и 6 на всю глубину камер, а также подниматься снизу до самого верха калориметрических камер. Перемещение подвижной платформы 17 обеспечивается винтовым механизмом с шаговым двигателем 20. Винтовой механизм 21 обеспечивает перемещение поршней 22 дозирующих шприцов, что позволяет производить инъекцию добавки в калориметрические камеры требуемой величины, от долей микролитров до десятков микролитров. В состав калориметра входят циркуляционный термостат 23, выход которого подключен к входному штуцеру змеевика охлаждения охлаждающего экрана 11, а входной штуцер указанного термостата 23 подключен к одному из штуцеров теплообменника 16 элемента Пельтье 15, другой штуцер которого подключен к выходному штуцеру змеевика охлаждения охлаждающего экрана 11.

Калориметр снабжен измерителем мощности тепловых процессов, состоящим из измерительной термобатареи 24, связанной своим выходом с входом нановольтметра 25, который снабжен интерфейсом RS-232, связывающим нановольтметр с компьютером 26. На активном шунте установлен датчик температуры 27, на первом термостатирующем экране установлен датчик температуры 28, на втором термостатирующем экране установлен датчик температуры 29. Датчики температуры 27, 28, 29 и 14 подсоединены к многоканальному измерительному усилителю 30, связанному с компьютером 26, содержащим многоканальный АЦП NI PCIe 6341 и модуль счетчиков/таймеров NI PCI-6602, связанные с блоком усилителей мощности 31, соединенным с нагревателем 32 активного шунта, с нагревателем 33 первого термостатирующего экрана, с нагревателем 34 второго термостатирующего экрана, с шаговыми двигателями титрационного узла 20 и 21, с элементом Пельтье 15, установленным на держателе шприцов 13.

Предлагаемый калориметр для исследований митохондрий работает следующим образом. Тепловая мощность, для измерения которой предназначен предложенный калориметр, возникает в рабочей калориметрической камере следующим образом: например, в режиме введения добавки при движении дозирующей иглы в камеру в рабочей камере 5 реагент добавки выделяется из иглы непосредственно в объем камеры. Сигнал разбаланса по температуре между камерами поступает на вход цифрового нановольтметра 25. Практически во всех современных калориметрах для этих целей используются высокочувствительные цифровые вольтметры, имеющие интерфейс RS-232. При пороге чувствительности нановольтметра на уровне 2 нВ в современных калориметрах обеспечивается порог чувствительности по мощности порядка 50 нВт. Сигнал разбаланса тепловой мощности поступает на СОМ-порт компьютера 26, считывается управляющей программой, индицируется на экране управляющего компьютера и архивируется для дальнейшей обработки. В процессе опускания дозирующих игл в объем камеры реагент добавки распределяется равномерно по всей длине камеры. В рабочую камеру дозируется реагент добавки, а в эталонную камеру дозируется такое же количество нейтрального вещества (буфер и др.). Часть калориметрических камер ниже границы теплового шунта 8 является измерительным объемом. При прохождении сопла дозирующей иглы в зоне шунта 8 тепловой эффект от взаимодействия реагента добавки с образцом не дает вклад в сигнал от измеряемой тепловой мощности, так как полностью шунтируется в системе шунтов 7 и 8.

Введение добавок осуществляется следующим образом: при введении дозы производится продольное перемещение держателя шприцов 13 на всю длину калориметрических камер винтовым механизмом, управляемым шаговым двигателем 20. Одновременно с этим производится перемещение связанных пластиной штоков поршней 22 винтовым механизмом, управляемым шаговым двигателем 21. За счет различной величины перемещений винтовых механизмов шприцами осуществляется дозирование заданного количества реагентов. Управление шаговыми двигателями 20 и 21 осуществляется компьютером 26. При этом добавка распределяется в исследуемом образце по всей длине рабочего объема калориметрической камеры в виде тонкого слоя. В процессе эксперимента добавка может вводиться многократно.

Термостатирование калориметрических камер обеспечивается термостатирующей оболочкой, состоящей из экранов: первого термостатирующего 9, второго термостатирующего 10, охлаждающего 11, и тепловыми шунтами 7 и 8, на которых соответственно установлены датчики температуры 27, 28 и 29, подключенные к многоканальному измерительному усилителю 30. Температура термостатирующей оболочки и активного теплового шунта автоматически регулируется по сигналам датчиков соответственно 27, 28 и 29, связанных с компьютером через многоканальный измерительный усилитель. Сигналы с усилителя 30 поступают в компьютер на многоканальный АЦП NI PCIe 6341. Сформированные сигналы ШИМ с выходов таймеров модуля NI PCI-6602 подаются в нагреватели термостатирующей оболочки и нагреватель шунта через усилитель мощности, обеспечивая автоматическое регулирование температуры в соответствии с уставкой, заданной на компьютере.

Перемещение дозирующих игл соосно калориметрическим камерам исключает возникновение паразитных тепловых шумов, возникающих при соприкосновении дозирующих игл со стенками калориметрических камер. Предложенное построение титрационного узла решает дополнительно с выполнявшимися ранее в прототипе задачами: введение заданной добавки в калориметрические камеры и перемешивание реагентов в калориметрических камерах, а также новую задачу: исключение трудоемких операций по перезаправке дозирующего шприца при многократном введении добавки митохондрий в калориметрическую камеру. Решение новой задачи достигается благодаря тому, что обеспечивается поддержание температуры 2°C держателя 14 дозирующих шприцов и, соответственно, сохранение материала добавки митохондрий, размещенной в шприце рабочей камеры. Терморегулятор построен с использованием датчика температуры 14, элемента Пельтье 15 с теплообменником 16 для охлаждения горячих спаев, многоканального измерительного усилителя 30. многоканального усилителя мощности 31, управляющего компьютера 26 с установленными модулем АЦП NI PCIe 6341 и модулем таймеров NI PCI-6602, циркуляционного термостата 23. При этом применение циркуляционного термостата, работающего в системе термостатирования калориметрических камер, упрощает решение задачи охлаждения горячих спаев элемента Пельтье. Дозирующие шприцы снимаются с калориметра вместе с подвижной платформой, на которой закреплен держатель шприцов в строго заданном положении. Возвращение шприцов в калориметр выполняется путем размещения подвижной платформы 17 на направляющей 18 с обеспечением контакта плоскостей угольника направляющей с подшипниками подвижной платформы без каких-либо регулировочных операций, т.е. без затрат времени. Температура держателя шприцов в 2°C надежно обеспечивается как в составе калориметра, так и вне калориметра.

Литература

1. Velazguez-Campoy A., Mayorga O.L. and Cabrerizo-Vilchez M.A. Development of an isothermal titration microcalorimetric system with digital control and dynamic power Peltier compensation. I. Description and basic performance // Review of Scientific Instruments. - 2000. - Vol. 71. - P. 1824-1840.

2. Garcia-Fuentes L., Baron C. and Mayorga O.L. Influence of dynamic power compensation in an isothermal titration microcalorimeter // Analytical Chemistry. - 1998. - Vol. 70. - P. 4615-4623.

3. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. / Wiseman Т., Williston S., Brandts J.F. and Lin L. // Analytical Biochemistry. - 1989. - Vol. 179. - P. 131-137.

4. METHOD OF SEPARATING THE SENSITIVE VOLUME OF CALORIMETRIC CELLS IN A DIFFERENTIAL TITRATION CALORIMETER / G.V. Kotelnikov, S.P. Moiseyeva, E.V. Mezhburd and V.P. Krayev // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. - 2000. - Vol. 62. - P. 39-50.

5. Калориметрические измерения тепловых процессов при трансформации и диссипации энергии в митохондриях / Г.В. Котельников, С.П. Моисеева, Гришина Е.В., Маевский Е.И. // Приоритетные направления развития науки и технологий: тезисы докладов XV всероссийской научн.-техн. конф.; под общ. ред. В.М. Панарина. - Тула: Инновационные технологии. - 2014. - С. 21-27.

Нанокалориметр для исследования митохондрий, содержащий рабочую и эталонную калориметрические камеры в виде прямых капилляров, корпус, объединяющий дозирующие шприцы, снабженные дозирующими иглами, при этом корпус установлен на средстве, обеспечивающем соосность шприцов и калориметрических камер и возможность перемещения корпуса, объединяющего шприцы, таким образом, что дозирующие иглы перемещаются соосно калориметрическим камерам на всю длину калориметрических камер, циркуляционный термостат, подключенный к термостатирующей оболочке калориметрических камер, средство измерения тепловой мощности, управляющий компьютер, отличающийся тем, что средство, обеспечивающее соосность шприцов и калориметрических камер, выполнено в виде подвижной платформы, на которой установлен объединяющий шприцы корпус с установленными на нем датчиком температуры и исполнительным органом регулятора температуры в виде термоэлектрического преобразователя Пельтье, который снабжен теплообменником, включенным в контур охлаждения термостатирующей оболочки.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области приборостроения и может быть использовано для измерения тепловой мощности в процессах трансформации и диссипации энергии в суспензиях живых митохондрий в исследованиях в области митохондриальной термодинамики, направленных на создание новых фармсредств и перспективных биотехнологий.

Изобретение относится к области физики. Может быть использовано для подготовки и перемещения проб к анализирующему устройству при спектральном анализе материалов и веществ.

Изобретение относится к микроклапану для применения в биосенсоре, к микрофлюидному устройству, к применению такого устройства, а также к микрофлюидному элементу. Нормально закрытый микроклапан для применения в микрофлюидном устройстве содержит корпусную часть, седло, впускное и выпускное отверстия и гибкую предварительно деформированную мембрану.

Изобретение относится к медицинской технике. Портативный медицинский прибор для измерения уровня глюкозы в крови содержит корпус с кассетоприемником, помещаемую в кассетоприемник сменную кассету с тест-лентой и привод, включающий в себя электрический двигатель и передаточный механизм, предназначенный для поворачивания катушки кассеты с тест-лентой таким образом, чтобы тест-лента кассеты наматывалась на катушку с возможностью последовательного использования расположенных на тест-ленте тест-элементов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Система состоит из следующих элементов: а) модуля подготовки образца, выполненного с возможностью захвата аналита из биологического образца в немикрожидкостном объеме на захватывающей частице, реагирующей на магнитное поле, и направления связанной с аналитом захватывающей частицы, реагирующей на магнитное поле, через первый микрожидкостный канал; б) реакционного модуля, включающего реакционную камеру, имеющую жидкостное сообщение с первым микрожидкостным каналом, и выполненного с возможностью иммобилизации связанной с аналитом захватывающей частицы, реагирующей на магнитное поле, и проведения реакции амплификации множества STR-маркеров аналита.

Изобретение относится к способу подготовки и анализа множества клеточных суспензий, содержащий, по меньшей мере, следующие последовательные этапы, на которых: (a) загружают множество флаконов на приемную площадку, при этом каждый флакон содержит предназначенную для анализа клеточную суспензию; (b) загружают множество аналитических емкостей на приемную площадку; и (c) отбирают из флакона пробу клеточной суспензии и вводят ее в аналитическую емкость; этап (с) повторяют для каждого анализируемого флакона; (d) повторно переводят пробу в суспензию; (e) выбирают релевантные клетки посредством дифференциальной декантации; (f) производят всасывание объема, полученного в результате дифференциальной декантации, при помощи пипеточных средств, при этом объем содержит предназначенную для анализа пробу.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для автоматического анализа образцов кала. Автоматический анализатор образцов кала содержит автоматический контроллер, контейнер для образцов, разжижающее устройство, перемешивающее и смешивающее устройство, анализирующее устройство, устройство всасывания и очистки, соединенное трубопроводами с анализирующим устройством.

Изобретение относится к измерительной технике, в частности, к медицинской. Устройство представляет собой квадрупольный магнитный блок (1, 2, 3, 4) для обеспечения различного градиента магнитного поля на сенсорной поверхности на дне средства, например, картриджа или камеры, для размещения жидкого образца в биосенсоре с целью управления частицами образца.

Изобретение относится к области иммунодиагностического тестирования и, в частности, к иммунологическому тестовому элементу. .

Изобретение относится к области приборостроения и может быть использовано для измерения тепловой мощности в процессах трансформации и диссипации энергии в суспензиях живых митохондрий в исследованиях в области митохондриальной термодинамики, направленных на создание новых фармсредств и перспективных биотехнологий.

Изобретение относится к области неразрушающих методов контроля и может быть использовано для определения качественного состояния фильтрующе-поглощающих изделий.

Изобретение относится к пограничной области между физикой, химией и биологией и может быть использовано в научных и промышленных лабораториях для определения параметров фазового перехода в воде и влияния на них условий (давление, температура), добавок веществ и полей.

Изобретение относится к области неразрушающих методов контроля качественного состояния фильтрующе-поглощающих изделий от паров токсичных химикатов и может быть использовано для оценки степени отработки шихты по загрязняющим веществам, поглощающими как на основе физической адсорбции, так и хемосорбции.

Изобретение относится к метрологии, в частности к методам градуирования аналитических приборов. .

Изобретение относится к теплофизике и может быть использовано для определения радиационных характеристик поверхностей и покрытий твердых тел. В отличие от известного способа определения излучательной способности твердых материалов, заключающегося в том, что воздействуют на исследуемый образец с помощью лазерного излучения, измеряют истинную контактную температуру Т поверхности образца в процессе воздействия, одновременно бесконтактно определяют интенсивность излучения от образца и используют полученные данные для определения излучательной способности, в предложенном способе воздействуют на образец лазерным излучением, преобразованным в тепловое излучение, после равномерного нагрева образца преобразованным лазерным излучением измеряют в исследуемом спектральном диапазоне длин волн теплового излучения от образца от λ1 до λ2 яркостную температуру Тя поверхности образца, по которой судят об интенсивности теплового излучения от образца.
Наверх